SE447910B - Tillvextfremjande forening m. 139603 med molekylformeln c?713?715h?715?713 0?718 na, forfarande for dess framstellning och streptomyces longisporoflavus n c i b 11426 samt jesningsblandning och extrakt erhallna genom od - Google Patents

Description

447 910 2 och nntsvarande form av den "fria syran" :ned nolekylforzneln C35H54O , kännetâclgïat av RF = 0,55 (ca) vid tlnmskütslcrccnatografi på silikagel (Merck's Kieselgel 60F- 254) med tjockleken 0,25 mn, utvecklad med en blandning av' dietyleter, metanol och nyrsyra i volynproportionenla 95:4:1, UV i etanol 274 nm (s=13900) , brett, och and- ra alkalilnetallsalter, som kan härledas därifrån.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstadkorrmes ett sätt att franntälla evan nännaa föreningar eruigt uppfinningen, innebärande att nan ea- lar en M. 139.603-bildande stam av Streptorrlyces longisporoflavus, eller en M.139. 3Eí~ bildande variant eller nmtant därav med väsentligen samma egenskaper, i ett vatten- haltigt innehållande en källa av assimilerbart kol under skakning vid aeroba betingelser vid en temperatur av 22-32°C, extraherar den sålunda erhållna jäsningsblandnmgen med ett med vatten ej blandbart organiskt lösningsmedel på kon- ventionellt sätt och avdrivning av lösningsmedlet, varefter, om så önskas, natrimn- saltet M. 139.603 kan omvandlas till den "fria syran", varefter den "fria syran" med konventionella rnetoder kan omvandlas till andra alkalinetallsalter.

En länplig M. 139.603-bildande stam av s. longisporeflam utgör Ncla 11426, wálken är tillgänglig utan restriktioner från National Collection of Indust- rial aaeteria, njmstty of Agriculture, Fianeriee and Feed, -Ibrry Research statien, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skottland, och som beskrivits på följande sätt: 7 (De använda xnediema har beretts enligt recepten för "the International Streptarlyces Project" (ISP) och föreligger såsom beskrivits av Shirling, E.G. & Gottlieb, D. (International Journal of Systematic Bacteriology, _1_§ (3), 313-340,196š_«).

Inknbatierrabetingelser - ea 2s°c - dagsljus.

IS_P__1_ Tryptonjäst (men tillsatt med agar) dagar - tunn, något fuktig, samnetslfi, ljust gulbrun - undersida ofärgad 13 dagar - tunn, samnetsljk - något granulär, ljust gulbrun - undersida ofärgad w 447 910 ISP 2 Jäst extrakt/maltagarextrakt dagar - 13 dagar - tunn, semmetslik, ljusgrå undersida - mycket svagt gulbrun ljus, upphöjd och fârad, sammetslik, ljusgul/ brun/grå undersida - gulbrun ISP 3 Havremjölagar dagar 13 dagar ISP 4 Oor dagar 13 dagar gles till tunn, sammetslik, ljust gul/grå undersida ej synlig tunn, något upphöjd, sammetslik, ljusgrå undersida ej synlig ganiska salter - startagar tunn, ljust gulbrun, något granulär undersida ofärgad tunn, något fuktig, gulbrun undersida mer eller mindre ofärgad ISP 5 Glycerol - asparaginagar dagar - 13 dagar - ISP 7 Tyr dagar 13 dagar PåjIsP 7 med kraftigare spo ISP 9 dagar tunn, något granulär, ljust gulbrun undersida ofärgad tunn, sammetslik, ljust grå undersida ofärgad osinagar gles till tunn, något granulär, sammetslik, ljust gulbrun/grå undersida ofärgad tunn, sammetslik, något upphöjd, gulbrun undersida - gulbrun/grå får kulturens gulbruna färg med tiden mer blekröd anstrykning, men uppvisar några fläckar med mörkare färg i samband rbildning.

Kolutnyttjande agar Gradering - inget kol - mycket gles, submers - - glykos - tunn/ljus, sammetslik, gulbrun f + - arabinos - gles É - fruktos - tunn, sammetslik, gulbrun + - inositol - mycket gles - - Mannitol - tunn, sammetslik + - Raffinos - mycket gles - - Ramnos - gles i + Xylos - gles 447 910 Allmänt Inga melaniner bildas Inga reversibla pigment bildas Inga lösliga pigment bildas Sporerna bäres i öppna och fasta spiraler, ofta skilda från huvudaxeln av en upprättstående stjälk, som uppbär "hypha“ eller kan- ske en kedja av sporer. Sporerna är svåra att se vid normalmikrosko- piering, då de är mycket nära sammanbundna. Sporväggarna (E.M. på preparat av 4%-igt uranylacetat) är jämna.

Denna stam av S. longisporoflavus är även tillgänglig utan arestriktioner från Centraalbureu voor Schimmelcultures, P.O.Box 273, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Nederländerna, under referensen CBS 312.79.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426- och M. 139.603-bil- dande mutanter därav med väsentligen samma egenskaper.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes en jäsningsblandning, som erhålles genom att man odlar en M. ' 139.603-bildande stam av Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426, eller en M. 139.603-bildande mutant därav, med väsentligen samma egenskaper.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes ett extrakt, som erhålles genom odling av en M. 139.603-bil- dande stam av Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426, eller en M. 139.603-bildande variant eller mutant därav, med väsentligen samma egenskaper, såsom ovan beskrivits, varefter man extraherar jäsnings- blandningen med ett med vatten ej blandbart organiskt lösningsmedel, t.ex. etylacetat.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes föreningen M. 139.603, närhelst den framställts från en kultur av Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426, eller en variant eller mutant därav, med väsentligen samma egenskaper, enligt ovan beskriv- na sätt, eller ett motsvarande sätt.

Den "fria syran", som motsvarar natriumsaltet M. 139.603, kan erhållas genom att man surgör en lösning av M. 139.603 och där- efter extraherar den sura lösningen med ett med vatten ej blandbart organiskt lösningsmedel. Andra alkalimetallsalter kan erhållas genom att man behandlar en lösning av den "fria syran" med en lämplig al- kalimetallhydroxid, t.ex. litiumhydroxid, kaliumhydroxid, cesiumhydr- oxid eller rubidiumhydroxid. Om man använder natriumhydroxid regene- reras M. 139.603, vilket visar att inte någon strukturell förändring är involverad i dessa reaktioner. s 447 910 Såsom ovan angivits uppvisar föreningarna den effekten att de ökar mängden propionsyra i vätskan i rumen. Särskilt ökar mäng- den propionsyra på bekostnad av metan och/eller ättiksyra. Det är känt att detta är en önskvärd effekt vid näringsprocessen hos idiss- lare, eftersom propionsyra är en mycket effektivare prekursor till glykos, varav djuret erhåller energi och tillväxt, än ättiksyra, medan däremot den del av djurets näringsintag, som omvandlas till metan, helt går förlorad för djuret. då metanet avges genom erukta- tion. Modifikationen av ämnesomsättningsprocessen i rumen, som upp- nås med föreningarna enligt uppfinningen har således synnerligen vär- defull verkan och anses öka idisslande djurs tillväxthastighet och energiomvandlingseffektivitet.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes således ett sätt användbart vid uppfödning av idisslande hus- djur att öka tillväxthastigheten och/eller öka energiomvandlingsef- fektiviteten hos idisslande husdjur, kännetecknat av att man till djuren oralt tillför en förening, jäsningsprodukt eller ett extrakt enligt uppfinningen såsom ovan beskrivits.

Vid sättet enligt uppfinningen tillföres lämpligen förening- arna enligt uppfinningen oralt till djuren såsom ett supplement till den normala dieten, dvs i blandning med ordinärt foder i fast form, i pellets eller i saltstenar, löst i dricksvattnet eller för unga djur, t.ex. lamm eller kalvar, löst i helmjölk eller i skummjölk.

Föreningarna enligt uppfinningen är införlivade i foder, pellets, saltstenar, dricksvatten, helmjölk eller skummjölk i sådan mängd att varje djur intar 0,01 - 30 mg/kg kroppsvikt per dag, företrädesvis 0,01 - 10 mg/kg per dag av en förening enligt uppfinningen.

Föreningarna enligt uppfinningen kan alternativt tillföras oralt till djuren i form av en intra-ruminal pellet eller större piller med fördröjd verkan så att djuret resorberar samma mängd per dag av föreningarna enligt uppfinningen.

Man kan ge djuren föreningarna enligt uppfinningen under hu- vudsakligen hela tillväxtperioden, eller under endast en del av till- växtperioden, t.ex. under den tidigaste perioden och/eller under pe- fioden före slakt. Den ökning i tillväxthastighet, som uppnås med sät- tet enligt uppfinningen möjliggör att djur, som uppfödes för kött- produktion, uppnår marknadsvikten eller slaktvikten på kortare tid än normalt eller möjliggör att tyngre djur frambringas mot slutet av den normala tillväxtperioden. Den förbättrade energiomvandlings- effektiviteten uppnås genom att man med metoden enligt uppfinningen 447 910 e möjliggör att behandlade djur uppnår vilken som helst önskad vikt med mindre näringsintag än obehandlade djur, som fått tillvâxa till samma vikt. Vid inklusionsnivåer som är optimalt tillväxtbefrämjan- de kan man inte påvisa någon som helst toxisk effekt med förenin- garna enligt uppfinningen.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes en komposition, kännetecknad av att den innehåller en för- ening, jäsningsprodukt eller ett extrakt enligt uppfinningen till- sammans med ett ätbart icke-toxiskt utspädningsmedel eller bärare i fast eller i flytande form.

Ett lämpligt flytande utspädningsmedel eller bärare är exem- pelvis dricksvatten, helmjölk eller skummjölk.

Ett lämpligt ätbart, icke-toxiskt utspädningsmedel eller bä- rare i fast form är exempelvis ett konventionellt näringsmässigt balanserat näringsämne för idisslare, t.ex. ett typiskt nötboskaps- eller fårfoder bestående av spannmålsprodukter, såsom kornmjöl, majsmjöl eller vetefoder, nöt- och fröprodukter, såsom kakor av de- corticerade malda nötter eller bomullsfrön, eller kakor av extrahe- rade bomullsfrön i förening med små mängder av exempelvis fjäder- mjöl, algmjöl, benmjöl, finmalet benmjöl, krita, salt, karbamid, melass, vitaminer och spårämnen. Ett lämpligt ätbart icke-toxiskt utspädningsmedel eller bärare kan även utgöras av ett dylikt utan energivärde, t,ex. kaolin, talk, kalciumkarbonat, fullerjord, atta- pulguslera, malda ostronskal, eller mald kalksten, eller kan det- samma utgöras av stärkelse eller av laktos.

Kompositionen enligt uppfinningen kan vara i form av ett kompletterande näringsämne för direkt utfodring till djur, varvid det innehåller 5 - 3000 ppm av föreningen enligt uppfinningen i blandning med ett konventionellt foder för idisslare. Kompositionen enligt uppfinningen kan också vara i form av en koncentrerad premix för utspädning med ett konventionellt foder för idisslare såsom ett supplerat foder lämpligt för direkt utfodring. En dylik premix innehåller 0,3 - 50 viktprocent av föreningen enligt uppfinningen i blandning med antingen ett konventionellt, näringsmässigt balanse- rat foder för idisslare, ett inert utspädningsmedel i fast form utan energivärde, t.ex. mald kalksten, eller stärkelse eller laktos.

I alla ovan beskrivna kompositioner enligt uppfinningen kan föreningen enligt uppfinningen ersättas med en jäsningsblandning enligt uppfinningen eller med ett extrakt enligt uppfinningen inne- hållande motsvarande mängd M.l39.603. J 447 910 Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes ett sätt att framställa en komposition i fast form enligt uppfinningen, kännetecknad av att man homogent blandar en förening, jäsningsblandning eller extrakt enligt uppfinningen med ett ätbart, icke-toxiskt utspädningsmedel eller bärare i fast form.

Föreningen med formeln I spädes lämpligen seriellt med ut- spädningsmedlet eller bäraren i två eller flera successiva steg för att säkerställa jämn blandning.

Såsom ovan angivits uppvisar föreningarna enligt uppfinning- en anticoccidial verkan. Detta framgår av ett vävnadsodlingsförsök på njurceller från kyckling, som ympats med sporozoiter av Eimeria tenella enligt det standardtestutförande, som beskrivits i Journal of Parasitology, §§, 664-668 (1972). I detta försök hämmar M.l39.603 tillväxt av sporozoiter i koncentrationen 4 0,001 ppm och uppvisar toxiska effekter på värdcellerna endast i en koncentration av 9 0,33 ppm.

Föreningen M.l39.603 uppvisar även grampositiva antibakteri- ella egenskaper och vid försök har det visat sig att föreningen häm- mar tillväxt av Staphyllococcus aureaus, Streptococcus faecalis, Clostridium welchii och Corynebacterium acne vid en koncentration av < 10 u g per ml, varför föreningen även kan användas som till- växtbefrämjande medel hos icke idisslande djur, t.ex. fjäderfä och svin.

Uppfinningen skall i det följande belysas närmare med hjälp av nedanstående utföringsexempel utan att dock vara begränsad till dessa.

Exempel 1 Streptomycesarten NCIB 11426 odlades i en 500 ml erlenmeyer- kolv på tryptonjästagar som innehöll: Trypton - "Oxoid" L42, 0,5% vikt/volym jästextrakt - “0xoid" L2l, 0,3% vikt/volym, som hade steriliserats i förväg genom upphettning i autoklav 20 mi- nuter vid normaltryck. Mediets pH var ca 7,0. Kolven skakades 120 timmar vid 2500 på en roterande skakapparat.

Kolvarnas innehåll användes för att ympa ytterligare 10 lik- nande kolvar, som var och en innehöll 200 ml av följande medium- glykossirap 3,0% vikt/volym kalciumkarbonat 0,25%vikt/volym natriumklorid 0,5% vikt/volym J 4J47 9')0 s magnesiumsulfatheptahydrat 0,05% vikt/volym koncentrat av spårelement 0,l% volym bakteriologisk pepton ("Oxoid" L37) 0,l% vikt/volym köttextraktpulver ("0xoid" L29, "Lab Lemco“ CDI O,5% vikt/volym dejoniserat vatten ad 100. pH-värdet inställdes på 7,2 och mediet steriliserades i förväg ge- nom upphettning i autoklav 20 minuter vid l20°C. De ympade kolvarna skakades 120 timmar vid 25°C på en roterande skakapparat, varefter flaskornas innehåll slogs samman och pH-värdet inställdes på 3 ge- nom noggrann tillsättning av 0,1-n klorvätesyra. Mediet extrahera- des med etylacetat (2 x 600 ml), extrakten förenades och torkades över natriumsulfat, varefter lösningsmedlet avdrevs. Härvid erhöll man en oljig återstod (290 mg). Etylacetatextraktet renades genom preparativ tunnskiktskromatografi på 2 silikagelplattor (Merck's "Kieselgel" 603-254 ) Q0 x 20 cm, tjocklek 2 mm) med etylacetat som elueringsmedel. Bandet vid RF = 0,39 (ca) skrapades bort från plattorna och extraherades med etylacetat, varefter lösningsmedlet avdrevs. Härvid erhöll man ett visköst gummi, (21 mg), som uppvisa- de in vitro antibakteriell verkan gentemot S. aureus. Denna aktiva fraktion renades ytterligare genom preparativ tunnskiktskromatografi på en silikagelplatta (Merck's "Kieselgel" 60F-254, 20 x 20 cm, tjocklek 0,25 mm), varvid man använde en blandning av dietyleter, metanol och myrsyra i volymförhållandet 95:4:l. Bandet vid RF å 0,55 (ca) skrapades bort från plattan och extraherades med etylace- tat. Efter avdrivning av lösningsmedlet erhöll man ett visköst gum- mi (9 mg). Gummit omvandlades till ett natriumsalt, M.l39.603 genom att man skakade en kloroformlösning med en lösning av natriumhydr- oxid (0,1 molar). Kloroformskiktet frånskildes och torkades över nat- riumsulfat, varefter lösningsmedlet avdrevs. Härvid erhöll man M.139.eo3 eåeem ett feet vitt änme (s mg), emp. 129-13z°c. Infra- rödspektrum (fig. l) uppvisade följande maxima: 3300, l725, 1645, 1565 och 9l5 cmfl. Elementaranalys: Funnet värde, C = 67,5, H = 8,8%. Beräknat värde för C35H5308Na, C = 67,3, H = 8,5%. Mass-spekt- rum: m* = a24,361, beräknat värae för c35H53o8Ne = e24,3e4. RF = 0,39 (tunnskiktskromatografi på Merck's 60F-254),0,25 mm plattor utvecklade med etylacetat, synligt som en brun fläck efter sprej- ning med 3-n svavelsyra och upphettning vid l00oC. Protonmagnetiskt spektrum i deuteriokloroform har återgivits i fig. 2. e 447 910 Exempel 2 M.l39.603-föreningens förmåga att hämma bildningen av metan i rumen hos idisslande djur och att öka mängden propionat på be- kostnad av acetat (Ac/PR) i de flyktiga fettsyror (VFA), som bildas, belyses av följande försök.

Vätska från rumen uppsamlades på konventionellt sätt från två ungtjurar, som utfodrades på samma diet av hö plus koncentrat. Tid- punkten för provtagningen standardiserades så långt det var möjligt och vätskan från de båda djuren slogs samman på 50/50-basis. Större föroreningar avlägsnades genom att man filtrerade den sammanslagna vätskan genom 4 skikt av muslintyg. Filtratet späddes därefter med artificiell rumenvätska i volymförhâllandet 1:3 (som framställts enligt G.L. Bales et al, Journal of Diary Science, äg, 1850 (1976) men utan ättiksyra)och blandningens pH-värde inställdes på 6,9 - 7,0 med en mättad lösning av natriumkarbonat. Prov (50 ml) av denna blandning fördelades i l00 ml koniska kolvar innehållande torkat och malet hö (0,5 g), varefter varje kolv användes för att prova en försöksförening vid en speciell koncentration.

Försöksföreningen sattes till den koniska kolven som en lös- ning i etanol, varefter kolven spolades med koldioxidgas, förslöts med korkpropp och inkuberades 15-16 timmar vid 39°C. Efter l timme infördes en tunn ihålig nål för att minska gastrycket, varefter nå- len drogs ut 30 minuter före inkubationstidens slut. Jäsningen av- bröts därefter genom att man placerade kolven i is och efter l5 mi- nuters kylning analyserade man gasen över vätskan med avseende på förekomst av metan med gaskromatografi. Innehållet i kolvarna filtre- rades därefter genom en i förväg torkad, sintrad glastratt. Tre prov av filtratet analyserades med gaskromatografi med avseende på före- komst av flyktiga fettsyror och vid jämförelse med den tidigare fast- ställda pre-inkubationsnivân hos flyktiga fettsyror kunde man fast- ställa nettomängden flyktiga fettsyror (acetat och propionat), som bildats under inkubationstiden.

Man erhöll följande resultat, uttryckta i % av de erhållna kontrollvärdena då ingen försöksförening användes. Honesin (9lyko- sid från monesiobark) ett känt tillväxtbefrämjande medel med verkan på rumen, användes som positiv kontroll. 447 910 10 Förhållandet Metan, % i för- acetat/propionat, Koncentration hållande till % i förhållande Förening ng per ml kontrollprovet till kontrollprovet M.l39.603 1,0 -58 62 0,3 72 64 0,1 87 70 Monesin 1,0 67 79 0,3 90 87 0,1 100 I 95 Exemgel 3 Streptomyces longisporoflavus NCIB ll426 odlades som sned- kulturer på ISP-7 agar (45 ml) 7 dagar vid 30°C. Tre dylika sned- kulturer skrapades individuellt ned i tre kolvar med 100 ml sterilt vatten, varefter de bildade suspensionerna användes för att ympa tre 2 l kolvar, som var och en innehöll 1 liter av följande medium: glycerol 3,0% vikt/volym bakteriologisk pepton '("Oxoid" L-37) 2,0% vikt/volym KHZPO4 0,024% vikt/volym MgSO4.7H2O 0,02% vikt/volym koncentrat av spårelement 0,l% volym krita 0,l% vikt/volym dejoniserat vatten ad l liter som hade steriliserats i förväg genom upphettning i autoklav vid normalt tryck l/2 time, varvid pH-värdet var ca 6,7.

De tre sålunda preparerade 2 l kolvarna skakades vid 3000 3 dagar på en roterande skakapparat. Innehållet i de tre kolvarna förenades därefter och användes för att ympa en jäsningsbehållare i rostfritt stål innehållande 30 1 steriliserat medium, som till- retts på följande sätt: 'glycerol " 3,0% vikt/volym sojamjöl BSP 70 l,0% vikt/volym krita 0,25% vikt/volym cerelos 3,0% vikt/volym NaCl 0,5% vikt/volym MgSO4.7H2O 0,05% volym koncentrat av spârelement 0,l% vikt/volym destillerat vatten ad 30 liter. 11 447 910 Innehållet i jäsningsbehållaren omrördes 70 timmar vid 3000, varvid man använde en turbin med 4 platta blad, som roterade med 350 varv/minut och luftades med 15 l luft/minut. Man hade satt 30 ml "Silcolapse“ , ett silikonantiskummedel, till blandningen före upphettningen i autoklav. pH-värdet vid tillvaratagandet var 7,9, och den bildade jäsningsblandningen (22 liter) blandades och skaka- des med motsvarande volym etylacetat. Efter 30 minuter uppdelades blandningen i en separercentrifug, varefter etylacetatextraktet (ca 18 1) torkades över vattenfritt natriumsulfat och filtrerades.

Filtratet koncentrerades i vakuum, varvid man erhöll en oljig åter- " stod (l0,7 g).

M.l39.603 erhölls från koncentratet på följande sätt: Den ol- jiga återstoden (lO,7 g) löstes i minimimängden etylacetat, varef- ter den bildade lösningen sattes till toppen av en kolonn av neutral aluminiumoxid (Woelm N, 200 g. 18 x 4 cm), beredd som en uppslamning med etylacetat. Kolonnen eluerades först med etylacetat och därefter med en 50 volymprocentig blandning av etylacetat och metanol och .slutligen med metanol. Följande fraktioner uppsamlades då lösnings- medelsfronten hade lämnat kolonnen: Fraktion nr. _ Volym Elueringsmedel l 150 ml _ etylacetat 2 150 ml etylacetat 3 150 ml etylacetat 4 150 ml etylacetat 150 ml etylacetat - metanol 50% volym 6 150 ml etylacetat - metanol 50% volym 7 150 ml etylacetat - metanol 50% volym 8 150 ml etylacetat - metanol 50% volym 9 200 ml metanol 200 ml metanol ll 200 ml metanol.

Fraktionerna 7-ll visade sig, genom tunnskiktskromatografi på silikagel, utvecklad med 20 volymprocent aceton i petroleumeter (kokp. 60-80°C), innehålla M.l39.603 jRF^I0,22) och de kombinerades sålunda och indunstades, varvid man erhöll ett visköst gummi (840 mg), som renades ytterligare med preparativ tunnskiktskromatografi på silika (Merck's "Kieselgel 60F250" , 40 x 20 cm, tjocklek 2 mm), varvid man såsom elueringsmedel använde en blandning av 20 volymproceät ace- 4117 9'|0 12 ton i petroleumeter (kokp. 60-80°C). Det UV-synliga bandet vid RF ~J0,22 (ca) skrapades bort från de båda plattorna och extraherades med etylacetat. Extraktet indunstades till torrhet, varvid man er- höll ett visköst gumi (240 mg), som kristalliserade vid tillsätt- ning av petroleumeter (kokp. 60-80°C). Detta ämne omkristallisera- des från petroleumeter (kokp. 60-80°C), varvid man erhöll M.l39.603 som färglösa kristaller, som avfiltrerades och torkades (210 mg), smp. 176-l78°C..Ultraviolettspektrum i etanol visade adsorption vid 234 nm (e = l2900)och 272 nm (e = 10800). Infraröd och kärnmag- netiskt resonansspektra var identiskt med dem, som erhållits från produkten enligt exempel l. 7 Exempel 4 M.l39.603 (40 mg) löstes i en blandning av aceton (10 ml) 'och vatten (2 ml) och l ml 2-n klorvätesyra tillsattes, varefter blandningen kraftigt omrördes 5 minuter. Destillerat vatten (20 ml) (tillsattes, varefter blandningen extraherades med diklormetan (2 x _l0 ml). Det organiska skiktet frånskildes och tvättades med 2-n klor- vätesyra, efterföljt av destillerat vatten. Diklormetanskiktet kon- centrerades därefter, varvid man erhöll ett visköst gummi (33 mg) av den "fria syra", som motsvarar M.l39.603. Elementaranalys: Fun- net värde, C é 69,5, H = 9,1. Beräknat värde för C35H54O8, C = 69,8, H = 9,0. I.R.-spektrum i nujololja såsom framgår av fig. 3, innehål- lande karakteristisk absorption vid 3500, 1765, 1685, 1650, 1575 cm_l.

Protonmagnetiskt resonansspektrum i deuteriokloroform framgår av fig. 4.

Exempel 5 Den "fria syran" som.motsvarar M.3l9.603 (30 mg) löstes i en blandning av tetrahydrofuran (7 ml) och vatten (1 ml). En alkali- metallhydroxid XOH (2-n, 2 ml) sattes till den vattenhaltiga tetra- hydrofuranblandningen, som därefter kraftigt omrördes 10 minuter.

Man tillsatte vatten (10 ml), varefter lösningen extraherades med eter (2 x l5 ml). Eterextrakten kombinerades och indunstades, var- vid man erhöll alkalimetallsalter, som motsvarade natriumsaltet M.139.so3. g n Då X betecknar kalium;.bildas kaliumsaltet, smp. 146-l50°C, molekylformel C35H53O8.K såsom utvisas av mass-spektrometri, som uppvisar en molekyljon, M med massan 640.335 (beräknat värde för H O K = 640,338), och av elementaranalys: Funnet värde, C = C35 53 s' 65,7%, H = 8,5%, beräknat värde för H35H5308.K, C = 65,6%, H =18,3%). 13 447 91Û Då X betecknar rubidium bildas rubidiumsaltet, smp. 95-l20°C, molekylformel C35H5308.Rb, såsom utvisas av mass-spektrometri, som uppvisar en molekyljon, M med massan 686,279 (beräknat värde för C35H53O8.Rb = 686,286).

Exempel 6 Förmågan hos M.l39.603 att öka mängden propionat på bekost- nad av acetat i rumenvätskan hos får belystes på följande sätt: 23 får hölls var för sig och utfodrades med samma diet om l kg torkat gräs i kuber dagligen per djur, uppdelat på två givor per dag. Djuren uppdelades slupvis på 13 negativa kontroller, 5 posi- tiva kontroller, med monesin, en känd rumenmanipulator, och 5 som fick doser av M.l39.603. De behandlade djuren erhöll monesin eller M.l39.603 oralt i en mängd av 0,5 mg/kg fyra dagar i följd, varef- ter man uppsamlade prover på rnmenvätskan genom matstrupen 6 tim- mar efter behandlingen den fjärde dagen. Proverna med rumenvätskan analyserades därefter med avseende på förekomst av acetat och pro- pionat såsom beskrivits i exempel 2. Man erhöll följande resultat: Totalmängd flyktiga fria fettsyror i mol-% Behandlingsgrupper acetat propionat Negativ kontroll 69,9 19,8 Postiv kontroll - monesin 9,5 mg/kg 57,1 32,3 M.l39.603 - 0,5 mg/kg 54,2 39,9 Acetatsvaret för M.l39.603 är signifikativt vid p < 0,02 i jäm- förelse med den positiva kontrollgruppen, monesin och propionatsva- ret för M.l39.603 är signifikativt vid p < 0,001 i jämförelse med den positiva kontrollen, monesin.

Claims (6)

4 447 910 I Patentkrav

1. Tillväxtbefrämjande kemisk förening M.139603, med följande karakteristiska egenskaper: a) molekylformel C35H5308Na såsom framgår av mass-spektrometri, som uppvisar en molekyljon, M med massan 624361 (beräknat värde för C35H53O8Na = 624 364), och av elementaranalys: C = 67,5, H = 8,8% (beräknat värde för C35H5308Na, C = 67,3, H = 8,5%), b) infrarödspektrum i nujololja, fig. 1, innehållande karakteris- tisk absorption vid 3300, 1725, 1645, 1565 och 915 cm-1 I c) protonmaqnetiskt resonansspektrum i deuteriokloroform, fi§. 2, d) ultraviolett spektrum i etanollösning uppvisar karakteristisk 12900) och 272 nm (6 = 10800), absorption vid 234 nm (e e) smp. 176-s°c, 23 D = -s2° (C = 0,2 1 f) fal metanol) g) en kemisk strukturformel som senare visat sig vara: .och motsvarande form av den "fria syran" med molekylformeln C35H54O8, k ä n n e t e c k n a d av RF = 0,53 (ca) vid tunnskiktskromato- grafi på silikagel (Merck's Kieselgel 60F-254), med tjockleken 0,25 mm, utvecklad med en blandning av dietyleter, metanol och myr- 13900), brett, och andra alkalimetallsalter, som kan härledas därifrån. syra i volymproportionerna 95:4:1, UV i etanol 274 nm (s = 447 910

2. Sätt att framställa föreningarna enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a t av att man odlar en M.139603-bildande stam av Strep- tomyces longisporoflavus, varav en stam deponerats som NCIB 11426, i ett vattenhaltigt näringsmedium innehållande en källa av assimi- lerbart kol under skakning vid aeroba betingelser vid en temperatur av 22-32°C, extraherar den sålunda erhållna jäsningsblandningen med ett med vatten ej blandbart organiskt lösningsmedel på konventio- nellt sätt och avdrivning av lösningsmedlet, varefter, Om så önskas, natriumsaltet M.139603 kan omvandlas till en “fri syra", varefter den "fria syran" med konventionella metoder kan omvandlas till and- ra alkalimetallsalter.

3. Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426- 0Ch M. 139603-bil- dande mutanter därav, med väsentligen samma egenskaper.

4. Jäsningsblandning, k ä n n e t e c k n a d av att den erhål- lits genom odling av en M.139603-bildande stam av Streptomyces lon- gisporoflavus NCIB 11426, eller en M. 139603-bildande mutant därav med väsentligen samma egenskaper, i ett vattenhaltigt näringsmedium innehållande en källa av assimilerbart kol under aeroba betingel- ser, skakning vid en temperatur av mellan 22° och 32°C samt antin- gen avfiltrering och torkning av det fasta mycelet eller avdriv- ning av de i jäsningsprocessen använda lösningsmedlen för erhållan- de av de totala fastämnena från jäsningen.

5. Extrakt, k ä n n e t e c k n a t av att det framställts ge- nom extraktion av jäsningsblandningen enligt krav 4 med ett i vat- ten ej blandbart, organiskt lösningsmedel, avskiljning av lösning- en ävorganiskt lösningsmedel och avdrivning av lösníngsmedlet.

6. Komposition med tillväxtbefrämjande egenskaper, k ä n n e - t e c k n a d av att den innehåller en förening enligt krav 1, en jäsningsblandning enligt krav 4 eller ett extrakt enligt krav 5 tillsammans med ett ätbart, icke-toxiskt utspädningsmedel eller bä- rare i fast eller flytande form.