SE437917B - Djurfoder innehallande en ny kemisk forening som befremjar tillvexten och forbettrar fodertillgodogorandet hos djur - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 40 8107272-0 1) Elementaranalys och summaformel Beräknat för C69 H96 03" (1H68) beräknat: C 56,U0 H 6,5ü 0 37,05 UOCH5 7,8 funnet* : C 56,19 H 6,5U 0 57,25_ OCHB 7,9 * efter torkning Å dagar i högvakuum vid 100°C.

Det bör dock nämnas att vid så stora molekyler omöjliggör ele- mentaranalysens felmarginal (i0,8% för den enskilda bestäm- ningen) beräkningen av en exakt summaformel (B.B.Woodward, Angew. Chem. Qg, sid. 50-51 (1957)). Den angivna summaformeln kan därför vara något felaktig. 2) Smältpunkt Substansen börjar sönderdelas lätt vid ca 1H2°C och sönder- delas kraftigt från ca 177°C. Vid en värmningshastighet av ca 5°C per minut-kan ett smältningsförlopp iakttagas inom tempera- turområdet 196-205°C. 3) Specífik vridning [7Å;7šD = -6,60 (C = 1,02 i metanol) 4) Molekylviktsbestämning Molekylvikten bestämdes genom ångtrycksosmometri av en kloro- formlösning av den nya substansen. 1570 (C = 2,10%) 1630 (C = 1,05%) 5) Ultraviolettabsorptionsspektrum UV-spektret för den verksamma föreningen framgår av fig. 1 (abskíssa: våglängd i mp, ordinata: extinktion): 7\ X = 307 nm (C = 0,0106% i metanol) ma.

KEÜ/CHJ 307 nm = 351 6) IR-absorptionsspektrum IR-absorptionsspektrum för den verksamma. produkten framgår av fig. 2 (abskíssa: vågtal i cm_1, ordinata: absorption). Absorp- tionsband uppträder vid följande våglängder (uttryckt i reci- proka centimeter) när produkten ingick i pressade KBr- -tabletter: 10 15 20 25 8107272-0 Bandfrekvens Intensitet Bandfrekvens Intensitet cm_1 cm_1 3U5O s 1195 s 2980 m 1150 S 2940 m 10H0 s 2900 m 945 m 1710 m 905 m 1615 s 870 m 1U50 m 8üO m 1Ä15 m 820 m 1375 s 785 m 1310 s 750 m 1290 s 735 m 1255 s 700 m 1215 s 7) 8) 1H-kärnspínnresonansspektrum, anges i delar per million (ppm) och svängningar per sekund (Hz). Se fig. 3. 1BC-kärnspinnresonansspektrum. Se fig. 4. 130-kärnspínnresonansspektret visar följande signaler, angivna i delar per million (ppm) och svängningar per sekund (Hz), i deras relativa íntensiteter: 8107272-0 4 Signal Nr. Intensitêt Signalläge (Hz) Signalläge (ppm) 1 66 5 4206.3 166.925 2 33 3657.6 1454149 3 42 3514.1 139.456 4 '35 5436.1 136.357 _ 5 -37 3389.4 134.506 6_ 41 3344.7 -~ 132.730 7 42 3286.o 130.402 8 174 3233.4 128.316 9 72 5230.6 128.205 10 , 204 3155.1 125.209 11 79 3053-0 121.157 12 37 3037.3 120.533 13 99 3033.6 120.386 14 49 3012.? 2 119.556 15 20 2632.3 104.463 16 23 2561.2 101.638 17 23 2511.8 99.680 18 22 2434.5 96.612 19 32 2419.? 96.024 20 31 . 2399.8 - 95.234 21 23 2174.2 ' 86.283 22 49 2074.? 82.334 23 ~ 62 2057.0 _ 81.631 24 37 2037.8 80.868. 25 ~ 41 2031.4 80.614 26 44 2006.1 79.612 27 89 1969.0 78.138 28 39 1963.0 77.900 - 29 _41 1955.5 77.602 30 41 1941.9 77.062 31 95 1937. 3 , 76.879 32 ~ .93 1905.5 75.620 33 _ 38 1898.6 - 75.345 34 89 1893.6 75.147 35 _ 56 1878.4 74.543 36 70 1843.9 73.176 37 - 64 _ 1831.9 72.700 38- 92 1811.5 71.889 39 39 .1805.4 71.647 40- 61 1790.9 71.071 41 58 l777.8 - 70.550 42 ' 38 1767.? 70.149 43 41 1763-5 69.982 44 59 1745.0 -_ 69.251 45 ' 34 ~ '1731.6 68.719 46 62 1562.4 62.004 47 44 1558.0 61.830 48 32 l536.4 ' 60.972 49 34 1488.2 59.061 50 21 508.7 20.190 51 21 506.6 20.106 52 . 70 450.9 17.893 53 7 45 404.4 16.050 54 61 0.0 0.000 10 15 20 25 30 35 81 (17272-0 9) Den verksamma föreningen är lättlöslig i kloroform, aceton, ättiksyraetylester, acetonitril, dimetylformamid, di- metylsulfoxid och de lägre alkoholerna, t.ex. metanol och etanol, men mindre löslig i vatten, dietyleter, petroleter och cyklohexan. I 10) Den verksamma produkten kan genom sur och alkalisk hydrolys omvandlas till föreningar vilka har antibiotisk verkan. Sålunda erhålles exempelvis med saltsyra i metanol och vatten (1 + 1 volymdelar) vid pH ü,5, och med natríum- hydroxid i metanol och vatten (1 + 1 volymdelar) vid pH 11, vid rumstemperatur redan inom några timmar nedbrytningspro- dukter vilka har tydlig verkan in vitro mot gramnegativa och grampositiva bakterier, t.ex. Escherichia coli. 11) Den verksamma produkten i fodren enligt uopfinningen är en amorf färglös neutral substans, som ej vandrar vid elektrofores. Vid kraftigare sur hydrolys avspaltas olika re- ducerande sockerarter (t.ex. med vattenhaltig 10%-ig (vikt) svavelsyra vid 8000). Substansen kan därför lätt göras synlig vid tunnskiktskromatografi på en kiselgelplatta med sockerrea- gens (t.ex. med anisaldehyd-svavelsyra, tymolsvavelsyra, vanillin-perklorsyra eller dimedon-fosforsyra) eller med molybdatfosforsyra genom karakteristisk färgning. Några fäger som kan tjäna som identifikation anges i tabell 1.

Tabell 1 Nr Reasens * Färg underlag 1 10% H2S0n brunt vitt 2 Jod brunt brungult 5 Molybdatfosforsyra blågrönt blekgrönt M Silvernitrat-NH3 brunt ljusbrunt 5 TYm°1"H2S04 rödviolett färglöst' 6 Dimedon-H3P0¿ _ grönt färglöst (1 UV-lgus gult) 7 Anisaldehyd-HZSOH grönt -färglöst 8 Vanillin-HCIOÄ brunt färglöst *a1o7272-0 10 15 20 25' 30 35 NO * Reagensen tillreddes enligt vanliga föreskrifter (jfr.

E.Stah1, Dünnschichtchromatographie, 2:dra upplagan, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York (1967)). 12) RF-värdena för den verksamma substansen på neutrala kiselgelplattor (Fa. Merck, Darmstadt, Bundes- republik Deutschland) i jämförelse med erytromycinbas i olika elueringsmedel anges i tabell 2.

Tabell 2 RF-värde för BF-värde för Nr Elueringsmedel (volymdelar) den nya före- erytromycin- ningen bas Kloroform + metanol 1 95 + 5 0,00 0,00 2 90 + 10 0,27 0,08 3 80 + 20 0,59 0,21 H 50 + 50 " 0,85 0,26 5 Kloroform + metanol + ammoniak* H0 + 6 + 1 0,3ü 0,62 6 Metanol . 0,83 0,25 Butanol + isättika + vatten _ 60 + 20 + 20 0,55 0,39 * vattenlösning innehållande 25 vikt% ammoniak _ Det i fig. 3 visade 220 MHz 1H-kärnspinnresonansspektret registre- rades för en lösning av den_yerksamma substansen i:deuteri- serad kloroform med tetramétylsilan som inre standard medelst en HR-SC-Spektrometer.frân firma Varian Associates, Paolo Alto, Kalifornien, Usnf ' 13C~kärnspinnresonansspektret (fig. H) registrerades för samma lösning medelst en XL-100-Spektrometer (15“) från firma Varian vid 25,2 MHz under protonbrusavskärmningz.

IR~bandintensiteterna betecknas med s, m och w. Ett s-band visar minst 2/3 av intensiteten för det starkaste bandet i spektret, ett m-band visar en intensitet inom området 1/3-2/3 för det starkaste bandet i spektret och ett w-band visar mindre än 1/3 av-intensiteten för det starkaste bandet. Dessa 10 15 20 25 30 55 HO 8107272-0 beräkningar baserar sig på den procentuella genomskinligheten. överraskande framställes den nya substansen enligt uppfin- ningen av de ovannämnda Actinoplanes-stammarna och kan med gott utbyte isoleras ur kulturmediet.

Vid förfarandet enligt stamansökan för framställningen av den nya föreningen kan de nya Actinoplanes-stammarna SE 73 och SE 73/B användas.

De insatta Actinoplanes-stammarna SE 73 och SE 73/B tillhör klassen Schizomyceter, ordningen Actinomycetales, familjen Actinoplanaceae och arten Actinoplanes. Stammen SE 73 isolera- des ur jord. Stammen SE 73/B erhölls som spontanmutant av stam- men SE 75. Stammarna SE 73 och SE 73/B har följande kännetecken: Myceliet är 0,3-1,3)1brett och grenat. Sporangierna har oregelbunden form, med en kontur som närmast är kulformig med bucklig yta, och en diameter av 5-18 ß . Sporerna är kul- formiga till ellipsoida, försedda med gisseltrådar och snabbt rörliga och har en diameter av 0,7-1,3 }1. I sporangiet är de ordnade i form av krokiga och hopgyttrade kedjor.

Nedanstående uppställning anger kännetecknen för kulturer på olika närsubstrat, registrerade efter 1N dagar vid en till- växttemperatur av 20-30°C: Cznpek-agar W god till mycket god S SM orange LP svagt brunaktigt gult Spg. +, mycelytan tunt besådd CPC y W god till mycket god (Casamino-Pepton- SM orange till orangebrunt Czapek-agar) LP brunt Spg. ++, mycelytan tunt besådd Mjölk-agar S W god till mycket god SM orange LP guldbrunt Spg. ++, mycelytan tunt besådd kaseinpeptoniserad 10 15 20 25 30 55 H0 8107272-0 8 Tyrosin~agar W måttlig till god SM brunt LP brunt Spg. -, mycelytan delvis tunt besådd tyrosinkristaller ej upplösta Melaminbildning positiv Mjölk-peptonisering positiv W = tillväxt - = saknas SM = substratmycel + = tydlig förekomst LP = löslígt pigment ++ = mycket tydlig förekomst Spg.= sporangiumbildning Stammen SE 73/B skiljer sig från stammen SE 73 genom en större produktion av den verksamma substansen.

Förfarandet enligt stamansökan för framställning av den nya verksamma substansen kan genomföras med hjälp av fasta, halv- fasta eller flytande närsubstrat. Företrädesvis användes dock vattenhaltiga flytande närsubstrat.

Ympningen av närsubstratet sker enligt vanliga metoder, t.ex. över snedagarrör eller kolvkulturer.

Odlingen utföres vid aeroba betingelser och kan genomföras en- ligt vanliga metoder, såsom under användning av skakkulturer t.ex. i skakkolvar, luftomrörda kulturer eller nedsänkta kulturerl Företrädesvis utföres odlingen enligt det aeroba neddoppningsförfarandet i luftade fermenteringskar, t.ex. i vanliga neddoppningsfermenteringskar. Odlingen kan_ske konti- nuerligt eller diskontinuerligt. Företrädesvis arbetar man dískontinuerligt.

Odlingen kan utföras i alla närsubstrat som på känt sätt nyttjas vid odling av mikroorganismer av ordningen Actino- mycetales. Närmediet måste innehålla en eller flera assimiler- bara kolkällor och kvävekällor samt även mineralsalter, vilka produkter kan föreligga i form av definierade enskilda be- ståndsdelar men även i form av komplexa blandningar, såsom isynnerhet biologiska produkter av olika ursprung. Som kol- källor ifrågakommer alla vanliga kolkällor. Exempelvis kan nämnas stärkelse, melass, vasslepulver, dextrín, socker såsom 10 15 20 25 30 35 NO 8107272-0 sackaros, maltos, glukos, laktos, sorbitol och glycerol. Som kvävekällor ifrågakommer alla vanliga, organiska och oorganiska kvävekällor. bomullsfrömjöl, linsmjöl, ärtmjöl, lösliga och olösliga vegetabiliska proteiner, majskällvatten, jästextrakt, pepto- ner och köttextrakt, samt även ammoniumsalter och nítrater, t.ex. NHuCl, (NH”)2S0u, NaNO5 och KNO3. Mineralsalterna som skall förekomma i närsubstratet avger t.ex. följande joner: Exempelvis kan nämnas sojabönmjöl, + + och NO _ , Na+, K+, Ca+ 3 Mg* , NHu*, cl", sou'", Poq"" samt även joner från de vanliga spårelementen, såsom Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Om kol- eller kvävekällorna eller det an- vända vattnet ej innehåller tillräcklig mängd av dessa salter eller spårelement är det lämpligt att i motsvarande grad komplettera närsubstratet. Närsubstratets sammansättning kan variera inom vida gränser. Närsubstratets art och sammansätt- ning beror i allmänhet på de beståndsdelar som vid varje till- fälle lämpligast står till förfogande.

Vid utförandet av förfarandet kan det vara lämpligt att när odlingen av Actinoplanes-stammarna påbörjas endast använda relativt ringa koncentrationer av de i närsubstratet lösliga beståndsdelarna och sedan under loppet av de tre första kultiveringsdagarna tillföra ytterligare näring genom ofta upprepade tillsatser av ifrågavarande komponenter i form av en steril, relativt koncentrerad lösning. - Den växande kul- turens pH-värde skall företrädesvis hållas mellan ca 6 och ca 8, isynnerhet mellan 6,5 och 7,5. En alltför kraftig pH- -sänkning inom det sura området kan undvikas genom tillsats av en organisk eller oorganisk bas, företrädesvis CaCO3. Så- som är vanligt inom fermenteringsteknologin kan pH-reglering- en även utföras automatiskt genom att steril organisk eller oorganisk syra, t.ex. HESOH, eller steril lut, t.ex. Na0H, periodvis tillföres kulturlösningen.

Man bör lämpligen tillförsäkra sig om att mikroorganismerna kommer i kontakt med en tillräcklig mängd syre och när- substanser. Detta kan åstadkommas med vanliga metoder, såsom skakning och omröring. 10 15 20 25 30 35 H0 8107272-0 10 Odlingstemperaturen kan ligga mellan ca 20 och ca UOOC, före- trädesvis mellan 25 och 35°C, och isynnerhet föredrages ca 28°C. Odlingstiden kan variera avsevärt, varvid t.ex. när- mediets sammansättning och odlingstemperaturen är av betydelse.

De vid varje tillfälle optimala betingelserna kan lätt fast- ställas av en fackman inom det mikrobiologiska området.

Det har visat sig att mängden av den i närsubstratet tillväx- ande verksamma substansen i allmänhet när sitt maximum ca 2-12, företrädesvis 5-8 dagar efter det att odlingen påbörjats.

Såsom är vanligt vid mikrobiologiska förfaranden skall främ- mande infektioner av kulturmedierna undvikas. Vanliga preven- tiva åtgärder skall därför vidtagas, såsom sterilisering av närsubstratet, behållarna och den för luftningen erforderliga luften. Vid steriliseringenuav anläggningen kan man exempelvis använda sig av både äng- och torrsterilisering.

Om det vid odlingen uppstår en icke önskad mängd skum kan man tillsätta vanliga kemiska antiskummedel, t.ex. flytande fetter och oljor, olja-vattenemulsioner, paraffiner, högre alkoholer såsom oktadekanol, silikonoljor och polyoxieten- eller poly- oxipropenföreningar. Skummet kan också dämpas eller avlägsnas med hjälp av vanliga mekaniska anordningar (vilka t.ex. ut- nyttjar centrifugalkraften).

Den verksamma föreningen kan isoleras ur myceliet och/eller kulturmediet enligt vanliga fysikalisk-kemiska metoder. Isole- ringen kan t.ex. ske genom extraktion, utfällning och/eller kromatografi. Den isolerade verksamma substansen kan även fin- renas med hjälp av de nämnda metoderna. I många fall erfordras emellertid ej någon finrening, eftersom de eventuellt när- varande föroreningarna ej har någon negativ inverkan på den' verksamma substansens effekt. Vid alla isolerings- och renings- förfaranden måste man se till att pH-värdet hålles från 7,0 och högre, företrädesvis mellan 7,0 och 9,0. För att höja pH- värdet kan man tillsätta organiska eller oorganiska baser, t.ex. ammoniak, alkali- och jordalkalihydroxider, alkali- och jordalkalikarbonater och vätekarbonater, exempelvis KOH, NaOH, Na2C0 NaHCO CaC03, och trialkylaminer 5' 3” 10 15 20 25 30 35 H0 8107272-0 ll såsom trietylamin, morfolin och pyridin. För att vid de nämnda isolerings- och reningsförfarandena utröna i vilka frakti0ner den verksamma šubstansen har den högsta koncentrationen eller renheten tillämpas de vanliga fysikaliska-kemiska metoderna, exempelvis bestämning av UV- -bandet vid 307 nm eller av RF-värdet.

Isoleringen och reningen av den verksamma substansen kan t.ex. ske på följande sätt, när ett flytande vattenhaltigt när- substrat användes: Till den myceliehaltiga kulturbuljongen sättes ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel och blandas noga, varvid å ena sidan aktiva ämnen extraheras ur myceliet och å andra si- dan en klarning av kulturbuljongen sker.

Som lösningsmedel kan man t.ex. använda lägre alkylalkoholer (C1-Ch), såsom metanol, etanol, n- och isopropanol eller tert.-butanol, dimetylformamid, tetrahydrofuran och isynner- het föredrages aceton. Mängden lösningsmedel kan variera inom vida gränser. Företrädesvis tillsättes ungefär samma volym som kulturbuljongen har. Därefter avskiljes icke lösta be- ståndsdelar (mycel, utfällda proteiner osv) genom filtrering, centrifugering, avsättning osv. .

Den vattenhaltiga organiska lösningen indunstas lämpligen i vakuum, exempelvis till det insatta kulturmediets volym.

Eventuellt inställer man medelst en bas (jfr. ovan), företrä- desvis med NaOH, ett pH-värde över 7,0, t.ex. ett pH-värde av 9,0. Den på så sätt framställda lösningen betecknas i det följande "lösning I".

Ur "lösning I" kan den aktiva substansen isoleras med hjälp av vanliga extraktionsförfaranden, fäll- ningsförfaranden och/eller kromatografiförfaranden och even- tuellt renas. Kromatograferíngen kan utföras som kolonn- kromatografi eller preparativ tunnskiktskromatografi. Som adsorptionsmedel kan man använda alla vanliga (icke sura) oorganiska eller organiska adsorptionsmedel, som t.ex. 10 15 20 25 30 5 H0 8107272 Û 12 aluminiumoxid, kiselgel, magnesiumsilikat, aktivt kol, cellu- losa, cellulosaderivat, konsthartser som polyamider, derivat av polyamíder osv, t.ex. acetylerad polamid eller dextrangeler.

Som elueringsmedel vid preparativ tunnskiktskromatografi kan man insätta sådana olika lösningsmedel eller lösningsmedels- blandningar i vilka den verksamma substansen är löslig.

Företrädesvis användes en blandning av kloroform och metanol (t.ex. 9:1 volymdelar). Som elueringsmedèl vid kolonnkromato- grafi kan man likaså insätta sådana lösningsmedel eller lös- ningsmedelsblandningar i vilka den verksamma substansen är löslig. Exempelvis kan nämnas koltetraklorid, metylenklorid och företrädesvis kloroform.

Vid isoleringen av den verksamma substansen tillämpas före- trädesvis något extraktionsförfarande, eventuellt i kombina- tion med något kromatografi- eller fällningsförfarande. Vid extraktion bör man se till att extraktionsmedlet, beroende på om den antibiotiska substansen enligt uppfinningen skall före- ligga i vattenfasen eller i den organiska fasen, väljes så att substansen är svårlöslig respektive lättlöslig i det- samma.

Extraktionen kan exempelvis utföras på följande sätt: "Lösning I" extraheras med något organiskt lösningsmedel som ej är blandbart med vatten enligt vanliga metoder (skakning, motströmsförfarande osv). Såsom lösningsmedel kan man insätta de vanliga extraktionsmedlen, t.ex. estrar såsom etylacetat och butylacetat, högre alkoholer såsom amylalkoholer, t.ex. n-amylalkohol, med vatten ej blandbara ketoner, t.ex. metyl- isobutylketon, samt klorerade lägre kolväten, t.ex. kloro- Iform, metylenklorid och koltetraklorid. Företrädesvis användes etylacetat och butylacetat, isynnerhet etylacetat.

När man vid extraktionen av "lösning I" insätter etylacetat (och/eller butylacetat) bortskaffas vattenfasen,.eftersom den.verksamma substansen förefinnes i den OPganiSk& fasen.

Den organiska fasen indunstas till ca 1110-1/30 av den 10 15 20 25 30 35 HO 8107272-'0 15 ursprungliga volymen. Slutligen utfälles på vanligt sätt den verksamma substansen genom tillsats av ett organiskt fäll- ningsmedel (lösningsmedel), i vilket den verksamma substansen är svårlöslig, t.ex. dietyleter eller mättade rakkedjiga eller grenade eller cykliska kolväten, exempelvis petroleum- eter, n-hexan eller cyklohexan.

Den råa verksamma substansen kan finrenas antingen genom vätske- -vätskefördelning (t.ex. enligt Craigs metod) eller om sä önskas genom vanliga kromatografiska metoder (pelarkromato- grafi, preparativ tunnskiktskromatografi), varvid man som adsorptionsmedel, såsom tidigare nämnts, kan använda de van- liga, icke sura oorganiska eller organiska adsorptionsmedlen, t.ex. aluminiumoxid, kiselgel, magnesiumsilikat, aktivt kol, cellulosa, cellulosaderivat, konstharts såsom polyamider, derivat av polyamider, t.ex. acetylerad polyamid, dextran- geler, jonbytare osv.

När man vid extraktionen av "lösning I" ej använder etylacetat eller butylacetat utan ett annat lösningsmedel, t.ex. CClu, bortskaffas vattenfasen, eftersom den verksamma substansen befinner sig i den organiska fasen. I detta fall indunstas det organiska lösníngsmedlet till företrädesvis 1/10-1/50 av den ursprungliga volymen, och utfällningen sker på vanligt sätt genom tillsats av ett lämpligt organiskt lösningsmedel i vilket den verksamma substansen är svårlöslig, t.ex. dietyleter eller mättade rakkedjiga eller grenade eller cykliska kolväten, exempelvis petroleumeter, n-hexan eller cyklohexan. Fällningen löses i vatten och lösningen frystorkas. Den erhållna rå- produkten kan koncentreras, t.ex. genom extraktion med etyl- acetat eller butylacetat, i vilka lösningsmedel förefintliga icke önskade substanser till största delen ej är lösliga, och renas enligt vanliga kromatografiska metoder, t.ex. genom pelarkromatografi eller preparativ tunnskiktskromatografi med hjälp av de vanliga adsorptionsmedlen (jfr. även ovan beskriv- na förfaringssätt) eller genom vätske~vätskefördelning. Vid reningen kan man också, såsom nämnts ovan, ur en lösning av râprodukten i ett organiskt lösningsmedel (t.ex. koltetra- klorid, kloroform och metylenklorid) utfälla den verksamma substansen med hjälp av ett lämpligt 10 15 20 25 30 35 H0 8107272-0 lå organiskt fällningsmedel i vilket substansen är svârlöslig, t.ex. dietyleter, mättade rakkedjiga eller grenade eller cyklíska kolväten, t.ex. petroleumeter, n-hexan och cyklo~ hexan.

Ur lösningarna kan den verksamma substansen utvinnas medelst vanliga metoder, t.ex. avdunstníng av lösningsmedlet, frystork- ning osv.

De nya Actinoplanes-stammarna med laboratoriebeteckningarna SE 73 och SE 73/B har under följande sifferbeteckningar deponerats hos följande officiella myndigheter: a) SE 73 ATcc-Nr. 31058 (2.8.71s) CBS -Nr. H}2.7Ä (12.8.7Ä) FRJ -Nr. 2669 (9.8.74) b) SE 75/B ATCC-Nr. 51060 (2.8.7H) CBS -Nr. Ã3Ä.74 (12.8.7U) FRJ -Nr. 2671 (9.8.7H) ATCC = American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA Centralbureau voor Schímmelcultures, Baarn, Nederländerna Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan.

CBS FRJ ll Il Den verksamma substansen enligt uppfinningen har vid ringa toxi- eitet ävaien kraftig antimikrobiell verkan. Dessa egenskaper möjliggör dess användning även som medel för konservering av oorganiska och organiska material, framförallt av organiska material av alla slag, som t.ex. polymerer, smörjmedel, färger, fibrer, läder, papper och trä, livsmedel och vatten.

Den verksamma substansen enligt uppfinningen är effektiv mot ett mycket brett spektrum av mikroorganismer. Med hjälp av den- samma kan man bekämpa gramnegativa och grampositiva bakterier och bakterieliknande mikroorganismer.

Den verksamma substansen enligt.uppfinningen kan användas vid 10 15 20 25 30 55 8107272-0 15 djuravel och djuruppfödning av alla slag, och insättes som medel för att främja och påskynda tillväxten och förbättra tillgodo- görandet av födan både då det gäller friska och sjuka djur.

Effekten av den verksamma substansen enligt uppfinningen är härvid i hög grad beroende på den ifrågavarande djurarten och sjukdomen. Speciellt värdefull har den verksamma substansen en- ligt uppfinningen visat sig vara vid djuravel och uppfödning av ungdjur och göddjur. Några djurarter till vilka man kan ge den verksamma substansen enligt uppfinningen för att befrämja och accelerera tillväxten och förbättra utnyttjandet av födan är exempelvis följande: varmblodiga djur såsom nötkreatur, svin, hästar, får, getter, katter, hundar och kaniner, pälsdjur som t.ex. nertz och chin- chilla, fjäderfän som t.ex. höns, gäss, ankor, kalkoner, duvor, papegojor och kanariefåglar, samt kallblodiga djur såsom fiskar, t.ex. karpar, och reptiler, t.ex. ormar.

De mängder av den verksamma substansen enligt uppfinningen som skall ges till djuren för att de önskade effekterna skall upp- nås kan variera inom vida gränser. Den föredragna mängden är ca 5-500 och isynnerhet 10-100 mg/kg kroppsvikt per dag. Administre- ringstiden kan vara från nâgra timmar eller dagar till flera år.

Den lämpliga mängden av den aktiva substansen och likaså den lämpliga administreringstiden beror framförallt på djurarten, åldern, hälsotillståndet och skötseln av djuren, och kan lätt fastställas av en fackman.

Den aktiva substansen enligt uppfinningen kan ges till djuren på vanligt sätt. Hur administreringen sker beror framförallt på djurarten, förhållandena och hälsotillståndet. Sålunda kan administreringen ske en gång eller flera gånger dagligen med regelbundna eller oregelbundna intervaller, oralt eller parente- ralt. Av lämplighetsskäl föredrages en oral administrering, och speciellt i den takt som djuren intager föda och/eller vatten.

Den aktiva substansen enligt uppfinningen kan ges som ren pro- dukt eller i form av en komposition, dvs. i blandning med icke toxiska inerta bärare av godtyckligt slag. 10 15 20 25 30 35 40 8107272-0 16 Den aktiva substansen enligt uppfinningen kan även i lämpligt utformad komposition administreras tillsammans med andra ak- tiva substanser, mineralsalter, spârelement, vitaminer, ägg- viteämnen, fetter, färgämnen och/eller smakämnen, om så önskas.

Fördelaktig är en oral administrering tillsammans med födan och/eller dricksvattnet, varvid man alltefter behov inblandar den aktiva substansen i hela mängden eller en del av födan och/eller dricksvattnet.

Den aktiva substansen enligt uppfinningen kan enligt vanliga metoder genom enkel inblandning av ren produkt, företrädesvis i finfördelad form eller som en komposition i blandning med ätbara icke toxiska bärare, och eventuellt även i form av en förblandníng eller ett foderkoncentrat, tillföras födan och/ eller dricksvattnet.

Födan och/eller dricksvattnet kan exempelvis innehålla den verksamma substansen enligt uppfinningen i en koncentration av ca 5-500 och isynnerhet 10-100 ppm (vikt). Den optimala koncentrationen av den aktiva substansen i födan och/eller dricksvattnet beror framförallt på mängden föda och/eller dricksvatten som djuret intager, och kan lätt fastställas av en fackman.

Typen av föda och dess sammansättning saknar här betydelse.

Alla vanliga i handeln_förekommande eller speciella fodersam- mansättningar kan användas, och företrädesvis de som innehål- ler den vanliga för ett avvägt näringsmedel nödvändiga jäm-_ vikten av energigivande och uppbyggande ämnen, inklusive vitaminer och mineralämnen. Födan kan exempelvis vara samman- satt av vegetabiliska material, t.ex. hö, rovor, spannmål och spannmålsbiprodukter, animaliska material, t.ex. kött, fett, benmjöl och fiskprodukter, samt vitaminer, t.ex. vitamin A, D-komplex och B-komplex, proteiner, aminosyror, t.ex. DL- -metionin, samt oorganiska material, t.ex. kalk och koksalt.

Foderkoncentraten innehåller den aktiva substansen enligt uppfinningen i blandning med ätbara material, t,ex. rågmjöl, majsmjöl, sojabönmjöl eller kalk och eventuellt andra närande och uppbyggande ämnen, samt även proteiner, mineralsalter och vitaminer. De kan framställas enligt vanliga blandnings- metoder. 10 15 20 25 30 35 H0 8107272-0 11 I förblandningar och foderkoncentrat skyddas företrädesvis den verksamma substansen enligt uppfinningen mot ljus, luft och/ eller fukt, eventuellt genom att dess yta överdrages med något lämpligt täckande medel, exempelvis icke toxiskt vax eller gelatin.

Nedan ges ett exempel på sammansättningen av en foderbland- ning avsedd för uppfödning av kycklingar, vilken blandning innehåller den verksamma substansen enligt uppfinningen: 200 g vete, BUO g majs, 361 g sojagröpe, 60 g oxtalg, 15 g dikalciumfosfat, 10 g kalciumkarbonat, U g jodhaltigt koksalt, 7,5 g vitamin-mineralblandning och 2,5 g förblandning av verksam substans, vilket efter noggrann blandning ger 1 kg foder.

Vitamin-mineralblandníngen består av: 6000 I.E. vitamin A, 1000 I.E. vitamin D3, 10 mg vitamin E, 1 mg vitamin KB, 3 mg riboflavin, 2 mg pyridoxin, 20 mg vitamin B12, 5 mg kalciumpantotenat, 30 mg nikotinsyra, 200 mg kolinklorid, 200 mg MnSOu.H20, 1U0 mg ZnSOu.7H20, 100 mg FeSOq.7H2O och 20 mg CuS0u.5H2O.

Förblandníngen av verksam substans innehåller den verksamma substansen enligt uppfinningen i önskad mängd, t.ex. 100lmg, och dessutom 1 g DL-metionin samt så mycket sojabönmjöl att 2,5 g förblandníng erhålles.

Nedan ges ett exempel på sammansättningen av en foderblandning för grisuppfödning, vilken innehåller den verksamma substansen enligt uppfinningen: 630 g fodersädgröpe (bestående av 200 g majs-, 150 g korn-, 150 g havre- och 130 g vetegröpe), 80 g fiskmjöl, 60 g soja- gröpe, 60 g tapiokamjöl, 38 g öljäst, 50 g vitamin-mineral- blandning för grisar (sammansättning t.ex. densamma som-för kycklingfodret), 30 g linfrökakmjöl, 30 g glutenmjöl, 10 g sojaolja, 10 g sockerrörmelass och 2 g förblandning av verk- sam substans (t.ex. samma sammansättning som för kyckling- fodret), vilket efter noggrann blandning ger 1 kg foder. 10 15 20 25 30 35 NO 8107272-0 18 De givna foderblandningarna är företrädesvis avsedda för upp- födning och gödning av kycklingar respektive grisar, men de kan med samma eller liknande sammansättning även användas för uppfödning och gödning av andra djur.

Den gynnsamma effekten av den verksamma substansen när den ges till djur som tillväxtbefrämjande medel framgår av följande försök: Vid utfodringsförsök inblandades substansen i ett foder som gavs till kycklingar (foderblandning enligt önskan). Dosen uppgick till 10 respektive 20 ppm. Som jämförelse insattes en negativ kontroll (foder utan tillsats). Försökstid: lü dagar.

Försök Viktökning Förbrukning av Utnyttjande av Grupp i % fodret i % fodret i % Kontroll 100 100 100 Antibiotikum enligt upp- finningen 10 ppm 102,8 102,8 100 20 PPM 103¿5 102,3 93,5 Framställningen av den verksamma substansen beskrives ytter- ligare med hjälp av följande exempel. Alla %-angivelser i beskrivningen (inklusive exemplen) är vikt%, om ej annat an- ges. Förkortningen "C" betyder koncentration; vol% = volym- delar och vikt% = viktdelar.

Exempel 1 På snedagar med sammansättningen (viktZ): Pepton 0,25% Kasein-hydrolysat, surt 0,25% K2HPOu.}H20, p.a. 0,1 % KCl, p.a. 0,05% MgS0“, p.a. 0,05% FeS04, p.a. 0,01% Rörsocker 3,0 5 10 15 20 25 30 35 HO 8107272-0 19 Agar 2,0 % Vatten till 100 % odlat mycel av arten Actinoplanes SE 73/B överympades med 1H0 ml steril, i 1-liters erlenmeyerkolvar förvarad närlösning (i det följande benämnd "närlösníng A") med följande sammansätt- ning: Sojamjöl, avfettat 3,0% Glycerol, ren 3,0% CaCO3, p.a. 0,2% Vatten till 100 % samt 1 droppe/1ü0 ml närlösning av en hydïïxylgrupphaltig (från Union Carbide Belg. N.V.) för avlägsnande av skum. Efter odling av arten neutral polyol, t.ex. Niax Polyol LHT 67 under 8 dagar i en rundskakningsmaskin vid 2800 centrífugera- des prover av kulturerna. Den klara överstående lösningen testades medelst agarhålplattor mot Escherichia coli ATCC 9637. Den i kulturlösningen befintliga antibiotiska substansen enligt uppfinningen orsakade tillväxthämmadel zoner med en diameter av ca 15 mm. Isoleringen av den Vefksammfi substansen ur närbuljongen utfördes såsom beskrives i exempel 3.

Exempel 2 Satser av 8 l närlösning med sammansättningen (viktí) Dextrin 0,41 Glycerol 0,2% _ “Jästextrakt 0,2% caco3 ^ o , 2% Ledningsvatten till 100% och 3,0 ml hydroxyl¿rupphaltig neutral polyol (t.ex. Niax Polyol LHT 67 (från Union Carbíde Belg. N.V.) per 8 1 närlösning infördes i fermenteringskärl av glas, försedda med omrörare och luftningsanordningar, och blandningen inställdes på pH 6,8 med natronlut och steriliserades vid 12000. Efter kyl- ning av lösningen ympades jäskaren med vardera 240 ml (3,0% (vo1ym)) av under 3 dagar i "närlösning A" odlade skakkulturer av arten Actinoplanes 73, luftades med ca H 1 luft/minut vid ca 600 varv/minut av omröraren och hölls vid en temperatur av 2800. 17 och 2N timmar efter det att odlingen påbörjats sattes 10 15 20 25 30 55 H0 8107272-0 20 till jäskaren varje gång 0,U% dextrin, O,2% glycerol och 0,3% jästextrakt, och efter 30, 41, 48 och 54 timmar tillsattes varje gång O,ü% dextrin, 0,2% glycerol och 0,U% jästextrakt i form av koncentrerade blandningar av dessa närsubstrat- komponenter i en volym av 200 ml per gângl Ökningen av kul- turvolymerna genom dessa tillsatser kompenserades av den upp- trädande vattenavdunstningen. Den totala mängden närsubstrat- komponenter var för dextrin 2,8%, för glycerol 1,ü%, för jäst- extrakt 2,H% och för CaCO5 0,2%. Efter 120 timmar avslutades odlingen.

Exemgel 3 De enligt exempel 2 framställda kulturbuljongerna i fem av fermenteringskärlen av glas (5x8 1) sammanfördes, H8 1 aceton tillsattes och blandningen omrördes 1 timme vid ca 2500, var- efter den centrifugerades. Den klara, från extraherat mycel befriade överflytande vätskan indunstades vid 20-35°C i vakuum till ca 35 1 och pH-värdet inställdes på 9 med natron- lut, varefter man extraherade med 18 1 etylacetat.

Den organiska fasen torkades med 500 g natriumsulfat, in- dunstades i vakuum till ca 1 l och 2 l cyklohexan tillsattes.

Genom avfiltrering av den bildade fällningen erhölls efter torkning i luft 12,5 g råprodukt av den verksamma substansen.

Exempel 4 Framställning av ren verksam substans_genom preparativ tunn- skiktskromatografi (DC).

På tunnskiktskromatogrammet för den enligt exempel 3 utvunna råprodukten förekom den verksamma substansen i huvudzonen med RF-värdet 0,3ü (elueringsmedel nr 5 i tabell 2, kiselgelplat- tor, Fa. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, kisel- gel 60 Fgsu). 1,00 g råprodukt separerades på 20 kiselgel- plattor (20 x 20 cm) (kiselgel PSC Fzsu, Fa. Merck) (elueringsmedel nr 5 i tabell 2).

Huvudzonen med RF'VäPdet 0,3" iS0lePadeS- I. 10 15 20 25 30 35 H0 8107272-0 21 Utbyte: 327 mg Exempel 5 Framställning av ren _verksam substans å@n0m pelar-kromatografi. 3,5 g av den verksamma råprodukten, utvunnen enligt exempel 3, kromatograferades på en 100 cm lång pelare med en diameter av 5 cm bestående av neutral kiselgel (kiselgel 60, kornstorlek mindre än 0,063. Fa. Merck, Damstadt) med elueringsmedlet nr 5 i tabell 2.

Den vid 307 nm absorberande huvudfraktionen uppsamlades. Elua- tet indunstades i vakuum och den erhållna återstoden om- kristalliserades ur ättiksyraetylester/petroleumeter. Den I verksamma substansen torkades vid 10000 i högvakuum vid 0,01 torr under H dagar.

Utbyte: 1,8 g Exempel 6 Rening genom Craig-fördelning 50 g av den enligt det i exempel 3 beskrivna förfarandet utvunna råprodukten underkastades en Craig-fördelning, varvid man använde en apparatur från Fa. Labortec F. Schmidiger, Basel (Schweiz) med fasvolymer av 250 cm; och en lösnings-I medelsblandning av petroleter, ättiksyraester, dimetylformamid och vatten i volymförhållandet 1,5:8,5:5:5. 180 fördelningssteg genomfördes, varvid man efter 60 steg fraktionerat uttog den övre fasen. Den verksamma substansen förekom i fraktionerna 21-68. Den uppsamlade övre fasen tvät- tades med vatten, indunstades noggrant i vakuum och 100 ml ättiksyraetylester tillsattes. Genom tillsats av 1 1 dietyl- eter utfälldes den verksamma substansen. Denna avfiltrerades och torkades i högvakuum vid 0,01 torr och en temperatur av 10000 under 4 dagar.

Utbyte: 17,0 g. 8197272-0 22 För den i djurfodret enligt uppfinningen ingående verksamma föreningen har vi i efterhand lyckats att i huvudsak bestämma sstrukturformcln. Denna återges på härefter närmast följande sida.

Claims (1)

1. 8107272-0 10 15 20 25 30 35 Djurfoder. 24 PällênllkräV k ä n n e t e c k n a t av att det som tillväxt» befrämjande substans och för förbättring av fodertillgodogö- randet hos djur innehåller en förening som (8) (b) (C) (d) (G) (f) (9) (h) (i) (i) är en neutral substans. som ej vandrar vid elektrofores, består av kol, väte och syre, har en specifik vridning av ßu]š0 = -6.6° i en 1 viktprocentig lösning av substansen i metanol, i UV-spektret har ett maximum vid A = 307 nm, är lättlöslig i kloroform. aceton, ättiksyraetylester. acetonitril, dimetylformamid. dimetylsulfoxid. metanol och etanol och svårlöslíg i vatten, dietyleter. petroleter och cyklohexan. innehåller 4 metoxigrupper, vid hydrolys med 10 viktprocentig svavelsyra vid B0°C av- spjälkar reducerande socker. uppvisar följande med hjälp av elementaranalys beräknade summaformel: CGQHQGO34 samt uppvisar i bifogade figurer l - 4 angivna UV-, IR- och NMR~spektra. vilken förening kan erhållas t.ex. genom att man under aeroba betingelser i ett vanligt kol-. kväve- och mineralhaltigt närsubstrat odlar Actinoplanes~stammarna SE 73 och/eller SE 73/B, vilka har deponerats under föl- jande beteckningar vid officiella deponeríngscentraler: a) SE 73 ATCC-nr 31058 CBS»nr 432.74 FRJ-nr 2669 b) SE 73/B ACTT-nr 31060 CBS~nr 434.74 FRJ-nr 2671 varefter substansen enligt vanliga metoder isoleras från kulturbuljongen och/eller myceliet och eventuellt renas. 25 j _ mm 98 O fö m _ U Q m _ m0 m Hwsuowuqušu: