DD152278A5 - Futtermittelzusammensetzung oder praemix fuer deren herstellung - Google Patents

Abstract

Futtermittelzusammensetzung oder Praemix fuer deren Herstellung fuer die Anwendung als wachstumsfoerderndes Mittel in der Tierzucht. Ziel der Erfindung ist, den Wirkungsgrad der Nahrungsaufnahme zu verbessern. Erfindungsgemaess wird mit einem Kulturstamm von Streptomyces longisporoflavus die Verbindung M.139603 durch aerobe Gaehrung gezuechtet. Die Verbindung M.139603 weist die folgenden Merkmale auf: a) die Molekularformel ist C&ind35!H&ind53!O&ind8!Na, nachgewiesen durch Massenspektrometrie. Dabei handelt es sich um ein Molekuelion M&exp+! der Masse 624361; b) das Infrarotspektrum in Nujol-Mull (Nujol=speziell behandeltes Fluessigkeitsparaffin) weist charakteristische Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm&exp-1! auf; c) das magnetische Protonenkernresonanzspektrum in Deuteriochloroform verlaeuft gemaess Abb.2; d) das UV-Spektrum in Methanolloesung weist eine charakteristische Absorption bei 234 nm (epsilon=12900) und bei 272 nm (epsilon=10800) auf; e) der Schmelzpunkt liegt bei 176 - 178 Grad C; f)&alfa!&exp23!&indD!=-82 Grad (c=0,2 in Methanol).

Description

2 Ί A 7 9 6 "^" ^Berlin' ^den 3.2. 12. so

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen mit einem Streptomyces-Stoffvvechselprodukt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden angewandt zur Wachstumsförderung in der Tierzucht, insbesondere bei Wiederkäuern·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß größere Wachstumsraten bei Wiederkäuern erzielt werden, wenn die Konzentration an Methan in der Pansenflüssigkeit gesenkt und di e Konzentration an Propionsäure in der Pansenflüssigkeit erhöht wird*

Zu diesem Zweck wurde bisher Monensin an Rinder oder Schafe verfüttert·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer Verbindung, welche in erhöhtem Maße den Wirkungsgrad der Nahrungsaufnahme vorbessert und daher wachstumsfordernde Eigenschaften hat·

fiarlegunci des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine solche Zusammensetzung aufzufinden, die in verstärktem Maße die Konzentration an Propionsäure in der Pansenflüssigkeit erhöht und ein Verfahren zu ihrer Herstellung ausfindig zu machen«

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Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung mit der Verbindung M, 139603 als Wirksubstanz hergestellt. Sie ist charakterisiert durch besondere Merkmale, nämlich, daß:

a) die Molekularformel gleich C₃₅Hp^O₈Na ist, wobei der Nachweis mit Hilfe der Massenspektrosmetrie geführt wird; es liegt ein Molekülion M der Masse 624361 (berechnet für C-zpHggQgNa = 624364) vor. Die Elementaranalyse ergibt: C= 67,5 &, H= 8,8 % (berechnet für ^C35^H5₃°8^Na:Π - f>7 ~*> °/ H =5 S ¹^ ^c/\ -

Ο— Ό',Ο/Ο/ Π— Ο, J Jq) ,

b) das I_nfrarotspektrum (IR) in Nujol-Mull gemäß Fig. 1

charakteristische Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565

— 1 und 915 cm aufweist;

c) das NMR-Spektrum in Deuteriochloroform gemäß Fig. 2 verläuft;

d) das UV-Spektrum in Ethanollösung eine charakteristische Absorption bei 234 nm (£ = 12900) und bei 272 nm ( £ = 10800) aufweist,·

e) der Schmelzpunkt bei 176 - 178 ⁰C liegt und

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^f) Z%7d ⁼ ~⁸² (^{c =} °'^{2 in} Methanol) ist.

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Die Verbindung kann auch in Form der freien Säure mit der Molekularformel C_3nHp₃O₀ vorliegen, die einen R,-Wert gleich 0,55 (ungefähr) aufweist; Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel ("Kieselgel 60F-254) mit einer Dicke von 0,25 rom unter Entwicklung mit einem Gemisch aus Diäthyläther, Methanol und Ameisensäure im Volumenverhältnis 95 : 4 ί 1; UV-Absorption in Äthanol bei 274 nm ( £ = 13900), breit.

Es können auch weitere Alkalimetallsalze der Verbindung hergestellt werden»

Das Herstellungsverfahren der oben genannten Verbindungen erfolgt dadurch, daß ein die Verbindung M139603 erzeugender Kulturstamra von Streptomyces Iongispοrof 1 a_cu _ts in einem wäßrigen Nährrnedium mit einem assimilierbaren Kohlenstoff unter geschüttelten aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 G und 32 C gezüchtet, das auf diesem Wege gewonnene Gärungsgemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel durch bekannte Verfahren extrahiert und das Lösungsmittel verdampft wird, wonach, falls es gewünscht wird, das Natriumsalz M,139603 in die Form der "freien Säure" und die Form der

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"freien Säure" in andere Alkalimetallsalze durch bekannte Verfahren umgewandelt werden kann·

Ein geeigneter die Verbindung M.139603 erzeugender Kulturstamm von Streptomyces longisporoflavus entspricht demjenigen Stamm, der durch die Bezeichnung ImCIB 11426 identifiziert ist· Dieser Stamm ist ohne Einschränkung von der folgenden Institution erhältlich: national Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Pood, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen ΑΪ/Ϊ9 8DG, Schottland. Die weiter unten folgende Beschreibung dient der näheren Kennzeichnung: . ·

/~ Die verwendeten Medien setzen sich gemäß den Angaben für das 'International Streptomyces Project' (ISP) zusammen und entsprechen der Beschreibung von E.G. Snarling und D. Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology, JJj₁ (3), 313-340, 1966)__7.

Inkubationsbedingungen: ca. 25 ⁰C

Tageslicht

ISP1 - Trypton-Hefe (aber mit zugegebenem Agar)

5 Tage - dünn, geringfügig feucht, samtartig,

hellbraun.

Rückseite unverfarbt· 13 Tage - dünn, samtartig, geringfügig körnig,

hellbraun.

Rückseite unverfarbt.

ISP2 - Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar

5 Tage - dünn, samtartig, hellgrau.

Rückseite sehr schwachgelb-hellbraun. 13 Tage - befriedigend, erhaben und gekräuselt,

samtartig, hellgelb/hellbraun/hellgrau.

Rückseite hellbraun.

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ISP3 - Hafermehl-Agar

Tage - spärlich, bis dünn, samtartig, hellgelb/

hellgrau.

Rückseite nicht sichtbar· Tage - dünn, geringfügig erhaben, samtartig,

hellgrau·

Rückseite nicht sichtbar.

ISP4 - Anorganische Salze-Ausgang-Agar

Tage - dünn, hellbraun, geringfügig körnig.

Rückseite unverfärbt. Tage - dünn, geringfügig feucht, hellbraun.

Rückseite mehr oder weniger unverfärbt«

ISP5 - Glyzerin-Asparagin-Agar

Tage - dünn, geringfügig körnig, hellbraun.

Rückseite unverfärbt. Tage - dünn, samtartig, hellgrau.

Rückseite unverfärbt·

_ISP7 - Tyrosin-Agar

Tage - spärlich bis dünn, geringfügig körnig,

samtartig, hellbraun/hellgrau.

Rückseite unverfärbt. Tage - dünn, samtartig, geringfügig erhaben,

hellbraun.

Rückseite hellbraun/hellgrau.

Was den Ansatz ISP7 anbelangt, so wird mit der Zeit die Kultur im allgemeinen stärker blaßrosa hellbraun, weist aber bestimmte Stellen mit dunklerer Färbung auf, verbunden mit einer star-, leeren Sporenbildung«

ISP9 - Kohlenstoffverwendung-Agar

Auswertung;

Tage - Kein Kohlenstoff - sehr spärlich,

submers

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Auswertung

Glukose - dünn/befriedigend, samtartig, hellbraun +

Arabinose - spärlich ±

Fruktose - dünn, samtartig, hellbraun +

Inositol - sehr spärlich -

Mannitol - dünn, samtartig + Raffinose - sehr spärlich

Rhamnose - spärlich +_

Xylose - spärlich +,

Allgemeines:

Melanine werden nicht erzeugt

Reversible Pigmente werden nicht erzeugt. Lösliche Pigmente werden nicht erzeugt.

Die Sporen entstehen in offenen und engen Spiralen, oftmals getrennt von der Hauptachse durch eine geradere, stützende Hyphenanordnung (Hyphe = aus einfachen Zellreihen bestehender Pilzfaden) oder vielleicht durch Sporenketten. Die Sporen selbst sind mit dem normalen Mikroskop schwierig zu beobachten, da sie sehr eng beieinander liegen. Die Sporenwände (E. M. auf der Basis eines 4%igen Uranylazetatansatzes) sind glatt.

Dieser Kulturstamm von Streptomyces 1 ongispοrοf1avus ist ebenfalls ohne Einschränkung bei der folgenden Institution erhältlich: Centraalbureau voor Schirnmelcultures, PO Box 273, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Niederlande, unter Angabe der Kennziffer CBS 312.79*

Bei dem hergestellten Stoffwechselprodukt M.139603, welches aus aer aeroben Kultur von Steptomyces lonciisporoflavus er-

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halten wird, handelt es sich augenscheinlich um eine neue Verbindung der Formel C₃₅H₅₇OgNa. Die Verbindung M.139603 stellt ein Natriumsalz dar und die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die entsprechende "freie Saure" sowie auf andere Alkalimetallsalze, die daraus abgeleitet werden können. Die Verbindungen wirken in der Weise, den prozentualen Anteil an Methan, das bei der Gärung im Pansen von Wiederkäuern entsteht, zu reduzieren und den prozentualen Anteil an Propionsäure in der Rinderpansenflüssigkeit zu vergrößern. Es wird in diesem Zusammenhang die Meinung vertreten, daß diese Verbindungen bei Wiederkäuern wachstumsfördernde Eigenschaften aufweisen, zumal gut bekannt ist, daß andere chemische Verbindungen, die die Konzentration der Propionsäure in der Pansenflüssigkeit erhöhen, zu größeren VVachstumsraten beitragen, wenn sie an Rindvieh oder Schafe verfüttert werden. Die neuen Verbindungen verfugen ebenfalls über eine antibakterielle Wirksamkeit gegen grampositive Organismen sowie über eine Antikokzidiose-Wirksamkeit gegen Eimeria tenella bei einem Versuch im Reagenzglas.

Die "freie Säure" entsprechend dem Natriumsalz der Verbindung M. 139603 kann in der '.Veise gewonnen werden, indem eine Lösung der Verbindung M.139603 angesäuert und die saure Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert wird,Weitere Alkalimetallsalze können in der Weise erhalten werden, indem eine Lösung der "freien Säure" mit einem geeigneten Alkalimetallhydroxid, wie z. B, mit Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Zäsiumhydroxid oder Rubidiumhydroxid, behandelt wird» Wenn zu diesem Zweck Natriumhydroxid verwendet wird, wird die Verbindung

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N.139603 wiedergewonnen, womit demonstriert wird, daß bei diesen Reaktionen keine strukturelle Änderung hervorgerufen wird.

Wie weiter oben angegeben wurde, wirken die Verbindungen in der Weise, indem sie den prozentualen Anteil an Propionsäure in der Pansenflüssigkeit und im besonderen den prozentualen Anteil an Propionsäure auf Kosten des Methans und/ oder der Essigsäure erhöhen. Von diesen Zusammenhängen ist bekannt, daß es sich dabei um erwünschte Effekte bei der Ernährung von Wiederkäuern handelt, weil die Propionsäure gegenüber der Essigsäure ein viel wirksamerer Vorläufer der Glukose ist, aus der das Tier seine Energie aufnimmt und sich sein Wachstum ergibt, während jener Teil der Mahrungsauf nehme durch das Tier, der in Methan umgewandelt wird, für das Tier ganz einfach als verloren anzusehen ist. Das Methan wird durch Aufstoßen ausgeschieden. Somit stellt die Modifikation des Pansenstoffwechsels, die durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung erreicht wird, einen äußerst nützlichen Effekt dar. Es wird hierbei die Auffassung vertreten, daß die V/achstumsrate und der Wirkungsgrad der Nahrungsumwandlung der wiederkäuenden Tiere erhöht werden.

Die neuen Verbindungen werden Tieren vorzugsweise auf oralem Wege verabreicht, und zwar als Ergänzung ihres normalen Futters, d, h, , als Beimischung zu einem gewöhnlichen festen Futter, in Futterblöcken oder Salzlecken, aufgelöst im Trinkwasser oder für Oungtiere, wie beispielsweise für Lämmer oder Kälber, aufgelöst in Voll- oder Magermilch. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden der Nahrung, den Futter-

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blöcken, den Salzlecken, dem Trinkwasser, der Voll- oder Magermilch in einer solchen Menge zugegeben, daß jedes behandelte Tier 0,01 mg einer Verbindung/kg Körpergewicht bis 30 mg einer Verbindung/kg Körpergewicht pro Tag aufnimmt, vorzugsweise 0,01 mg einer Verbindung/kg Körpergewicht bis 10 mg einer Verbindung/kg Körpergewicht pro Tag·

Die Verbindungen können alternativ den Tieren in der Form einer in dem Pansen eines Wiederkäuers sich langsam auflösenden Tablette oder großen Pille derart verabreicht werden, daß das Tier eine ähnliche Menge an erfindungsgemäßen Verbindungen pro Tag aufnimmt.

Die Tiere können die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung im wesentlichen während ihrer gesamten Wachstumsperiode erhalten oder nur während eines Teiles ihrer Wachstumsdauer, zum Beispiel zu Beginn ihres Wachstums und/oder während der Zeit, die dem Schlachten vorausgeht. Die Zunahme der Wachstumsrate auf Grund der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bietet die Möglichkeit, daß die Tiere, die zur Gewinnung von Fleisch gezüchtet wurden, in einer kürzeren Wachstumszeit auf ein entsprechendes Marktgewicht oder Schlachtgewicht gebracht werden, als dies normalerweise der Fall ist, oder es besteht die Möglichkeit, am Ende der normalen Wachstumsperiode schwerere Tiere zu erhalten. Der verbesserte Wirkungsgrad der Nahrungsumwandlung bietet die Möglichkeit, daß die behandelten Tiere jedes gewünschte Gewicht erreichen, während dabei weniger Futtermittel verbraucht werden, als dies bei unbehandelten Tieren der Fall ist, die auf dasselbe Gewicht gewachsen sind« Bei optimal aufgenommenen Mengen der vvachstumsfordernden Substanzen werden keine Anzeichen für irgendwelche giftigen Effekte durch die Verbindungen beobachtet*

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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bestehen aus der Verbindung M.139603, einem Gärungserzeugnis oder einem Extrakt gemeinsam mit einem festen oder flüssigen, eßbaren, ungiftigen Verdünnungsmittel oder einer entsprechenden Trägersubstanz.

Ein geeignetes flüssiges Verdünnungsmittel oder eine entsprechende Trägersubstanz stellt beispielsweise Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch dar»

Ein geeignetes festes, eßbares, ungiftiges Verdünnungsmittel oder eine entsprechende Trägersubs'canz kann beispielsweise eine bekanntes, die Ernährung betreffend ausgeglichenes Viehfutter sein, z, B. ein typisches Vieh- oder Schaffutter, bestehend aus Getreideerzeugnissen, wie etwa Gerstenmehl, Maismehl oder Weizenfutter, aus Nuß- und Samenerzeugnissen, wie etwa aus geschältem Erdnußkuchen oder Baumwollsamenkuchen, oder aus extrahiertem ßaumwollsamenkuchen zusammen mit kleineren Mengen z, B, von Federmehl, Seetangmehl, Knochenmehl, Kreide, Salz, Harnstoff, Melasse, Vitaminen und Spurenmineralien; oder es kann sich um ein inertes, festes Verdünnungsmittel oder eine entsprechende Trägersubstanz ohne Nährwert handeln, z. B« um Kaolin, Talk, Kalziumkarbonat, Fullererde, Attapulgit, gemahlene Austerschalen oder gemahlenen Kalkstein; oder es kann Stärke oder Laktose sein.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann die Form eines Ergänzungsfutters zur direkten Verfütterung an die Tiere aufweisen, in welchem Falle 5 ppm bis 3000 ppm der erfindungsgemäßen Verbindung in einer Beimischung zu einem be-

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kannten Viehfutter zu verabreichen sind; oder die Zusammensetzung kann die Form einer konzentrierten Vormischung zum Zwecke der Verdünnung mit einem bekannten Viehfutter aufweisen, um zu einem Ergänzungsfutter zu gelangen, welches sich zur direkten Verfütterung eignet. Eine derartige Vormischung wird 0,3 Gew.-% bis 50 Gew«-% der erfindungsgemäßen Verbindung in einer Beimischung entweder zu einem bekannten, die Ernährung betreffend ausgeglichenen Viehfutter, einem inerten, festen Verdünnungsmittel ohne Nährwert, zum Beispiel gemahlenem Kalkstein, oder zu Stärke oder Laktose enthalten«

Die feste Zusammensetzung der Erfindung kann hergestellt werden durch Vermischung mit einem festen, eßbaren, ungiftigen Verdünnungsmittel oder einer entsprechenden Trägersubstanz gleichmäßig zu mischen.

Die Verbindung M.139603 wird vorzugsweise der Reihe nach mit dem Verdünnungsmittel oder mit der Trägersubstanz in zwei oder mehr sukzessiven Bearbeitungsschritten zum Zwecke der Gewährleistung eines gleichmäßigen Mischens verdünnt.

Auch weisen, wie weiter oben angegeben wurde, die Verbindungen eine Antikokzidiose-Wirksamkeit auf. Dies läßt sich durch einen Gewebekulturversuch in Hühnernierenzellen demonstrieren, wobei die Zellen mit Sporentierchen der Art Eimeria jenj3l_la okuliert werden* Hierbei liegt das Standardprüfverfahren zugrunde, welches in dem Oournal of Parasitology, Band 58, Seiten 664 - 668 (1972) beschrieben ist« Bei diesem Versuch verhindert die Verbindung M*139603 das Wachstum der Sporentierchen bei einer Konzentration von ^.0,0Ol ppm und zeigt toxische Effekte im Hinblick auf die w'irtszellen nur bei einer Konzentration von "^0,33 ppm.

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Die Verbindung M.139603 verfügt ebenfalls über grampositive antibakterielle Eigenschaften. Hierzu nur ein Beispiel, Es ist nachgewiesen worden, daß die obige Verbindung, das Wachstum von Staphyllococcus aureaus, Streptococcus faecalis« Clostridium, welchii und .Corynebacterium acne, bei einer Konzentration von -^ 10 /Ug pro ml verhindert. Daher kann die Verbindung M.139603 als wachstumsfordernde Substanz bei nichtwiederkäuenden Tieren, z. B. beim Federvieh und bei Schweinen, verwendet werden.

Ausführungsbeispiel

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele näher erläutert, aber nicht eingeschränkt:

Beispiel 1

Streptomyces-Art ITCIB 11426 wurde in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben unter Verwendung von Trypton-Hefe-Agar gezüchtet. Dieser Trypton-Hefe-Agar enthielt:

Trypton - "Oxoid" IA2 (Warenzeichen) 0,5 Gew.-%

Hefeextrakt - "Oxoid" L21 (Warenzeichen) 0,3 Gew.-^

Durch Behandlung in einem Autoklaven war eine Vorsterilisie« rung 20 Minuten lang bei normalem Druck vorgenommen worden. Der pH-Wert des Mediums lag ungefähr bei 8,0. Der Kolben wurde bei 25 ⁰C 120 Stunden lang auf einem rotierenden . Schüttelapparat geschüttelt.

Der Inhalt des Kolbens diente dann dazu, um weitere 10 ähnliche Kolben zu okulieren, die jeweils 200 ml des folgenden Mediums enthielten:

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Glukosesirup

Kaiζ iumkarbonat

Natriumchlorid

Magnesiumsulfat-Heptahydrat Spurenelementkonzentrat Bakteriologisches Pepton ("Oxoid" L37 - Warenzeichen) Rindfleischextraktpulver ("Qxoid" L29, "Lab Lemco"-Warenzeichen)

Entmineralisiertes Wasser

3,0 % Gewicht/Volumen 0,25 % Gewicht/Volumen 0,5 % Gewicht/Volumen 0,05 % Gewicht/Volumen 0,1 % Volumen/Volumen

0,1 % Gewicht/Volumen

0,5 % Gewicht/Volumen auf 100

Der pH-Wert wurde auf 7»2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120 ⁰C 20 Minuten lang vorsterilisiert. Die okulierten Kolben wurden bei 25 ⁰C 120 Stunden lang auf einem rotierenden Schüttelapparat geschüttelt und der Inhalt der Kolben wurde sodann zusammengefaßt und durch sorgfältige Zugabe von 0,1 N Salzsäure auf einen pH-Wert gleich 3 eingestellt. Das Medium wurde mit Äthylazetat (2 χ 600 ml) extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet« Das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei ein ölartiger Rückstand (290 mg) erhalten wurde.

Der Äthylazetatextrakt wurde mit Hilfe der präparativen Schichtchromatographie unter Verwendung von zwei Silikagelplatten ("Kieselgel" 6OF 254 - Warenzeichen, 20 χ 20 cm, mit einer Dicke von 2 mm) unter Benutzung von Äthylazetat als Elutionsmittel gereinigt. Der Streifen bei B^ = 0,39 (ungefähr) wurde von den Platten abgekratzt und mit Äthylazetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde sodann verdampft, wobei ein viskoser gumartiger Rückstand (21 mg) erhalten wurde. Dieser Rückstand wies gegenüber Staphyllococcus aureus

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eine antibakterielle Wirksamkeit im Reagenzglas auf. Diese wirksame Fraktion wurde des" weiteren mit Hilfe der präparativen Schichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelplatte ("Kieselgel" 6OF 254 - Warenzeichen, 20 χ 20 cm, mit einer Dicke von 0,25 ~®&) unter Benutzung eines Gemisches aus Diäthyläther, Methanol und Ameisensäure im Volumenverhältnis 95 : 4 : 1 gereinigt. Der Streifen bei R^ = 0,55 (ungefähr) wurde von der Platte abgekratzt und mit Ithylazetat extrahiert. Dabei wurde nach dem erfolgten Verdampfen des Lösungsmittels ein viskoser gumartiger Rückstand (9 mg) erhalten. Der gumartige Rückstand wurde in einer Chloroformlösung durch Schütteln mit einer Lösung aus Natriumhydroxid (0,1 M) in ein Natriumsalz M.139603 umgewandelt. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft. Es wurde die Verbindung M.139603 als eine weiße feste Substanz (8 mg) erhalten. Der Schmelzpunkt entspricht 129 - 132 ⁰C. Das Infrarotspektrum (Abbildung 1) enthielt die folgenden Maxima: 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm""¹). Die Elementaranalyse kann wie folgt angegeben werden: Gefunden - C = 67,5 %» H = 8,8 %· berechnet für C₃₅H₅₃OgNa -C =67,3%, H= 8,5%. Massenspektrum: M⁺ = 624361, berechnet für CocHcoO

624364. Hf = 0,39 (Dünnschichtchromatographie auf Platten 601? 254 mit einer Dicke von 0,25 mm unter Entwicklung mit Äthylazetat). Die Sichtbarmachung erfolgte als brauner Fleck nach dem Besprühen mit 3N Schwefelsäure und Erwärmen bei 100 ⁰C. Das magnetische Protonenkernresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Abbildung 2 wiedergegeben«

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Beispiel 2

Die Fähigkeit der Verbindung M.139603, die Entwicklung von. Methan im Pansen von Wiederkäuern zu unterbinden und den prozentualen Anteil an Propionat auf Kosten von Azetat (Ac/Pr) in den gebildeten flüchtigen Fettsäuren (VFA) zu vergrößern, läßt sich wie folgt veranschaulichen:

Von zwei Ochsen wird auf einer normalen Routinebasis Pansenflüssigkeit entnommen. Diese beiden Ochsen werden mit demselben Heu/Konzentrat-Futter gefüttert. Die Zeit für die Probenahme ist soweit wie möglich standardisiert^und die Pansenflüssigkeit von den beiden Tieren wird auf einer 50/50-Basis zusammengefaßt. Einzelne größere Teilchen werden in der Weise entfernt, indem die zusammengefaßte Flüssigkeit durch vier Schichten aus Musselin filtriert wird. Das FiI-trat wird anschließend im Verhältnis 1 Volumenteil Filtrat auf 3 Volumenteile einer künstlichen Pansenflüssigkeit verdünnt (hergestellt gemäß der

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Beschreibung von G.L. Bales und anderen, Journal of Diary Science, 1976, Band 59, Seite 1850, aber unter Auslassen der Essigsäure). Der pH-Wert des Gemisches wird mit gesättigter· wäßriger ITatriumkarbonatlösung auf 6,9-7,0 eingestellt. Aliquote Teile (50 ml) dieses Gemisches werden auf 100-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt, in denen sich getrocknetes und gemahlenes Heu (0,5 g) befindet. Jeder einzelne Kolben dient dazu, eine Yersuchsverbindung bei einer speziellen Konzentration zu untersuchen.

Die Versuchsverbindung wird dem Erlenmeyer-Kolben als Lösung in Äthanol zugegeben, der Kolben mit Kohlendioxidgas ausgespült, mit einer Suba-Dichtung verschlossen und bei 39 ⁰C 15-16 Stunden lang in der Brutkammer aufbewahrt. Nach Ablauf einer Stunde wird eine !Tadel mit einer feinen Bohrung durch die Suba-Dichtung eingeführt, um den Gasdruck zu entlasten. Diese Nadel wird 30 Minuten vor dem Ende der Aufbewahrung in der Brutkammer wieder herausgezogen. Die Gärung wird sodann unterbunden, indem der Kolben auf Eis gestellt wird. Nach einer Abkühlungszeit von 15 Minuten wird das Gas über der Flüssigkeit mit Hilfe der GasChromatographie auf Vorhandensein von Methan analysiert. Der Kolbeninhalt wird anschließend durch einen vorher getrockneten Glassintertrichter filtriert. Drei Proben des Filtrates werden mit Hilfe der Gaschromatographie auf Vorhandensein von flüchtigen Fettsäuren (VFA) analysiert. Durch einen Vergleich mit der vorher bestimmten Konzentration an flüchtigen Fettsäuren (VFA) vor der Aufbewahrung in der Brutkammer werden die gesamten flüchtigen Fettsäuren (Azetat und Propionat), die sich während des Aufbewahrens in der Brutkammer gebildet haben, bestimmt.

Die weiter unten folgenden Ergebnisse wurden erzielt, ausgedrückt in % der Kontrollwerte, die erhalten wurden, wenn keine Versuchsverbindung eingesetzt wurde. Monensin, eine bekannte wachstumsfördernde Substanz, die erfolgreich auf den Pansen einwirkt, ist als positive Kontrollsubstanz benutzt worden.

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Al

Tabelle: Ergebnisse

	Konzentration in /Ug pro ml	Methan in % relativ zu den	Azetat/Propionat- Verhältnis in % relativ zu den Kontrollwerten
Verbindung	1,0 0,3 0,1	58 72 87	.62 64 70
M. 139603	1,0 0,3 0,1	67 90 100	79 87 95
Monensin

Beispiel 3

Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 wurde als Gefällekultur auf ISP-7-Agar (45 ml) 7 'Tage lang bei 30 ⁰C gezüchtet. Drei derartige Kulturen wurden einzeln in drei Kolben mit 100 ml keimfreiem Wasser abgekratzt» Die auf diese Weise ge-Vi/onnenen Suspensionen wurden dazu verwendet, um drei 2-1-Kolben zu okulieren, in denen sich jeweils 1 1 des folgenden Mediums befand:

Glyzerin ················« 3,0 % Gewicht/Volumen

Bakteriologisches Pepton

("Oxoid" 137 - Warenzeichen) ....... 2,0% Gewicht/Volumen

KHpPO. ..·..·«...*...·...·. 0,024 % Gewicht/Volumen

MgSO₄.7H₂O .·.....··....·»··..··..·... 0,02 % Gewicht/Volumen

Spurenelementkonzentrat ·· 0,1 % Volumen/Volumen

Kreide .............«·.....·.. 0,1 % Gewicht/Volumen

Entmineralisiertes Wasser ·····.·.···· auf 1 Liter

Das Medium war in einem Autoklaven bei normalem Druck ¹/2 Stunde lang vorsterilisiert worden. Der pH-Wert entspricht ungefähr 6,7.

Die drei 2-1-Kolben, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden

bei 30 ⁰C 3 Tage lang auf einem rotierenden Schüttelapparat

geschüttelt. Der Inhalt der drei Kolben wurde anschließend vereinigt und diente dazu, um in einem Gärtank aus rostfreiem Stahl als Impfstoff eingesetzt zu werden, in dem sich 30 1 des folgenden sterilisierten Mediums befanden:

Glyzerin .........······.······.·..·· 3,0 % Gewicht/Volumen

Soyamehl BSP 70 .......e......_e.*.... 1,0 % Gewicht/Volumen '

Kreide .............. .».cc.....*.... 0,25 % Gewicht/Volumen

Zerelose **...*...··.«»··.·.«··.·...« 3,0 % Gewicht/Volumen

HaCl 0,5 % Gewicht/Volumen

MgSO₄₀7H₂O .*....,...,............... 0,05 % Volumen/Volumen

Spurenelementkonzentrat ··«········.. 0,1 % Gewicht/Volumen

Destilliertes V/asser .·....·....».··. auf 30 Liter

Der Inhalt des Gärtanks wurde bei 30 ⁰C 70 Stunden lang unter Verwendung einer Turbine mit vier flachen Schaufeln umgerührt. Die Drehzahl der Turbine lag bei 350 U/min. Die Belüftung fand bei einer Geschwindigkeit von 15 1 pro Minute statt. 30 ml "Silcolapse" (Warenzeichen), ein Silikonantischaummittel, waren dem Gemisch vor der Behandlung im Autoklaven zugegeben worden. Der pH-T'ert lag am Schluß der Behandlung bei 7,9 und das sich ergebende Gärungsgemisch (22 Liter) wurde mit einem gleichen Volumen Äthylazetat gemischt und anschließend umgerührt. Nach 30 Minuten wurde das Gemisch in einem Zentrifugalabscheider getrennt und der Äthylazetatextrakt (ungefähr 18 1) über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wurde unter verringertem Druck angereichert und ergab einen ölartigen Rückstand (10,7 g)·

Die Verbindung M.139603 wurde aus dem obigen Konzentrat durch das folgende Verfahren gewonnen:

Der ölartige Rückstand (10,7 g) wurde in dem Mindestvolumen Äthylazetat aufgelöst und die sich ergebende Lösung auf den Säulenkopf aus neutraler Tonerde (Woelm, Ii, 200 g, 18 cm χ 4 cm) in Anwendung gebracht. Dabei handelte es sich um eine

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Aufschlämmung mit Äthylazetat. Die Säule wurde zunächst mit · Äthylazetat eluiert, anschließend mit einem Gemisch aus Äthyl azetat und Methanol in einem 50%igen Volumenverhältnis und schließlich mit Methanol· Die folgenden Fraktionen wurden erhalten, nachdem die Lösungsraittelfront aus der Säule ausgetreten war:

Fraktion Nr.	Volumen	Elutionsmittel	50	% Volumen/
1	150 ml	Äthylazetat		Volumen
2	150 ml	Äthylazetat	50	% Volumen/
3	150 ml	Äthylazetat		Volumen
4	150 ml	Äthyläzetat	50	% Volumen/
5	150 ml	Äthylazetat - Methanol		Volumen
			50	% Volumen/
6	150 ml	Äthylazetat - Methanol		Volumen
7	150 ml	Äthylazetat - Methanol
8	150 ml	Äthylazetat - Methanol

200	ml	Methanol
200	ml	Methanol
200	ml	Methanol

Von den Fraktionen 7 bis 11 einschließlich wurde mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel unter Entwicklung mit 20 % Volumen/Volumen Azeton in Petroläther (Siedepunkt 60-80 ⁰G) nachgewiesen, die Verbindung M.139603 (Rf etwa gleich 0,22) zu enthalten. Daher wurden diese Fraktionen vereinigt und eingedampft, wobei ein viskoser, gumartiger Rückstand (840 mg) erhalten wurde. Dieser wurde des weiteren mit Hilfe der präparativen Schichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel ("Kieselgel" 6OF-254 - Warenzeichen, 40 cm χ 20 cm, mit einer Dicke von 2 mm) unter Benutzung eines Gemisches von 20 % Volumen/Volumen Azeton in Petroläther (Siedepunkt 6O-8O ⁰C) gereinigt. Der im UV sicht-

2 1 4 7 S S - te -

bare Streifen bei R_f etwa gleich 0,22 (ungefähr) wurde von den beiden Platten abgekratzt und mit Äthylazetat extrahiert· Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, wobei ein viskoser gumartiger Rückstand (-240 mg) erhalten wurde, der nach Zugabe von Petroläther (Siedepunkt 60-80 ⁰C) auskristallisierte. Dieses Material wurde aus,Petroläther (Siedepunkt 60-80 ⁰C) umkristallisiert, wobei die Verbindung M.139603 in Form von farblosen Kristallen erhalten wurde. Diese wurden abfiltriert und getrocknet (210 mg). Sie wiesen einen Schmelzpunkt von 176-178 ⁰C auf. Das UV-Spektrum ergibt in Äthanol Absorptionen bei 234 nm (£, = 12900) und bei 272 nm (£ = 10800) auf. Die .Infrarotspektren sowie die magnetischen Kernresonanzspektren waren mit denjenigen identisch, die von dem Erzeugnis in Beispiel 1 erhalten wurden.

Beispiel 4

Die Verbindung M. 139603 (40 mg) wurde in einem Gemisch aus Azeton (10 ml) und Wasser (2 ml) aufgelöst, 1 ml 2If Salzsäure zugegeben und das Gemisch 5 Minuten lang kräftig umgerührt. Destilliertes Wasser (20 ml) wurde zugegeben und das Gemisch mit Dichlormethan (2 χ 10 ml) extrahiert· Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 211 Salzsäure gewaschen, gefolgt von einem Auswaschen mit destilliertem Wasser. Die Dichlormethanschicht wurde anschließend angereichert, wobei. ein viskoser gumartiger Rückstand (33 mg) in Porm der "freien Säure" als Äquivalent zu der Verbindung M.139603 erhalten wurde. Die Elementaranalyse ergab: Gefunden -G= 69,5 %, H = 9,1 %; berechnet für C₃₅H₅₃Og - G = 69,8 %, H = 9,0. . Das Infrarotspektrum in Nujol-Mull enthält gemäß Wiedergabe in Abbildung 3 charakteristische Absorptionen bei 3500, 1765, 1685, 1650, 1575 cm" . Das magnetische Protonenkernresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Abbildung 4 wiedergegeben«

Beispiel 5

Die der Verbindung M.139603 äquivalente "freie Säure" (30 mg)

147 96

wurde in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran (7 ml) und V/asser (1 ml) aufgelöst. Dem wäßrigen Tetrahydrofurangemisch wurde ein Alkalimetallhydroxid XOH (2I\i, 2 ml) zugegeben. Anschließend wurde das Gemisch 10 Minuten lang kräftig umgerührt, Wasser (10 ml) wurde zugegeben und die Lösung mit Äther (2 χ 15 ml) extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereinigt und eingedampft, wobei die Alkalimetallsalze entsprechend dem Natriumsalz M. 1396.03 erhalten wurden.

Wenn X = Kalium, wird das Kaliumsalz gewonnen· Der Schmelzpunkt liegt bei 146-150 ⁰C. Die Molekularformel entspricht C₃₅H₅₃OgK, wie auf Grund der Massenspektrometrie nachgewiesen ist· Wir haben es dabei mit einem Molekülion M⁺ der Masse 640335 zu tun (berechnet für G₃₅H₅₃OgK = 640338). Auf Grund der Elementaranalyse ergibt sich: Gefunden - C = 65,7 %, H= 8,5 % (berechnet für C₃₅H₅₃OgK -C= 65,6 %, E = 8,3 %).

Wenn X = Rubidium, wird das Rubidiumsalz gewonnen. Der Schmelzpunkt liegt bei 95-120 ⁰C. Die Molekularformel entspricht C₃₅H₅₃OgRb, wie auf Grund der Massenspektrometrie nachgewiesen ist« V/ir haben es dabei mit einem Molekülion M⁺ der Masse 686279 zu tun (berechnet für C₃₅H₅₃O₃Rb = 686286).

Beispiel 6

Die Fähigkeit der Verbindung M.139603 zur Erhöhung des prozentualen Anteils von Propionat auf Kosten des Azetates in der Pansenflüssigkeit von Schafen wurde wie folgt veranschaulicht:

23 Schafe wurden individuell gehalten und erhielten dasselbe Putter in einer Menge von 1 kg Trockengraswürfeln je Tier je Tag, aufgeteilt auf zwei Fütterungen pro Tag. Den Tieren · wurden zufällig 13 negative Vergleichskontrollen und 5 positive Vergleichskontrollen unter Verwendung von Monensin, einem bekannten modifizierenden Pansenmittel, und 5 Dosierungen der Verbindung M.139603 zugeordnet. Den behandelten Tieren wurde

21479

Monensin oder die Verbindung M.139603 oral in einer Menge von 0,5 mg/kg an jeweils vier aufeinanderfolgenden Tagen verab- · reicht· Proben der Pansenflüssigkeit wurden durch einen Hagerischlauch 6 Stunden nach der erfolgten Behandlung am 4· Tag ent nommen. Die Proben der Pansenflüssigkeit wurden anschließend auf Vorhandensein von Azetat- und Propionat analysiert, wie in Beispiel 2 weiter oben beschrieben ist· Die erzielten Ergebnisse können wie folgt angegeben werden:

Tabelle: Ergebnisse

Behandlungsgruppen Mol-% der gesamten flüchtigen

Fettsäuren (VPA)

Azetat Propionat

Negative Vergleichskontrollen 69,9 19,8 Positive Vergleichskontrollen

Monensin 0,5 mg/kg 57,1 32,3

Verbindung M.139603 0,5 mg/kg 54,2 39,9

Das Verhalten des Azetates in bezug auf die Verbindung M·139603 ist bei ρ kleiner als 0,02 signifikant, verglichen mit den positiven Vergleichskontrollen unter Verwendung von Monensin; und das Verhalten des Propionates in bezug auf die Verbindung M. 139603 ist bei einem ρ kleiner als 0,001 signifikant, verglichen mit den positiven Vergleichskontrollen unter Verwendung von Monensin.

Claims (2)

1. 2-14796

   Erfindunqsanspruch

   n/erp^t fressZeZZctrttf» gekennzeichnet dadurch, daß sie neben einer festen Substanz oder einer Flüssigkeit, einem eßbaren nichttoxischen Verdünnungsmittel oder einer entsprechenden Trägersubstanz die Verbindung M.139603 enthält, die folgende Kennzeichen aufweist

   a) Summenformel C₃₅H₅₃OgNa, nachgewiesen durch Massenspektrometrie, mit einem Molekülion M der Masse 624,361 (berechnet für C₃₅H^₃O₃Na = 624,364) , Elementaranalyse C = 67,5 %, H = 3,8 % (berechnet für C₃₅H₅₃O₃Na -C= 67,3 %, H = 8,5 %);

   b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull siehe Fig. 1 mit charakteristischen Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm"¹;

   c) NMR-Spektrum in Deuterio-Chloroform gemäß Fig, 2;

   d) UV-Spektrum in Ethanol-Lösung mit einer charakteristischen Absorption bei 234 nm (E= 12900) und 272 ( £ = 10800) ;

   nm

   e) Schmelzpunkt 176 - 178 ⁰C;

   f) C<&J Q³ = -82° (C = 0,2 in Methanol);

   oder die entsprechende freie Säure der Summenformel C^_nHj—O₀ enthält, mit einem R^-Wert von annähernd 0,55 bei

   12. 12. 80
   55 993 12
2. 2 1 L 7 9 S a/I

   Dünnschichtchromatografie über Kieselgel mit 0,25 mm Dicke aus einem Gemisch von Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Volumenverhältnis 95 : 4 : 1 und einer UV-Absorption in Ethanol von 274 nm ( £ = 13900), breit; oder andere Alkalimeiallsalze enthält, die davon abgeleitet werden.

   Hlerzn JLS^ten Zeichnungen