CS221514B2

CS221514B2 - Method of making the metabolite streptomyces longisporoflavus

Info

Publication number: CS221514B2
Application number: CS795335A
Authority: CS
Inventors: David H Davies; Geoffrey L F Norris
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1978-08-03
Filing date: 1979-08-02
Publication date: 1983-04-29
Also published as: BG40659A3; FR2433578A1; PT70023A; AT366892B; BE878042A; IT1162363B; US4279894A; NZ191105A; SU1324575A3; ZA793772B; DE2954593C2; RO79259A; NO156201C; HU179207B; CH649780A5; DE2931082A1; SE447910B; YU188079A; NO156201B; IE791403L

Description

Předmětem vynálezu je způsob výroby metabolitu Streptomyces longisporoflavus, vyznačující se tím, že' se .pěstuje kmen Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 produkující metabolit - M. 139,603 ve vodném živném prostředí s obsahem -zdroje využitelného uhlíku za stálého třepání a za aerobních podmínek - při teplotě 22 až 32 °C a při - pH 5 až 9, s výhodou 6 až . .8 získaná fermentační směs se extrahuje - -organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, rozpouštědlo se odpaří a popř. ' se sodná sůl M. 139,603 převede na volnou kyselinu a tato kyselina se popřípadě převede na . jinou alkalickou sůl. '

Vynález se týká způsobu výroby metabolitu Streptomyces longisporoflavus. Jde o sloučeninu, nazývanou M. 139,603, kterou je možno získat z aerobní kultury Sterptomyces longisporoflavus. Jde o novou sloučeninu sumárního vzorce

C53H550eNa.

Tato látka je vlastně sodnou solí sloučeniny M. 139,603, do oboru vynálezu spadá rovněž odpovídající volná kyselina a další soli této sloučeniny s alkalickými kovy. Tyto látky jsou účinné v tom smyslu, že snižují podíl methanu, vznikající při trávení v bachoru a zvyšují podíl kyseliny propionové ve šťávě bachoru, takže mají příznivý vliv na růst přežvýkavců, jak je to známo i v případě jiných sloučenin, které zvyšují koncentraci kyseliny propionové v bachorové šťávě, zejména u skotu nebo u ovcí. Nové sloučeniny mají rovněž antibakteriální účinnost proti gram-pozitivním mikroorganismům a antikokcidiální účinnost proti Eimeria tenella při testech in vitro.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat sloučeninu M. 139,603 s následujícími vlastnostmi:

a) Molekulární vzorec CssHssOsNa, jak je možno prokázat hmotovou spektrometrií, molekulární ion M⁺ má hmotnost 624,361 (vypočítáno pro C35H530eNa = 624,364] a pro C35H53O8.Na vypočteno: 67,3 % C, 8,5 % H; nalezeno: 67,5 % C, 8,8 % H.

b) Infračervené spektrum v nujolovém mulu je znázorněno na obr. 1 a obsahuje charakteristické absorpční pruhy při 3300,1725, 1645, 1565 a 915 cm-1.

c) Spektrum při protonové magnetické resonanci v deuterochloroformu je znázorněno na obr. 2.

d) Spektrum v ultrafialovém světle v ethanolovém roztoku má charakteristickou absorpci při 234 nm (E — 12 900) a 272 nm (E = 10 800).

e) Teplota tání je 176 až 178 °C.

f) [_a]_D23 ₌ _82° (c = 0,2 v methanolu).

Odpovídající volná kyselina má molekulární vzorec C35H54O8 a Rf = 0,55 při chromatografii na tenké vrstvě silikagelu (Merck Kieselgel 60F-254) o tloušťce 0,25 mm při použití směsi diethyletheru, methanolu a kyseliny mravenčí v objemovém poměru 95 : : 4 : 1. Spektrum v ultrafialovém světle v ethanolu má široký absorpční pruh při 274 nm (E = 13 900').

Způsobem podle vynálezu je možno vyrobit i soli této kyseliny s alkalickými kovy.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby metabolitu Streptomyces longisporoflavus, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 produkující metabolit M. 139,603 ve vodném živném prostředí з obsahem zdroje využitelného uhlíku za stálého třepání a za aerobních podmínek při teplotě 22 až 32 °C a při pH 5 až 9, s výhodou 6 až 8 získaná fermentační směs se extrahuje organickým rozpuštědlem, nemísitelným s vodou, rozpouštědlo se odpaří a popřípadě se sodná sůl M. 139,603 převede na volnou kyselinu a tato kyselina se popřípadě převede na jinou alkalickou sůl.

Kmen S. longisporoflavus, který produkuje sloučeninu M. 139,603 je možno získat pod číslem NCIB 11 426 bez omezení z National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skotsko.

Použitá prostředí jsou ve shodě s Internation Streptomyces Project (1SP) a byla popsána v publikaci Shirling, E. G. a Gottlleb D [International Journal of Systemic Bacteriology, 16, (3), 313 až 340, 1966]. Podmínky při Inkubací je možno popsat jako pěstování na denním světle při teplotě 25 °C.

ISP1 prostředí s tryptonem, extraktem z kvasnic a agarem po 5 dnech — nízké kolonie vlhkého a sametovitého vzhledu. Zadní strana nezbarvena po 13 dnech — nízké sametovité světlé granulární kolonie, zadní strana nezbarvena

ISP 2 agar s extraktem z kvasnic a sladem po 5 dnech — nízké sametově světle šedé kolonie, zadní strana bledě žlutá.

po 13 dnech — kolonie jsou vyšší a zvrásněné, sametoviíého tvaru, barva světle žlutohnědá, zadní strana špinavě šedá.

ISP 3 agar s ovesnou moukou po 5 dnech — velmi chudé až nízké kolonie, sametovitého vzhledu, světle žlutohnědé, zadní stranu nelze pozorovat po 13 dnech — kolonie mírně zvýšené, sametovité, světle šedé, zadní stranu není možno pozorovat.

ISP 4 agar s obsahem anorganických solí po 5 dnech — kolonie nízké, světle špinavě šedé, mírně granulované, zadní strana nezbarvena po 13 dnech — kolonie núzk^ vto^ho vz^hle^du, špinav^ěše^dé, za^dní strana vtoemráě nezbarvena.

ISP 5 agar s glycerinem a asparaginem po 5 dnech — ^ko^lonie n^íz^ké, mírn^ě granulovaný světle špinavě, šedé, zadní strana nezbarvena po 13 dnech — kolonie nízké, sametovité, světle šedé, zadní strana nezbarvena.

ISP 7 agar s tyrosinem po 5 dnech — velmⁱ c^hud^é až rnz^{ké g}ranulované sametovité světle špinavě šedé kolonie, zadní strana nezbarvena po 13 dnech — nízké sametovité, mírně zvýšené špinavě šedé kolonie, zadní strana špinavě šedá. Pří stárnutí na tomto prostředí se barva kultury mění na špinavě růžovou, avšak obsahuje oblasti temnějšího zbarvení v závislosti na sporulaci.

ISP 9 agar s různými zdroji uhlíku

Využití po 15 dnech — bez uhlíku — chudé submerzní kolonie— glukóza — nízké sametovité ^špinavě ^šedé kolonie+ ara^bin^óza — slabý r^ůst+ fruktóza — nízké sametovité ^ko^lonie^{, špi}nav^{ě š}edé+ inositol — velmi slabý růst— mannitol — ' nízké sametovité kolonie-rafíinóza — velmi slabý růst— rhamnóza — stebý r^ůst+ xylóza — slabý růst+

Obecné vlastnosti kultur

Nedochází k produ^km melarnný ani ^k produkci pi^gmentů na zadní stran^ě kuttu^ arn k žádné produkci roz^pustných ^pigmentů.

S^póry jsou produkovány v otevřených a hustých spirálách a často jsou mimo¹ vlastní osu je^št^ě da^{lší ř}etězce spor nebo ^podpůrné hyfy. Sopry jsou tak těsně u sebe, že je nesnadné je pozorovat běžným mikroskopem. štšny s^por jsou hla^dké^, ja^k b^ylo zjmtěno elektronovým mi^krosk:opem při použití 4% uranylacetátu.

Kmen S. longisporoflavus je rovněž možno ' získat bez omezení ze sbírky Centraalbureau voor Schimmelcultures, PO Box 273, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Netherlands, pod číslem CBS 312.79.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat sloučeniny M. 139,603 tak, že se pěstuje kmen Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426, nebo některá z jeho variant nebo . mutant.

Tímto způsobem je možno získat ' po ' pěstování kmene Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426, nebo některé ' z jeho variant nebo motaný živné prost^řed^í s obsahem slou^čenin^y M. ^139,6^03, toto živné prostfedí se pak extrahuje organickým rozpouštědlem neutišitelným s . vodou, například ethylacetátem.

Volná . kyselina, která odpovídá sodné soli sloučeniny M. 139,603 se může získat tak, že se okyselí roztok s ' obsahem sloučeniny M. 139,603. a tento okyselený roztok se extrahuje organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou. Jiné soli s alkalickými kovy je možno získat ta^ že se působí na roztok vo^ln^{é k}yseliny pristošným hydroxidem alkalického kovu, . například hydroxidem lithným, draselným nebo hydroxidem cesia nebo rubidia. V případě, že se užije ' hydroxidu sodného, získá se zpět sloučenina· M. 139,603, čímž je možno prokázat, že nedošlo ke změně struktury.

Jak j^iž b^ylo uvedeno, sloučeniny ^podle vynálezu zvyšují podíl kyseliny propionové v ^bachorov^{é š}ťávě, a to zv^láště na úkor podílu methanu a/nebo kyseliny octové. Je známo, že j^de o ž^ouri ^účinek . v meta^bohsmu přežvýkavců, protože ^kyselrna pro^pionová je daleko výhodnějším prekursorem glukózy, z níž si živočichové tohoto typu odvozují energetické zdroje, a tím i růst, než kyselina octová. Část ^krmⁱva^{, k}terá se m^ění na methan je pro výživu zvířete ztracena, protože methan uniká beze změny. Znamená to, že modifikace metabohsmu v ^bachoru, dosažen^á p^ůsobením slou^čemn po^dle vynálezy je velmi cenná a zvyšuje rychlost růstu a využití krmivá u přežvýkavců.

^idáv^m stoučenrn^ zfekané; způsobem po^dle vyrálezu, je te^dy mo^žno zvýšit rychlost růsto a/nebo zvýšit využití krmívá u přežvýkavců .tak že se těmto . zvířatům ^podává perorálně sloučenina jako taková, výsledné fermentační prostředí nebo extrakt tohoto fermentačního prostředí, jak bude dále popsáno.

Sloučenina podle vynálezu se podává s vý221!

hodou . perorálně jako doplněk běžného krmivá, a to zyláště ve směsi s běžným pevným krmivém, s tabletovaným krmivém nebo s lyzem, v roztoku v pitné vodě nebo v případě mladých zvířat, jako jehňat nebo telat, v mléce nebo odstředěném mléce. Do těchto· krmivových součástí se sloučeniny podle vynálezu včleňují tak, aby dávka účinné látky na jedno zvíře se pohybovala v rozmezí 0,01 až 30 mg/kg a den, s výhodou 0,01 až 10 mg/ /kg a den.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu je možno podávat perorálně také ve formě pomalu rozpustných tablet, takže každé zvíře dostane syrchu uvedenou dávku sloučeniny podle vynálezu denně tímto způsobem.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu je možno podávat celou dobu růstu nebo část růstové doby, například pp dobu časného růstu a/nebo před porážkou. Vzestup růstu, kterého· ' je možno tímto způsobem dosáhnout, umožní získat zvířata v ' ' 'jatečně váze za kratší dobu nebo je možno získat v téže době těžší kusy. Zlepšení · využitelnotsi 'krmivá podáváním sloučenin, vyrobených způsobem podle vynálezu umožňuje dosáhnout žádané hmotností zvířete . · při nižší spotřebě krmivá, než je tomu u zvířat, kterým se tyto látky nepodávají. V průběhu podávání nebylo možno· pozorovat žádné toxické příznaky, které by bylo nutno připsat sloučeninám podle vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat také ve formě ' prostředků, které obsahují sloučeninu, fermentační prostředí nebo extrakt tohoto prostředí spolu s pevným nebo kapalným ' požívatelným · netoxlckým ředidlem nebo nosičem.

Vhodným kapalným ředidlem nebo nosičem je například pitná voda, plné mléko nebo odstředěné mléko.

Pevným poživatelným, netoxlckým' ředidlem nebo nosičem · je například běžné vyvážené krmivo pro přežvýkavce, například krmivo pro skot nebo ovce, sestávající z obilovin, například ječné mouky, kukuřičné mouky nebo pšenice, pokrutin z ořechů nebo bavíníkových semen nebo extraktu z těchto pokrutin spolu s malým množstvím mouky z peří, mořských řas, kostní mouky, 'křídy, soli, močoviny, melasy, vitamínů a stopových prvků.

Mimoto může jít o pevná ředidla nebo· nosiče bez energetické hodnoty, například kaolin, mastek, uhličitan vápenatý, infusoriová hlinka, atapulgit, mleté ulity nebo mletý vápenec, popřípadě může jít o škrob nebo laktózu.

Takto získaný prostředek může mít formu doplňkového krmivá pro přímé podávání zvířatům, v tomto případě obsahuje 5 až 3000 ppm sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu ve směsi s běžným krmivém pro přežvýkavce, nebo může jít o koncentrované přídavné krmivo, které je určeno pro ředění běžným krmivém a pak se podá vá hospodářským zvířatům, tento koncentrát může obsahovat 0,3 až 50 hmotnostních procent sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu ve směsi s běžným, vyváženým krmivém pro přežvýkavce, inertním pevným ředidlem energetické hodnoty, například mletým vápencem nebo škrobem nebo laktózou.

Ve všech těchto přípravcích je možno sloučeninu podle vynálezu nahradit fermentačním prostředím nebo extraktem tohoto prostředí s obsahem ekvivalentního množství sloučeniny M. 139,603.

Svrchu uvedené prostředky je možno získat tak, že se stejnoměrně promísí sloučenina, získaná podle vynálezu, fermentační prostředí nebo extrakt tohoto prostředí s pevným použivatelným, ' netoxickým ředidlem nebo nosičem.

Sloučenina, získaná způsobem podle vynálezu se ' s výhodou sériově ředí ředidlem nebo nosičem ve dvou nebo více po sobě následujících stupních, aby bylo možno zajistit stejnoměrné promísení.

Jak již bylo uvedeno, · mají sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu antikokcidiální ' účinnost. Tuto účinnost je možno prokázat ' na tkáňové kultuře kuřecích . ledvinových · buněk, naočokvaných · sporozoity Eímeria tenella standardním způsobem, který · byl popsán v journal of Parasitology, sv. 58, str. 664 až 668 (1972). Při tomto testu sloučenina· M. 139,603· brání růstu sporoziotů v koncentrací nižší nebo rovné 0,001 ppm a · má toxické účinky hostitele až v koncentraci rovné nebo vyšší 0,33 ppm.

Sloučenina M. 139,603 je také účinná proti gram-pozitivním bakteriím, jako příklad je možno uvést, že inhibuje růst Staphylococcus aureus, Streptococcus feacalís, Clratridium walchii a Corynebacterium acne v koncentraci nižší nebo rovné 10 ^g/ml a je ji možno užít jako růstové látky 1 u ne přežvýkavců, například drůbeže a vepřů.

Vynález bude osvětelen následujícími příklady.

Příklad 1

Streptomyces NCIB 11 426 se pěstuje v Erienmeyerově baňce o obsahu 500 ml na agaru s peptonem a extraktem z kvasnic, tento agar obsahuje:

trypton — „Oxoid“ L 42 (obchodní název) 0,5 % (hmotnostní/objemová %) a extrakt z kvasnic — „Oxoid“ L 21 (obchodní název) v množství 0,3 % (hmotnostní/objemová %')

Tento materiál se předem sterilizuje v autoklávu 20 minut za atmosférického tlaku. Toto prostředí má pH 7,0. Baňka se pak třepe při teplotě 25 °C po dobu 120 hodin na rotační třepačce.

Obsah baňky 'se pak užije k naočkování 10 podobných baněk, z nichž každá 'obsahuje 200 ml následujícího prostředí.

glukózový sirup v množství 3,0 % (hmotnostní/objemová procenta) uhličitan vápenatý v mno^žství ^0,25 % (hmotnostn^otyemová procenta) chlorid sodný v mno^žství ^0,5 % ^motnostabobjemová procenta) heptahydrát síranu horečnatého v množství ^0,05 % (^hmotnostn^í/o^bjemov^áprocenta) koncentrát stopových prvků v množsM ^0,1 % (o^bjemov^á/o^bjemov^áprocenta) bakteriologický pepton (o^bc^hodm n^ázev „Oxoid“ L 37) v mno^žství ^0,1 % (hmotnos^tn^í/o^bjemov^áprocenta) práškový extrakt z hovězího masa (o^bchodn^í název ,Oxoid“ L ^29, „La^b Lemco“) v množství ^0,5 % (hmotnostnpotyemová procenta j deionizovaná voda ^do ¹⁰⁰ ohjemovýc^h %.

Směs se upraví na pH 7,2 a pak se před^běžně sterihzuje ' v auto^klávu pn toptotá ¹²⁰stu^pň^ů Celsia po do^bu. ²⁰ mrnut Naočkované ^baň^ky se ^protř^epávaj^{í 120 h}odm ^při tepotě 25 °C na rotační třepačce, pak se _ jejich obsah slije a upraví na pH 3 opatrným přidáváním 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Získaný materii se extrahuje ‘ ^dvakr^át 6⁰⁰ m^lethylacetátu, extrakty se slijí, vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se ' odpaří, čímž se získá 2>90 mg olejovitého _ zbytku.

Ethylacetátový extrakt se čistí preparativn^í chromatografh . na dvou ^desk^ác^h k^ysl^iční^ku Memtáhého (Měre^k „Kíeselgel“ ⁶⁰ F-²⁵4 o zozměru 20X20 cm a tloušťce 2 mm), přičemž jako rozpouštědla se užije ethylacetátu. Pás o Rf = 0,39 se vyjme a extrahuje et^hylacet^átem a roz^pou^št^ědlo se o^dpa^ří^, čím^žse získá 21 mg viskózního pryžovitého materiálu, který má in vitro antibakteriální účinnost proti S. aureus. Tato účinná frakce se dále čistí preparativní chromatografií na desce kysličníku křemičitého (Merck „Kieselgel“ ^{60 F}-²⁵⁴ o rozm^ěrec^h 20X20 cm a tloušťce 0,25), při použití . směsi diethyletheru, methanolu a kyseliny mravenčí . v objemovém ^poměru ⁹⁵ : ⁴ : 1. . P^ás o· Rf — 0^55 se vyjme a extrahuje ethylacetátem, čím se ^po o^dpa^řen^í roz^pou^štědla zfe^ ⁹ m^g visltozního pryžovitého produktu.

^Tato ^lát^ka se ^převe^de na sodnou · s^ůl

M. 139^,603 ^prot^ře^páním s ^{0,1 M} _ ^hydroxi^dem soudným v chloro^formov^ém roztok. Chloro^formov^á vrstva se od^l^ vysu^ší síranem so^dným a roz^ustádto se od^paří, ^čím^ž se získá 8 mg M. 139,603 . ve formě pevné, bílé látky o teplotě tání 129 až 132 ° . C, spektrum v infračerveném světle je znázorněno na obr. 1 a má maxima při 3300, 1725, 1645, ¹⁵6⁵ a ⁹15 cm^-1.

Pro CssHssOsNa v^ypo^čteno: ^67,3 % C ^8,5 % ^{H; n}ale^zeno: 67^,5 % C, ^8,8 % H.

Hmotové spektrum M⁺ = 6^361 v^ypočítáno pro C25H53O8 . Na = 624,364, ' Rf =0,39 při chromatografií na tenké . vrstvě silikagelu Měrek 60 F-524 o tloušťce 0,25 mm při .použití ethylacetátu, hnědá skvrna vznikne po postřiku 3 N kyselinou sírovou a po zahřátí na 100 °C. Spektrum při protonové magnetické resonanci v ' deuterochloroformu zobrazenému na obr. 2.

Příklad 2

Schopnost sloučeniny M. 139,603 k inhibici produkce methanu v bachoru. přežvýkavců a ke zvýšení podílu propionátu na úkor acetátu (Ac/рг) a tákavých mastnýc^h k^yselin (VFA) je možno prokázat následujícím způsobem:

Bachorová šťáva se odebere běžným způsobem od dvou býčků, krmených senem a koncentrátem. Pokud možno se standardizuje doba odběru .a šťáva, odebraná od obou zvířat se slije tak, že se mísí v poměru 1 : 1. ^pak se štáva zfHtruje ft^násobným mutem. Filtrát _ se zředí v poměru 1 díl filtrátu ke 3 dílům artčficiální bachorové šťávy připravené způsobem podle publikace G. L. Bales a další, Jo-urnal of Dairy Science, 1976, sv. 5^9, str. ^{1850 p}ři vynec^hání ^kyselin^y octové pH směsi se upraví na 6,9 až 7,0 nasyceným vodným roztokem uhličitanu sodného. Podíly z této směsi po 50 ml se vloží do baněk o obsahu 100 ml s obsahem 0,5 g sušeného m^le^tého sena a ^kaž^dá z táclito ^ban^ěk se užije ke z^koušen^í určhé toncentrace zkoumané látky.

Tato zkoumaná látka se přidá . do baňky v ethanolovém roztoku, baňky se promyjí kyshíínftem uh^ličitým^, zazátkují a inhibují 15 a^{ž 16} hodin ^při te^plotě 39 °C. Po hodině se z^táa proraz^í jetoou ^k odstranil přebytečného plynu a jeh^la se odstraní 30. minut před ukončením inkubace. Pak se fermentace zastaví položením baněk na led a po 15 mrnutác^h chlazení se ^plyn na^{d k}a^palinou ^anal^yzuje na přítomnost metoanu ^plynovou c^hr^omatogra^fií. ^Obsah ban^ěk se ^pa^k zfdtruje sintrém, ^který Ьу^{1 p}re^dem v^ysu^šen a uložen ^do . s^klen^ěn^é n^álev^ky. ^Tři vzor^ky filtrátu se analyzuj^í ptynovou chromatografií na ^přítomnost vFa a srovnávají se s hladinou VFA pře^{d i}n^ku^bac^í, immoto se stanoví množství ^VFA (acetátu a ^opon^u^ ^produkovatelných v ^pr^ůběhu inkubace.

21514 maných látek. Pozitivní kontrolou byl mo nensin, známý růstový faktor s vlivem na me tabolismus bakterie.

Tímto způsobem byly získány následující výsledky, vyjádřené jako % kontrolních hodnot, které byly získány bez použití ' zkou12

Sloučenina	Koncentrace (Ug/ml	Methan % kontrol	Poměr acetát/propionát % kontrol
M. 139,603	1,0	58	62
	0,3	72	64
	0,1	87	70
Monensin	1,0	67	79
	0,3	90	87
	0,1	100	95

Příklad 3

Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 '426 se pěstuje v šikmé kultuře na 45 ml agaru ISP-7 po dobu 7 dnů při teplotě 30 °C. Tři zkumavky šikmého agaru se užijí k naočkování tří baněk s obsahem 100 ml sterilní vody a touto suspenzí se naočkují tři baňky o obsahu 2 litrů, z nichž každá obsahuje 1 litr následujícího živného prostředí.

glycerol v množství 3,0 % hmotnostní/objemová %) bakteriologický pepton (obchodní název „Oxoid“ L-37j v množství 2,0 % (hmotnostní/objemová procenta) dihydrogenfosforečnan draselný v množství 0,024 % (hmotnostní/objemová procenta)

MgSO4.7HzO v· množství 0,02 % (hmotnostní/objemová procenta) .....

koncentrát stopových prvků v množství 0,1 % objemových křída v množství 0,1 % (hmotnostní/objemová procenta) deionizovaná voda 'do 1 litru.

Toto prostředí bylo předběžně sterilizováno v autoklávu při atmosférickém tlaku po dobu půl hodiny, pH prostředí bylo přibližně 6,7.

Tři takto připravené baňky o' obsahu 2 litrů byly třepány ' 3 dny při teplotě 30 °C na rotační třepačce. Pak ' byl obsah baněk slit a užit k naočkování fermentoru z ' nerezové oceli s obsahem 30 '' litrů sterilizovaného·' živného prostředí následujícího složení: .....

glycerol v množství 3,0 % (hmotnostní/objemová procenta) sójová mouka BSP 70 v množství 1,0 % (hmotnostní/objemová procenta) křída v množství 0,25 % (hmotnostní/objemová procenta') cerelóza v množství 3,0 % (hmotnostní/objemová procenta) chlorid sodný v množství 0,5 % (hmotnostní/objemová procenta')

MgSO47HžO ...........

v množství 0,05 ' % (hmotnostní/objemová procenta) koncentrát stopových prvků v množství 0,1 % objemových destilovaná voda do 30 litrů. '

Obsah fermentoru se míchá při teplotě 30 °C po dobu 70 hodin vrtulí se čtyřmi plochými lopatkami při 350 otáčkách za minutu za provzdušňování 15 litrů za minutu. Ke směsi se před sterilizací v autoklávu přidá 30 ml protipěnivého prostředku s obsahem silikonu (Silcolaps). Prostředí po fermentaci má pH 7,9, získá se 22 litrů fermentačního prostředí, které se za stálého míchání smísí se stejným objemem ethylacetátu. ' Po ' 30 minutách se směs oddělí odstředěním a přibližně 18 litrů ethylacetátového extraktu se vysuší síranem sodným a zfiltruje.' Filtrát se zahustí za sníženého tlaku .' na 10,7 g olejovitého zbytku.

Z tohoto koncentrátu se · získá sloučenina M. 139,603 následujícím způsobem:

Sloupec se vymyje ethylacetátem a pak se promýchá směsí ethylacetátu o koncentraci objemových % a nakonec methanolem.

Byly získány následující frakce.

10,7 g olejovitého zbytku se rozpustí v co nejmenším objemu ethylacetátu a výsledný roztok se nanese na vrchol sloupce neutrálního kysličníku hlinitého (Woelm N, 200 g, rozměry sloupce 18X4 cm) v ethylacetátu.

Číslo frakce Objem (ml) Eluční činidlo

1	150	ethylacetát
2	150	ethylacetát
3	150	ethylacetát
4	150	ethylacetát
5	150	ethylacetát-methanol 50 objemových %
6	150	ethylacetát-methanol
		50 objemových %
7	150	ethylacetát-methanol 50 objemových %
8	150	ethylacetát-methanol 50 objemových %
9	200	methanol
10	200	methanol
11	200	methanol

Při chromatografií na tenké vrstvě silikagelu a při použití 20 objemových % acetonu v petroletheru při teplotě varu 60 až 80 °C bylo možno prokázat, že frakce 7 až 11 obsahují sloučeninu M. 139,603 (Rf přibližně 0,22). Tyto frakce byly slity a odpařeny, čímž bylo získáno 840 mg viskózního pryžovitého materiálu, který je možno dále čistit preparativní chromatografií na vrstvě kysličníku křemičitého (Merck „Kieselgel“ 60G-250 o rozměru 40 X 20 cm a tloušťce 2 mm), elučním činidlem byl aceton o koncentraci 20 olremových % v petroletheru o teplotě varu 60 až 80 °C. Pás o Rf přibližně 0,22, viditelný v ultrafialovém světle byl z obou desek vyjmut a extrahován ethylacetátem, extrakt by odpařen dosucha, čímž bylo získáno 240 mg viskózního pryžovitého materiálu, který po přidání petroletheru o teplotě varu 60 až 80 °C vykrystalizoval.

Tento materiál je možno podrobit překrystalování z petroletheru o teplotě varu 60 až 80 °C, čím se získá 210 mg sločeniny M. 139,603 ve formě bezbarvých krystalů o teplotě tání 176 až 178 °C. Absorpční spektrum v ultrafialovém světle v ethanolu má pásy při 234 nm (E = 12 900) a 272 nm (E = = 10 800). Spektrum v infračerveném světle, NMR-spektrum bylo totožné se spektry, získanými pro výsledný produkt z příkladu 1.

Příklad 4 mg sloučeniny M. 139,603 se rozpustí ve směsi 10 ml acetonu a 2 mi vody. Přidá se 1 ml 2 N kyseliny chlorovodíkové a směs se energicky míchá 5 minut. Pak se přidá 20 ml destilované vody a směs se extrahuje dvakrát 10 ml dichlormethanu. Organická vrstva se oddělí a promyje 2 N kyselinou chlorovodíkovou a destilovanou vodou. Dichlormethanová vrstva se pak odpaří na 33 miligramy viskózní pryže, která je ekviva lentem sloučeniny M.139,603 a má formu volné kyseliny.

Pro C35H.54O9 vypočteno: 69,8 % C, 9,0 % H; nalezeno: 69,5 % C, 9,1 % H.

Spektrum v infračerveném světle v nujolovém mulu je znázorněn na obr. 3 a má charakteristické absorpční pásy při 3500, 1765, 1685, 1650, 1575 cm^-1, spektrum v protonové magnetické resonanci v deuterochloroformu je znázorněno na obr. 4.

Příklad 5 mg volné kyseliny sloučeniny M.139,603 se rozpustí ve směsi 7 ml tetrahydrofuranu a 1 ml vody. Pak se přidají 2 ml 2 N hydroxidu alkolického kovu a vodná tetrahydrofuranová směs se energicky míchá 10 minut. Pak se přidá 10 ml vody a roztok se extrahuje dvakrát 15 ml etheru. Etherové extrakty se slijí a odpaří, čímž se získá alkalická sůl sloučeniny M. 139,603, která je ekvivalentem sodné soli.

V případě, že se užije hydroxidu draselného, získá se draselná sůl o teplotě tání 146 až 150 stupňů Celsia o molekulárním vzoirci C35H55O8 . K, jak je možno zjistit hmotovou spektrometrií, která prokáže molekulární ion M⁺ = 640.335 (vypočítáno pro C35H53O8 .K = 640.338).

Pro C35H53O8. К vypočteno: 65,6 % C, 8,3 % H; nalezeno: 65,7 % C, 8,5 % H.

V případě, že se užije hydroxidu rubidia, získá se sůl rubidia o teplotě tání 95 až 120 stupňů Celsia s molekulárním vzorcem C35H53O8 . Rb, jak je možno zjistit hmotovou spektrometrií, která prokáže molekulární ion M ⁺ = 686.279 (vypočítáno pro C35H35O8 . . Rb = 686.286)

Příklad 6

Schopnost sloučeniny M. 139,603 ke zvýšení podílu propionátu na účet acetátu v bachorové šťávě ovcí byla prokázána následujícím způsobem.

ovcí bylo ustájeno odděleně a všem ovcím bylo podáváno stejné krmivo, a to 1 kg sušené lisované trávy na zvíře a den ve dvou denních dávkách. Ze zvířat bylo odděleno 13 negativních kontrol, 5 pozitivních kontrol, jimž byl podáván monensin, který je známým růstovým faktorem pro přežvýkavce, 5 zvířatům byla podávána sloučenina M. 139,603. Skupině pozitivních kontrol byl podáván monensin, skupině pokusných ovcí sloučenina M. 139,603 perorálně vždy v dávce 0,5 mg/kg čtyři po sobě následující dny, čtvrtého dne byly žaludeční sondou odebrány vzorky bachorové šťávy 6 hodin po podání poslední dávky účinné látky. Vzorky bachorové šťávy byly pak analyzovány na obsah acetátu a propinonátu stejným způsobem jako v příkladu 2. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Pokusná skupina

Mol. % celkových VFA acetát propionát

negativní kontroly	69,9	19,8
pozitivní kontroly
monensin 0,5 mg/kg	57,1	32,3
M. 139,603 0,5 mg/kg	54,2	39,9

Vliv sloučeniny M. 139,603 na acetát je statisticky významný při p < 0,02 ve srovnání s pozitivní kontrolou s monesinem, vliv na propionát je statisticky významný při p <0,001 ve srovnání s pozitivní kontrolou, která obdržela monensin.

Claims

Způsob výroby metabolitu Streptomyces longisporoflavus, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Streptomyces longisporoflavus ŇCIB 11 426 produkující metabolit M. 139,603 ve vodném živném prostředí s obsahem . zdroje využitelného uhlíku za stálého třepání a za aerobních podmínek při teplotě

22 až 32 °C a při pH 5 až 9, s výhodou 6 až 8, získaná fermentační směs se extrahuje organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, rozpouštědlo se odpaří a popřípadě se sodná sůl M. 139,603 převede na volnou kyselinu a tato kyselina se popřípadě převede na jinou alkalickou sůl.