CS226162B2 - Method of producing antibiotics - Google Patents

Description

Vynález se týká mikrobiologického způsobu výroby nového antibiotika z kmenů Actinoplanaceae a použití tohoto antibiotika, zejména jako antimikrobiálního prostředku u lidí i u zvířat a jako krmivá к podpoře růstu a zvýšení využití krmivá u zvířat.

Je již známo, že celá řada antibiotik mikrobiálního původu má antimikrobiální účinky. Tato antibiotika však zčásti nemají žádné účinky, pokud jde o spektrum účinnosti a mimoto mají ještě další nevýhody. Antibiotika beta-laktamového typu jsou Často inektivována penicilinázou. Chloramfeniko1, tetracykliny a streptomycin mají v celé řadě případů velké nežádoucí účinky (Walter Heilmeyer, Antibiotika Fibel, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 3. Auflage, 1969, str. 24Θ, 278 až 2Θ0 a 311 až 319).

Předmětem vynálezu je způsob výroby nového antibiotika, které je neutrální látkou a * při elektroforéze se nevzdaluje od počátku, sestává z uhlíku, vodíku a kyslíku, má specifickou otáčivost[α] = -6,6° v roztoku o koncentraci 1 hmotnostní % у methanolu, v ultrafialovém světle má maximum při vlnové délce 307 nm, je dobře rozpustné v chloroformu, асеr tonu, ethylesteru kyseliny octové, acetonitrilu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, methanolu a ethanolu a málo rozpustné ve vodě, diethyletheru, petroletheru a cyklohexanu, obsahuje 4 methoxyskupiny a při hydrolýze kyselinou sírovou o koncentraci 10 hmotnostních % při 80 °C se odštěpují redukující cukry, s molekulovou hmotností přibližně 1 468 a sumárním vzorcem ^9^9^^34 ^{8 8} účinností na růst zvířat a využití krmiv u zvířat, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinoplanes SE 73 ATCC 31058 a/nebo SE 73/B ATCC 31060 za aerobních podmínek při teplotě 20 až 40 °C a pH 6 až 8 na živném prostředí s obsahem zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických látek, načež se antibiotikum ze živného prostředí a/nebo mycelia izoluje a popřípadě čistí.

Dále bylo zjištěno, Že nové antibiotikum má silnou antimikrobiální účinnost, anebo podporuje růst živočichů, což je možno využít zejména u domácích zvířat, u nichž dochází také к lepšímu využití krmivá.

Antibiotikum podle vynálezu má následující chemické a fyzikální vlastosti.

1. Elementární analýza pro (1468) vypočteno: C 56,40, H 6,54, 0 37,05, 4 OCH₃ 7,8 %, naleaeno^x) C 56,19, H 6,54, 037,25, 0CH₃ 7,9 %.

^χ) po 4 dnech sušení ve vysokém vakuu při teplotě 100 °C.

Je nutno uvést, že při tak velké molekule je možná chyba při elementární analýze

- 0,8 % u jednotlivého stanovení, takže toto stanovení nedovoluje bezprostředně vypočítat přesný sumární vzorce. (R. B. Woodward, Angew. Chem. 69. str. 50 až 51 /1957/3.

Svrchu uvedený sumární vzorek může tedy obsahovat určitpu chybu.

2. Bod tání

Látka, se rozkládá při teplotě 142 °G neúplně, od 177 °C velmi silně. Při rychlosti zahřívání 5 °C za minutu je možno pozorovat při teplotách 196 až 205 °C tání.

3. Specifická otáčivóst

Μρθ - -6,6° (C = 1,0 % v methanolu)

4. Stanovení molekulové váhy

Molekulová váha byla stanovena v chloroformovém roztoku antibiotika osmometricky při použití tlaku par.

570 (C = 2,10 %)

I 630 (C = 1,05 %).

5. Absorpční spektrum v ultrafialovém světle

Spektrum antibiotika v ultrafialovém světle je uvedeno na obr. 1, kde na ose úseček je uvedena vlnová délka v nm, na ose pořadnic extinkce.

X max = 307 nm (C = 0,0106 % v methanolu)

E¹*/ 3°7 nm = 351 cm

6. Absorpční spektrum v infračerveném světle

Absorpční spektrum antibiotika v infračerveném světle je znázorněno na obr. 2, kde na ose úseček je nanesena vlnová délka v cm'¹ e na ose pořadnic absorpce. Stanovení bylo prováděno v peletách s KBr při následujících vlnových délkách: (při cm“¹):

Intenzita

Frekvence

Intenzita

Frekvence

3 450	s	1 195	в
2 980	m	1 130	s
2 940	m	1 040	s
2 900	m	945	m

Tabulka ~ pokračování

Frekvence	Intenzita	Frekvence	Intenzita
1 710	m	905	m
1 615	s	870	m
1 450	m	840	13
1 415	m	820	m
1 375	3	785	m
1 310	s	750	m
1 290	s	735	m
1 255	э	700	m
1 215	8

7* 'н jaderná resonance, jejíž spektrum je udáno v ppm a v Hz na obr. 3.

i 3

8. C jaderná resonance, znázorněná na obr. 4.

Při jaderné resonanci tohoto typu byly pozorovány signály, jejichž údaje jsou v následující tabulce uvedeny v ppm, v Hz a v relativních intenzitách:

Signál č.	Intenzita	Hz	ppai
1	66	4 206,3	166,925
2	33	3 657,6	145,149
3	42	3 514,1	139,456
4	35	3 436,1	136,357
5	37	3 389,4	134,506
6	41	3 344,7	132,730
7	42	3 286,0	130,402
8	174	3 233,4	128,316
9	72	3 230,6	128,205
10	204	3 155,1	125,209
11	79	3 053,0	121,157
12	37	3 037,3	120,533
13	99	3 033,6	120,386
14	49	3 012,7	119,556
15	20	2 632,3	104,463
16	23	2 561,2	101,038
17 ·	23	2 511,8	99,680
18	22	2 434,5	96,612
19	32	2 419,7	96,0C4
20	31	2 399,8	95,234
21	23	2 174.2	86 ? 28?
22	49	2 074,7	82,334
23	62	2 057,0	81,6j1
24	37	2 037,8	-80,868
25	41	2 031,4	30,614
26	44	2 006,1	79,612
27	89	1 969,0	78,138
28	39	1 963,0	77,900
29	41	1 955,5	77,602
30	41	1 941,9	77,062

Tabulka- pokračování

Signál č.	Intenzita	Hz
31	95	1 937,3	76,879
32	93	1 905,5	75,620
33	38	1 898,6	75,345
34	89	1 893,6	75,147
35	56	1 878,4	74,543
36	70	1 843,9	73,176
37	64	1 831,9	72,700
38	92	1 811,5	71,889
39	39	1 805,4	71,647
40	61	1 790,9	71,071
41	58	1 777,8	70,550
42	38	1 767,7	70,149
43	41	1 763,5	69,982
44	59	1 745,0	69,251
45	34	1 731,6	68,719
46	62	1 562,4	62,004
47	44	1 558,0	61,830
48	32	1 536,4	60,972
49	34	1 488,2	59,061
50	21	508,7	20,190
51	21	506,6	20,106
52	70	450,9	17,893
53	45	404,4	16,050
54	61	0,0	0,000

9* Antibiotikum je dobře rozpustné v chloroformu, acetonu, ethylesteru kyseliny octové, acetonitrillu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu a nižších alkoholech, například methanolu, ethanolu, oproti tomu je méně rozpustné ve vodě, diethyletheru, petroletheru a cyklohexanu.

10. Antibiotikum, vyrobené způsobem podle vynálezu,je možno převádět hydrolýzou v kyselém nebo alkalickém prostředí na sloučeniny, které rovněž mají antibiotickou účinnost. Například působením kyseliny chlorovodíkové ve směsi ethanolu a vody v objemovém poměru 1:1 při pH 4 a působením hydroxidu sodného ve směsi methanolu a vody v objemovém poměru 1:1 je možno při pH 11 získat již při teplotě 20 °C v průběhu několika hodin produkty, které mají ještě významnou účinnost in vitro proti gram-negativním a gram-pozitivním bakteriím, například Escherlchia coli.

11· Antibiotikum, vyrobené způsobem podle vynálezu je amorfní bezbarvá neutrálně reagující látka, která se při elektroforéze nevzdaluje od začátku. Při silné hydrolýze v kyselém prostředí se odštěpí různé redukující cukry, například působením 10% roztoku kyseliny sírové při teplotě 80 °C. Z tohoto důvodu je možno při provádění tenkovrstavné chromatografie na desce z kysličníku křemičitého vybarvit toto antibiotikum reakčními činidly, které reagují na cukry, například směsí anisaldehydu a kyseliny sírové, thymolu a kyseliny sírové, vanilinu a kyseliny chloristé nebo dimedonu a kyseliny fosforečné nebo kyselinou molybdenofosforečnou, čímž dochází к charakteristickému zbarvení. Zbarvení, které může sloužit к identifikaci antibiotika, je uvedeno v tabulce 1.

Tabulka 1

Číslo	Reakční činidlo*'	Barva	Pozadí
1	10% h2so.	hnědá	bílé
2	jod	hnědá	hnědožluté
3	kyselina molybdenofosforečná	moodozelená	nazelenalé
4	dusičnan rtřbrnýý-H-j	hnědá	světle ' hnědé
5	.ttymol-^SO^		bezbarvé
6	dined^-H^PO^	zelená (v UV světlei^á)	bezbarvé
7	anl^i^aldhhy-^H^.^S^O^	zelená	bezbarvé
8	vaniím-HC^	hnědá	bezbarvé

Reakční činidla byla vyrobena běžným způsobem. (É. StahL, DiÚLnschichtchromatogpraphie, 2. vydéáií, Springer Verltg Beelín, Heidelberg, . New-York /1967/).

12. Tabulka 2 uvádí hodnoty Rf pro antibioikkim podle vynálezu na neutrálních ciliktgelovýhh deskách (Merck, DairnsCadt, NSR) ve srovnání c volným erythromycinem při poukití různých smmsi rozpuktidel.

Tabulka 2			•	/
Číslo	RoznusiUo	Rf aiti-	Rf erythro-
	(objemové díly)	Hoti-ka	mrcinu

	chloroform	+ methanol
1	95	+	5		0,00	0,00
*2	90	+	10		0,27	0,08
3	80	+	20		0,59	0,21
4	50	+	50		0,85	0,26
	chlorofora + methianol +	amoniak
5	40 +	6 +	1		0,34	0,62
6	methanol			0,83	0,25
	butanol + ledová kyselina	octová +	voda
	60 +	20	+	20	0,55	0,39

Bylo užito vodného roztoku amoniaku o koncobrací . 25 váhových %· ^-jaderná reconarce^, jej^íž s^pe^ktrum pH ²20 MHz je znfoorněno na ob]?. 3, tyla ^prov^áděna v roztoku antibiotika v deuterováném chloroformu při použití tetramethclciltrk jako vnitřního standardu na H-SSc-spetrometru (Firma Vvrian As^o^ate^ Peolo Alto, КаИЛЫв USA).

^³C-jaderné resonanční spektrum, znázorněné na obr. 4 bylo prováděno v tomtéž roztoku na XL-100 spektrometru (h^-firma Vaaian) při 25,2 MHz.

Intenzity absorpčních pásů v infračevvmém světle jsou označovány s, js a w. Pruh, označený £,má alespoň 2/3 intenzity nej^lnějšího pásu ve spektru, m-pruh má intenzitu v Zbašti 1/3 ai 2/3 uvedené hodnoty a w-pruh méně než 1/3 uvedené hodnoty. Uvedené označení se provádí podle propustnosti v procentech.

Je překvapující, že nové antibiotikim, získané z.kmenů Actinoplanes je možno izolovat ze živného prostředí₍ s dobrým- výtěžkem, přičemž antibiotikum má silný antimi1k*oobální, zejména antibakkeriální účinek - také proti gram-negativním mikooooganimmům, aniž by mmio svrchu uvedené nevýhody- známých antibiotik. - Mimoto nové antibiotikum podporuje i růst p vybití krmiv k živočichů p znamená proto obohacení známého stavu techniky.

Při výrobě nového antibiotika je možno využít nové kmeny Actinoplaneo SE 73, p SE 73/B, . Kmeny SE 73 a SE 73/B, kterých je možno využít při provádění způsobu podle vynálezu, patří do třídy Schizomcet, řádu Actinomyceeales, čeledi Actinoplpnaceae rodu Actinoplpnes.- Kmen SE 73 byl izolován z půdy, kmen SE - 73/B byl získán jako spontánní muttaitp kmene SE 73. Oba kmeny SE 73 a SE 73/B mm Pí následnicí vlastnosti:

Mediím je Široké 0,3 až 1,3 ju p je rozvětvené. Sporangia mmpí nepravidelný tvar, v průřezu jsou téměř kulovitá nebo ' s nepravidelným povrchem při - velikosti $ až 18 yu. Spory jsou kulovité až vejčité, opatřené bičíkem, rycKLe potybHvé s průměrem 0,7 až 1,3 /a. Jsou uspořádány na sporarniích ve formě zahnutých nebo šroubovitá uspořádaných řetězců.

Na různých živných půdách po - 14 dnech pěstování při teplotě 20 až 30 - °C mmpí takto získané kultury svrchu uvedených mikroorganismů následnicí vlastnosti:

Czapkův agar

W dobrý až velmi dobrý

SM oranžové

LP světle hnědožlutý

Spg. +, povrchová plocha m^dia tence rýhovaná *CPC (Czapkův agar s epspminopeptonem)

W	dobrý až - velmi dobrý
SM	oranžové až oranžově hnědé
LP	hnědý
Spg.	++, povrchová plocha media tence rýhovaná

mléčný pgpr

W	dobrý až velmi dobrý
SM	oranžové
LP	zlatofcnědý
Spg.	++, povrchová plocha meceia tence rýhovaná,

dochází k peptonizaci kaseinu agar s tyrosneem

W	mírný až dobrý
SM	hnědé
LP	hnědý
Spg.	povrchová plocha m^dia částečně tence rýhovaná

krystaly tyrosinu ee nerozpouuěěpí tvorba melaninu pozitivní peptonizace mléka pozitivní

W = růst

SM = substrátové mediím

LP = rozpustný pigment

Spg. = tvorba sporarngií

- = jev není přítomen + = jev je zřetelně - přítomen.

++ = jev je velmi vyjádřen.

Kmen SE 73/B se liší od kmene SE 73 vyšší produkcí antibiotika podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu je možno provádět při použití pevného, polotuhého nebo kapalného živného prostředí, s výhodou při použití kapalného vodného živného prostředí.

Při očkování živného prostředí se užívá běžných způsobů, postupuje se například přes šilmý agar nebo kultury v baňkábh.

Pěstování se provádí za aerobních podmínek běžným způsobem, jde tedy například o třepací kultury například v ·-třepacích -lahvích, provzdušněné kultury nebo submerimí kultury.

S výhodou se postup provádí jako submerzní kultura v provzdušněných fermentorech, jak jsou například běžně užívány 'pro ostatní submerzní fermentace. Postup je m^j^no provádět kontinuálně nebo diskontinuálně, s výhodou se provádí po jednotlivých vsázkách» butlvaci je možno provádět na všech živných prostředích, - vhodných ke kultivaci mikroorganismů řádu Actionomy^ccteaes. živné prostředí musí obsahovat alespoň jeden využitelný zdroj uhlíku a dusíku, a anorganické soli, přičemž tyto látky je možno dodat jako definované jednotlivé složky nebo také ve formě komppeimích směěí, zejména biologických produktů různého původu. Ze zdrojů uhlíku padají v úvahu všechny vhodné zdroje, například škroby, meeasa, sušená syrovátka, dextrin, cukry jako sacharóza, maatóza, glukóza, laktóza, sorbit a glycerin.

Ze zdrojů dusíku padají v úvahu všechny běžné organické i anorganické zdroje dusíku, například sojová mooka, mouka z bavlníkových semen, z čočky, burských oříšků, rozpustné a nerozpustné rostlimé bílkoviny, kukuřičný výluh, extrakt z kvasnie, pepton a extrakt z masa i amonné soli e dusičnany, například chlorid amorný, síran amorný, dusičnan sodný a draselný. Aiorganické soli, které mmaí být obsaženy v živném prostředí, jsou -zdrojem například následujících iontů:

Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH*, Cl’, SO”, PO“’^ NO“ jakož i ionty běžných stopových prvků, například ionty mmdi, železa, m^anu, molybdenu, zinku, kobaltu a niklu. V případě, že zdroje uhlíku a dusíku, popřípadě pou^tá voda neobsahují tyto soli a stopové prvky, je účelné doplln-t živné prostředí těmito látkami. Jinak se může složení živného prostředí рРпОЪ v širokém rozmeeí. Typ a složení tohoto prostředí se mění v závislosti na tom, které jeho složky jsou zvláště příznivé k pouužií. .

Při provádění - způsobu podle vynálezu může být výhodné ze začátku pouužt při pěstování kmenů ActinOplanes jen nízkých konccnnrací složek živného prostředí a pak v průběhu prvních tří dnů kultivace tyto složky dále přidávat ve formě sterilních, poměrně koncentrovaných roztoků těchto složek způsobem, živné prostředí u rostoucích kultur má mít s výhodou pH 6 až 8, s výhodou 6,5 až 7,5. Příliš rychlý pokles pH v kyselém prostředí je možno za^eeiit přidáváním organické nebo anorganické zásady, s výhodou uhličitanu vápenatého .

Tak jak je to běžné při fermentacích, je možno pH řídit také autommaicky, tak, že se přidává sterilní roztok organické nebo anorganické kyseliny, například kyseliny sírové nebo sterilní roztok zásady, - například hydroxidu sodného v různých časových odstupech do živného prostředí.

Je účelné íqaistit, aby pikroorgnoípus byl dostatečně zásoben kyslíkem a byl také přiváděn do styku s čerstvým živným prostředím. Z tohoto - důvodu se běžným způsobem kultura míchá nebo protřepává.

Teplota živného prostředí při pěstování se pohybuje v rozmezí 20 až 40 °C, s výhodou v rozmezí 25 až 35 °C, nejvý^^ně^! teplotou je 28 °c. Doba pěstování se může mměňt v šl226162 rokém rozmezí, přičemž teto doba závisí na složení živného prostředí a na teplotě pěstování. Nejoptimálnějěí podmínky může snadno stanovit-každý odborník v miirooiooooii.

Bylo zjištěno, že minžžtví antibiotika, které se hromadí v žiwiém prostředí, dosahuje svého maxima po 2 až 12 dnech, Obiykle však po 5 až 8-dnech pěstování.

Jak je to při milkobiologických postupech ob^klé, je nutno zabránit infekci živného prostředí. K tomuto účelu se užívá běžných opaltření» jako je sterilizace živného prostředí, nádob, v nichž se pěstování provádí,a vzduchu, užívaného k provzdušňovťlií. Ke sterilizaci příslušného zřízení je možno užít sterilizace v páře nebo za sucha.

Protože při kultivaci obvykle vzniká nežádoucí množtví pěny, je možno užít běžných chemických prostředků, které snižují tvorbu této pěny, jako je'například kapalný olej nebo oUje, em^uze oleje ve vodě, parafiny, vyáSÍ alkoholy jako o^adekanl, silkoonové oleje, polyoxyethylenové a polyoxypropylenové sloučeniny. Tvorbu pěny je možno snížit také použitím mecheaiických zařízení, která využívají například odstředivé síly.

Annibiotkkim, vyrobené způsobem podle vynnáezu, je možno z . ^Telia a/nebo živného prostředí izolovat běžnými fyzikálně chemickými metodami. Izolace se provádí například běžnou extrakcí, srážením a/nebo chromaaoogrficry· Izolované je možno použitím svrchu uvedených.způsobů také čistit. V mnoha případech však není nutné vysoké čištění, protože znečiStěniny, přítomné v aníiiiotirž, nijak neovlivňují jeho účinnost.

r ·

Při všech izolacích a čisticích postupech je nutno dbát toho, aby bylo udrženo pH 7,0 nebo vyšší, s výhodou 7,0 až 9,0. Ke zvýšení pH je možno užít anorganické i organické zásady, jako je am)o^í^ι^lr, hydroxidy alkalických kovů a kovů alkalických zemin, uhličitany ' alkalických kovů a kovů alkalických zemin, mimoto kyselé uhičitany, jde tedy například o hydroxid draselný, hydroxid sodný, uhličitan sodný, kyselý uhlčitan sodný, uhličitan vápenatý, triangl aminy, například - tristly^-amin, morrflin a pyridin.

Ke zjištění frakcí při izolačních a čisticích postupech, v nichž se - antibiotkuum nachází v nejvyšší koncentraci nebo s největší čistotou, je možno užít běžně'fyzikálně chemické metody, například měření absorpce v.žltoafiaOvvéí světle při 307 nm, hodnoty Rf nebo zkoumání na antiíiir?obiálíí účinnost. Zvláště výhodné je v daném případě zjištění antimikrobiální účinnosti proti Escherichia cooi, například Escherichia coli ATCC 9, 6, 3 a 7 pomooí běžných zkoušek na plotnách (P. K.ein, Bakkeeiologische Orrundlagen der chemotherapeutischen ^^ογ81ογ1^βι:>γοχΧ8, Springar-Verlag, Gottingen (1957), str. 86 ff).

Izolace a čištění antibiotika podle vynáLezu je možno provádět například v případě, že se užije vodného živného prostředí následujícím způsobem.

K živnému prostředí včetně mceeia se přidá s vodou mísitelné organické rozpouštědlo a směs se důkladně promíchá, přičemž se na jedné straně extrahuje účinná látka z m^c®eia a na druhé straně se doocií vyčeření- Živného prostředí.

Z rozp^i^u^tě^í^l je možno užít například alkylalkoholy o 1 až 4 atomech uhlíku, jako methanol, ethanol, n- a isopropanol nebo t-butanol, dále dimethylformamid, tetrahydrofuran, zejména aceton. Množní použitého rozpouštědla se může pohybovat v širokém rozmeeí, s výhodou se užije přibližně téhož objemu, jako živného prostředí. Po důkladném promísení se nerozpustný podíl, například mrcellx^ a vyerážené bílkoviny oddělí filtrací, odstředěním, usazením apod.

Směs vody a organického ' rozpouštědla se pak s výhodou odpaří ve vakuu například na objem původně užitého živného prostředí.

Pak se popřípadě použitím svrchu uvedených zásad, s výhodou hydroxidu sodného upraví pH na hodnotu vyšší než 7,0, například na hodnotu 9,0. Takto získaný roztok bude dále označován jeko roztok 1.

Z.roztoku 1 je možno izolovat antibiotiUm podle vynálezu běžnou ' extrakcí, srážením a/nebo chromc^tt^ég^r^^ficky a popřípadě je čistit· Chrommttorrfie může být prováděna jako sloupcová chromatoogafie nebo jako preparativní tenkovrstevná chromattoraaie. Z absorpčních prostředků je možno užít všech běžných anorganických t organických adsorpčních prostředků, které nemaj kyselou povahu, jako je například kysličník hlinitý, silika^el, křemičitan hořečnatý, aktivní uhlí, celulóza, deriváty celulózy, umělé pryskyřice, jako polyamidy, deriváty polyamidů apod., například acetylovaný polyamid nebo dextrsnové gely.

Ze směsí rozpouštědel při preparativní tenkovrstevné chromattgrraii je možno užít nejrůznější rozpouštědla, v nichž je antibiotkuum podle vynálezu rozpustné, zvláště výhodná je směs chloroformu a methanolu, například v objemovém poměru 9:1. Jako rozpouštědla při sloupcové cta'omattorraii je možno užít takové rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel, v nichž je antibiotkuím podle vynálezu rozpustné, například tetrachlorethan, metltylenchLorid, s výhodou chloroform.

Výhodným postupem k izolaci antibiotika podle vynálezu je extrakce, popřípadě v kombinaci s chra^aat^ogrfi^ií a srážením. Při provádění extrakce je nutno dbát toho, aby po jejím provedení se antibiotkum nacházelo bud ve vodné nebo v organické fázi, takže je nutno extrakční činidlo tak, aby v něm bylo tntibioiiUua nerozpustné nebo velmi snadno rozpustné.

Extrakci je možno provádět například následujícím způsobem.

Roztok 1 se extrahuje' s vodou nemísitelým . organiclým rozpouštědlem běžným způsobem, například protře páváním, protipruudovým dělením apod. Rozpouštědlem může být například ester, jako ethylacetát nebo butylacetát, v/Sší alkoholy, jako amlalkoholy, například n-amlalkoholy, s vodou nemíístelné ketony, jako aeethlisdbutylketdl, chlorované Užší uhlovodíky, jako chloroform, aee^h^гl^βnchhoriU a tetrachlorethan. Výhodným rozpouštědlem je ethylacetát a butylacetátv zvláště ethylecetát.

V případě, že se při extrakci roztoku 1 užije ethylacetát a/nebo butylacetát, odloží se vodná fáze, protože se antibiotkum podle ^nálezu nachází v organické fázi.

togírnická fáze se ' pak například na 1/10 až 1/30 původního objemu. Pak se vysráží antibioikuím podle vynálezu přidáním organického rozpouštědla, v němž je antibioikuím podle vynálezu těžce rozpustné, například přidělím diethyletheru, nebo nasycením uhlovodíků s přímým, rozvětverým nebo cyklickým řetězcem, jako je petrolether, n-hexan nebo cyklohexan běžným způsobem.

Surové antibioikuím je možno čistit až na vysokou'čistotu dělením podle Creiga nebo popřípadě běžným ' chrdmatografickm způsobem jako je sloupcová chrdmattdгafie, preparativní tenkovrstevná chrdmattdrrfie, přičemž jako absorpční činidlo se užívá svrchu uvedených anorganických a organických činidel, která nemaj kyselou povahu, jako je například kysličník hlinitý, stliitgel, křemičitan hořečnatý, aktivní uilí, celulóza, deriváty celulózy, umělé pryskyřice jako polyamidy, nebo deriváty polyamidů, například acetylovaný polyamid, dextranové gely, tontoaěniče apod.

V případě, že se k extrakci roztoku 1 neužívá ethylacetát nebo butylacetát, nýbrž jiné rdZiUUtiUll, například tetrachlorethan, odloží se vodná fáze, protože se antibiotkuím ' podle ^nálezu nachází v organické fázi. I v tomto případě se organický roztok odpaří s výhodou na 1/10 ež 1/30 původního objemu a pak se antibiotkum vysráží přidáním vhodného organického rozpouštědla, v němž je podle vynálezu těžce rozpustné, například diethyl: etheru nebo nasycených uhlovodíků s ^mným rozvětverým nebo cyklickým řetězcem, jako je petrolether, n-hexan nebo cyklohexan běžným způsobem. Sraženina se rozpustí ve vodě a roztok se lyofllizuje. Získaný surový produkt se popřípadě čistí například extrakcí ethylacetátem nebo butylacetátem, v nichž většinou nežádoucí balastní látky nejsou rozpustná, čištění je možno provádět také chromatograficky, jako sloupcovou chromátografií, preparativní tenkovrstevnou chromatografií při použití svrchu uvedených adsorpčních činidel nebo protiproudovým dělením. Čištění je možno provádět také tak, že se surový produkt v roztoku v organickém rozpouštědle jako tetrachlormethanu,chloroformu nebo methylenchloridu sráží pomocí organických rozpouštědel, v nichž je antibiotikum těžce rozpustné, například přidáním diéthyletheru, nasycených uhlovodíků, s přímým, rozvětveným nebo cyklickým řetězcem, jako petrolether, n-hexan nebo cyklohexan.

Ze svých roztoků se antibiotikum získá běžným způsobem, například odpařením rozpustidla a lyofilizací apod.

Nové kmeny Actlnoplanes s laboratorním označením SE 73 a SE 73/B byly uloženy ve veřejných sbírkách 8 následujícím označením;

a) SE 73

ATCC - δ. 31 058	(2. 8. 74)
CBS - č. 432.74	(12. 8. 74)
FBJ - δ. 2669	(9. 8. 74)
b) SE 73/B
ATCC - δ. 31060	(2. 8. 74)
CBS - δ. 434.74	(12. 8. 74)
FRJ - δ. 2671	(9. 8. 74)

ATCC = Američan Type Culture Collestion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

CBS = Centralbureau voor Schlmmelcultures, Maarn, Niederlande.

FRJ = Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan.

Antibiotikum podle vynálezu je možno zpracovat na farmaceutické přípravky, které obsahují kromě účinné látky podle vynálezu ještě netoxické farmaceutické nosiče nebo obsahují jen účinnou látku.

Farmaceutické přípravky в obsahem účinné látky podle vynálezu mohou být zpracovány do nejrůznějších lékových forem, jako jsou například tablety, dražé, kapsle, pilulky, čípky a ampule, v nichž popřípadě je možno obsah účinné látky snížit i na zlomek jednotlivé dávky nebo zvýšit na několikanásobek jednotlivé dávky. Znamená to, že jednotka může obsahovat například 1, 2, 3 nebo 4 jednotlivé dávky nebo 1/2, 1/3 nebo 1/4 jednotlivé dávky. S výhodou však obsahuje léková forma takové množství účinné látky, která je nutná pro jedno podání, popřípadě je například tableta dělena tak, aby její zlomek obsahoval polovinu>. třetinu nebo čtvrtinu denní dávky.

Z netoxických, z farmaceutického hlediska vhodných nosičů padají v úvahu pevné, polotuhé nebo kapalné ředicí prostředky, plnidla a látky, usnadňující výrobu prostředku·

Výhodným farmaceutickým přípravkem je tableta, dražé, kapsle, pilulka, granulát, čípek, roztok, suspenze a emulze, pasta, mast, želé, krém, lotion, pudr a spray.

Tablety, dražé, kapsle, pilulky a granuláty mohou kromě účinné látky a běžného nosiče obsahovat ještě a) plnldlo, například škrob, mléčný cukr, třtinový cukr, glukózu, mannlt a kyselinu křemičitou, b) pojivá, jako karboxyméthylcelulózu, alkgináty, želatinu nebo póly vinylpyrrolidon, c) činidla, udržující obsah vody, například glycerin, d) bobtnavé látky, například agar-agar, uhličitan vápenatý a uhličitan sodný, e) látky, znesnadňujícl rozpouštění jako paafin a f) látky, usnadňující vstřebávání, například krarterní amoniové sloučeniny, g) zesítňující látky, jako cetylalkohol nebo glycerinmooooseerát, h) adsorpční činidla jako kaolin a bentoniX a i) kluzné látky, například maatek, sternn vápenatý a hořečnatý, a pevné polyethylenglykoly nebo směsi látek, uvedených za a) až za i).

Tabbety, dražé, kapsle, pilulky a granuláty mohou být opatřeny potahy a obaly a mohou mít takové složení, že se účinná látka uvolňuje pouze nebo převážně v určité části zažívací soustavy, popřípadě zpommaeně, přičemž se užívá zvláštních prostředků, zpomaluUjcích toto uvolňování, jako jsou polymerní látky a vosky.

Účinná látka může být zpracována za poiUíltí jednoho nebo většího počtu nosičů také na mikrokapsle.

Čápky mohou obsahovat mimo účinnou látku ještě běžné, ve vodě rozpustné nebo nerozpustné nosiče, například polyethylenglykoly, tuky, jako kakaové máslo a vyšší estery, například estery alkoholů se 14 atomy Uhlíku s alifatickou kyselinou se 16 atomy Uhlíku nebo směsi těchto látek.

Maasi, pasty, krémy a želé mohou kromě účinné látky obsahovat ještě běžné nosiče, například živočišné a rostlinné tuky, vosky, parafiny, škroby, tragant, deriváty celulózy,· polyethylenglykoly, silikony, ben^oin^, kyselinu křemičitou, mastek a kysličník zinečnatý nebo těchto látek.

Pudry a spraye mohou také obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče, například mléčný cUkr, mmatek, kyselinu křemičitou, hydroxid hlini.tý, . křemičitan vápenatý, práškovaný polyamid nebo směsi těchto látek. Spraye mohou být připraveny při pooUití běžného hnacího prostředku, jako chlorovaných'a fluorovaných uhlovodíků.

Roztoky i em^U.ze mohou rovněž obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče jako rozpouštědla, látky ^^άπ^Οί rozpouštění a emulggtory, například vodu, ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylkarbonát, ettylacetát, benzylalkohol, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, dimethylformamid, oleje, zejména olej z bavlníkových semen, podzerniicový olej, Hej z kUkUřičných klíčků, olivový olej, ricónový olej a sezamový olej, glycerin, glycerinová 1, tetгahyňroflrflryllliohol, polyethylenglykoly a estery llifatii]ýih kyselin se sorbUanem nebo svrchu uvedených látek.

K sθreoeerálníal podání je možno vyrobbt tytéž roztoky a emulze také ve sterilní a s krví izotonické formě.

Suspenze mohou obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče, například kapalná ředidla, jako jsou voda, ethylalkohol, propylenglykol, činidla, usnadrňUící vznik suspenze jako ethLoxylovaný isoseearylllkohol, estery s⁰ly^oχyyeeh/lenooobitl a so^item, mikkookrytalická , celulóza, meeahydroxid hlinitý, bentonnt, agar a trabant nebo sm^^^ látek.

Svrchu uvedené lékové formy mohou obsahovat také barvivé, konzervační látky a sloučeniny, zlepšu^cí chuť i vůni, například mátový olej a eukalyptový Hej nebo sladidla, například οι^θγΑ.

Terapeuticky účinná složka má být ve svrchu uvedených farmaceutických připravcí^ch přítoomna s výhodou v konce^nci 0,1 až 99,5, s výhodou 0,5 až 95 ·váhových % celkové směěi.

Svrchu uvedené farmaceutické látky mohou obsahovat mimo účinné látky podle vynálezu ještě další účinné složky.

Svrchu uvedené farmaceutické přípravky se vyrábějí známým způsobem, například smísení^m účinných látek s jedním nebo několika nosiči.

Přípravky podle vynálezu se užívají v lidském i veterinárním lékařství k prevenci, zlepěení a/nebo vyléčení onemoonění, způsobených svrchu uvedenými mikroorganismy.

Přípravky podle vynálezu je možno podávat místně, perorálně, parenterálně, intraperitoneálně a/nebo rektálně, s výhodou perirálně nebo parenterálně, a to- zejména nitrosvalově, popřípadě ve formě dlouhodobé - kapací infúze.

Bylo zjištěno, že v lidském i veterinárním lékařství je výhodné podávat účinnou látku podle vynálezu při perorálním nebo parenterálním podání v celkovém mrnlžtví 10 až 1 000, s výhodou 50 až 500 вд/kg váhy za 24 hodin, popřípadě rozděleně v několika jednotlivých dávkách k dosažení žádoucího účinku. Jednotlivá'dávka v tomto případě obsahuje účinnou látku podle vynálezu s výhodou v minlžtví 15 až 150, zejména 10 až 100 mg/kg váhy. Může být nutné se od svrchu uvedeného dávkování odcthlit a to v závvslosti na druhu živočicha, na jeho tělesné váze, na typu a závažnoiti onemoonnnn, na druhu přípravků a na cestě podání a popřípadě také na době nebo intervalu, v němž dochází k podání - jednotlivých dávek. Z tohoto důvodu 9ŮŽe v některých případech být dostatečná nižší než svrchu uvedená dávka účinné látky, kdežto v jiných případech je nutno svrchu uvedenou dávku účinné látky překročit. Stanovení optimální dávky a cesty podání stanoví v jednotlivých případech snadno příslušný odborník.

Antibiotikum podle vynálezu má při nízké toxicitě silnou antioikrobiální účinnost. Tyto vlastnosti umoožuuí jeho pouužtí k chemooerapeutidýfa účelům v lékařství i ke konzervačním účelům pro anorganické i organické maateiály, zejména pro organické oattriály různého původu, například polymery, maaadla, barvy, vlákna, kůže, papír a dřevo, potraviny a vodu.

Annibiotklum podle vynálezu je účinné proti širokému spektru mikroorganismů; s jeho pomocí je možno pooiačit růst gram-negaaivních a gram-pooztivních bakkeeií, jakož i mikroorganismů, které jsou bakkerlíy podobné, a rovněž zabránit vzniku onemoonněn, která jsou těmito mikroorganismy způsobena a tato onemoonění zlepšit a/nebo vyléčit.

Zvváště- účinná je účinná látka podle vynálezu proti bakteriím a mikroorganismům, které jsou bakteriím podobné. Je proto zvláětě účelné využívat k . profylaxi a chemooheeapii lokálních ' i systemických infekcí v lidském i veterinárním lékařství, přičemž jde o infekce, vyvolané svrchu uvedenými původci.

Je například možno léčit místní a/nebo systemická onemoonněn, která jsou způsobena následujícími původci jednotlivě nebo ve větším omlžs-víí

Micrococaceae, ' Stap^lo^^, například Staphylococcue aureus, Staph. epid^mičta, Staph. aerogenes a Gaffýka tetragena.

Lotobaaceriaceae, jako streptokoky, například Streptococcus pyogenes, alfa- nebo betahemolltické streptokoky,.nehemolyzuuící gaoa-ptreotoкoкy, Str. viriCati, Str. faecalis (Enherokoky), Str. alalactiae, Str. lactis, Str. equi, Str. anaeribis a Diplococcus p^uso^ee (pneumoko]kr).

Neiseeriaceae, jako n^dLsserie, například Neisseria gonorrhoeae (gino^l^), N-mseni^itidis (moningokolkr) , N-<^8^1X81^ a N. flava.

Colyyniaethiiaciae, jako clrynebaaieaia, například Corynebacteriím Cioeteeriaa, C. pyogenes, C. ΒΙρΙη^βΓά^ϋ, C. acnes, C. parvuo, C. bovis, C. та^' C. ovis, C. im^uisept^i^t^u^o, Lateria, například Listeria monnoctogenes, Eryelpelothrix, například E^s^elothrix ^sidiisa, Kuuthia, například Kuuthia zoppii.

Mcobacteriaceae, jako původci mbobakterióz, například Mycobacterium tuberculosis, M. Booie, M. avium, tak zvaná atypická mCkbaCkeria skupin Runyon I, II, III a IV, M. leprae.

ΕπΙβΓοΡβοΙβΓ^ο^^ například bakterie skupiny Escheriohia coli, například E. coli, Enterobaater, například E. aerogenes, E. cloacea, KleeaSellc, například K· pneumoonae, K. K. ozaenae, Erwiniae, například Erwinia spec., Seeratia, například Seratia marcescens, Próteus, například Próteus vulgaris, Pr. moogaani, Pr. rettgeri, Pr. miiaabiis, Providencia,. 'například Providencia sp.

Salmooneleae, Salmonna, například Salmoonna parceyρhi A a B, S. typhi, S. mteeitidis, S. cholera suis, S. typ^mu^^, Shigeeia, například Shigela dysenneni^, Sh· ammagua, Sh. flexneri, Sh. boyclii, Sh· sonnei· ερίΓΗΙε^^, Vibrio, například Vibrio cholerae, V. proteus, V. fetus, Spirillum, například ' SpirilLm minus.

Βα^ΙΙ^^^ například aerobní tyčinky, tvořící spory, například BaCllus cnthrccis, B· subaelis, B· cems, anaerobní tyčinky, tvořící spory, jako СИ^гШг, například Clottridjιm perfringrns_> d^ep^uum, Cl. oedetmaiens, Cl. histo^^um, C^tetani, Cl. botuHim,

MyC:kblasmmaa, například МоР^зшс pneumoonae, M· hominns, M.suis · pneumoonae, M. gallispticum, M. ^сог№п^.

Svrchu uvedený výčet možnách původců byl uveden pouze jako příklad a nemá nikterak sloužit k brnceení vynálezu.

Z bnemoonění, jimž je mo^no předjít nebo která je možno zlepšit a/nebo vyléfiiX, je možno uvést následující onemocnění: onemocnění iýchicCch^:cest a nosní dutiny, zánět středního ucha, zánět .nosoЫ.tanl, zápal plic, zánět pobaišnicr, zánět pánviček ledvinných, zánět močového mměl^ře, zánět nitroblány srdeční, systémové infekce, zánět, průdušek, · zánět kloubů, místní záněty a kožní infekce.

Atibiotilum podle vynálezu je možno užít také u zvířat jako prostředek k podpoře růstu c ke zlepšení vyuuití potravin u zdravých i nemocných zvířat.

Účinnost · antibiotika podle vynálezu je do značné míry nezávvslá na druhu a pohlaví zvířete. Zvváště ortné. je podle. vynálezu při šlechtění a chovu mladých zv^L^at a zvířat na žír. Ze zvířat, u nichž je možno použít účinnou látku podle vynálezu ke zrychlení a zlepšení růstu a ke zvýše né mu vybití krmivý je možno užít například následnicí užitková a chovná zvířata.

Teplokrevná zvířata, jako je skot, vepř, kůň, ovce, koza, kočka, pes, králík, kožešinová zvířata, například norek a činčila, drůbež, jako slepice, husy, kachny, krocani, holubi, papoušci c kanáři, i studenokrevná zvířata, jako ryby, například kapři a plazi, například hadi.

Množtví podle vynálezu, které, je možno aplikovat zvířaůům při dosažení žádaného účinku, Se pohybuje v širokém rozmezí. Výhodné rozmezí je 5 až 500, zejména 10 až 100 mg/kg váhy á den. Doba podávaní se může pohybovat od několika hodin nebo dnů až do několika let. Vodná dávka a vhodná doba podáváií účinné látky závvsí zejména na druhu zvířete, jeho stáří, pohlaví, zdravotním stavu a účelu, pro který se zvíře chována stanoví ji snadno odborník.

Účinná látka podle vynálezu se podává zvířatům běžným způsobem. Cesta podání, závisí zejména na druhu zvířete, jeho chování a zdravotním stavu. Účinnou látku je možno podávat jednou nebo vícekrát denně v pravidelných nebo nepravidelných intervalech perorálně nebo parenterálně. Pro účelnost se účinná látka většinou podává perorálně, a to zejména s potravou a/nebo pitnou vodou.

Účinná látka podle vynálezu se podává v čisté formě nebo ve formě přípravku, například ve směsi s netoxickými inertními nosiči různého původu, například s týmiž nosiči a v téže formě, jaká byla popsána pro farmaceutické přípravky.

Účinná látka podle vynálezu se podává také spolu s dalšími farmaceutickými účinnými látkami, anorganickými solemi, stopovými prvky, vitamíny» bílkovinami, tuky, barvivý a/nebo chuťovými látkami.

Nejjednodušší je perorální podání spolu s krmivém a/nebo pitnou vodou, přičemž podle koncentrace se přidává účinná látka jen к části krmivá a/nebo vody nebo к celkovému množství.

Účinná látka podle vynálezu se mísí v čisté formě, s výhodou v jemně rozptýlené formě s poživatelnými netoxickými nosiči, popřípadě je možno ji s těmito látkami mísit také ve formě předběžné směsi nebo koncentráty a pak ji včlenit do krmivá a/nebo pitné vody.

Krmivo a/nebo pitná voda mohou obsahovat účinnou látku podle vynálezu například v koncentraci 5 až 500, s výhodou 10 až 100 ppm. Optimální koncentrace účinné látky v krmivu a/nebo pitné vodě je zvláště závislá na množství, které v průběhu dne zvíře přijímá, a je možno ji snadno stanovit.

Povaha krmivá a jeho celkové složení nemá žádný vliv na účinnou látku podle vynálezu. К uvedenému účelu je možno užít všech běžných nebo zvláštních druhů krmiv, která s výhodou obsahují jednotlivé živiny v požadované rovnováze tak, aby dodávala energii i stavební látky, včetně vitamínů a anorganických látek.

Vhodné krmivo sestává například z látek rostlinného původu, jako je seno, řepa, obilí, obilné produkty, živočišného původu, jako je maso, tuk, kostní moučka, rybí produkty, z vitamínů, například vitamínu A, B-komplexu a D-komplexu, bílkovin, aminokyselin, jako je DL-methionin, a anorganických látek, jako je uhličitan vápenatý a chlorid sodný.

Koncentráty obsahují účinnou látku podle vynálezu spolu s dalšími látkami, jako jsou Žitná mouka, kukuřičná mouka, mouka ze sójových bobů nebo uhličitan vápenatý, popřípadě s dalšími živnými a stavebními látkami,jako jsou bílkoviny, anorganické soli a vitamíny. Tato krmivá je možno vyrobit běžným způsobem.

Předběžné směsi a koncentráty mohou obsahovat účinnou látku podle vynálezu také ve formě, v níž je účinná látka na povrchu chráněna například netoxickými vosky nebo želatinou před vlivem vzduchu, světla a/nebo vlhkosti.

Jako příklad složení krmné směsi pro kuřata je možno uvést krmivo s obsahem účinné látky následujícího složení:

200	g	pšenice
340	g	kukuřice
361	8	sójového šrotu
60	8	hovězího loje
15	8	středního fosforečnanu vápenatého
10	g	uhličitanu vápenatého
4	g	jodované kuchyňské soli
7,	5 g	směsi vitamínů a anorganických solí
2,	5 g	účinné látky
1	kg	krmivá.

Směs vitamínů a minerálních látek sestává z následujících složek:

000 mezinárodních jednotek vitamínu A, 1 000 mezinárodních jednotek vitamínu D^, mg vitamínu E, 1 mg vitamínu 3 mg Riboflavinu, 2 mg pyrídoxinu, 20 mcg vitamínu Bj₂, mg pantotenátu vápenatého, 30 mg kyseliny nikotinové, 200 mg cholinchloridu, 200 mg MnS0₄ x H₂0, 140 mg ZnSO₄ x 7H₂O, 100 mg FeS0₄ x 7H₂0 a 20 mg CuS0₄ x ЭД₂0.

Předběžná směs s obsahem účinné látky obsahuje tuto látku v Žádaném množství, například 100 mg a mimoto obsahuje 1 g DL-methioninu a tolik sójové mouky, aby vzniklo 2,5 g předběžné směsi.

Příkladem vhodného krmivá pro vepře s obsahem účinné látky podle vynálezu může být krmivo následujícího složení;

630 g krmného obilného Šrotu 2 200 g kukuřice, 150 g ječného Šrotu, g

g g

g g

g g

g g

g kg

150 g ovesného šrotu a 130 g pšeničného šrotu, rybí moučky, sójového šrotu, tapiokové mouky, pivovarských kvasnic, směsi vitamínů a anorganických látek, stejného složení jako svrchu, moučky z lněných pokrutin kukuřičné mouky, sójového oleje, melasy a předběžné směsi s obsahem účinné látky svrchu uvedeného složení krmivá

Svrchu uvedené krmné směsi jsou zvláště vhodné к chovu kuřat a vepřů, přesto je možno je užít i к chovu jiných zvířat.

Dobrá antimikrobiální účinnost antibiotika podle vynálezu byla prokázána následujícími pokusy:

a) Pokusy in vitro

Antibiotikum podle vynálezu bylo ředěno při použití Muller-Hintonova živného prostředí s přídavkem 1 % glukózy na obsah 200 jag účinné látky v 1 ml. V užitém Živném prostředí se nacházelo 1 x 10^ až 2 x 10^ bakterií v 1 ml. Zkumavky s uvedeným obsahem byly inkubovány 18 hodin a byl stanoven stupeň zakalení jejich obsahu. V případě, že nedošlo к zakalení, bylo antibiotikum plně účinné. Při dávce 200 yug/ml nebylo možno pozorovat zákal v žádné z následujících bakteriálních kultur:

Escherichia coli 14,

Escherichia coli C 165,

Próteus vulgaris 1017,

Klebsiella К JO,

Klebsiella 63,

Salmonella sp.,

Shigella sp.,

Bnterobacter sp.,

Serratia sp.,

Próteus indolnegetiv, sp.,

Próteus indolpositiv, sp.,

Pasteurella pseudotuberculosis,

Staphylococeus·aicis 133,

Neesseria eatarchalis sp.,

Diplococeus pneumoniae sp.,

Stceptscoeeus pyogenes W ,

Enterococcus sp.,

Lacooeccilus sp.,

Corynebacterbm Oiphtheriee gravis, '

Corynebacteriím •pyogenes M,

Clostcidbum botulinum,

Clostcidbm tetani,

PsauOomonas aeciginosa sp.,

Aemmonas h^<^^ropp^i_^^a sp.,

Nfcoplasma sp.

b.) Pokusy in vivo

Z následníci tabulky 1 je zřejmá · účinnost antibiotika proti řaOě bakkeeií u- bílých mrší kmene CC*p ktecé byly infikovány intcapecitoneálně.

Tabulka · 1

Pokus na bílých m^ích ke stanovení ED^q po 24 hodinách .

Kmen	Dávka v m/kg váhy
Escherichia coli 165	2 x 600
Staphylococeus auceus	1 x 400

Léčba : jeOnou 30 minut po infekci poOkožně Ovatoát 30 minut po 90 minutách po infekci.

EDjq je Oávka, při níž přežívá 50 % infkkovaných zvířat po 24 hodinách.

Dobrá účinnost antibiotika podle vynálezu jako prostřeOku k podpoře cůstu zvířat může být pmkázána násleOujícím pokusem.

Při tomných pokusech se účinná látka smísí s krmivém a kcmivo se · poOává kuřatům aO libHum. Dávka antibiotika je 10 a 20 ppm.·Pak se scovnají výsleOky u negativních kontrol, kterým se poOává ki^mivo bez antibiotika. Pokus tcvá 14 Oni.

Skupina	Váhový píří— cůstek (%)	Spotřeba krmivá (%)	VvyHtí kcmivá (%)
kontrola	100	100	100
pokusná skupina
10 ppm	102,8	102,β	100
20 ppm	103,5 ‘	102,3	98,5

Způsob výrnby antibiotika podle · vynálezu buOe osvětlen v násleOujících příklaOeeh.

Všechny údaje v % v pcůběhu popisu včetně · př.íklaOů se vztahuj nen^li lveOeto jinak, na váhová procenta. Zkratka · · C znamená koncce^nc!.

Příklad 1

Na šikmý agar následujícího složení (váhová %)

pepton	0,25 %
kyselý hydrolyzát kaseinu	0,25 %
K2HP04 x 3HgO, p. a.	o,i %
KC1, p. a.	0,05 %
^5^04, p. a.	0,05 %
PeSO4, p. a.	0,01 %
třtnnový cukr	3,0 %
agar	2,0 %
voda do	100 %

se nanese m^cePi-um kmene Actinoplanes SE 73/B a po dostatečném rozmnožení se tato kultura přenese na 140 ml sterilního prostředí následujícího složení, které je uloženo v Erlenmeyerových baňkách o obsahu 1 litru (živný roztok A'’)

sojová mouka zbavená tuku	3,0
čištěný glycerin	3,0
CeCO^,' p. a.	0,2
voda	do 100

K živnému prostředí se přidá jeSté jako protipěnivá látka polyol, obsahuUící hydroxylové skupiny, například Niax Polyol LHT 67 (výrobek Union Ccrbide Belg. N. 7.) v miožství 1 kapka/140 ml živného roztoku. Po 8denní kultivaci uvedeného kmene na rotační třepaččce při teplotě 28 °C se odeberou vzorky kultury a tyto vzorky se odstředí. Čirý supernatant se zkouší na agarových plotnách pro 1ti Escherichia coli ATCC 9637. Vzhledem k účinnosti antibiotika, které se nachází v živném prostředí, vznikají zóny inhibice růstu mikroorganismu o průměru přibližně 15 mm. Izolace antibiotika podle vynálezu ze živného prostředí je možno'provádět způsobem popsaným v příkladu 3»

Příklad 2

Do skleněného fermentoru, opatřeného míchadlem a provzdušňovacím zařízením,se vloží 8 litrů živného roztoku následujícího složení: (váhová %)

dextrin	0,4.	%
glycerin	0,2	%
extrakt z kvasnic	0,2	%
CaCO^	0,2	%
voda z vodovodu	do 100	%

a 3,0 ml · polyolu s obsahem hydroxylových skupin neutrální povahy, například Niax Polyol LHT 67 (výrobek Union Ccrbide Belg. N. V ) na 8 litrů živného roztoku.

živný roztok se upraví hydroxidem sodným na pH 6,8 a sterilizuje se při teplotě

120 °C. Po zchlazení roztoku se do každého fermentoru přidá 240 ml (3 objemová %) 3 dny v_ živném roztoku A pěstované třepací kultury kmene Actinoplanes SE 73 ·a kultura se · provzdušňuje 4 litry vzduchu za minutu při 600 otáčkách míchadla za·minutu a při teplotě 28 °C. 17 a 24 hodin od začátku kultivace se do fermentoru přidá 0,4 % dextrinu, 0,2 % glycerinu a 0,3 % extraktu z kvasnic a po 30, 41, 48 a·54 hodinách· se vždy přidá ještě 0,4 % dextrinu, 0,2 % glycerinu a 0,4 % extraktu z kvasnic ve formě koncentrované sm^í^i těchto složek živného prostředí vždy v objemu 200 ml. Objemu živného prostředí při přidávání dalšíoh složek živného prostředí je kompenzováno odpařováním vody. Celková dávka dextrinu v živném prostředí byla 2,8 %, pro glycerin 1,4 %, pro extrakt z kvasnic 2,4 % a · pro

CaCO^ 0,2 %. Po 120 hodinách pěstování se kultivace přeruší.

Příklad 3 .

živné prostředí z 5 skleněných fermentorů (5x8 litrů), získané způsobem podle příkladu 2, se slije, smísí se 48 litry acetonu, směs se míchá při teplotě 25 °C hodinu a pak se odstředí. čirý, extrahovaného m^cclia zbavený supernatant se o^j^ř^a^zí ve vakuu při 20 až 35 °C na 35 litrů, pil se upraví hydroxidem sodným na 9 a směs se extrahuje 18 litry ethylacetátu.

Organická fáze se zbaví vody 500 g síranu sodného, odpaří ve vakuu na 1 litr a smísí se 2 litry cyklohexanu.

OOdiltrovéním vzniklé sraženiny se po usuSení na vzduchu získá 12,5 g surového antibiotika podle vynálezu.

P ř í k 1 a d 4

Čištění antibiotika podle vynálezu preparativní tenkovrstevnou ctarornatografií.

Při tenkovrseevném chromatogramu antibiotika, získaného způsobm podle příkladu 3, se nachází antibioikuím podle vynálezu v hlavní zóně s Rf 0,34. Bylo užito směsi rozpustidel č. 5 z tabulky 2, stlikageloeých desek firmy Merck, Daamssadtt, NSR značky 60 ^F254·

1,00 g takto získaného surového antibiotika se dělí na 20 siliaageoových deskách o rozměru 20 x 20 cm při pouužtí přípravku Kieselgel PSC F354 firmy Merck. Použije se směsi rozpuutidél č. 5 z tabulky 2. .

Izoluje se hlavní zónq,která má hodnotu Rf 0,34.

A^ttibiotkuím podle vynálezu se získá v čisté formě ve výtěžku 327 mg·

Příklad 5

Čištění antibiotika podle vynálezu sloupcovou chrg^stogrrai:C·

3,5 g surového antibiotika podle vynálezu, získaného způsobem podle příkladu 3, se ^^ma^g^a^e na 100 cm dlouhém sloupci o průměru 5 cm. Sloupec se plní neutrálním stlikageler (Kieselgel 60 o velikosti zrn pod 0,063, firmy Merck, DarmsSoat)· Jako smmsi rozpi^s^stidé^ se užije směs č. 5 z tabulky 2.

Z eluátu se zachytí frakce, která obsahuje při 307 ηφ. Tato frakce se odpaří ve vakuu a odparek se sráží sSí^zí ethyl^te™ kyseliny octové a petroletheru. Získané antibioikuum se suší 4 dny při teplotě 100 °C ve vysokém vakuu o 0,01 torr.

Tímto způsobem se získá čisté antibioikuum ve výtěžku 1,8 g.

Příklad 6

Čištění antibiotika podle vynálezu Craigovým dělením g surového antibiotika podle vynálezu, získaného způsobem podle příkladu 3, se podrobí Craigovu dělení, přičemž se užije přístroje firmy Labortec F. S(21hmStiigeг, Baasiej (Švýcarsko) s objemem fáze 250 ml a směs petroletheru, eth^lusteru kyseliny octové, formamidu a vody v objemovém poměru 15:8,5:5:5.

Provádí se celkem 180 dělení, přičemž po 60. dělení se odebere frakcionovaně horní fáze. Antibiotkkim se nachází ve frakcích 21 až 68. Počáteční horní fáze se promyje vodou, odpaří se ve vakuu a smísí se 100 ml ιΟ^ΙιηΟι^ kyseliny octové. Aitibi.otkkim se vysráží přidáním 1 litru diethyletheru. Vzniklá směs se zfiltruje, načež se suší při teplotě 10.0 °C 4 dny ve vysokém vakuu při 0,01 torr. Aitibiotiloim se získá ve výtěžku 17,0 g.

V příkladech uvedený test s difúzí antibiotika na plotnách se provádí následujícím způsobem: (P. Klein, Baaieriologische Gruundlagen der Chemotherraputischen Ljbooatoriumsprsxis, Springer-Verlag, Gottingen (1957), str. 86 ff):

Na agarové plotny, infikované kmenem Escherichia coli ATCG 9637, se vytvoří otvory, do nichž se nanese zkoumaná látka ve formě Vodného roztoku, načež se plotny inkubují při 37 °C 16 hodin. OOlasti, v nichž dochází k zábraně růstu, jsou mírou účinnosti proti mikroorganismu. Z velikosti těchto oblastí je také možno soudit na obsah antibiotika podle vynálezu.

A^t:ibiotk^\m, vyrobené způsobem podle vynálezu, bylo podáváno kuřatům a selata. Výsledky jsou uvedeny v. následuj lících tabulkách.

Výsledky pokusů se selaty o hmoonnoti 6 až 26 kg, 4 skupiny po 12 selatech.

Látka	ppm	Přírůstek v %	Dennf přírůstek v %	Spotřeba krmivá na kg přírůstku
Kontгoly	-	100	100	100
podle vynálezu	12,5	105,6	108,9	96,2
	25	107,0	109,1	96,8
	50	108,3	111,0	97,8

Výsledky podávání sttibistiis podle vynálezu kuřatům ve stáří 6 týdnů a více; bylo užito 4 skupin po 40 zvířatech.

Látka	ppm	Přírůstek v %	Spotřeba v %	Vyuužtí krmivá v %
Koonrola	-	100	100	100
podle vynálezu	25	105,3	99,9	94,9
	50	1015,5	97,8	91,8
	100	103,9	98,5	94,8
	2C0	10*7,8	100,7'	93,4

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby nového antibiotika, které je teujráltí látkou a při rlritrsfsrénr se nevzdaluje od počátku, sestává z uhlíku, vodíku a kyslíku, má specifickou otáčivost [^α]^ρθ = -6,6° v roztok o tonccnnraci ¹ tanoonnotní % v methano-lu, v uKrfttmoéém světle má maximum při vlnové délce 307 nm, je dobře rozpustné v chloroformu, acétonu, rteylrstrru kyseliny octové, асеШПгНu, dtmeteylfooπlamiiu, iioerlhУ^sulfsxiiu, methanolu a rtestslu a málo rozpustné ve vodě, iieteylrteerj, petrslrterru s cyklnhexanu, obsahuje

   4 methoxyskupiny a při hydrolýze kyselinou sírovou o koncentraci 10 hmotnostních % při

   80 °G se odštěpují redukující cukry, s molekulovou hmotností přibližně 1 468 a sumárním vzorcem. e s účinností na růst zvířat a využití krmiv u zvířat, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinoplanes SE 73 ATCC 31050 в/nebo SE 73/B ATCC 31060 za aerobních podmínek při teplotě 20 až 40 °C a pH 6 až 8 na živném prostředí s obsahem zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických látek, načež se antibiotikum ze živného prostředí a/nebo mycelia izoluje a popřípadě čistí.