PL130950B1 - Process for preparing novel metabolite streptomyces,m. 139603,and agent for use in stock-breeding of ruminants - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego metabolitu Streptomyces, M. 139603, oraz sro¬ dek do stosowania w hodowli zwierzat przezuwajacych zawierajacy ten metabolit.Nowy zwiazek wytwarza sie w postaci soli sodowej o wzorze CasHssOsNa, lub w postaci odpowiedniego wolnego kwasu lub soli innych metali alkalicznych, które mozna z niego wyprowadzic. Zwiazki te skutecznie zmniejszaja ilosc metanu wytwarzanego w trakcie fermentacji w zwaczu oraz zwiekszaja ilosc kwasu propionowe- go w tresci zwacza bydla, w zwiazku z czym pobudzaja wzrost zwierzat przezuwajacych, przy czym znany jest fakt zwiekszania przez inne zwiazki chemiczne poziomu kwasu propionowego w tresci zwacza, z czego wynika zwiekszenie szybkosci wzrostu bydla lub owiec przyjmujacych te zwiazki w pozywieniu.Nowy zwiazek M.139603 posiada nastepujaca charakterystyke: a) wzór czasteczkowy CssHssOsNa, jak wykazano metoda spektrometrii masowej, która ukazuje jon czasteczkowy M+ o masie 624,361 (obliczono dla Ca 5 H5 3 Os Na = 624,364) oraz metoda analizy elementarnej: C = 67,5, H= 8,8% (obliczono dla Cast^OgNa: C = 67,3, H = 8,5%), b) widmo w podczerwieni (zawiesina w nujolu), jak pokazano na fig. 1, wykazujace charakterystyczne absorpcje przy 3300, 1725,1645,1565 i 915 cm"1, c) widmo protonowego rezonansu magnetycznego w deuterochloroformie, jak pokazano na fig. 2., d) widmo w nadfiolecie w roztworze etanolowym wykazujace charakterystyczna absorpcje przy 234 nm (E = 12900) i 272 nm (E = 10800), e) temperatura topnienia 176 — 178°C, 2 3 f) [a] D = - 82° (c = 0,2 w metanolu), a pochodzacy od niego odpowiedni wolny kwas o wzorze czasteczkowym C35H54O8 charakteryzuje sie wartpscia Rf = okolo 0,55 w chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym Kieselgel 60 F — 254 (znak ochronny) Mercka przy grubosci warstwy 0,25 nm i przy uzyciu do rozwiniecia chromatogramu mieszani¬ ny 95:4:1 w stosunku objetosciowym eteru etylowego, metanolu i kwasu mrówkowego, wykazujacy absorpcje w nadfiolecie w etanolu przy 274 nn(E = 13900), pik poszerzony.2 130950 Wedlug wynalazku sposób wytwarzania nowego metabolitu Streptomyces, oznaczonego jako M. 139603* w wzorze czasteczkowym C3sH5308Na lub pochodzacego od niego odpowiedniego wolnego kwasu o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego soli innych metali alkalicznych, polega na tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 w wodnym podlozu odzywczym zawierajacym zródlo przyswajalnego wegla, w warunkach napowietrzania przez wytrzasanie, w temperaturze 22 — 32°C, po czym tak otrzymana mieszanine fermentacyjna ewentualnie poddaje sie w zwykly sposób ekstrakcji nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem organicznym, oddziela roztwór organiczny, a nastepnie ewentualnie odparowuje roz¬ puszczalnik iuzyskany zwiazek M. 139603 w postaci soli sodowej ewentualni przeprowadza sie w zwykly spo-^ sób w wolny kwas, a nastepnie wolny kwas ewentualnie przeprowadza sie w sole innych metali alkalicznych.Wedlug wynalazku srodek do stosowania w hodowli zwierzat przezuwajacych zawiera nowy metabolit Streptomyces, M. 139603, o wzorze czasteczkowym CasHsaOsNa albo pochodzacy od niego wolny kwas o wzo¬ rze czasteczkowym C3 5 H5 4 Os lub jego sole z innymi metalami alkalicznymi, lacznie ze stalym lub cieklym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem.Szczep Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 mozna bez ograniczenia otrzymac z National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries nad Food, Torry Research Station, 13S Abbey Road, Aberdeen AB 9 8 DG, Szkocja; posiada on nastepujaca charakterystyke: [Stosowane podloza przygotowane sa zgodnie z przepisami dotyczacymi „International Streptomyces Pro¬ ject" (ISP), tak jak zostaly opisane przez E.G. Shirlinga i D. Gottlieba w International Journal of Systematic Bacteriology, 16, (3), 313-340 (1966)].Warunki hodowli: temperatura okolo 25°C swiatlo dzienne.ISP 1 Wyciag drozdzowy z tryptonem (ale z dodatkiem agaru). 5 dni - Kolonie cienkie, lekko wilgotne, aksamitne, jasnoplowe — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bezbarwne 13 dni - Kolonie cienkie, aksamitne — lekko ziarniste, jasnoplowe — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bezbarwne ISP 2 Agar z wyciagiem drozdzowym i wyciagiem slodowym 5 dni — Kolonie cienkie, aksamitne, jasnoszare — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bardzo blade zólto-plowe 13 dni - Kolonie rozwiniete, wypukle i pomarszczone, aksamitne, jasnozólte (brazowe) szare — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: plowe ISP 3 Agar z maka owsiana. 5 dni - Kolonie rzadkie do cienkich, aksamitne,jasnozólte/szare — Kolonio ogladane z odwrotnej strony: niewidoczne 13 dni - Kolonie cienkie, lekko wypukle, aksamitne, jasnoszare — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: niewidoczne ISP 4 Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi * 5 dni — Kolonie cienkie, jasnoplowe, lekko ziarniste — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bezbarwne 13 dni — Kolonie cienkie, lekko wilgotne, plowe — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: wiecej lub mniej bezbarwne ISP 5 Agar glicerolowo-asparaginowy. 5 dni — Kolonie cienkie, lekko ziarniste, jasnoplowe — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bezbarwne 13 dni — Kolonie cienkie, aksamitne, jasnoszare — Kolonie ogladane z odwrotnej stronybezbarwne ISP 7 Agar z tyrozyna. 5 dni — Kolonie rzadkie do cienkich, lekko ziarniste, aksamitne, jasnoplowe/szare — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: bezbarwne 13 dni — Kolonie cienkie, aksamitne, lekko wypukle, plowe — Kolonie ogladane z odwrotnej strony: plowe/szare.Na podlozu ISP 7, w miare starzenia sie, hodowla na ogól staje sie bardziej rózowo-plowa, ale zawiera pewne strefy zabarwione ciemniej, co stowarzyszone jest z obfitszym zarodnikowaniem.ISP 9 Agar do badania wykorzystania wegla z róznych zródel.130950 3 Zapis 15 dni — Bez zródla wegla: kolonie bardzo rzadkie, podpowierzchniowe — — Glukoza: kolonie cienkie, rozwiniete, aksamitne, plowe + -Arabinoza: kolonie rzadkie, aksamitne,plowe ± -Fruktoza: kolonie cienkie, aksamitne,plowe + -Inozyt: kolonie bardzo rzadkie — -Mannit: kolonie cienkie,aksamitne + — Raflnoza: kolonie bardzorzadkie — — Ramnoza: kolonierzadkie ± — Ksyloza: kolonierzadkie ± Opis ogólny.Nie wytwarza melamin.Nie wytwarza barwników widocznych od strony odwrotnej.Nie wytwarza barwników ropuszczalnych.Tworzy zarodniki formujace otwarte i zwarte spirale. Zarodniki czesto sa oddzielone od glównej osi przez prostujaca strzepke podporowa, lub, byc moze, lancuch zarodników. Same zarodniki trudno obserwowac przez zwykly mikroskop, poniewaz sa ze soba bardzo scisle zlaczone. Sciany zarodników sa gladkie (mikroskop elektronowy, preparat w 4% octanie uranylu).Powyzszy szczep S. longisporoflavus mozna takze otrzymac bez ograniczenia z Centraalbureau veer Schimmelcultures, PO Box 273, Gosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Holandia, pod numerem rejestracyjnym CBS 312.79.Wolny kwas odpowiadajacy soli sodowej zwiazku M. 139603 mozna wytwarzac droga zakwaszenia roztwo¬ ru M. 139603 i ekstrakcji kwasnego roztworu rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszajacym sie z woda. Sole innych metali alkalicznych mozna wytwarzac poddajac roztwór wolnego kwasu reakcji z odpowiednim wodoro¬ tlenkiem metalu alkalicznego, takim jak wodorotlenek litowy, wodorotlenek potasowy, wodorotlenek cezowy lub wodorotlenek rubidowy. W przypadku uzycia wodorotlenku sodowego, regeneruje sie M. 139603, wykazujac tym samym, ze reakcje te nie spowodowaly zadnych zmian strukturalnych.Jak wyzej wspomniano, zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wywoluja zwiekszenie ilosci kwasu propionowego w tresci zwacza, a w szczególnosci wzrost zawartosci kwasu propionowego kosztem ilosci metanu i/lub kwasu octowego. Jest to znany i pozadany efekt, jesli chodzi o karmienie zwierzat przezuwajacych, poniewaz kwas propionowy jest o wiele bardziej wydajnym, anizeli kwas octowy, prekursorem glukozy, z której zwierze czerpie energie i w konsekwencji rosnie, zas ta czesc spozytej paszy, która zostaje przeksztalcona w me¬ tan, jest po prostu stracona dla zwierzecia, przy czym metan zostaje wydalony przez odbijanie sie. Dlatego modyfikacja metabolizmu w zwaczu uzyskiwana przez zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku jest efektem bardzo korzystnym i przyjmuje sie, ze powoduje ona zwiekszenie szybkosci wzrostu zwierzat przezuwa¬ jacych i wydajnosci wykorzystania przez nie paszy.Sposób uzytkowania zwiazków wytworzonych w sposób wedlug wynalazku w hodowli gospodarskich zwie¬ rzat przezuwajacych w celu zwiekszenia szybkosci wzrostu i/lub zwiekszenia wydajnosci wykorzystania paszy polega na doustnym podawaniu zwierzetom zwiazków wytworzonych sposobem wedlug wynalazku. Zwiazki korzystnie podaje sie doustnie jako dodatek do normalnej diety, to znaczy w mieszaninie ze zwyklym stalym pokarmem, w prasowanej paszy lub lizawkach solnych, rozpuszczony w wodzie do picia, albo w przypadku zwierzat mlodych, takich jak jagnieta lub cieleta, rozpuszczony w mleku pelnym lub odciaganym. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wprowadza sie do pokarmów, prasowanej paszy, lizawek solnych, wody do picia, mleka pelnego lub mleka odciaganego w takiej ilosci, ze kazde traktowane nim zwierze pobiera zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku w ilosci 0,01 mg/kg wagi ciala dziennie, korzystnie od 0,01 mg/kg do 10 ipg/kg dziennie.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna tez podawac doustnie zwierzetom w postaci powoli uwalniajacych sie wewnatrz zwacza pastylek lub duzych pigulek, tak, ze zwierze absorbuje w kazdym dniu podobna ilosc zwiazku wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku.Zwierzeta moga otrzymywac zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku w czasie calego zasadni¬ czo procesu wzrostu albo tylko w ciagu pewnego okresu wzrostu, takiego jak wczesna faza wzrostu i/lub okres przedubojowy. Wzmozenie szybkosci wzrostu uzyskiwane przez zastosowanie srodka wedlug wynalazku umozli¬ wia doprowadzenie zwierzat hodowanych na mieso do wagi handlowej lub ubojowej w skróconym w stosunku do normalnego okresie wzrostu, wzglednie umozliwia uzyskanie pod koniec normalnego okresu wzrostu zwierzat ciezszych. Polepszenie wydajnosci wykorzystania pozywienia, uzyskiwane przez praktyczne zastosowanie sposo¬ bu wedlug wynalazku, umozliwia to, ze zwierzeta przyjmujace zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynala¬ zku, osiagaja zadana wage przy ilosci spozytej paszy mniejszej od ilosci spozytej przez zwierzeta nie przyjmujace4 130 950 zwiazków, wyhodowane do tej samej wagi. Przy optymalnym poziomie przyjmowania zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku zapewniajacym wzrost, nie zauwazono, aby wywieraly one jakikolwiek wplyw toksyczny.Jak juz wspomniano, wynalazek obejmuje takze srodek do stosowania w hodowli zwierzat przezuwajacych zawierajacy nowy metabolit Streptomyces M. 139603 o wzorze czasteczkowym C3sH53 08Na albo pochodzacy od niego wolny kwas o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego sole z innymi metalami alkalicznymi, lacznie ze stalym lub cieklym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem.Odpowiednim cieklym rozcienczalnikiem lub nosnikiem jest np. woda do picia, mleko pelne lub mleko odciagane.Odpowiednim stalym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem moze byc np. zwykly, pelnowartosciowy pokarm dla zwierzat przezuwajacych, taki jak zwykla dieta bydleca lub owcza skladajaca sie z produktów zbozowych, takich jak maka jeczmienna, kukurydziana lub pszenna, produkty otrzymane z orze¬ chów lub nasion, takie jak makuchy z luszczonych orzeszków ziemnych lub makuchy z nasion bawelny lub wyekstrahowane makuchy z nasion bawelny, lacznie z mniejszymi ilosciami np. maczki z pierza, maczki z wodo¬ rostów, maczki kostnej, maki kostnej, kredy, soli, mocznika, melasu, witamin i pierwiastków sladowych, albo moze nim byc obojetny staly rozcienczalnik lub nosnik pozbawiony wartosci pokarmowej, taki jak kaolin, talk, weglan wapnia, ziemia Fullera, glinka attapulgitowa, mielone muszle ostryg lub mielony wapien, albo tez moze nim byc skrobia lub laktoza.Srodek wedlug wynalazku moze miec postac wzbogaconego pokarmu przeznaczonego do bezposredniego zywienia zwierzat i w tym przypadku zawiera on od 5 do 3000 ppm zwiazku wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku jako domieszki do zwyklego pokarmu przezuwaczy. Moze on takze miec postac skoncentrowanego premiksu do rozcienczania zwyklym pokarmem przezuwaczy z utworzeniem wzbogaconego pokarmu nadajacego sie do bezposredniego zywienia zwierzat. Premiks taki zawiera od 0,3 do 50% wag./wag. zwiazku wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku zmieszanego albo ze zwyklym pelnowartosciowym pokarmem zwierzat przezuwa¬ jacych, czy obojetnym stalym rozcienczalnikiem pozbawionym wartosci pokarmowej, takim jak mielony wapien, albo ze skrobia lub laktoza.Sposób wytwarzania srodka wedlug wynalazku polega na tym, ze miesza sie az do uzyskania jednorodnosci zwiazek wytworzony sposobem wedlug wynalazku ze stalym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem ' * Zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku korzystnie rozciencza sie seryjnie rozcienczalnikiem lub nosnikiem w dwu- lub wiecej, kolejnych stadiach, zapewniajac wyrównane wymieszanie calosci.Wynalazek objasniaja, nie ograniczajac jego zakresu, nastepujace przyklady.P r z y k l a d I. Prowadzi sie hodowle Streptomyces sp. NCIS 11426 w 500 ml kolbie Erlenmeyera na agarze z wyciagiem drozdzowym i tryptonem, zawierajacym: Trypton- „Oxoid" L 4 2 (znak ochronny) 0,5% wag./obj.Ekstrakt drozdzowy - „Oxoid" L 2 1 (znak ochronny) 0,3% wag./obj. uprzednio wysterylizowanym przez ogrzewanie w autoklawie wciagu 20 minut pod normalnym cisnieniem; pH podloza wynosi okolo 7,0.Kolbe wytrzasa sie w temperaturze 25°C w ciagu 120 godzin na trzesawce obrotowej.Zawartosci kolby uzywa sie nastepnie do zaszczepienia dalszych 10 podobnych kolb, z których kazda zawiera 200 ml podloza o nastepujacym skladzie: syropglukozy 3,0% wag./obj. weglanwapniowy 0,25% wag./obj. chloreksodowy 0,5% wag./obj. siarczan magnezowy siedmiowodny 0,05% wag./obj. koncentrat mikroelementów 0,1% wag./obj. pepton bakteriologiczny („Oxoid" L 37 - znak ochronny) 0,1% wag./obj. ekstrakt z miesa wolowego w proszku („Oxoid" L 29, „Lab Lemco" - znak ochronny) 0,5% wag./obj. woda dejonizowana do 100 pH doprowadza sie do 7,2 i podloze wstepnie sterylizuje sie przez ogrzewanie w autoklawie w 120°C w ciagu 20 minut. Kolby po zaszczepieniu wytrzasa sie w temperaturze 25°C w ciagu 120 godzin na trzesawce obrotowej. Nastepnie zawartosc kolb laczy sie i pH doprowadza do 3 za pomoca ostroznego dodawania 0,1 N kwasu solnego, po czym calosc poddaje sie ekstrakcji 2 razy po 600 ml octanu etylu, a nastepnie ekstrakty laczy sie i suszy siarczanem sodowym. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie 290 mg oleistej pozostalosci.aSu^dO D Wyekstrahowana substancje poddaje sie oczyszczaniu metoda preparatywnej chromatografii cienkowar¬ stwowej na dwóch plytkach 20 x 20 cm pokrytych warstwa zelu krzemionkowego („Kiesielgel" 60 F - 254 - znak ochronny - Mercka) grubosci 2 mm, stosujac do elucji octan etylu. Zdrapuje sie z plytek pasmo o wartosci RF okolo 0,39 i poddaje ekstrakcji octanem etylu, po czym rozpuszczalnik odparowuje sie, otrzymujac 21 mg lepkiej gumowatej pozostalosci, wykazujacej in vitro aktywnosc antybakteryjna wobec S. aureus. Te aktywna frakcje oczyszcza sie dalej metoda preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej na jednej plytce 20 x 20 cm pokrytej warstwa zelu krzemionkowego („Kieselgel" 60 F - 254 Mercka) grubosci 0,25 mm przy uzyciu miesza¬ niny 95 :4 :1 w stosunku objetosciowym odpowiednio eteru etylowego, metanolu i kwasu mrówkowego. Na¬ stepnie z plytki zdrapuje sie pasmo o wartosci Rf okolo 0,55, poddaje ekstrakcji octanem etylu i po odparowa¬ niu rozpuszczalnika otrzymuje sie 9 mg lepkiej gumowatej pozostalosci, która przeksztalca sie w sól sodowa, metabolit M. 139603, za pomoca wytrzasania jej chloroformowego roztworu z 0,1 M roztworem wodorotlenku sodowego. Oddziela sie warstwe chloroformowa i po osuszeniu siarczanem sodowym rozpuszczalnik odparowuje sie, otrzymujac 8 mg M. 139603 w postaci ciala stalego o barwie bialej, o temperaturze topnienia 129 - 132°C.Widmo w podczerwieni (rys. 1) wykazuje nastepujace maksima: 3300, 1725, 1645, 1565 i 915 cm"1. Analiza elementarna: obliczono dla C3sH5308Na - C 67,3, H = 8,5. Znaleziono C = 67,5, H = 8,8%. Widmo masowe : M+= 624,361 (obliczono dla CasHsaOsNa - 624,364). Rp = 0,39 (chromatografia cienkowarstwowa na plytkach pokrytych zelem krzemionkowym 60 F — 254 Mercka, grubosci 0,25 mm, z uzyciem do rozwijania octanu etylu, brazowa plama po wywolaniu przez natrysniecie 3 N kwasem siarkowym i ogrzewanie w tempera¬ turze 100°C). Widmo protonowego rezonansu magnetycznego w deuterochloroformie pokazane jest na rys. 2\ Przyklad II. Zdolnosc M. 139603 do hamowania wytwarzania metanu w zwaczu zwierzat przezuwaja¬ cych i do zwiekszania udzialu propionianu kosztem octanu (Ac/Pr) w ogólnej ilosci utworzonych lotnych kwa¬ sów tluszczowych (VFA), wykazuje sie w sposób nastepujacy: Tresc zwacza pobiera sie w regularny sposób od dwóch wólców karmionych taka sama dieta zlozona z siana i koncentratu. Pobieranie próbek standaryzuje sie tak dalece,jak tylko to jest mozliwe i plyny pobrane od dwóch zwierzat laczy sie w stosunku 50/50. Nastepnie wieksze czastki usuwa sie przez przesaczenie polaczo¬ nych plynów przez poczwórnie zlozona gaze, po czym przesacz rozciencza sie w stosunku jedna objetosc przesaczu do trzech objetosci sztucznej tresci plynu zwacza, przygotowanej w sposób opisany przez G.L. Balesa i wsp., Journal of Diary Science, 1976, tom 59, str. 1850, ale z pominieciem kwasu octowego. Nastepnie pH otrzymanej mieszaniny doprowadza sie do wartosci 6,9- 7,0 nasyconym wodnym roztworem weglanu sodowe¬ go. Z mieszaniny tej pobiera sie 50 ml próbki i przenosi je do 100ml stozkowych kolb zawierajacych po 0,5 g wysuszonego zmielonego siana i kazdej kolby uzywa sie do testowania badanego zwiazku w danym stezeniu.Zwiazek badany w postaci roztworu etanolowego wprowadza sie do stozkowej kolby, po czym kolbe przeplukuje sie gazowym CO2, zamyka hermetycznym zamknieciem i inkubuje w temperaturze 39°C w ciagu 15—16 godzin. Po uplywie 1 godziny wprowadza sie w hermetyczne zamkniecie waska swidrujaca igle w celu zmniejszenia cisnienia gazu i igle te wyciaga sie na 30 minut przed zakonczeniem inkubacji. Fermentacje przery¬ wa sie przez wlozenie kolby do lodu i po uplywie 15 minut oziebiania oznacza sie metoda chromatografii gazowej zawartosc metanu w gazie znajdujacym sie nad ciecza. Nastepnie zawartosc kolb saczy sie przez uprzed¬ nio wysuszony saczek ze spiekanego szkla. W trzech próbkach przesaczu oznacza sie metoda chromatografii gazowej zawartosc VFA i przez porównanie z poprzednio oznaczonym poziomem VFA ustala ilosc netto VFA (octan i propionian), wytworzonych w trakcie inkubacji.Otrzymane wyniki zamieszczono w ponizszej tablicy I, wyrazajac je jako % wartosci uzyskanych w próbach kontrolnych bez uzycia zwiazku badanego. Jako dodatnia kontrole wlaczono monenzyne, znany promotor wzrostu dzialajacy na zasadzie wplywu na poziomie zwacza.Tablica I Zwiazek M. 139603 Monenzyna Stezenie jug/ml 1,0 0,3 0,1 1,0 0,3 0,1 Metan % w stosunku do kontroli 58 72 87 67 90 100 Stosunek octan/propionian % w stosunku do kontroli 62 64 70 79 87 956 130950 Przyklad III. Prowadzi sie hodowle Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 na skosnym podlozu agarowym ISP-7 uzytym w ilosci 45 ml, w ciagu 7 dni w temperaturze 30°C. Hodowle z trzech skosów zdrapuje sie pojedynczo do trzech kolb zawierajacych po 100 ml jalowej wody i otrzymanych tak zawiesin uzywa sie do zaszczepienia trzech 2 litrowych kolb zawierajacych po 1 litrze podloza o nastepujacym skladzie: gliceryna ^ 3,0% wag./obj. pepton bakteriologiczny („Oxoid" L-37 - znak ochronny) 2,0% wag./obj.KH2P04 0,024% wag./obj.MgS04 • 7H20 0,02% wag./obj. koncentrat mikroelementów 0,1% wag./obj. kreda 0,1% wag./obj. wodadejonizowana do 1 litra uprzednio wysterylizowanego przez ogrzewanie w autoklawie pod normalnym cisnieniem wciagu 1/2 godziny, o pH okolo 6,7.Tak przygotowane trzy 2 litrowe kolby wytrzasa sie w temperaturze 30°C wciagu 3 dni na trzesawce obrotowej. Nastepnie zawartosci tych trzech kolb laczy sie i uzywa do zaszczepienia fermentora ze stali nie¬ rdzewnej zawierajacego 301 jalowego podloza o nastepujacym skladzie: gliceryna 3,0% wag./obj. maka sojowa BSP70 1,0% wag./obj. kreda 0,25% wag./obj. glukoza 3,0%wag./obj.NaCl 0,5% wag./obj.MgS04-7H20 0,05% wag./obj. koncentrat mikroelementów 0,1% wag./obj. woda destylowana do 30litrów * ' Zawartosc fermentora miesza sie w temperaturze 30°G w ciagu 70 godzin, przy uzyciu mieszadla turbino¬ wego o 4 plaskich lopatach przy 350 obr./min. i napowietrzaniu 15 l/min. Do mieszaniny dodaje sie przed sterylizacja 30 ml „Silicolapse" (znak ochronny), silikonowego srodka przeciwpiennego. pH w momencie zakon¬ czenia fermentacji wynosi 7,9 i otrzymana mieszanine fermentacyjna o objetosci 22 litrów miesza sie w ciagu 30 minut z taka sama objetoscia octanu etylu, po czym mieszanine rozdziela sie w separatorze odsrodkowym i otrzymany ekstrakt octanowy o objetosci okolo 181 suszy sie siarczanem sodowym i saczy. Otrzymany prze¬ sacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 10,7 g oleistej pozostalosci.Z tak otrzymanego koncentratu M. 139603 wyodrebnia sie w nastepujacy sposób: 10,7 g oleistej pozostalosci rozpuszcza sie w mozliwie najmniejszej objetosci octanu etylu, po czym otrzymany roztwór nanosi sie na wierzcholek kolumny, 18 cm x 4 cm, zawierajacej 200 g obojetnego tlenku glinowego Woelm N w postaci papki z octanem etylu. Elucje prowadzono wpierw octanem etylu, a nastepnie 50% obj./obj. mieszanina octanu etylu i metanolu, i w koncu metanolem. Po ukazaniu sie frontu rozpuszczalnika w wylocie kolumny odbiera sie nastepujace frakcje: Frakcja nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Objetosc 150 ml 150 ml 150 ml 150 ml 150 ml 150 ml 150 ml 150 ml 200 ml 200 ml 200 ml Eluent octan etylu octan etylu octan etylu octan etylu octan etylu octan etylu octan etylu octan etylu metanol metanol metanol — metanol 50% obj./obj. - metanol 50% obj./obj. — metanol 50% obj./obj. - metanol 50% obj./obj.Frakcje 7—11 wlacznie zawierajace, jak to wykazano metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krze¬ mionkowym z uzyciem do rozwijania chromatogramu mieszaniny 20% obj./obj. acetonu z eterem naftowym o temperaturze wrzenia 60-80°C, M. 139603 (Rf= ^ 0,22), laczy sie i odparowuje, otrzymujac 840 mg lepkiej gumowatej pozostalosci. Pozostalosc te poddaje sie dalszemu oczyszczaniu metoda preparatywnej chromato^- grafii cienkowarstwowej na plytkach 40x20 cm pokrytych zelem krzemionkowym „Kieselgel 60 F 250"— znak- ochronny — Mercka, grubosci warstwy 2 mm, stosujac do erupcji mieszanine 20% obj./obj. acetonu z eterem130 950 naftowym o temperaturze wrzenia 60 - 80°C. Z dwóch plytek zdrapuje sie pasmo widoczne w swietle UV o Rp = okolo 0,22 i poddaje ekstrakcji octanem etylu, po czym otrzymany ekstrakt odparowuje sie do sucha, otrzymujac 240 rpg lepkiej gumowatej pozostalosci, krystalizujacej po dodaniu eteru naftowego o temperaturze wrzenia 60 - 80°C. Otrzymany zwiazek rekrystalizuje sie z eteru naftowego o temperaturze wrzenia 60 — 80°C, otrzymujac bezbarwne krysztaly, które odsacza sie i suszy, otrzymujac 210 mg M. 139603 o temperaturze top¬ nienia 176 - 178°C. Widmo UV w etanolu wykazuje absorpcje przy 234 nm (E = 12900) i 272 nm (E = 10800).Widma IR i NMR sa identyczne z uzyskanymi w przypadku zwiazku wytworzonego w sposób, jak wyzej opisano w przykladzie L P r z y k l a d IV. 40 mg M. 139603 rozpuszcza sie w mieszaninie 10 ml acetonu i 2 ml wody, po czym dodaje sie 1 ml 2 N kwasu solnego i otrzymana mieszanine energicznie miesza sie w ciagu 5 minut. Nastepnie dodaje sie 20 ml wody destylowanej i otrzymana mieszanine poddaje sie ekstrakcji 2 razy po 10 ml chlorku metylenu. Warstwe organiczna oddziela sie i przemywa 2 N kwasem solnym, a nastepnie woda destylowana, po czym warstwe te zateza sie, otrzymujac 33 mg „wolnego kwasu" odpowiadajacego M. 139603, w postaci lepkiej, gumowatej pozostalosci. Analiza elementarna: obliczono dla C35H54O8 C = 69,8, H = 9,0. Znaleziono C = 69,5, H = 9,1. Widmo IR, w zawiesinie w nujol, jak pokazano na rys. 3, zawiera charakterystyczne absorpcje przy 3500, 1765, 1685, 1650 i 1575 cm"1. Widmo protonowego rezonansu magnetycznego pokazano na rys. 4.PrzykladV. 30 mg „wolnego kwasu" odpowiadajacego M. 139603 rozpuszcza sie w mieszaninie 7 ml tetrahydrofuranu i 1 ml wody. Do mieszaniny wodno-tetrahydrofuranowej dodaje sie 2 ml 2 N wodorotlenku metalu alkalicznego, XOH, po czym calosc miesza sie energicznie wciagu 10minut. Nastepnie dodaje sie 10 ml wody i otrzymany roztwór poddaje sie ekstrakcji 2 razy po 15 ml eteru. Otrzymane ekstrakty eterowe laczy sie i odparowuje, otrzymujac sól metalu alkalicznego odpowiadajaca soli sodowej, M. 139603.W przypadku, gdy X = potas, wytwarza sie sól potasowa o temperaturze topnienia 146 - 150°C, o wzorze czasteczkowym C3 5 Hs 3 0sK,jak to wykazano metoda spektrometrii masowej, wskazujacej jon czasteczkowy M+ o masie 640,335 (obliczono dla C35H53O8K = 640,338), oraz metoda analizy elementarnej: obliczono dla C35H53O8K - C = 65,6%, H = 8,3%. Znaleziono - C = 65,7%, H = 8,5%.W przypadku gdy X = rubid, wytwarza sie sól rubidowa o temperaturze topnienia 95 — 120°C, o wzorze czasteczkowym CssHssOsRb, jak to wykazano metoda spektrometrii masowej, wskazujacej jon czasteczkowy M* o masie 686,279 (obliczono dla C3 5 H5 3 08 Rb = 686,286).Przyklad VI. Zdolnosc M. 139603 do zwiekszania ilosci propionianu kosztem octanu w tresci zwacza owcy wykazuje sie w sposób nastepujacy: 23 owcom, chowanym osobno, podaje sie 2 razy dziennie taka sama diete, zlozona z suchej brykietowanej trawy, w ogólnej ilosci 1 kg/l zwierze/dzien. Zwierzeta podzielone sa losowo na trzy grupy: 13 zwierzat stanowi kontrole ujemna, 5 kontrole dodatnia (z podawaniem monenzyny, znanego modyfikatora metabolizmu w zwa- czu) i 5 zwierzat traktowanych jest M. 139603. Monenzyne iM. 139603 podaje sie doustnie, kazdy w dawce wynoszacej 0,5 ipg/kg w ciagu 4 kolejnych dni. Próbki tresci zwacza pobiera sie zglebnikiem zoladkowym 4 dnia po uplywie 6 godzin od podania zwiazku, a nastepnie oznacza sie w nich octan i propionian w sposób jak wyzej opisano w przykladzie II. Otrzymane wyniki zamieszczono w ponizszej tablicy II.TablicaII Sposób traktowania grup zwierzat Kontrola ujemna Kontrola dodatnia - monenzyna 0,5 mg/kg M. 139603-0,5 mg/kg % molowy ogólnej ilosci VFA octan 69,9 57,1 ' 54,2 propionian 19,8 32,3 39,9 Odpowiedz octanowa dla M. 139603 jest znaczaca przy p<0,02 w porównaniu z kontrola dodatnia - monenzyna, a odpowiedz propioniowa dla M. 139603 jest znaczaca przy p< 0,001 w porównaniu z kontrola dodatnia — monenzyna.8 130950 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego metabolitu Streptomyces, M. 139603, o wzorze czasteczkowym C3 5H5308Na lub pochodzacego od niego odpowiedniego wolnego kwasu o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego soli innych metali alkalicznych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyc¬ es longisporoflavus NCIB 11426 w wodnym podlozu odzywczym zawierajacym zródlo przyswajalnego wegla, w warunkach napowietrzania przez wytrzasanie, w temperaturze 22 — 32°C, po czym tak otrzymana mieszanine fermentacyjna ewentualnie poddaje sie w zwykly sposób ekstrakcji nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalni¬ kiem organicznym, oddziela roztwór organiczny, a nastepnie ewentualnie odparowuje rozpuszczalnik i uzyskany zwiazek M. 139603 w postaci soli sodowej ewentualnie przeprowadza sie w zwykly sposób w wolny kwas, a na¬ stepnie wolny kwas ewentualnie przeprowadza sie w sole innych metali alkalicznych. 2. Srodek do stosowania w hodowli zwierzat przezuwajacych, znamienny tym, ze zawiera nowy metabolit Streptomyces M. 139603, o wzorze czasteczkowym CasHsaOsNa albo pochodzacy od niego wolny kwas o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego sole z innymi metalami alkalicznymi, lacznie ze stalym lub cieklym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem.Dtugose tali /mikrony/ 4000 3000 8)00 ttO Liczba totowa 1000 900 MO /cm -1/ »i|iiiifitM|Mn|iiitfiMf|ifit|iiit|iiif|MiitiiM|iiiimii|im|nnniTTpni|Mfl|tTinim|ifti|ninnn|w £ to 5 1 ..1....!....I....!....!....I....I....I....I ... pfm&D 9 6 7 ..aniiiiiiiiiiiii..i,t,...i....ii...i....i....i....i....i.. ^J 6 5 4 3 2 1 0 e 8 2130 950 4000 3000 Liczbo X 60PPM10CHe50 40 M 20 10 1 70 AJL' i i i —i. PL PL PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego metabolitu Streptomyces, M. 139603, o wzorze czasteczkowym C3 5H5308Na lub pochodzacego od niego odpowiedniego wolnego kwasu o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego soli innych metali alkalicznych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyc¬ es longisporoflavus NCIB 11426 w wodnym podlozu odzywczym zawierajacym zródlo przyswajalnego wegla, w warunkach napowietrzania przez wytrzasanie, w temperaturze 22 — 32°C, po czym tak otrzymana mieszanine fermentacyjna ewentualnie poddaje sie w zwykly sposób ekstrakcji nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalni¬ kiem organicznym, oddziela roztwór organiczny, a nastepnie ewentualnie odparowuje rozpuszczalnik i uzyskany zwiazek M. 139603 w postaci soli sodowej ewentualnie przeprowadza sie w zwykly sposób w wolny kwas, a na¬ stepnie wolny kwas ewentualnie przeprowadza sie w sole innych metali alkalicznych.

2. Srodek do stosowania w hodowli zwierzat przezuwajacych, znamienny tym, ze zawiera nowy metabolit Streptomyces M. 139603, o wzorze czasteczkowym CasHsaOsNa albo pochodzacy od niego wolny kwas o wzorze czasteczkowym C35H54O8 lub jego sole z innymi metalami alkalicznymi, lacznie ze stalym lub cieklym, jadalnym, nietoksycznym rozcienczalnikiem lub nosnikiem. Dtugose tali /mikrony/ 4000 3000 8)00 ttO Liczba totowa 1000 900 MO /cm -1/ »i|iiiifitM|Mn|iiitfiMf|ifit|iiit|iiif|MiitiiM|iiiimii|im|nnniTTpni|Mfl|tTinim|ifti|ninnn|w £ to 5 1 ..1....!....I....!....!....I....I....I....I ... pfm&D 9 6 7 ..aniiiiiiiiiiiii..i,t,...i....ii...i....i....i....i....i.. ^J 6 5 4 3 2 1 0 e 8 2130 950 4000 3000 Liczbo X 60PPM10CHe50 40 M 20 10 1 70 AJL' i i i —i. PL PL PL PL PL PL