CH649780A5

CH649780A5 - Streptomyces-metabolit.

Info

Publication number: CH649780A5
Application number: CH7107/79A
Authority: CH
Inventors: David Huw Davies; Geoffrey Lightfoot Floy Norris
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1978-08-03
Filing date: 1979-08-02
Publication date: 1985-06-14
Also published as: BG40659A3; NO156201B; YU188079A; NO792537L; KE3433A; AT367450B; DK325179A; MY8500754A; AU530316B2; SG54784G; CS221514B2; ZW13679A1; NO156201C; NZ191105A; ATA160081A; FI66184C; IT7949943A0; JPS5551097A; FI792420A; DK151257C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Metaboliten, M. 139 603, der durch aerobe Kultivierung von Streptomyces longisporoflavus erhalten werden kann. Dabei handelt es sich offensichtlich um eine neue Verbindung der Formel 60 C35H53OgNa. M. 139 603 ist ein Natriumsalz. Die Erfindung bezieht sich auch auf die entsprechende «freie Säure» und auf die anderen Alkalimetallsalze, die davon erhalten werden können. Die Verbindungen sind dazu in der Lage, den Anteil an Methan, der bei der Fermentation im Rumen erzeugt wird, 65 zu verringern und den Anteil an Propionsäure in der Rinder-rumenflüssigkeit zu steigern, weshalb sie wachstumsfördernde Eigenschaften bei Wiederkäuern besitzen dürften, da es allgemein bekannt ist, dass andere chemische Verbindun

gen, welche den Anteil an Propionsäure in der Rumenflüssig-keit erhöhen, eine erhöhte Wachstumsgeschwindigkeit ergeben, wenn sie an Rinder oder Schafe verabreicht werden. Die neuen erfindungsgemässen Verbindungen besitzen ausserdem eine antibakterielle Aktivität gegenüber grampositiven Organismen. Schliesslich besitzen sie auch bei einem in vitro-Test eine Anticoccidienaktivität gegen Eimeria tenella.

Gegenstand der Erfindung ist also die Verbindung M.139 603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist:

a) Molekularformel C35H5308Na, gemessen durch Mas-senspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit der Masse 624,361 zeigt - berechnet für C35H5308Na=624,364, und durch Elementaranalyse: C=67,5, H = 8,8 % - berechnet für C35H5308Na - C=67,3, H=8,5%;

b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300,1725,1645, 1565 und 915 cm""1;

c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deute-riochloroform wie in Figur 2 gezeigt;

d) Ultraviolettspektrum in Methanollösung zeigt eine charakteristische Absorption bei 234 nm—s = 12 900, und 272nm-e 10 800;

e) Schmelzpunkt 176-178 °C;

f) [a]^ = - 82°, c=0,2 in Methanol;

und die entsprechende «freie Säureform» dieser Verbindung mit der Molekularformel C35H5408, die gekennzeichnet ist durch Rf=0,55 bei Dünnschichtchromatographie auf Sili-cagel (Merck «Kieselgel 60F-254» - Warenzeichen), Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis 95:4:1; UV in Ethanol 274 nm (s = 13 900), breit; sowie die davon ableitbaren Alkalimetallsalze. Gemäss der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der obigen erfindungsgemässen Verbindung vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen M. 139 603-bildenden Stamm von Streptomyces longisporoflavus in einem wässrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 32 °C kultiviert, das so erhaltene Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und das Lösungsmittel eindampft, worauf man ggf. das Natriumsalz, M.139 603, in die «freie Säure» überführt und die «freie Säure» ggf. in ein anderes Alkalimetallsalz überführt.

Ein geeigneter M.139 603-bildender Stamm von S. longisporoflavus ist derjenige, der am 19. Juli 1978 bei NCIB, d.h. bei der National Collection of Industriai Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, hinterlegt worden und dort erhältlich ist und die folgende Schreibung aufweist:

[Die verwendeten Medien wurden gemäss den Rezepten für das 'International Streptomyces Project' (ISP) hergestellt und sind von Shirling E.G. & Gottlieb D. (International Journal of SystematicBacteriology, 16(3), 313-340, 1966) beschrieben],

Bedingungen für die Inkubation - ca. 25 °C

- Tageslicht. ISP1 Trypton-Hefe (aber mit zugesetztem Agar).

5 Tage - Dünn, etwas feucht, samtig, bräunlich.

- Unterseite ungefärbt.

13 Tage - Dünn, samtig, etwas körnig, bräunlich.

- Unterseite ungefärbt.

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ISP2 Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar.

5 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

- Unterseite sehr blass, gelbbraun.

13 Tage - Sauber, erhaben und gerunzelt, samtig, hell-5 gelb/braun/grau.

- Unterseite rehbraun.

ISP3 Hafermehl-Agar.

5 Tage - Spärlich bis dünn, samtig, hellgelb/grau.

- Unterseite nicht sichtbar.

io 13 Tage - Dünn, etwas erhaben, samtig, hellgrau.

- Unterseite nicht sichtbar.

ISP4 Anorganische Salze / Stärke-Agar.

5 Tage - Dünn, bräunlich, etwas körnig.

- Unterseite ungefärbt.

i513 Tage - Dünn, etwas feucht, rehbraun.

- Unterseite mehr oder weniger ungefärbt. ISP5 Glycerin/Asparagin-Agar.

5 Tage - Dünn, etwas körnig, bräunlich.

- Unterseite ungefärbt.

2013 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

- Unterseite ungefärbt.

ISP7 T yrosin-Agar.

5 Tage spärlich bis dünn, etwas körnig, samtig, bräunlich/grau.

25 - Unterseite ungefärbt.

13 Tage - Dünn, samtig, etwas erhaben, rehbraun.

- Unterseite rehbraun/grau.

Bei ISP7 wird beim Altern die Kultur im allgemeinen rötlichbraun, zeigt aber einige Bereiche dunklerer Färbung zusam-3o men mit stärkerer Sporulation. ISP9 Kohlenstoffausbeutungs-Agar. Einstufung

15 Tage - Kein Kohlenstoff- sehr spärlich,

submers —

- Glucose- Dünn, sauber, samtig,

35 rehbraun +

- Arabinose- Spärlich ±

- Fructose-Dünn, samtig, rehbraun +

- Inosit-Sehr spärlich -

- Mannit-Dünn, samtig + 40 - Raffinose- Sehr spärlich —

- Rhamnose - Spärlich ±

- Xylose - Spärlich ±

Allgemein

45 Es werden keine Melanine gebildet. An der Unterseite werden keine Pigmente gebildet. Es werden keine löslichen Pigmente gebildet. Die Sporen werden in offenen und dichten Spiralen erzeugt, die oftmals von der Hauptsache durch ein gerades Stück getrennt sind, das «Hyphen» oder u.U. Sporen-50 ketten trägt. Die Sporen selbst sind durch das normale Mikroskop schwierig zu sehen, da sie sehr dicht miteinander verbunden sind. Die Sporenwandungen (E.M. auf 4% Uranyl-acetatpräparat) sind glatt.

Dieser Stamm von S. longisporoflavus ist auch ohne Be-55 schränkung vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, PO Box 273, Oosterstraat 1,3740 AG Baarn, Netherlands, unter der Bezeichnung CBS 312.79 erhältlich.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 als Mittel zur Ausführung des 60 oben definierten Verfahrens.

Die dem Natriumsalz, M. 139 603, entsprechende freie Säure kann dadurch erhalten werden, dass man eine Lösung von M.139 603 ansäuert und die saure Lösung mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. 65 Andere Alkalimetallsalze können dadurch erhalten werden, dass man eine Lösung der freien Säure mit einem entsprechenden Alkalimetallhydroxid, wie z.B. Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Caesiumhydroxid oder Rubidiumhydr

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oxid, behandelt. Wenn Natriumhydroxid verwendet wird, dann wird M.139 603 regeneriert, was demonstriert, dass durch diese Reaktionen keine strukturellen Änderungen entstehen.

Wie oben bereits festgestellt, besitzen die Verbindungen die Wirkung, dass sie den Anteil an Propionsäure in der Ru-menflüssikeit und insbesondere den Anteil an Propionsäure auf Kosten von Methan und/oder Essigsäure steigern. Dies ist bekanntermassen ein nützlicher Effekt bei der Wiederkäuerernährung, da Propionsäure ein wesentlich wirksamerer Vorläufer für Glucose ist, aus welcher das Tier seine Energie und sein Wachstum bezieht, als dies bei Essigsäure der Fall ist. Der Teil der Tiernahrung, der in Methan überführt wird, geht ganz einfach durch die Bildung von Blähungen verloren. Somit ist also die Änderung des Rumenstoffwechsels, der durch die erfindungsgemässen Verbindungen erreicht wird, ein äusserst nützlicher Effekt. Es ist anzunehmen, dass hierdurch die Wachstumsgeschwindigkeit und die Nahrungsausnutzung bei Wiederkäuern erhöht werden.

So wird also gemäss der Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Mast von domestizierten Wiederkäuern vorgeschlagen, um deren Wachstumsgeschwindigkeit und/oder Ausnutzung der Nahrung zu steigern, welches darin besteht, dass man den Tieren eine erfmdungsgemässe Verbindung, wie sie oben beschrieben wurde, oral verabreicht.

Beim soeben erwähnten Verfahren werden die erfindungsgemässen Verbindungen vorzugsweise oral den Tieren als Ergänzung zu deren normalen Nahrung verabreicht, d.h. also in Mischungen mit einer gewöhnlichen festen Nahrung, in Nahrungswürfeln oder in Salzlecksteinen, als Lösung im Trinkwasser oder, bei jungen Tieren, wie z.B. Lämmern oder Kälbern, als Lösung in Vollmilch oder Magermilch. Die erfindungsgemässen Verbindungen werden in die Nahrung, die Nahrungswürfel, die Salzlecksteine, das Trinkwasser, die Vollmilch oder die Magermilch vorzugsweise in einem solchen Ausmass einverleibt, dass jedes behandelte Tier 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 30 mg/kg Körpergewicht je Tag, vorzugsweise 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg je Tag, einer erfindungsgemässen Verbindung erhält.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können alternativ oral an Tiere in Form von intraruminalen Pellets oder Pillen mit langsamer Wirkstoffabgabe verabreicht werden, so dass das Tier eine ähnliche Menge je Tag der erfindungsgemässen Verbindung aufnimmt.

Die Tiere können die erfindungsgemässen Verbindungen während praktisch ihrer ganzen Wachstumsperiode oder nur während eines Teils ihrer Wachstumsperiode erhalten, beispielsweise während einer frühen Periode und/oder während einer Periode vor dem Schlachten. Die Zunahme der Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das erfmdungsgemässe Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, Tiere auf Fleisch zu züchten, so dass sie in einer kürzeren Wachstumszeit auf Marktgewicht oder Schlachtgewicht als normal gebracht werden können. Das Verfahren ermöglicht es jedoch auch, schwerere Tiere am Ende einer normalen Wachstumsperiode zu erzielen. Die verbesserte Nahrungsausnützung, die durch das Mastverfahren erreicht wird, ermöglicht es, dass die behandelten Tiere ein bestimmtes Gewicht erreichen, während sie weniger Nahrung als unbehandelte Tiere, die auf das gleiche Gewicht gezüchtet werden, verbrauchen. Bei optimalen Wachstumsförderungskonzentrationen wurden keinerlei Anzeichen irgen-welcher giftigen Wirkungen durch die erfindungsgemässen Verbindungen beobachtet.

Es wird deshalb gemäss der Erfindung weiterhin eine Zusammensetzungvorgeschlagen, die eine erfmdungsgemässe Verbindung zusammen mit einem festen oder flüssigen, verzehrbaren, nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Ein geeignetes flüssiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch.

Ein geeignetes festes, verzehrbares, nicht-giftiges Verdün-5 nungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise eine herkömmliche nährwertmässig ausgewogene Wiederkäuernahrung, wie z.B. eine typische Rinder- oder Schafsnahrung, die aus Getreideprodukten, wie z.B. Gerstenmehl, Maismehl oder Weizenschrot, Nüssen und Samenprodukten, wie z.B. io Kuchen aus dekortierten gemahlenen Nüssen oder Baumwollsamen oder extrahierten Baumwollsamen, gemeinsam mit kleineren Mengen von beispielsweise Federmehl, Seetangmehl, Knochenmehl, Kreide, Salz, Harnstoff, Melassen, Vitaminen und Spurenmineralien bestehen. Es kann sich aber i5 auch um ein inertes festes Verdünnungsmittel oder Trägermittel ohne Nährwert handeln, wie z.B. Kaolin, Talkum, Calciumcarbonat, Fuller'sche Erde, Attapulgitton, gemahlene Austernschalen oder gemahlener Kalkstein. Es kann sich auch um Stärke oder Lactose handeln. 20 Die erfmdungsgemässe Zusammensetzung kann die Form einer Ergänzungsnahrung zum direkten Verfüttern an Tiere aufweisen, in welchem Fall sie 5 ppm bis 3000 ppm der erfindungsgemässen Verbindung in Mischung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung enthält. Sie kann auch die Form 25 eines konzentrierten Vorgemischs für die Verdünnung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung aufweisen, um eine ergänzte Nahrung herzustellen, die sich für das direkte Verfüttern eignet. Ein solches Vorgemisch wird 0,3 bis 50% (G/G) der erfindungsgemässen Verbindung in Mischung mit 3o entweder einer herkömmlichen, nährwertmässig ausgewogenen Wiederkäuernahrung oder einem festen inerten Verdünnungsmittel ohne Nährwert, wie z.B. gemahlener Kalkstein, oder Stärke oder Lactose enthalten.

Wie oben bereits festgestellt, besitzen die erfindungsge-35 mässen Verbindungen eine Aktivität gegen Coccidien. Diese wird durch einen Gewebskulturtest bei Hühnernierenzellen, die mit Sporozoiten von Eimeria tenella beimpft werden, durch das Standardtestverfahren, das in Journal of Parasito-logy, Bd. 58, S. 664-668 (1972) beschrieben ist, demonstriert. 40 Bei diesem Test verhindert M.139 603 das Wachstum der Sporozoiten bei einer Konzentration von < 0,001 ppm. Ausserdem zeigt M.139 603 toxische Wirkungen bei den Gastzellen nur bei einer Konzentration von > 0,33 ppm.

Die Verbindung M. 139 603 besitzt ausserdem gramposi-45 tive antibakterielle Eigenschaften. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass sie das Wachstum von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Clostridium welchii und Coryne-bacterium acne bei einer Konzentration von ^ 10 ng/ml verhindert, weshalb sie als Wachstumsförderer bei Nichtwieder-5° käuern, wie z.B. Geflügel und Schweinen, verwendet werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

55

Beispiel 1

Die Streptomycesart NCIB 11 426 wurde in einem 500 ml-Erlenmayerkolben auf Trypton/Hefe-Agar gezüchtet, der folgendes enthielt:

60

Trypton- «Oxid» L42 (Warenzeichen) 0,5% G/V

Hefeextrakt - «Oxoid» L21 (Warenzeichen) 0,3 % G/V

und der vorher in einem Autoklaven während 20 min bei 65 Normaltemperatur vorsterilisiert worden war. Der pH des Mediums betrug annähernd 7,0. Der Kolben wurde 120 st läng auf einem Rotationsschüttler bei 25 °C geschüttelt. Der Inhalt des Kolbens wurde dann dazu verwendet, wei-

5

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tere 10 ähnliche Kolben zu beimpfen, von denen jeder 200 ml des folgenden Mediums enthielt:

Glucosesirup Calciumcarbonat Natriumchlorid Magnesiumsulfat-heptahydrat Spurenelementekonzentrat Bakteriologisches Pepton («Oxoid» L37-Warenzeichen)

Rinderextraktpulver («Oxoid» L29, «Lab Lemco»-Warenzeichen)

Entsalztes Wasser

3,0 % G/V

0,25 % G/V

0,5 % G/V

0,05 % G/V

0,1 % V/V

0,1 % G/V

0,5 % G/V auf 100

Der pH wurde auf 7,2 eingestellt, und das Medium wurde in einem Autoklaven während 20 min bei 120 °C vorsterilisiert. Die beimpften Kolben wurden bei 25 °C 120 st auf einem Rotationsschüttler geschüttelt, und der Inhalt der Kolben wurde dann zusammengeschüttet und durch sorgfältige Zugabe von 0,1 n Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Das Medium wurde 2mal mit 600 ml Ethylacetat extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei ein öliger Rückstand (290 mg) erhalten wurde.

Der Ethylacetatextrakt wurde durch präparative Dünn-schichtchromatografie auf zwei Silicaplatten (Merck «Kieselgel» 60F-254-Warenzeichen, 20 x 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluiermittel gereinigt. Die Bande bei Rf=0,39 (annähernd) wurde von den Platten abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, worauf das Lösungsmittel abgedampft wurde, so dass 21 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden. Dieser zeigte in vitro eine antibakterielle Aktivität gegen S. aureus. Diese aktive Fraktion wurde weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silicagel-platten (Merck «Kieselgel» 60F-254,20 x 20 cm, 0,25 mm dick) unter Verwendung eines Gemisches aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis von 95:4:1 gereinigt. Die Bande bei RF=0,55 (annähernd) wurde von der Platte abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, wobei nach Abdampfen des Lösungsmittels 9 mg eines viskosen Gummis zurückblieben. Der Gummi wurde in das Natriumsalz, M.139 603, überführt, indem eine Chloroformlösung mit einer Lösung von 0,1 m Natriumhydroxid geschüttelt wurde. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei 8 mg M.139 603 als weisser Feststoff erhalten wurden, Fp 129-132 "C. Das Infrarotspektrum (Figur 1)

zeigte die folgenden Maxima: 3300, 1725,1645,1565 und 915 cm-1. Elementaranalyse: Gefundene=67,5, H = 8,8%; berechnet für C35H5308Na C=67,3, H = 8,5. Massenspektrum: M+ = 624,361, berechnet für C35H53O8 • Na=624,364. RF=0,39 (Dünnschichtchromatografie auf Merck 60F-254-Platten mit einer Dicke von 0,25 mm, entwickelt mit Ethylacetat, sichtbar gemacht als brauner Fleck nach Bespritzen mit 3 n Schwefelsäure und Erhitzen auf 100 "C. Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Figur 2 angegeben.

Pharmakologischer Versuch

Das Vermögen von M.139 603, die Bildung von Methan im Rumen von Wiederkäuern zu hemmen und den Anteil des Propionats auf Kosten des Acetats (Ac/Pr) in den gebildeten flüchtigen Fettsäuren (VFA) zu erhöhen, wird wie folgt demonstriert:

Rumenflüssigkeit wird in der üblichen Weise von zwei Stieren gesammelt, die mit der gleichen Heu-und-Konzentrat-Nahrung gefüttert werden. Die Probezeit wird so weit wie möglich standardisiert, und die Flüssigkeit von den beiden

Tieren wird auf einer 50/50-Basis vereinigt. Grosse teilchen-förmige Stoffe werden durch Filtrieren der gesammelten Flüssigkeit durch vier Schichten eines Muslin-Tuchs entfernt. Das Filtrat wird dann im Verhältnis von 1 Volumen Filtrat zu 3 5 Volumina künstlicher Rumenflüssigkeit verdünnt (hergestellt nach der Vorschrift von G.L. Bales et al., Journal of Diary Science, 1976, Bd. 59, S. 1850, wobei jedoch die Essigsäure weggelassen wird), und der pH des Gemisches wird mit gesättigter wässriger Natriumcarbonatlösung auf 6,9-7,0 einge-xo stellt. Proben von 50 ml dieses Gemisches werden in konische 100 ml-Kolben, die 0,5 g getrocknetes gemahlenes Heu enthalten, abgegeben, und jeder Kolben wird dazu verwendet, eine Testverbindung bei einer bestimmten Konzentration zu testen.

15 Die Testverbindung wird dem konischen Kolben als Lösung in Ethanol zugegeben, der Kolben wird mit Kohlendioxidgas gespült, mit einer Suba-Dichtung zugestöpselt und 15-16 st bei 39 °C inkubiert. Nach 1 st wird eine Nadel mit einer engen Bohrung durch die Suba-Dichtung eingeführt, um 20 den Gasdruck wegzunehmen, worauf die Nadel 30 min vor Beendigung der Inkubation herausgezogen wird. Die Fermentation wird dann abgebrochen, indem der Kolben in Eis gestellt wird, und nach einer Kühlzeit von 15 min wird das Gas über der Flüssigkeit durch Gaschromatografie auf 25 Methan analysiert. Die Kolbeninhalte werden dann durch einen vorher getrockneten gesinterten Glastrichter filtriert.

Drei Proben des Filtrats werden durch Gaschromatografie auf VFA analysiert, und durch Vergleich mit den vor der Inkubation bestimmten VFA-Werten netto die VFA (Acetat 30 und Propionat), die während der Inkubation gebildet werden, bestimmt.

Es wurden die folgenden Resultate erhalten, ausgedrückt als % von Vergleichswerten, die erhalten werden, wenn keine Testverbindung verwendet wird. Monensin, ein bekannter 35 Wachstumsförderer, der aufgrund eines Effekts auf den Rumen wirkt, ist als positiver Vergleich beigeschlossen.

Verbindung Konzentration

40 ng/ml

Methan-% im Verhältnis zum Ver-

Acetat/Propio-nat-Verhältnis-% im Verhältnis

gleich zum

M.139 603

1,0

58

62

0,3

72

64

45

0,1

87

70

Monensin

1,0

67

79

0,3

90

87

0,1

100

95

50

Beispiel 2

Steptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 wurde auf Schrägkulturen auf ISP-7-Agar (45 ml) 7 Tage lang bei 30 °C 55 gezüchtet. Drei Schrägkulturen wurden einzeln in drei Kolben mit 100 ml sterilem Wasser gekratzt, und die so erhaltenen Suspensionen wurden dazu verwendet, drei 21-Kolben zu beimpfen, von denen jeder 11 des folgenden Mediums enthielt:

60

Glycerin

Bakteriologisches Pepton

(«Oxoid» L37-Warenzeichen) 2,0 % G/V KH2P04 0,024 % G/V

65 MgS04 • 7H20 0,02 % G/V

Spurenelementekonzentrat 0,1 % V/V

Kreide 0,1 % G/V

Entsaltzes Wasser auf 11

3,0 % G/V

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6

welches in einem Autoklaven bei Normaldruck während1 /2 st vorsterilisiert worden war, wobei der pH annähernd 6,7 betrug.

Die drei 21-Kolben wurden 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 30 °C geschüttelt. Die Inhalte der drei Kolben wurden dann vereinigt und dazu verwendet, einen Fermenta-tor aus rostfreiem Stahl, der 301 eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, zu beimpfen:

Glycerin 3,0 % G/V

Sojamehl BSP 70 1,0 % G/V

Kreide 0,25 % G/V

Cerelose 3,0 % G/V

NaCl 0,5 % G/V

Mg04 • 7H20 0,05 % G/V

Spurenelementekonzentrat 0,1 %V/V

Destilliertes Wasser auf 301

Der Inhalt des Fermentators wurde 70 st bei 30 °C gerührt, wobei eine Turbine mit 4 flachen Schaufeln verwendet wurde, die mit 350 U/m lief. Dabei wurde mit einer Geschwindigkeit von 151/min belüftet. Dem Gemisch waren vor der Behandlung im Autoklaven 30 ml «Silcolapse» (Warenzeichen), ein Silicon-Antischäummittel, zugegeben worden. Der pH der Ernte war 7,9, und das erhaltene Fermentationsgemisch (221) wurde mit einem gleichen Volumen Ethylacetat gemischt und geschüttelt. Nach 30 min wurde das Gemisch in einer Zentrifuge getrennt, worauf der Ethylacetatextrakt (annähernd 181) über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 10,7 g eines öligen Rückstands erhalten wurden.

M.139 603 wurde aus dem obigen Konzentrat durch das folgende Verfahren erhalten:

Der ölige Rückstand (10,7 g) wurde in dem geringsten Volumen Ethylacetat aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf die Oberseite einer Kolonne von neutralem Aluminiumoxid (Woelm N, 200 g, 18 cm x 4 cm), die mit Ethylacetat vorbereitet worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde zunächst mit Ethylacetat, dann mit einem 50:50-Volumenge-misch aus Ethylacetat und Methanol und schliesslich mit Methanol eluiert. Es wurden die folgenden Fraktionen gesammelt, nachdem die Lösungsmittelfront aus der Kolonne ausgetreten war:

Frak- Volumen Eluiermittel tion

Nr.

1

150 ml

Ethylacetat

2

150 ml do.

3

150 ml do.

4

150 ml do.

5

150 ml do.

-Methanol 50 %V/V

6

150 ml do.

do. do.

7

150 ml do.

do. do.

8

150 ml do.

do. do.

9

200 ml

Methanol

10

200 ml do.

11

200 ml do.

Von den Fraktionen 7-11 konnte durch Dünnschichtchromatografie auf Silicagel und bei Entwicklung mit 20% V/V Aceton in Petrolether (Kp 60-80 °C) gezeigt werden, dass sie M.139 603 (RF~ 0,22) enthielten, weshalb sie vereinigt und eingedampft wurden, wobei 840 mg eines viskosen Gummis entstanden, der weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silica (Merck «Kieselgel 60F250» -Warenzeichen, 40 cm x 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung eines Gemischs aus 20% V/V Aceton und Petrolether (Kp 60-80 °C) als Eluiermittel gereinigt wurde. Die im UV sichtbare Bande bei RF ~ 0,22 (annähernd) wurde von den beiden Platten abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, und 5 der Extrakt wurde zur Trockene eingedampft, wobei 240 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden, der bei Zusatz von Petrolether (Kp 60-80 °C) kristallisierte. Das Metall wurde aus Petrolether (Kp 60-80 °C) umkristallisiert, wobei M. 139 603 in Form farbloser Kristalle erhalten wurde, die io nach dem Abfiltrieren und Trocknen 210 mg wogen und einen Fp von 176-178 °C aufwiesen. Das UV-Spektrum in Ethanol zeigte Absorptionen bei 234 nm (e= 12 900) und 272 nm (s=10 800). Das IR-Spektrum und das magnetische Kernresonanzspektrum waren mit denjenigen des Produkts von Bei-i5 spiel 1 identisch.

Beispiel 3

40 mg M.139 603 wurden in einem Gemisch aus 10 ml Aceton und 2 ml Wasser aufgelöst, 1 ml 2 n Salzsäure wurde 20 zugegeben, und das Gemisch wurde 5 min heftig gerührt. 20 ml destilliertes Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 2mal in 10 ml Dichloromethan extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 2 n Salzsäure und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Dichloro-25 methanschicht wurde dann konzentriert, wobei 33 mg eines viskosen Gummis, der M.139 603 entsprechenden freien Säure, erhalten wurden. Elementaranalyse: Gefunden C=69,5, H=9,l; berechnet für CssH^Og C=69,8, H=9,0; IR-Spektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 3 gezeigt, enthielt 3o charakteristische Absorptionen bei 3500,1765,1685,1650, 1575cm-1.Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuterochloroform ist in Figur 4 gezeigt.

Beispiel 4

35 30 mg der M. 139 603 entsprechenden «freien Säure» wurden in einem Gemisch aus 7 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Wasser aufgelöst. 2 ml eines 2n-Alkalimetallhydroxids, XOH, wurden dem wässrigen Tetrahydrofurangemisch zugegeben, das dann 10 min heftig gerührt wurde. 10 ml Wasser 40 wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 2mal in 15 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt und eingedampft, wobei das dem Natriumsalz M.139 603 entsprechende Alkalimetallsalz erhalten wurde.

Wenn X für Kalium stand, dann wurde das Kaliumsalz 45 erzeugt, Fp 146-150 °C, Molekularformel C35H53O8 • K, ermittelt durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit einer Masse von 640,335 zeigt (berechnet für C35H5308 ■ K= 640,338), und durch Elementaranalyse: Gefunden C=65,7%, H=8,5; berechnet für C35H5308 • K 50 C=65,6%, H=8,3%).

Wenn X für Rubidium steht, dann wird das Rubidiumsalz gebildet, Fp 95-120 °C, Molekularformel C35H5308 • Rb, er-55 mittelt durchMassenspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit einer Masse von 686,279 (berechnet für CjsHsjOg • Rb=686,286) zeigt.

Tierversuch

60 Das Vermögen von M.139 603, den Anteil an Propionat auf Kosten von Acetat in der Rumenflüssigkeit eines Schafs zu erhöhen, wurde wie folgt demonstriert:

23 Schafe wurden einzeln gehalten und mit der gleichen Nahrung von 1 kg getrockneten Graswürfeln je Tier und je 65 Tag, aufgeteilt in zwei Portionen je Tag, gefüttert. Die Tiere wurden willkürlich wie folgt zusammengefasst: 13 als negativer Vergleich, 5 als positiver Vergleich unter Verwendung von Nonensin, einem bekannten Rumenmanipulator, und 5 für

7

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die Dosierung mit M.139 603. Die behandelten Tiere erhielten Monensin oder M. 139 603 oral in einer Rate von 0,5 mg/kg an einem jeden von vier aufeinanderfolgenden Tagen. Proben der Rumenflüssigkeit wurden durch Magenkanülen 6 st nach der Behandlung am 4. Tag gesammelt. Die Rumenflüssigkeitsproben wurden dann gemäss der Vorschrift des pharmakologischen Versuches auf Acetat und Propionat analysiert. Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:

Behandelte Gruppen

Negativer Vergleich 5 Positiver Vergleich -Monensin 0,5 mg/kg M.139 603-0,5 mg/kg

Mol-% der gesamten VFA Acetat Propionat

69,9

57.1

54.2

19.8

32,3

39.9

Das Ansprechen im Hinblick auf Acetat durch M. 139 603 io ist bei p < 0,02 gegenüber dem positiven Vergleich, Monensin, bemerkenswert, und das Ansprechen im Hinblick auf Propionat durch M. 139 603 ist bei p < 0,001 gegenüber dem positiven Vergleich, Monensin, bemerkenswert.

C

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Die Verbindung M. 139 603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist:

a) Molekularformel C35H5308Na, gemessen durch Mas-senspektrometrie, welche ein Molekularion, M+, mit der Masse 624,361 zeigt - berechnet für C3sH5308Na=624,364, und durch Elementaranalyse: C=67,5, H=8,8 % - berechnet für C35H5308. Na - C=67,3, H=8,5%;

b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull, wie in Figur 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300,1725,1645, 1565 und 915 cm-1;

c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deute-riochloroform wie in Figur 2 gezeigt;

d) Ultraviolettspektrum in Methanollösung zeigt eine charakteristische Absorption bei 234 nxn - e = 12 900, und 272 nm-s= 10 800;

e) Schmelzpunkt 1765-178 °C;

f) [a]^ = — 82°, c=0,2 in Methanol;

und die entsprechende freie Säureform dieser Verbindung mit der Molekularformel C35H5408, die gekennzeichnet ist durch Rf=0,55 bei Dünnschichtchromatographie auf Sili-cagel, Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhält-nis 95:4:1; UV in Ethanol 274 nm (e —13 900), breit; sowie die anderen davon ableitbaren Alkalimetallsalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen
M. 139 603-bildenden Stamm von Streptomyces longisporo-flavus in einem wässrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 32 °C kultiviert, das so erhaltene Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und das Lösungsmittel eindampft, worauf man ggf. das Natriumsalz, M. 139 603, in die «freie Säure» überführt und die «freie Säure» ggf. in ein anderes Alkalimetallsalz überführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als M. 139 603-bildender Stamm von S. longisporoflavus deijenige verwendet wird, der mit NCIB 11 426 identifiziert ist und der die folgende Schreibung besitzt, wobei die verwendeten Medien gemäss den Rezepten für das International Streptomyces Project (ISP) hergestellt wurden und von Shir-ling E.G & Gottlieb D. (International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340,1966) beschrieben werden:

Bedingunge für die Inkubation - ca. 25 °C

- Tageslicht. ISP1 Trypton-Hefe (aber mit zugesetztem Agars 5 Tage - Dünn, etwas feucht, samtig, bräunlich.

- Unterseite ungefärbt.

13 Tage - Dünn, samtig, etwas körnig, bräunlich.

- Unterseite ungefärbt. /SP2Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar.

5 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

- Unterseite sehr blass, gelbbraun.

13 Tage - Sauber, erhaben und gerunzelt, samtig, hellgelb/

braun/grau.

- Unterseite rehbraun.

ISP3 Hafermehl-Agar.

5 Tage - Spärlich bis dünn, samtig, hellgelb/grau.

- Unterseite nicht sichtbar.

13 Tage - Dünn, etwas erhaben, samtig, hellgrau.

- Unterseite nicht sichtbar.

ISP4 Anorganische Salze/Stärke-Agar.

5 Tage - Dünn, bräunlich, etwas körnig.

- Unterseite ungefärbt.

20

25

13 Tage - Dünn, etwas feucht, rehbraun.

- Unterseite mehr oder weniger ungefärbt. ISP5 Glycerin/Asparagin-Agar.

5 Tage - Dünn, etwas körnig, bräunlich. 5 - Unterseite ungefärbt.

13 Tage - Dünn, samtig, hellgrau.

- Unterseite ungefärbt.

ISP7 Tyrosin-Agar.

5 Tage - Spärlich bis dünn, etwas körnig, samtig, io bräunlich/grau.

- Unterseite ungefärbt.

13 Tage - Dünn, samtig, etwas erhaben, rehbraun.

- Unterseite rehbraun/grau.

Bei ISP7 wird beim Altern die Kultur im allgemeinen rôtis lichbraun, zeigt aber einige Bereiche dunklerer Färbung zusammen mit stärkerer Sporulation.

ISP9 Kohlenstoffausbeutungs-Agar. Einstufung

15 Tage - Kein Kohlenstoff- Sehr spärlich,

submers —

- Glucose - Dünn, sauber, samtig,

rehbraun +

- Arabinose-Spärlich ±

- Fructose-Dünn, samtig, rehbraun +

- Inosit- Sehr spärlich —

- Mannit-Dünn, samtig +

- Raffmose—Sehr spärlich —

- Rhamnose-Spärlich ±

- Xylose - Spärlich ± m,kj>-

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Allgemein

Es werden keine Melanine gebildet. An der Unterseite werden keine Pigmente gebildet. Es werden keine löslichen Pig-35 mente gebildet. Die Sporen werden in offenen und dichten Spiralen erzeugt, die oftmals von der Hauptsache durch ein gerades Stück getrennt sind, das «Hyphen» oder u.U. Sporenketten trägt. Die Sporen selbst sind durch das normale Mikroskop schwierig zu sehen, da sie sehr dicht miteinander verbünden 4o sind. Die Sporenwandungen (E.M. auf 4% Uranyl-acetatpräparat) sind glatt.
4. Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 als Mittel zur Ausführung des Verfahrens gemäss Anspruch 2.
5. Die Verbindung M. 139 603 nach Anspruch 1, sofern sie 45 durch das Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 hergestellt worden ist.
6. Verfahren zur Mast von domestizierten Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, dass man den Tieren eine Verbindung nach Anspruch 1 oral verabreicht.

so 7. Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach Anspruch 1 gemeinsam mit einem festen oder flüssigen verzehrbaren, nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

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