KR790000957B1 - 항생물질 a-28086의 제조방법 - Google Patents

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Description

항생물질 A-28086의 제조방법

제1도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A의 IR 흡수스펙트럼.

제2도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 B의 IR 흡수스펙트럼.

제3도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A 아세틸 에스테르 유도체의 IR 흡수 스펙트럼.

제4도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체의 IR 흡수스펙트럼.

제5도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A 부티릴스테르 유도체의 IR 흡수스펙트럼.

제6도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A 발레릴에스테르 유도체의 IR 흡수스펙트럼.

제7도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 A 카프로일 에스테르 유도체의 IR 흡수스펙트럼.

제8도는 클로로포름 중에서 항생물질 A-28,086 인자 D의 IR 흡수스펙트럼.

본 발명은 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 항-PPIO제, 항구균제, 살충제 및 살비제로서 사용되며 반추 동물에 있어서 사료이용 효능을 높이는 것으로서 항생물질 A-28,086 인자 A, B 및 D를 함유한 항생물질 A-28,086 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 제조방법은 스트렙토마이세트 아우레오화시엔스 NRRL 5758이나 스트렙토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 8092를 탄수화물, 질소 및 무기염류를 함유하는 영양 배지중에서 영양배지중에 기본량의 항생작용이 생길때까지 심부호기성 발효조건하에서 배양시켜 인자 A, 인자 B 및 인자 D를 함유한 항생물질 A-28,086 복합체를 제조하는 방법이다.

항생물질 A-28,086 인자 A는 아세톤-물로 결정화시킬 때 백색 결정성 화합물이며, 저급알콜, 디메틸포름 아마이드, 디메틸설폭사이드, 초산에틸, 클로로포름, 아세톤 및 벤젠같은 유기용매에 녹으며 헥산 같은 비극성 용매에는 아주 약간 녹고 물에는 난용성이고 융점은 98-100℃이며, 다시 고체화 한 다음 약 195-200℃에서 다시 녹으며 상세한 성질은 다음과 같다.

a) 분자량 : 764(스펙트로메트리로 측정)

b) 원소분석 탄소, 66.69%, 수소 9.85% 및 산소 23.10%

c) 경험식 C₄₃H₇₂O₁₁(질량분석기로 측정)

d) 비선광도 : -54°(C=0.2, 메타놀) 25℃에서 측정.

e) IR 최대흡수 스펙트럼(클로로포름)

2.85, 3.34, 5.83, 6.82, 7.22, 7.53(약함), 7.78(약함), 8.75(강함), 8.95(강함), 9.15, 9.50(강함), 9.55(강함), 9.60, 9.85, 10.15, 10.45 및 10.70(약함) 마이크론.

f) U. V. 스펙트럼(에타놀) : 200mμ 이하에서 최종흡수.

g) 헥자기 공명 스펙트럼(CDCl₃)

δ 6.01, 4.21, 4.11, 3.99, 3.89, 3.80, 3.67, 3.65, 3.57, 3.55, 2.83, 2.76, 2.74, 2.68, 2.66, 2.58, 2.56, 2.30, 2.22, 2.17, 2.10, 2.05, 1.96, 1.90, 1.85, 1.70, 1.62, 1.60, 1.47, 1.39, 1.31, 1.25, 1.18, 0.95, 0.93, 0.90, 0.88, 0.85, 0.77, 0.75, 0.73, 0.68, 및 0.66ppm

h) 80% 디메틸포름아마이드 수용액중에서 Pka 7.9인 적정기.

i) 결정사이의면 간격(Å)이 다음과 같은 X-레이 분말 회절모양(Cu⁺⁺방사, 1.5405λ, 니켈휠터)

j) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633를 사용하여 실리 카겔상에서 벤젠-초산에틸(3 : 2)용매계로 박층 크로마토그라프시킬때의 Rf 치 : 0.24

k) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 다음과 같이 페이퍼 크로마토그라피시킬 때의 Rf치

l) 염 및 에스테르 유도체를 생성시킬 수 있는 산

m) 에스테르화 할수 있는 적어도 한개의 수산기

항생물질 A-28,086 인자 B는 아세톤-물로 결정화시킬때 백색결정성 화합물이며 저급알콜, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 초산에틸, 클로로포름, 아세톤 및 벤젠 같은 유기용매에 녹으나 헥산 같은 비극성용매에는 아주 약간 녹으며, 물에는 난용성이며 상세한 성질은 다음과 같다.

a) 융점 150-153℃

b) 분자량 762(고분해능 질량분석기로 측정)

c) 경험식 C₄₃H₇₀0₁₁(고분해능 질량분석기로 측정)

d) IR 최대 흡수 스펙트럼(클로로포름)

2.82, 3.30, 5.77, 5.85, 6.80, 7.20, 7.50(약함) 7.72(약함), 7.80(약함), 8.57(강함), 8.68, 8.90,(강함), 9.10, 5.50, 9.83(강함), 9.90, 10.10, 10.17(강함), 10.43(약함), 10.80(약함), 11.20(약함), 11.35(약함), 11.73(약함), 12.03(약함)마이크론

e) 220mμ에서의 U.V. 최대흡수 스펙트럼(에타놀)

f) 헥자기 공명 스펙트럼(CDCl₃)

δ 7.20, 7.09, 6.26, 6.15, 4.19, 4.12, 4.05, 3.95, 3.89, 3.78, 3.62, 3.59, 3.52, 3.48, 2.81, 2.73, 2.63, 2.52, 1.99, 1.91, 1.84, 1.67, 1.71, 1.64, 1.55, 1.43, 1.33, 1.18, 1.11, 0.90, 0.94, 0.90, 0.87, 0.84, 0.77, 0.74, 0.68ppm

g) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 실리카겔상에서 벤젠-초산에틸( 3 : 2)로 박층크로마토그라피 시킬때 Rf 치 : 0.42

h) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 다음과 같이 페이퍼-크로마토그라피계 시킬때의 Rf치

i) 염 및 에스테르 유도체를 생성시킬 수 있는 산.

j) 2개의 케톤

k) 적어도 한개의 하이드록실기

항생물질 A-28,086 인자 D는 아세톤-물로 결정화시킬 때 백색 결정성 화합물이며, 메타놀, 에타놀, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 초산에틸, 클로로포름, 아세톤 및 벤젠같은 유기용매에 녹으며 헥산같은 비극성용매에는 약간 녹고 물에는 난용성이며 융점은 96-98℃이다. 상세한 성질은 다음과같다.

a) 분자량 : 778(고분해능 질량 분석기로 측정)

b) 원소분석 C, 67.59%, H 9.38, O 22.77%

c) 경험식 C₄₄H₇₄O₁₁(고분해능 질량분석기로 측정)

d) 비선광도 : -56°(C=0.1, 메타놀) 25℃에서 측정.

e) IR 최대흡수 스펙트럼(클로로포름)

2.89, 3.39, 3.43, 3.50, 5.88, 6.90, 7.27, 7.60, 7.84, 9.00, 9.26, 9.62, 10.31, 10.58, 11.10, 11.49 마이크론

f) 95% 에타놀 수용액에서 U V 흡수는 관찰되지 않음

g) 헥자기 공명 스펙트럼(클로로포름)

δ6.00, 4.20, 4.10, 4.00, 3.98, 3.92, 3.86, 3.83, 3.79, 3.67, 3.64, 3.57, 3.54, 2.88, 2.81, 2.71, 2.62, 2.58, 2.48, 2.43, 2.37, 2.29, 2.21, 2.15, 2.10, 2.04, 1.97, 1.89, 1.83, 1.76, 1.68, 1.61, 1.58, 1.55, 1.47, 1.39, 1.30, 1.25, 1.18, 0.95, 0.90, 0.88, 0.84, 0.74, 0.68ppm

h) 80% 디메틸포름아마이드 수용액중에서 PKa 8.67인 적정기.

i) 결정사이의 면 간격(Å)이 다음과 같은 X-레이분말 회절모양(Cu⁺⁺방사, 1.5405λ, 니켈휠터)

d) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633를 사용하여 실리카겔상에서 박층크로마토그라피 할때 Rf치

k) 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 페이퍼 크로마토그라피할때 Rf치

l) 염 및 에스테르 유도체를 생성시킬 수 있는 산.

m) 에스테르화 할수 있는 적어도 한개의 하이드록실기

오늘날 많은 항생제가 알려져 있음에도 불구하고 계속해서 새로운 개량 항생제가 요구되어 왔다. 통용되는 항생제 치료에 있어서 한가지 문제점은 항생제들이 병원균에 대한 그들의 효능면에서 다르다는 사실이다. 또 하나의 문제점은 표준항생제에 대해 내성인 균주의 발달이다. 또 하나는 환자개개인이 초과민증 및/또는 독성에 인한 특수항생제의 작용 때문에 가끔 심히 고통을 받는 다는 사실이다. 이러한 문제들 때문에 새로운 항생제가 계속 필요하게 된다.

사람의 병을 치료하는데 유효한 새로운 항생제의 필요성외에도 수의과 분야에서는 개량항생제도 필요하다. 한가지 중요한 점으로는 개량 항생제는 가끔 동물의 성장을 촉진시키는데 필요하다. 예를들면 병을 감소시키고 사료이용효능을 증가시켜 성장을 촉진시킨다. 수의과학, 좀더 특수하게는 가금산업에 있어서 경제적으로 중요성을 띈 잘 알려진 병은 원충유 포자충병이다. 포자충병은 하나 또는 여러종의 에이메리아나 이소스포라에 의해서 감염된다.

(룬드 및 파르, 디지즈 오브 폴트리, 제 5판 비스터 및 슈와 르트 편집, 아이오아 주립대학 출판사 1965, pp.1.056-1,096)포자충병에 인한 경제적인 손실 및 기존 항포자충병제의 불리한 점에서 좀더 좋은 함포자 충병 제제의 연구가 계속되었다.

장염은 또한 가족에 있어서 심각한 경제적 손실을 가져오는 또 하나의 병이다. 장염은 병아리, 돼지, 소 및 양에 생기며 주로 염기성 박테리아 특히 클로스트리디움 퍼후링겐스 및 바이러스에 의해 생긴다. 반추동물에 있어서 장성중독증(腸性中毒症), 예를들면 양에 있어서 과식증은

c. 퍼후링겐스 감염에 의해서 생긴 것이다.

소 같은 반추동물에 있어서 성장촉진은 경제적으로 바람직한 수의과학의 목적이다. 특히 이로운점은 사료 이용효능을 증가시켜 성장을 촉진시킬 수 있다는 것이다. 반추동물사료의 주 영양원(탄수화물)의 이용기전은 잘알려져 있다. 반추동물에 있어서 미생물은 탄수화물을 분해시켜 단당류를 생성시키고 다음 단당류를 파이루베이트 화합물로 전환시킨다. "파이루베이르는 미생학적으로 대사되어 초산염, 부티레이트나푸로피온산 염으로 된다. 좀더 구체적인 것은 랭이 지은" 피지오로지 오브 다이제스천 엔드 메타볼리즘 인더 우미넌트"(1970) pp.408-410에 잘 기록되어 있다.

휘발성지방산(VFA) 이용의 상대 효능은 맥쿨로우가 지은 휘드스터프스(1971, 6.19) p.19; 에스켈란드가 지은 J. Au, Sci 33, 282(1971) 및 쳐치가 지은 "다이제스티브 피지오로지 앤드 뉴트리션 오브 루미넌츠" Vol 2, 1971, pp.622 및 625에 기술되어 있다. 아세테이트 및 부티레이트가 사용되지만 푸피치오네이트가 더 많이 이용된다. 더욱이 푸로피온산염을 극히 소량 사용할때는 동물은 캐토시스를 일으킨다. 그러므로 유익한 화합물이란 동물로 하여금 탄수화물로부터 푸로피온산염을 많이 생성시키도록 자극을 주어 탄수화물이용 효능을 높이고 케토시스를 감소시키는 것을 말한다.

항생물질 A-28,086 인자 A,B 및 D는 폴리에테르 항생제의 새로운 화합물이다. 이 군에 속하는 물질들의 예를들면 모넨신 (미국특허 3,501,568호); 디아네마이신 [R.L. 하밀, M.M 휀, G.E 피텡거, J. 챰벌린, 및 M. 고만, J. 안티바이오릭스 22, 161(1969)]; 니거리신[L.K. 스타인라우스, 매리 핀커톤 및 J. W. 챰벌린, Biochem. Biophys. Res. Comm33 29 (1968)] 및 살리노마이신 [일본특허공보 47-25,392, 1972년 10월 20일, 출원번호 19,620/1971 데트웬트 No.76960T, 미국특허출원 3,857,948호 및 H. 기나시, N. 오타크, H. 요네하라, S. 사토 및 Y. 사이로, 테트라헤드론 Lett. 49, 4,955-4,958(1973)]이다.

발효문헌 및 본 명세서에서 사용되는 항생제 복합체라는 말은 화학적인 복합체가 아니라 함께 생성된 각 항생물질인자들의 혼합물을 말한다. 발효법으로 항생제를 제조시 발효조건에 따라 항생제 복합체중의 각 인자의 비가 달라진다.

A-28,086 항생제 복합체는 새로운 균주인 스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 5758을 심부 호기성 발효조건하에서 기본량의 항생작용이 생길때까지 배양시켜 제조한다.

A-28,086 항생제 복합체는 다른 새로운 균주인 스트렙토마이세스 아우레오화시엔스, NRRL 8092를 배양시켜 제조할 수도 있다. S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758이나 S. 아우레오화시엔스 NRRL 8092를 사용하여 제조할때 A-28,086 항생제 복합체는 발효배양액 및 균사체로부터 극성 유기용매로 추출한다. 추출된 항생제 혼합물은 용매를 농축하고 과량의 석유에테르에 농축물질을 가하여 불순물을 침전시키고, 여과 여액을 증발시켜 분리하여 얻는다. 항생제 혼합물은 컬럼 크로마토그라피법으로 정제, 분리한다.

A-28,086 화합물들은 동물 및 식물에 병원성인 균의 성장을 억제한다. 따라서 A-28,086 화합물들은 항포자충병제제로서 사용된다. 그외 A-28,086 화합물들은 항생제, 항바이러스제, 항-PPLO 제, 살충제 및 살비제 이고 반추동물에 있어서 사료이용효능을 증가시킨다.

A-28,086 인자들은 구조적으로 서로 다르다. 적어도 4개의 항생물질 인자들은 발효도중에 함께 생성되며 혼합물로서 얻어진다. 인자 A,B 및 D는 각각의 화합물로 분리된다. A-28,086 인자들의 혼합물은 대부분의 유기용매에 녹으나 물에는 난용성이다.

A-28,086 인자 A, B 및 D의 물리적 성질 및 스펙트럼성질은 전술한 바와 같으며 단지 실험상 가설로 나타낼 수 있는 A-28,086 인자 A의 구조식은 구조식(Ⅰ)과 같다.

A-28,086 항생물질 인자 B의 화학적인 구조는 밝혀져 있지 않으나 물리-화학적 데이타로 인자 B는 한개의 카복실산기와 2개의 케톤, 및 하나 또는 여러개의 하이드록실기를 가지고 있음을 알 수 있다.

항생물질 A-28,086 인자 C는 S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758에 의하여 제조될때 약간 제조된다. 그러나 S. 아우레오화시엔스 NRRL 8092에 의하여 제조될때 A-28,086 인자 D는 회수한 항생제 10%까지 존재한다.

A-28,086인자 D의 나트륨염을 질량분석할때 최대점의 원소조성물은 800.5050(C₄₄H₇₃O₁₁Na=800.5050)이며 A-28,086 인자 D 유리산을 질량분석할때 작은 피크는 778에서 더큰 피크는 760.5117(C₄₄H₇₂O₁₀=760.5125)에서 측정된다. 유리산의 질량 스펙트럼에서 m/e760은 몰이온에서 물이 없어진 것이다. 그러므로 A-28,086 인자 D 유리산은 몰이온 조성물은 C₄₄H₇₄O₁₁이다. C₄₄H₇₄O₁₁에 대한 이론치는 C, 67.87%, H, 9.51%, O,22.72%이다. 전술한 바와 같은 물리적 성질을 기초로할 때 항생물질 A-28,086인자 D의 구조는 구조식(Ⅱ)와 같이 측정할 수 있다.

구조식중 R₁=CH₃, R₂=C₂H₅

또는 R₁=C₂H₅, R₂=CH₃

바실루스 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 페이퍼크로마토그라피했을 때의 항생물질 A-28,086 인자 A, B 및 D의 Rf치는 표 I과 같다.

[표 1]

표 Ⅱ는 B. 섭틸리스 ATCC 6633을 사용하여 실리카켈상(미리입힌판, 층두께 0.25mμ)에서 2번 박층크로마토그라피를 행할때 항생물질 A-28,086 인자 A,B 및 D에 대한 Rf 치이다.

[표 2]

A-28,086-Ⅰ으로 명명되는 또 다른 물질도 항생물질 A-28,086 복합체와 함께 생성된다. A-28,086-Ⅰ은 미생물학적으로 활성이 없음에도 불구하고 구조상으로 A-28,086 항생물질 인자와 같다. A-28,086-Ⅰ은 아세톤-물로 결정화시킬때 백색 결정성 화합물이며 융점은 160-162℃이다. A-28,086-Ⅰ과 합성한 A-28,086 인자 A 메틸에스테르와의 NMR 스펙트럼 및 다른 성질들을 비교연구할때 A-28,086-Ⅰ은 A-28,086 인자 A 메틸에스테르 이거나 또는 입체이성체와 같은 아주 밀접한 화합물임을 알수 있다.

처음에 A-28,086-Ⅰ이 활성인 A-28,086 인자들과 함께 침전됨에도 불구하고 실리카겔 크로마토그라피로 쉽게 분리할 수 있다. A-28,086-Ⅰ은 용출용매로서 초산에틸을 사용하고 발색제로서 바닐린 스프레이시약(3% 바닐린 메타놀용액 +0.5ml 농황산=100ml 용액)을 사용하여 실리카겔상에서 박층크로마토그라피할때 Rf치는 약 0.56이다. 바닐린으로 스프레이하고 가열한 후

A-28,086-Ⅰ은 청색점으로 나타내며 반면에 A-28,086 항생물질 인자들은 곧 암갈청색으로 변하는 분홍점으로 나타난다.

항생물질 A-28,086 인자 A,B 및 D와 인자 A 및 D 의 특수한 아실에스테르 유도체들은 염을 형성할 수 있다. 생리학적으로 가능한 염들은 온혈동물에 투여했을때 염형태가 아닌 화합물에 비하여 독성이 증가되지 않는 염류를 말한다. A-28,086 인자 A 및 B 대표적인 적당한 알카리금속염 및 알카리토금속염은 나토륨, 칼륨, 리튬, 세슘, 루비듐, 비튬, 칼슘 및 마그네슘염을 포함한다.

A-28,086 인자 A 및 B의 적당한 아민염은 암모늄 및 일급, 2급 및 3급 C₁-C₄-알킬암모늄 및 하이드록시 C₂-C₄-알킬암모늄염을 포함한다. 아민염들은 A-28,086 인자 A 및 B를 수산화암모늄, 메틸아민, 2급부틸아민, 이소푸로필아민, 디에틸아민, 디이소푸로필아민, 에타놀아민, 트리에틸아민, 3-아미노-1-푸로파놀 등과 반응시켜 얻는 것들이다.

A-28,086 인자 A, B 및 D 인자 A 및 D 아실 에스테르 유도체의 알카리금속 및 알카리토금속 양이 온염은 상법에 따라 제조한다. 예를들면 항생물질인자의 유리산 형태나 에스테르 유도체를 따뜻한 메타놀이나 에타놀 같은 적당한 용매에 녹이고 화학당량의 원하는 무기염기를 함유한 수용성메타놀용액을 가한다. 생성된 염은 여과나 용매 증발법 같은 상법으로 분리할 수 있다.

유기아민 염은 예를들면 기체나 액체아민을 아세톤같은 적당한 용액에 항생물질인자를 녹인용액에 가하고 용매 및 과량의 아민을 증발시켜 제거하여 얻는다.

수의용 약제로 사용할때는 항생제의 형태는 중요하지 않으며 대부분의 경우 동물의 상태에 따라 약제의 형태가 달라진다. 그러나 염형태는 경제적인면, 편리한면, 독성을 고려하여 선택된다.

A-28,086 인자 A는 아실에스테르 유도체를 형성한다.

A-28,086 인자 A의 하이드록실기중 하나를 C₂-C₆-산

안하이드라이드 나 산클로라이드로 처리하여 에스테르화시킨다. 그러한 에스테르류는 실온에서 A-28,086 인자 A를 대응하는 산 안하이드라이드와 반응시켜 제조한다. 이들 에스테르 유도체들은 항생제 및 사료-이용효능을 증가 시키는 제제로서 유효하다.

이러한 A-28,086 인자 A 아실에스테르 유도체들의 성질은 다음과 같다.

A-28,086 인자 A 아세틸 에스테르 유도체는 아세톤-물로 결정화시킬 때 백색 결정성 화합물이며 융점은 약 100-103℃이다. A-28,086 인자 A 아세틸 에스테르 유도체는 경험식 C₄₅H₇₄O₁₂이며 분자량은 약 807이다. 인자 A 아세틸에스테르 유도체의 원소분석은 다음과 같다.

이론치 : C, 66.97; H, 9.24; O, 23.79

실측치 : C, 67.67; H, 8.71; O,23.13

클로로포름중에서 A-28,086 인자 A 아세틸에스테르 유도체의 IR 스펙트럼은 제 3도와 같다. 최대흡수치는 다음과 같다. 2.85, 3.36, 3.38(강함), 5.80, 6.83, 7.25, 7.52(강함), 7.60(약함), 7.80(강함), 8.45(강함), 8.80(강함), 8.95(강함), 9.10(강함), 9.20, 9.63, 9.80(강함), 10.12(약함), 10.25(약함), 10.50 마이크론.

에타놀중에서 A-28,086 인자 A 아세틸 에스테르의 U.V 스펙트럼은 최종흡수만을 나타낸다.

80% 디메틸포름아마이드 수용액중에서 A-28,086 인자 A 아세틸에스테르 유도체를 전기적정할때 PKa가 8.5인 적정기가 있음을 알 수 있다.

A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체는 아세톤-물로 결정화시킬때 백색결정성 물질이며 융점은 약 96-98℃이다. A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체는 경험식 C₄₆H₇₆O₁₂이며 분자량은 약 821이다. 이들 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체의 원소분석은 다음과 같다.

이론치 : C, 67.29; H, 9.33; O, 23.38

실측치 : C, 66.06; H, 9.17; O,23.41

클로로포름중에서 A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체의 IR 스펙트럼은 제 4도와 같다.

흡수최대치는 다음과 같다.

2.85, 3.33, 3.38(강함), 3.45(강함), 5.75(강함), 5.82, 6.81, 7.22, 7.30(강함), 7.50(약함), 7.60(약함), 7.80, 8.43, 8.75(강함), 8.90, 9.05, 9.15(강함), 9.50(강함), 9.63, 9.83(약함), 10.05(강함), 10.13, 10.20(강함), 10.45 및 10.68 마이크론 에타놀중에서 A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르의 유도체의 UV 스펙트럼은 최종 흡수만을 나타낸다.

항생물질 A-28,086 인자 A 부티릴 에스테르 유도체는 아세톤-물로 결정화시킬때 백색 결정성 화합물이며 융점은 약 96-98℃이다. A-28,086 인자 A 부티릴 에스테르 유도체는 경험식 C₄₇H₇₈O₁₂이며 분자량은 약 835이고 원소분석은 C, 67.60%, H, 9.41%, O, 22.99%이다.

클로로포름중에서 A-28,086 인자 A 부티릴 에스테르 유도체의 IR 스펙트럼은 제 5도와 같다. 흡수최대치는 다음과 같다.

2.89, 3.40, 3.45, 3.51, 5.85, 5.92(강함), 5.97(강함), 6.90, 7.30, 7.84(약함), 8.55, 8.85(약함), 9.01(강함), 9.26, 9.76, 9.95, 10.31, 10.64 마이크론

항생물질 A-28,086 인자 발레릴에스테르 유도체는 아세톤-물로 결정화시킬때 백색결정성 화합물이며 융점은 약 173-175℃이다. A-28,086 인자 A 발레릴 에스테르 유도체는 경험식 C₄₈H₈₀O₁₂이며 분자량은 약 849이다. 원소분석은 C, 67.89%, H, 9.50%, O, 22.61%이다.

클로로포름중에서 A-28,086 인자 A발레릴에스테르 유도체의 IR 스펙트럼은 제 6도와 같다. 흡수 최대치는 다음과 같다.

2.90, 3.40, 3.45, 3.51, 5.87, 5.92(강함), 5.99(강함), 6.91, 7.30, 7.69(약함), 7.87(약함), 8.16, 8.58, 8.85(약함), 9.26, 9.76, 10.00(약함), 10.31 및 10.64 마이크론.

항생물질 A-28,086 인자 A 카프로일 에스테르 유도체는 아세톤-물로 결정화시킬때 백색결정성 화합물이며 융점은 약 163-167℃이다. A-28,086 인자 A 카프로일 에스테르 유도체는 경험식 C₄₉H₈₂O₁₂이며 분자량은 약 863이고 원소분석은 C, 68.18%, H, 9.58%, O, 22.24%이다.

클로로포름중에서 A-28,086 인자 A 카프로일 에스테르 유도체의 IR 스펙트럼은 제 7도와 같다. 흡수최대치는 다음과 같다.

2.90, 3.40, 3.45, 3.51, 5.87, 5.92(강함), 5.97(강함), 6.90, 7.30, 7.66(약함), 7.84(약함), 8.16, 8.58, 8.85(약함), 9.05(강함), 9.17, 9.72, 9.95, 10.29, 10.62 마이크론.

A-28,086 인자 A의 아실화는 1H 핵자기공명 스펙트럼에서 다음과 같이 변한다. 약 4ppm에서 생기는 카비닐 공명은 약 5.3ppm으로 떨어지며(정확한 위치는 여러가지 아실 유도체에서 약간 달라진다) 비닐푸로톤 시그날도 바뀐다. 이것은 다음과 같이 특징적으로 일부 구조에서 달라진다.

이 일부 구조는 H호모뉴클레아 대코플링 실험 13C 및 핵자기 데이타와 일치한다.

A-28,086 인자 A의 C₂-C₆-아실에스테르 유도체는 메타놀, 에타놀, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 초산에틸, 클로로포름, 아세톤, 벤젠같은 유기용매에 녹으나 헥산같은 비극성 유기용매에는 약간 녹으며 물에는 난용성이다.

A-28,086 의 C₂-C₆-아실 에스테르 유도체들은 염 및 에스테르유도체를 생성시킬 수 있는 산이다.

A-28,086 항생물질의 제조시 사용되는 새로운균주는 터이키의 마운트 아라라트에서 채집한 토양으로 부터 분리한다. 이근은 E.B. 셜링 및 D. 코트리브가 지은 코오포레이티브 디스크립션 오브타입 컬쳐스 오브스트렙토마이세스, Ⅲ. 애디셔날 스페시스 디스크립션스 후럼 회스트 앤드 세컨드 스터디스 " Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 18, 279-392(1968)에 기술되어 있는 바와 같이 균주 스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 듀가로서 분류된다.

이 분류는 몇몇 보조시험과 함께 인터내셔날 스트랩토마이세스 푸로젝트 [E.B. 셜링 및 D. 코트리브, "메쏘드 포케랙터리제이션 오브 스트랩토마이세스 스페시스",

Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16, 313-340(1966)]의 방법을 기준으로 한 것이다.

색명은 ISCC-NBS 방법 (K.L. 켈리 및 D.B. 쥬드, "더 ISCC-NBS 메쏘드 오브 데지그네이팅 컬러 엔드어 딕셔너리 오브 켈러 네임스")에 따른 것이다. 괄호안의 숫자는 트레스너 및 박쿠스 색 계열 [트레스너, H.D. 및 S.J. 박쿠스, "시스템 오브 컬러 휠스 포 스트렙토마이세스 텍소노미", Appl. Microbiol 11, 335-338(1963)]을 말하며 메르쯔 및 폴색영역은 대괄호[ ]로 묶었다. (A. 메르쯔 및 M.R. 폴, "딕셔너리 오브 컬러")배양액은 특별히 명시하지 않는한 30℃에서 14일간 배양시킨다.

A-28,086-생성균주 NRRL 5758의 특성형태학

포자의 기 균사는 갈고리, 루프 및 개열 나선형으로 이루어져 있다. 또한 직근(直筋)유동형이다. 포자는 짧으며 실린더 모양이고 10-50개의 포자가 체인으로 되어 있다. 포자크기는 1.3μ-1.95×1.3μ이다. 전자 현미경으로 관찰할때 포자표면은 매끈하다.

여러 배지상에서의 NRRL 5758의 배양특성

표준방법으로 NRRL 5758균의 생리학적 성질을 측정한다. 관찰한 성질 및 특성은 다음과 같다.

균 NRRL 5758의 탄소이용도 시험결과는 다음과 같다.

성장반응표시는 다음과 같다.

+잘자람, 이용함

(+) 약간-보통자람

(-) 빈약하게 자람, 아마도 이용하지 않을 것임.

-자라지 않음, 이용하지 않음

새로운 A-28,086 -생성균은 천연계에서 선택한 다음 화학적으로 변이시켜 S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758로 부터 얻는다.

8092로서 알려진 이 균도 역시 균주 스트렙로마이세스 아우레오화시엔스 듀가로서 분류된다. 이 분류는 전술한 스트렙토마이세스 분류법 및 똑같은 성장조건을 사용한 균 NRRL 8092의 연구를 기초로 한 것이다. 균 NRRL 8092의 특성은 다음과 같이 요약할 수 있다.

A-28,086-생성균주 NRRL 8092의 특성 형태학

배지 ISP β7(타이로신 한천)상에서 배양시킬때 불시에 갈고리가 생기나 주로 짧은 직선포자가 생긴다. 포자고리는 고리 한개당 10개 이하의 포자를 가지며 보통 4-7개의 포자이다. 짧은 직선포자 고리들은 ISP β3. 쟈펙크용액 한천 및 ISP β5 같은 배지에서 관찰할수 있다. 에머슨 한천에서는 많은 핵을 발견할 수 있다. 타이토신 한천(ISP β7) 및 글루코즈-아스파라긴 한천을 전자현미경으로 관찰한다. 포자는 매끈하며 크기는 길이 1.2-2.0μ 직경 약 1.0μ이다.

여러 배지상에서의 NRRL 8092의 배양특성

균 NRRL 8092의 탄소이용시험의 결과는 다음과 같다.

+잘자람, 이용, 양성

(+) 약간-보통자람.

(-) 빈약하게 자람, 아마도 이용하지 않을 것임.

-성장무, 이용무

A-28,086-생성 S. 아우레오화시엔스 균주의 특성은 셜링 및 고트리브에 의해 기술된 균의 특성과는 다르다. 이들의 차이점은 표 Ⅲ과 같다.

[표 3]

표 Ⅳ

베네트 한천 내부는 단황색 내부는 분홍색

A-28,086 항생물질의 제조에 사용되는 스트펩토마이세스 아우레오화시엔스 배양액을 NRRL 5758 및 NRRL 8092로 등록시켜 일리노이주 페오리아 미국농무성, 노던 마케팅 및 뉴트리션 리써치 디비젼의 배양수집액 중의 일부가 되었다.

스트펩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 5758이나 스트펩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 8092이 자라는데 사용되는 영양배지는 전술한 배지중의 하나일 수 있다. 경제적인 면, 최적수율 및 생성물 분리 용이도에 따라 바람직한 배지를 선택한다. 예를 들면 대량 발효에 있어서 바람직한 탄수화물원은 타피오카텍스트린 및 서당이다. 그외 글루코즈, 옥수수전분, 과당 만노즈, 말토즈, 유당등도 사용될 수 있다. 옥수수기름, 낙하생기름, 콩기름 및 어유도 탄소원으로서 유효하다. 바람직한 질소원은 효소-가수분해 카제인이며 펩톤류, 콩죽, 면실유 글루타민산 같은 아미노산 등도 사용된다. 배양배지중에 함유될 수 있는 영양무기염 가운데에는 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 탄산염, 황산염 등의 이온을 얻을 수 있는 가용성 염들이다. 균의생장 및 발달에 필수적으로 필요한 미량원소들도 배양배지중에 함유되어야 한다. 그러한 미량 원소들은 보통 균을 생장시킬 수 있는 충분량의 다른 성분 가운데 불순물로서 생긴다.

거품이 문제가 된다면 대량 발효배지에 폴리푸로필렌글리콜 같은 항거품제를 소량(0.2ml/ℓ) 가하는 것이 필요하다. 반드시 필요한 것은 아니나 콩기름 같은 소량의 기름을 가하여, A-28,086-생성 스트렙토마이세스 아우레오화시엔스 균주의 항생제를 제조한다.

기본량의 A-28086 항생물질 제제를 얻기 위하여 탱크 중에서 심부 호기발효시키는 것이 바람직하다. 소량의 A-28086 항생물질은 진탕 훌라스크 배양하여 제조한다. 대량의 탱크를 포자형태의 균으로 접종시켜 항생제를 제조할 때 시간의 지연 때문에 생장성 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 생장성 접종물은 소량의 배양배지를 포자형태나 균사체의 균으로 접종시켜 신성하고 활력있게 자라는 균의 배양액을 얻으므로써 제조한다. 다음 생장성 접종물을 대량의 탱크에 옮긴다. 생장성 접종물을 생장시키는데 사용되는 배지는 대량 발효시 사용되는 것과 같은 것이나 다른 배지도 역시 사용할 수 있다.

A-28086-생성균은 약 20℃ 내지 40℃ 사이의 온도에서 자랄 수 있다. 약 27-30℃의 온도에서 A-28086은 가장 많이 생성된다.

심부호기성 배양방법에서와 마찬가지로 배양배지에 멸균공기를 통과시킨다. 균을 충분히 자라게 하기 위한 대량 제조시 사용되는 공기의 량은 약 0.1량/배양배지의 량/분이 바람직하다. 필요량의 A-28086 항생물질을 제조하기 위하여 대량 제조에 사용되는 공기의 량은 0.25량/배양배지의 량/분이 바람직하다. 고농도의 산소가 녹아 있을 때 항생제의 제조를 억제하지는 않는다.

발효시키는 동안 배양액의 샘플이나 균사체 추출액의 샘플을 가지고 항생제에 대하여 민감하다고 알려져 있는 균에 대한 항생작용을 측정하여 항생제를 제조할 수 있다. 본 발명의 항생제를 시험하는데 사용하는 검정균은 바실루스 섭틸리스 ATCC 6633이다. 생물 검정법은 한천 플레이트상에서 페이퍼-디스크 시험으로 수행한다.

접종되지 않은 배양배지의 최초 pH는 사용되는 배지에 따라 달라진다. 일반적으로 pH는 6.0 내지 7.5의 범위 이내이어야 한다. 발효가 끝날 때의 pH는 6.5 내지 8.0으로 약간 높다. 일반적으로 항생작용은 발효시킨지 이틀째 되는 날에 찾아볼 수 있다. 최대의 항생작용이 생기는 것은 약 6일째 내지 10일째 되는 날이다.

심부호기성 발효조건하에서 항생제를 제조한 후 A-28086 항생물질은 주로 발효방법에서 사용하는 법으로 발효배지로부터 회수할 수 있다. A-28086-생성균을 발효시키는 동안 균사체 및 여과된 배양액중에 항생작용이 생긴다. 그러므로 여과, 추출 및 흡착 크로마토그라피법으로 A-28086 항생물질을 최대로 회수할 수 있다. 전량 또는 여과된 발효배양액으로 부터 A-28086 항생물질을 분리하는 가장 바람직한 용매는 초산에틸이나 보통 다른 용매로도 만족한 결과를 얻는다.

A-28086 인자 A, B 및 D를 분리하는 유익한 방법은 전 발효배양액의 pH를 약 3.0으로 낮추는 것이다. 이 pH 3.0에서 A-28086 인자 A, B 및 D는 여과에 의하여 균사체와 함께 분리된다. A-28086 인자를 분리하는 다른 유익한 방법은 리터당 약 1그람의 양이 들어있는 전배양액에 중탄산나트륨같은 중탄산염을 가하는 것이다. 이때 A-28086 인자들은 염형태의 균사체와 함께 분리된다. 메타놀은 균사체로부터 항생제를 분리하는 바람직한 용매이나 다른 저급알콜 및 케톤류도 적당하다.

A-28086 항생물질의 회수방법으로 공비증류법을 사용하는 것도 유익하다. 이 방법에서 물과 함께 적당한 공비물을 생성하는 유기용매를 수용성 발효배양액에 가한다. 이 용매-배양액 혼합물을 공비증류시켜 배양액으로부터 적어도 물 반을 제거하고 A-28086 항생물질이 유기용매에 용액으로 녹아있는 물-용매 혼합물을 유리시킨다. 불용성 부생성물은 여과나 원심분리법 같은 적당한 방법으로 분리할 수 있다. 다음 A-28086 항생물질은 용매중량, 추출법, 침전법 같은 공지의 방법으로 유기용액으로부터 분리할 수 있다.

물과 적당한 공비물을 생성하는 유기용매는 부틸알콜, 아밀알콜, 헥실알콜, 벤질알콜, 부틸아세테이트, 아밀아세테이트, 1,2-디클로로에탄, 3-펜타논, 2-헥사논, 벤젠, 사이클로헥사논, 톨루엔, 크실렌 등이다.

대량발효방법에서는 공지증류시켜 회수하는 것이 특히 유익하다. 공비물 중의 물과 용매는 둘다 공지방법으로 분리한 후 재순환시킬 수 있다. 이렇게 제거된 물은 불순물이 없는 것이며 폐물처리방법이 필요없다. 이렇게 제거된 용매는 재순환시켜도 좋다. A-28086 항생물질은 추출법 및 흡착법으로 더 정제한다. 실리카겔, 활성탄, 플로리실(규산 마그네슘) 같은 흡착물질을 사용할 수도 있다.

변법으로 배지 조성물 및 균사체를 포함하여 고체배양물은 추출이나 분리하지 않고 사용할 수 있으나 바람직하게는 물을 제거한 후 A-28086 항생물질의 근원으로서 사용한다. 예를 들면, A-28086 항생물질 작용이 생성된 후 배양배지는 동결건조법으로 탈수한 후 직접 사료 혼합물과 혼합할 수 있다.

다른 방법으로는 배양배지 중에 A-28086 항생제가 생성된 후 균사체를 분리 탈수하여 사료 혼합물에 직접 사용할 수 있는 생성물을 얻는다. 그렇게 사용하기 위하여 균사체를 분리할 때는 여과할 때 탄산칼슘(약 10g/ℓ)을 가하여 얻고자 하는 생성물을 얻는다. 이러한 조건하에서 NRRL 5758 및 NRRL 8092로서 명명되는 스트렙토마이세스 아우레오화시엔스 균주는 월등한 인자로서 안티바이오틱 A-28086 인자 A를 생성한다. 인자들의 비율은 사용된 발효조건에 따라 달라지나 일반적으로 인자 A는 NRRL 5758로부터 회수할 때는 총 항생제의 99% 이상을 차지하며 NRRL 8092로부터 회수할 때는 총항생제의 약 90%를 차지한다. A-28086 인자 B는 NRRL 5758로부터 회수할 경우 남아있는 항생제의 대부분을 차지하며 인자 D는 소량이다. 달리 말하면 A-28086 인자 D는 NRRL 8092로부터 회수한 총항생제의 약 8-10%이며 인자 B는 소량이다.

항생물질 A-28086 인자 A, B 및 D는 각각으로부터 분리되며 컬럼크로마토그라피, 박층크로마토그라피와 같은 공지의 방법으로 각각 분리할 수 있다. 예를 들면 벤젠-초산에틸 같은 용매 혼합물로 용출시켜 실리카겔상에서 컬럼크로마토그라피하여 인자 A, B 및 D를 분리시킬 수 있다. 실리카겔컬럼상에서 벤젠-초산에틸 용매 혼합물을 사용하여 먼저 인자 B를 용출시키고 다음 인자 A 및 D를 용출시킨다. 전술한 바와 같이 박층크로마토그라피는 편리한 용출방법이다.

A-28086 화합물들은 동물 및 식물에 병원성인 박테리아 및 곰팡이의 성장을 저해시킨다. A-28086 인자 A 및 B의 미생물학적 작용은 표 Ⅴ와 같다.

시험방법은 공지의 원판-확산법이다(용액 ㎖당 1㎎의 화합물을 함유하는 용액에 6㎜의 발을 담근다. 시험균을 심은 한천판 위에 발을 올려놓는다).

[표 5]

한가지 중요한 점으로는 A-28086 화합물들은 염기성 박테리아의 성장을 저해시킨다. 표준한천 희석법으로 측정할때 A-28086 인자 A가 혐기성 박테리아를 저해시키는 최소 저해농도는 표 Ⅵ와 같다. 종말점은 24시간 배양 후 읽은 것이다.

[표 6]

A-28086 인자 A의 C₂-C₆-아실에스테르 유도체들은 항생작용 및 항진작용을 가지고 있다. 이들 유도체들은 그람 양성작용을 증가시킨다. 이들 유도체들의 그람 양성작용을 인자 A의 작용과 비교하였다.

화합물들은 N.R. 쿠젤 및 F.W. 카바나의 J. Pharmaceut Sci 60(5), 764 및 767(1971)에 기술되어 있는 반자동계(Autoturb

마이크로바이오로지칼 아쎄이 시스템, 엘란코)상에서 터비도메트리 아쎄이로 시험한다.

A-28086 항생물질을 테스트할 때, 영양배양배지(pH7) 중에서 스타필로코크스 아우레우스(H-히트레이) NRRL-314를 37℃에서 4시간 배양시킨 시험 파라메타를 사용한다.

시험샘플 및 표준물질을 메타놀-물(10 : 90)에 녹인다. 표준물질, A-28086 인자 A는 2,3,4 및 5mcgml의 농도에서 오토터브

캐로셀에 나타난다. 시험화합물들은 캐로셀로 측정시 ml당 약 3-4mcg의 활성도를 갖도록 희석한다. 표준물질과 비교할 때의 시험화합물의 활성도는 다음과 같다.

마이코플라스마에 대한 작용은 A-28086 화합물들의 항미생작용이 있다는 점이다. PPLO균(生胸膜脯炎)으로서 알려져 있는 마이코플라스마 좋은 사람 및 여러 동물에게 발병성이다. PPLO균에 대하여 활성인 화합물은 특히 가금산업에 필요한 것이다. 여러 마이코플라스마종에 대한 항생물질 A-28086 인자 A의 최소저해농도(MIC)를 시험관내 배양액-희석법으로 측정할 때 그 결과는 표 Ⅶ과 같다.

[표 7]

용액 ml당 항생물질 A-28086 10마이크로그람만큼 적은 양을 함유하는 용액은 동물을 여러 마이코플라스마종으로부터 보호하는 감염저해제로서 사용된다.

A-28086 화합물은 또한 항바이러스제로서 사용된다. A-28086 인자 A는 시미노프의 어플라이드 마이크로바이오로지 9 [1], 66-72(1961)에 기술되어 있는 것과 같은 시험관내 전염병 저해시헤에 의해서 알 수 있는 바와 같이 타입 Ⅲ 폴리오바이러스, 바시니아 바이러스, 테트페스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스에 대하여 활성이 있다.

A-28086 인자 A는 유사한 조직-배양 테스트로 알 수 있는 바와 같이 트란스미시블 가스트로-엔태라이리스 바이러스, 뉴캐슬 디지즈 바이러스 및 인홱셔스 보바인 리노트라케이리스 바이러스에 대하여 활성이 있다.

그러므로 A-28086 화합물은 바이러스를 저해시키기 위하여 포유동물에 경구, 국소 또는 비경구적으로 투여된다. 바이러스 병의 저해 및 치료에 대한 투여량은 바이러스에 따라 또 약물을 예방학적이나 치료학적으로 사용하느냐에 따라 약 1-5㎎/㎏으로 변화된다.

더욱이 바람직하게는 표면활성제와 함께 A-28086 화합물을 함유하는 용액은 폴리오나 헤드페스 같은 바이러스의 시험관내 균을 오염시키지 못하게 하는데 사용된다.

A-28086 화합물 약 1-1,500mcg/ml를 함유하는 용액은 바이러스를 억제시키는데 유효하다.

쥐에 복강내 투여할 때 LD₅₀을 나타내는 항생물질 A-28086 인자 A의 급성독성은 7.15㎎/㎏이다.

A-28086 화합물들은 살충제 및 살비제로서도 사용된다. A-28086 화합물들은 500ppm 이하의 약을 투여할 때 멕시코 콩딱정벌레, 산인삼벌레 및 집파리 같은 곤충에 대하여, 두점박이 거미 진드기 같은 진드기류에 대하여 활성이 있다. 또한 A-28086 화합물들은 1ppm이하의 양을 투여할 때 모기유충에 대하여 활성이 있다.

항콕씨디움 작용은 A-28086 화합물의 중요한 성질이다. 예를들면, 먹이 실험으로 0.003퍼센트와 같은 적은 양을 어린 병아리에게 투여할 때 A-28086 화합물들은 체중을 증가시키며 0.05퍼센트 이하와 같은 적은 양을 투여할 때 죽음을 막으며 병아리의 구균류에 의한 상해를 감소시킨다. 병아리에 있어서 여러가지 에이메리아종에 대한 인자 A의 시험결과는 표 Ⅷ∼Ⅹ와 같다.

[표 8]

[표 9]

① 각각 5종에 대하여 4회 실시

[표 10]

가금의 콕씨디움증을 치료하기 위하여 A-28086 화합물의 비독성항 콕씨디움증 치료량을 새들에게 바람직하게는 경구 투여한다. A-28086 화합물은 여러가지 방법으로 투여될 수 있으나 가장 편리하게는 생리적으로 가능한 담체와 함께 사료를 투여한다. 여러 인자들이 A-28086 화합물의 농도를 측정하는데 고려되어야 함에도 불구하고 일반적으로 투여량은 0.003 내지 0.04퍼센트의 범위내, 바람직하게는 0.005 내지 0.02퍼센트의 범위내이다.

동물에 있어 사료 이용효능을 개량하는 능력은 A-28086 화합물의 또 하나의 중요한 성질이다. 예를들면 발달한 반추 기능을 가지고 있는 반추동물에 있어서 A-28086 화합물들은 사료 이용 효능을 개량시킨다.

전술한 바와 같이 반추동물에 있어서 탄수화물 이용효능은 동물의 되삭임식물성음식으로 하여금 아세테이트나 부티레이트 화합물보다는 푸로피오네이트 화합물들을 생성하게끔 자극하는 치료에 의해서 증가된다. 사료이용의 효능은 반추동물에 있어서 푸로피오네이트 화합물의 생성 및 농도를 다음과 같은 방법으로 측정하여 알 수 있다.

반추위액은 외과수술용관으로 숫송아지의 제 1위를 열어 얻는다. 숫송아지는 낱알을 많이 먹인다. 반추위액의 샘플은 4겹의 거칠은 무명으로 여과하고 여액을 모은다. 무명위의 입자들을 충분량의 생리학적인 완충액에 재현탁시켜 최초의 반추위액의 양으로 만들고 이 현탁액을 다시 여과한다. 사용된 완충액은 다음과 같은 조성물로 이루어진다.

[(Cheng 및 그의 연구자들, J. Dairy Sci 38, 1225-1230(1955)]

투여액을 혼합하고 입자들이 완전히 분리될 때까지 방치한다. 맑은 층을 분리하고, 같은 완충액(1 : 1)로 희석한 다음 pH 6.8-7.0으로 맞춘다.

희석한 반추위액(10ml)을 40㎎의 전술한 사료 1㎎의 콩 단백 및 시험화합물이 들어 있는 25ml용 훌라스크에 넣는다. 각 시험에 대하여 4개의 똑같은 훌라스크를 사용한다.

각각 4개의 대조 훌라스크를 2번 실시한다. 제로시간 대조군과 16시간 배양시킨 대조군을 사용한다. 모든 시험용 훌라스크는 38℃에서 16시간 배양시킨다. 배양시킨 후 pH를 측정하고 각 훌라스크에 25% 메타인산(2㎖)을 가한다. 시료들을 방치하고 상등액을 개스크로로 검정하여 푸로피오네이트, 아세테이트 및 부티레이트 화합물의 양을 측정한다. 유효화합물은 대조군의 것보다 푸로피오네이트 생성을 증가시킨다.

시험화합물의 결과들을 대조군의 결과와 충분히 비교하였다. 표 ⅩI은 대조군 훌라스크 내의 휘발성 지방산의 함량에 대한 시험군 훌라스크 내의 휘발성 지방산의 함량의 비를 나타낸 것이다.

[표]

탄수화물 이용효능은 그들의 제 1위의 내용물을 없앨 수 있도록 제 1위에 관을 집어넣어 생체내 시험하여 측정한다.

표 XII에 기록되어 있는 시험은 각각 약 1,000파운드인 성숙한 황소를 시험한 것이다. 두마리의 황소에게 정상의 음식을 먹이고 각 시험용 4마리의 황소에게는 A-28086 인자 A가 들어있는 똑같은 음식을 먹인다. 채취한 각 위액 100㎖에 10% 메타인산 100ml를 가한다. 시료를 방치하고 상등액을 개스크로로시험하여 푸로피온산 함량을 측정한다.

표 XII의 결과는 14일간의 치료기간 중 5회를 시험했을 때 푸로피온산 함량의 평균치보다 증가한 퍼센트를 나타낸 것이다.

[표 12]

더욱이, 생체내 시험으로 A-28086 인자 A는 양에 있어서 사료이용효능을 증가시킴을 알 수 있다. 56일에 걸쳐 시험한 결과는 표 XIII와 같이 요약할 수 있다.

[표 13]

A-28086 인자 D 화합물은 항바이러스체이다. A-28086 인자 D는 시미노프의 어플라이드 마이크로바이올로지 9 [1], 66-72(1961)과 똑같은 방법으로 생체 내 전염병 저해 테스트하여 알 수 있는 바와 같이 매릴랜드 B 바이러스, 타잎 Ⅲ 폴리오바이러스, COE 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스에 대하여 활성이 있다.

A-28086 인자 D는 또한 똑같은 조직-배양테스트로 알 수 있는 바와 같이 트랜스미시블 가스트로-엔테라이티스 바이러스, 뉴캐슬 디지즈 바이러스 및 인홱셔스 보바인 리노트라 케이티스 바이러스에 대하여 유효하다.

A-28086 인자 D 화합물들이 바이러스 및 힘기성 박테리아에 대하여 활성을 가지고 있다는 사실은 이들 화합물들을 특히 병아리, 돼지, 소 및 양의 장염 치료에 유익하게 사용할 수 있게 만들었다. A-28086 인자 D 화합물들은 또한 반추동물의 장독혈증 치료에도 사용된다.

항콕씨디움 작용은 본 발명의 방법에 따라 제조된 A-28086 인자 D 화합물의 중요한 성질이다. 시험관내 실험으로 에이메리아 테넬라에 대한 A-28086 인자 D의 항콕씨디움 작용을 알 수 있다. 다음의 방법을 사용하였다. [좀더 자세히 알기 위하여는 L.R. 맥도갈드 및 R.B. 갤로웨이의 Exper. Parasitology 34, 189-196(1973)을 참조할 것]

숙주세포배양액은 래이톤 튜브, 플라스틱 접시나 플레이트, 또는 다른 적당한 배양용기를 사용하여 공지의 방법으로 제조한다. 적당한 배양배지(이 글의 최소 필수배지, Earle 또는 한크의 밸런스드 소금용액중의 락트알부민 가수분해물질, 배지 199등) 중에서 2-3일간 자란 후 적당한 단층이 생성되며 감염 및 약물처리에 사용된다. 병아리 신장세포의 1차 배양물을 이들 연구에 사용한다.

에이메리아 테넬라의 살 수 있는 낭포체는 감염된 병아리의 분비물로부터 얻은 다음 깨끗이 씻어 사용하기 전에 멸균시킨다. 현탁액에 공기를 주입시키며 실온에서 배양시킬 때 낭세포는 포자를 생성한다 칼륨 디크로메이트나 황산(또는 다른 시약들)은 포자가 생성하는 동안 박테리아나 곰팡이의 생장을 막는데 사용된다.

낭세포로부터 감염성 포자소체를 탈랑시키는 것은 낭세포벽을 기계적으로 분열시킨 다음 트립신 및 담즙염으로 처리하여 포자낭세포로부터 포자소체를 자유롭게 함으로써 수행한다.

세포 배양물은 살 수 있는 포자소체를 배양용기에 넣어 감염시킨다. 시험용 화학시약들은 이때에 또는 잇딸아서 주가할 수 있다. 화학시약들은 생리학적 염에 녹인 10% 디메틸포름아마이드에 원하는 농도로 녹여 가한다. 시험의 종말점은 무성발달 단계를 저해할 때이며 96시간 후 감염시킨 배양물을 전자현미경으로 조사하여 측정한다.

결과는 제 2세대 분혈충의 존재여부 및 단층세포에 대한 현저한 독성에 따라 활성(A), 불활성(N) 또는 세포독성(C)로서 나타내었다.

이 시험으로 측정한 A-28086 인자 D의 항콕씨디움작용은 표 VII과 같다.

[표 ]

A-28,086 인자 D 화합물의 다른 유효한 성질은 발달한 제 1위의 기능을 가지고 있는 반추동물에 있어서 사료이용효능을 개량시키는 능력이다 반추동물사료의 주 영양원(탄수화물)을 이용하는 작용기전은 잘 알려져 있다. 동물의 제 1위에 있는 미생물들은 탄수화물들 단당류로 분해시키며 다음 이들 단당류를 파이루베이트 화합물로 전환시킨다. 파이루베이트는 미생물의 작용에 의해 대사되어 휘발성 지방산(VFA)으로 알려져 있는 아세테이트, 부티레이트, 푸로피오네이트로 된다. [Leng의 "피지오로지오브 다이제스천 앤드 메타볼리즘 인더루미넌트" 팔립손 et.al., Eds., 오리엘 프레스, Newcastle upon Type, 잉글랜드, 1970, 408-410]

VFA 이용의 상대효능은 맥풀로우의 휘드스터프스,-(1971년 6월 19일), 19페이지 ; Eskeland et al.의 J. An. Sei 33, 282(1971) 및 쳐치 et. al.의 "다이제스티브 피지오로지 앤드 뉴트리션 오브 루미넌트", Vol. 2, 1971, 622 및 625페이지에 기술되어 있다. 아세테이트 및 부티레이트가 이용됨에도 불구하고 푸로피오네이트가 더 많이 이용된다. 더욱이 푸로피오네이트를 거의 사용하지 않을 때 동물들은 케토시스를 일으킨다. 그러므로 유익한 화합물이란 탄수화물로부터 푸로피온산을 더 많이 생성시켜 탄수화물 이용효능을 증가시키며 케토시스를 감소시키는 것이다.

그러한 유익한 화합물의 작용은 전술한 인자 A에 사용한 바와 같은 방법으로 제 1위에 있어서의 푸로피오네이트 화합물의 생성 및 농도에 미치는 영향을 측정하여 알 수 있다.

시험화합물의 결과는 대조군의 결과와 비교하였다. 표 VII은 대조군 훌라스크 중의 VFA의 농도에 대한 A-28,086 인자 D로 처리한 훌라스크 중의 VFA 농도의 비를 나타낸 것이다.

표 VIII

화합물들은 대표적으로 푸로피오네이트를 증가시키며 따라서 반추동물에게 약 0.05㎎/㎏/일 내지 약 5.0㎎/㎏/일의 양을 경구투여 할때 사료이용효능을 증가시킨다. 가장 유익한 결과는 약 0.1㎎/㎏/일 내지 약 2.5㎎/㎏/일의 양을 투여할 때 얻는다. 화합물은 동물사료와 함께 혼합하여 투여하는 것이 바람직하나, 정제, 음약, 캡슐제, 거환약 같은 다른 방법으로 투여할 수도 있다. 이들 여러가지 투여형태는 잘알려진 수의용 약제 방법으로 만든다. 1회 투여단위는 시험동물의 일회량에 직접 관련된 화합물의 양을 함유해야 한다.

A-28,086은 화합물 톤당 1-30그람 및 사료를 포함하는 사료조성물에 사용할 수 있다.

이 분야에 능통한 사람이면 알수있듯이 소의 사료는 가금사료와 같은 다른 사료와 다르다. 소의 사료는 면실 깍지 및 옥수수사료와 같은 식용겨를 함유한다. 또한 비단백질소원을 15-25% 함유한다. 통상의 비단백 질소원은 우레아이다.

전술한 바와 같이 A-28,086 화합물들은 항바이러스제이며 또한 특히 클로스트리디움 퍼후링겐스 같은 형기성 박테리아에 대하여 활성이 있다. 그러므로 A-28,086 화합물들은 병아리, 돼지, 소 및 양의 장염을 막는데 유효하다. A-28,086 화합물 들은 또한, 반추동물의 장독혈증의 치료에도 사용된다.

다음의 실시예들은 본 발명을 더욱 잘 설명해 준다.

[실시예 1]

A.S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758을 사용한 A-28,086의 진탕 훌라스크 발효법.

스트렙토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 5758의 배양물을 제조하고 다음 조성으로 이루어지는 한천사면에 심는다.

사면을 스트렙토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 5758로 접종시키고 접종시킨 사면을 30℃에서 6-10일간 배양시킨다. 성숙한 사면 배양물을 소고기 혈청으로 덮고 멸균루프로 포자가 듬성듬성 하도루 스크랩한다. 포자 및 균사체의 소고기-혈청 현탁액을 동결건조시켜 6개의 환약으로 만든다.

이렇게 제조한 하나의 동결건조 환약은 다음의 조성으로 이루어진 식물성 배지 50ml를 접종시키는데 사용한다.

접종시킨 식물성 배지를 250ml 엘렌마이어 훌라스크중에서 직경 2인치인 회전 진탕기 위에서 250rpm으로 회전시키며 30℃, 72시간 배양시킨다.

B.S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758을 사용한 A-28,086 의 탱크발효.

다량의 접종물을 만들기 위하여 전술한 바와 같은 식물성 배양배지 10ml를 식물성 배지와 똑같은 조성으로 이루어지는 제 2단계 식물성 생장배지 400ml를 접종하는데 사용한다. 이 제 2단계 배지를 2리터 훌라스크 중에서 직경 2인치인 회전 진탕기 위에서 250rpm으로 회전시키며 30℃에서 24시간 배양시킨다.

이 제 2단계 식물성 배지(1ℓ)는 다음 조성으로 이루어지는 멸균 생성배지 100리터를 접종시키는데 사용한다.

15-20파운드 압력 120℃에서 30분간 고압멸균 시킨 후 배지의 pH는 6.7이다. 165리터 발효탱크중에서 제조배지를 29℃에서 10일간 발효시킨다. 발효배지를 0.4볼륨 공기/배지볼륨/분의 속도로 멸균공기로 쏘여준다. 배지를 통상의 교반기로 250rpm으로 교반한다.

[실시예 2]

다음 조성으로 이루어지는 훌라스크-제조배지를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 방법에 따라 A-28,086 항생물질을 제조한다.

[실시예 3]

S. 아우레오화시엔스 NRRL 5758에 의해서 제조된 A-28,086 항생물질 복합체의 분리

실시예 1의 방법에 따라 얻은 전 발효배양액(132ℓ)을 여과 보조제로 여과(하이플로 슈퍼-셀, 규조토)하여 여과 배양액 97리터를 얻는다. 여과배양액을 약 동량의 초산에틸로 추출한다. 초산에틸 추출액을 수층으로부터 분리하고 약 500㎖의 양까지 농축시킨다. 이 농축시킨 초산에틸 추출액을 다량의 석유 에테르(스켈리 솔브 에프 ; 약 10리터)에 가하여 원하지 않는 물질을 침전으로 떨어뜨려 분리한다. 분리한 여액을 진공에서 증발시켜 A-28,086 항생물질 복합체의 배양부분(6.9g)을 얻는다.

A-28,086 항생물질 복합체의 균사체 부분은 여과된 균사체를 약

량의 메타놀로 2회(62ℓ, 59ℓ)추출하여 얻는다. 두 메타놀 추출액을 혼합하고 진공에서 농축시켜 메타놀을 제조한다. 농축한 후 약 10리터의 수층이 남는다. 이 수층을 묽은 수산화나트륨으로 pH 약 7.5로 맞춘다. 생성된 용액을 약 1/2량의 초산에탈로 2회(9ℓ, 10ℓ) 추출한다. 초산에틸추출액을 혼합한 다음 약 400㎖의 량으로 농축시킨다. 이 농축된 초산에틸 추출액을 과량의 석유에테르에 가하고 농축시킨 여과배양추출액을 처리할때와 같은 전술한 방법을 사용하여 원하지 않는 물질을 제거한다. 여액으로 부터 얻은 A-28,086 항생물질 복합체의 균사체 부분은 20.6g이다.

[실시예 4]

A-28,086 인자 A 및 B의 분리 A-28,086 항생물질 복합체의 균사체 부분(235g, 실시예 3의 방법에 따라 제조)을 80ml의 벤젠에 녹인다. 이 벤젠용액을 실리카겔 컬럼에 가한다(9×130㎝, 8ℓ, 마테손 그레이드 62 실리카겔)컬럼을 여러가지 벤젠-초산에틸 혼합물로 용출시킨다. 용출을 박층 크로마토그라피 방법으로 수행한다. 벤젠-초산에틸(9 : 10) 용매계를 사용하여 인자 B를 처음에 녹이고 각 인자로서 분리시킨다. 인자 B(43㎎)을 아세톤-물로 결정화 시킨다.

융점 150-153℃

서서히 현존하는 초산에틸의 비를 증가시키며 벤젠-초산에틸 혼합물로 계속 용출시켜 인자 A를 용출시키고 인자 A를 함유하는 여러가지 분획층을 혼합하고 진공에서 농축시킨다. 이 잔류물질을 아세톤(약 150ml)에 녹이고 물(약 150ml)을 아세톤 용액에 가한다. 생성된 용액의 pH를 1N-염산을 가하여 pH 3으로 맞춘다. 산성 혼합물을 약 1시간 교반시킨다. 이때 침전이 생성된다. 이 침전을 여과하여 분리하고 물(약 60ml)을 가하여 아세톤(약 150ml)으로 부터 재결정 시킨다. 침전을 진공에서 밤새도록 탈수시켜 인자 A(약 6.6g)을 수득한다. 여액으로 부터 아세톤을 부분 증발시킨후 인자 A를 더 회수한다.(약 1.2g)

[실시예 5]

A-28,086 인자 A-아세틸 에스테르 유도체 A-28,086 인자 A(7.4g)을 피리딘(150ml)에 녹인다. 무수초산(50㎖)을 이 용액에 가한다. 이 용액을 완전히 혼합한 다음 실온에서 밤새도록 방치한다.

완전히 혼합하며 물 200ml을 가한다. 이 혼합물을 실온에서 4시간 방치한다. 백색고체가 침전으로 떨어진다. 이 고체를 여과하여 분리시키고 물로 세척후 풍건시킨다.

생성된 고체를 아세톤 100ml에 녹이고 아세톤 용액을 진공에서 증발 건조시킨다(3회 반복), 잔류물질을 아세톤-물(50ml)로 결정화시켜 융점 100-103℃인 A-28,086 인자 A 아세틸 에스테르 유도체(6.14g)를 수득한다.

[실시예 6-9]

실시예 5의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 인자 A를 푸로피온산 무수물과 반응시켜 융점 96-98℃인 A-28,086 인자 A 푸로피오닐 에스테르 유도체를 수득한다.

항생물질 A-28,086 인자 A 부티릴에스테르 유도체는 실시예 5의 방법에 따라 피리딘 존재하에서, 인자 A를 n-부티린산 무수물과 반응시켜 제조한다.

융점 79-81℃

항생물질 A-28,086 인자 A n-카푸로일에스테르 유도체는 실시예 5의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 인자 A를 카푸로인산 무수물과 반응시켜 제조한다.

융점 163-167℃

항생물질 A-28,086 인자 A n-발레릴에스테르 유도체는 실시예 5의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 인자 A를 발레린산 무수물과 반응시켜 제조한다.

융점 173-175℃

[실시예 10]

A-28,086 인자 A 나트륨염의 제조

항생물질 A-28,086 인자 A(500㎎)를 아세톤 50ml에 녹인다. 물 50ml를 가하고 5N-수산화나트륨을 가하여 용액의 pH를 10.5-11로 맞춘다. 생성된 용액을 1시간 교반한 다음 초산에틸로 추출시킨다. 추산에틸추출액을 진공에서 증발건조시킨다. 잔류물질을 아세톤-물 용액으로 침전시켜 융점 120-123℃인 A-28,086 인자 A 나트륨염 378㎎을 수득한다.

[실시예 11-15]

A-28,086 인자 A 바륨염은 실시예 10의 방법을 사용하여 항생물질 인자 A(500㎎) 및 포화수산화바륨으로부터 제조한다(369㎎),

용액 188-190℃

항생물질 A-28,086 인자 A 칼슘염은 실시예 10의 방법을 사용하여 항생물질 A-28,086 인자 A(500㎎) 및 5N-수산화칼륨으로부터 제조한다. (363㎎), 융점 165-167℃

항생물질 A-28,086 인자 A 세슘염은 실시예 10의 방법에 따라 항생물질 A-28,086 인자 A(500㎎) 및 1N-수산화세슘으로부터 제조한다 (540㎎), 융점 190-210℃

항생물질 A-28,086인자 B 나트륨염은 실시예 10의 방법에 따라 항생물질 A-28,086 인자 B 및 5N-수산화나트륨으로부터 제조한다.

[실시예 16]

S. 아우레오화시엔스 NRRL 8692을 사용한 A-28,086의 진탕-훌라스크 발효

스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 8692의 배양물을 제조하고 다음 성분으로 이루어지는 한천 사면위에 접종시킨다.

스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 8692 접종시킨 사면은 30℃에서 약 7일간 배양시킨다. 충분히 발육한 사면 배양물을 멸균 소혈청으로 덮고 멸균투프로 스크탭하여 사면 배양물로부터 포자 및 균사체 현탁액을 제조한다. 생성된 현탁액을 동결건조시켜 6개의 환약으로 만든다.

이렇게 제조한 동결건조 환약 중 한개는 다음 조성으로 이루어지는 식물성 배지 50ml를 접종시키는데 사용한다.

접종시킨 식물성 배지를 250ml의 엘렌마이어 훌라스크 중에서 직경 2인치인 회전증발기 위에서 250rpm으로 회전시키며 30℃에서 48시간 배양시킨다. 전술한 바와 같은 식물성 배양배지(0.5ml, 1퍼센트)를 다음의 조성으로 이루어지는 발효배지 50ml를 접종시키는데 사용한다.

[실시예 17]

S. 아우레오화시엔스 NRRL 8092를 사용한 A-28086의 탱크 발효

A-28086의 진량훌라스크 발효에 사용한 실시예 16의 처음조작을 탱크 발효법에 사용한다. 다량의 접종물을 만들기 위하여, 식물성 배양배지 10ml를 처음의 식물성 배지와 똑같은 조성으로 이루어지는 제 2단계 식물성 배지 400ml를 접종시키는데 사용한다. 이 제 2단계 배지를 2리터 엘렌마이어 훌라스크 중에서 직경 2인치인 회전 진탕기 위에서 250rpm으로 회전시키며 30℃에서 24시간 배양시킨다.

이 배양한 제 2단계 식물성 배지(800ml)는 다음 조성으로 이루어지는 멸균발효배지 100리터를 접종시키는데 사용한다.

15-20 파운드 압력, 121℃에서 30분간 고압멸균시킨 후 배지의 pH는 6.8±0.1이다. 165리터의 발효탱크 중에서 접종된 제조배지를 28±1℃에서 10-12일간 발효시킨다. 발효배지는 0.4 볼륨공기/배양배지볼륨/분의 속도로 멸균공기를 쏘여준다. 배지는 통상의 교반기로 300rpm으로 교반시킨다.

[실시예 18]

다음 조성으로 이루어지는 진탕 훌라스크/탱크제조배지를 사용하여 실시예 17의 방법에 따라 A-28,086 항생물질을 제조한다.

[실시예 19]

S. 아우레오화시엔스 NRRL 8092에 의하여 제조된 A-28,086 항생물질 복합체의 분리

실시예 17의 방법에 따라 제조한 전발효배양액 60리터를 묽은 염산을 가하여 pH 3으로 맞춘다. 생성된 용액을 여과보조제(하이플로 슈퍼셀, 규조로)도 여과한다. 분리된 균사물질을 메타놀 30리터로 추출하고 교반하여 추출액에 중탄산나트륨 1.56㎏을 가한다. 이 추출액을 분리한 후 다시 균사물질을 30리터의 메타놀로 추출한다. 두 메타놀 추출액을 혼합하고 진공에서 농축시켜 메타놀을 제거한다. 남아있는 수용액(약 7리터)을 묽은 염산으로 pH 7.5로 맞춘다. 생성된 용액을 초산에틸 7리터로 2회 추출한다. 초산에틸 추출액을 혼합하고 진공에서 농축시켜 유상 잔류물질을 수득한다. 이 유상 잔류물질을 1,500ml의 아세톤에 녹인다. 물 1,500ml를 아세톤 용액에 가한다. 생성된 용액을 묽은 염산으로 pH 3으로 맞추고 1시간 교반한다. 생성된 침전을 여과하여 분리한 다음 아세톤 1,500ml에 녹이고 물 400ml을 가한다. 생성된 용액을 16시간 방치하여 결정화시킨다. 생성된 결정을 여과하여 분리하고 진공에서 탈수하여 A-28086 인자 A 및 D와 다른 결정성 불순물을 함유하는 조 결정성 생성물 74g을 수득한다.

이 조 결정성 생성물(40g)을 약 250ml의 벤젠에 녹인다. 다음 벤젠용액을 실리카겔 컬럼(9×120㎝ 컬럼, 크레이스-다비드손 그레이드 62 실리카겔)에 넣는다. 컬럼은 다음 물질 40리터로 각각 계속해서 용출시킨다.

1) 벤젠

2) 벤젠 : 초산에틸(9 : 1)

3) 벤젠 : 초산에틸(4 : 1)

4) 벤젠 : 초산에틸(7 : 3)

5) 벤젠 : 초산에틸(1 : 1)

6) 초산에틸

7) 메타놀

1리터씩의 분획층을 모은다. 각 분획층은 바실투스 섭틸리즈에 대한 작용을 첵크하고 박층크로마로그라피법으로 용출화합물을 확인한다. I은 벤젠 : 초산에틸(4 : 1)로 용출된다. 인자 B는 벤젠 : 초산에틸(7 : 3)로 용출된다. A- 인자 A 및 D는 벤젠 : 초산에틸(7 : 3 및 1 : 1)로 용출시킬 때 분획층 119-156에서 용출된다. 이들 분획층을 혼합하고 진공에서 증발 건조시킨다. 이렇게 얻은 잔류물질을 아세톤 500ml이 녹인다. 아세톤 용액에 물 500ml를 가한 다음 묽은 염산으로 pH 3으로 맞춘 다음 1시간 교반한다.

생성된 침전을 여과하여 분리하고 아세톤(500ml)-물(180ml)로부터 결정화시킨다. 생성된 결정을 여과하여 분리하고 진공에서 건조하여 A-28086 인자 A 및 D의 혼합물 20.1g을 수득한다.

[실시예 20]

인자 A 및 D의 분리 및 정제방법

실시예 18의 방법으로 얻은 A-28086 인자 A 및 D의 결정성 혼합물 18.8g을 벤젠 50ml에 녹인다. 벤젠용액을 실리카겔 컬럼에 넣는다(7×100㎝ 컬럼 ; E. 메르크 그레이드 60 실리카겔, 230 메시보다 더 미세한 ASTM) 컬럼을 한시간에 90ml의 속도로 계속해서 다음 용매로 용출시킨다.

1) 벤젠 12리터

2) 벤젠 : 초산에틸(9 : 1) 12리터

3) 벤젠 : 초산에틸(4 : 1) 12리터

4) 벤젠 : 초산에틸(7 : 3) 32리터

5) 메타놀 10리터

B. 섭틸리스 바이오오로그라피에 의해서 박층 셀루로즈 크로마토그라피(알미늄 지지체상에서의 메르크다륨스타드 셀루로즈)를 수행한다. 물 : 메타놀 : 아세톤(12 : 3 : 1)의 용매계를 사용하고 처음에 암모니아 수로 pH 10.5로 맞춘 다음 염산으로 pH 7.5로 맞춘다. 활성물질이 측정될 때까지 1-2리터의 분획층을 모은 다음 200ml 분획을 모은다. A-28086 인자 D만을 함유하는 분획층을 혼합하고 진공에서 증발시킨다. 이 잔류물질을 아세톤-물(1 : 1)로 결정화시킨다. 결정들을 분리하고 진공에서 건조시켜 결정성 A-28086 인자 D 140㎎을 수득한다.

미량의 A-28086 인자 A와 함께 A-28086 인자 D를 함유하는 분획층을 같은 방법으로 처리하여 소량의 A-28086 인자 A를 함유하는 결정성 A-28086 인자 D 150㎎을 더 수득한다.

A-28086 인자 A만을 함유하는 분획층을 같은 방법으로 처리하여 결정성 A-28086 인자 A 4.7g을 수득한다.

[실시예 21]

다음 조성으로 이루어지는 사면 배지를 사용하여 실시예 16의 방법에 따라 A-28086 항생물질을 제조한다.

접종시킨 사면 배지를 28℃에서 약 7일간 배양시킨다.

[실시예 22]

다음 조성으로 이루어지는 훌라스크/제조배지를 사용하여 실시예 17의 방법에 따라 A-28,086 항생물질을 제조한다.

[실시예 23]

다음 조성으로 이루어진 제 3단계 식물성 배지를 사용하여 실시예 21의 방법에 따라 A-28086 항생물질을 제조한다.

[실시예 24]

콕시디움증을 저해시키기 위한 병아리의 A-28086 사료

체중급증용 체중을 급격히 증가시키기 위하여 병아리 사료에 가해지는 고 에너지 사료는 다음과 같이 제조된다.

이들 물질들을 표준사료-혼합법에 따라 혼합한다. 상나의 사료를 필요량의 물과 함께 먹인 병아리를 콕시디움증에 걸리지 않도록 보호하고 체중 증가를 약물을 제외하고는 똑같은 음식을 먹인 콕씨디움증이 없는 병아리의 체중증가와 비교한다.

[실시예 25]

개량시킨 소에 대한 A-28086의 사료

곡식이 많은 사료는 다음과 같이 제조한다.

혼합한 사료는 압착시켜 환약으로 만든다. 동물 한마리가 하루 평균 15파운드의 사료를 소화시킬 때 이 사료는 하루 동물 한마리에 대하여 약 300㎎의 A-28086 인자 A를 제공한다.

[실시예 26]

A-28086 인자 D 아세틸에스테르 유도체

항생물질 A-28086 인자 D를 피리딘에 녹인 다음 화학당량의 초산 무수물을 가한다. 생성된 용액을 완전히 혼합한 다음 실온에서 밤새도록 방치한다.

과량의 물을 가하고 완전히 혼합한 후 실온에서 수시간 방치한다. 생성된 침전을 여과하여 분리하고 물로 세척 후 탈수한다. 생성된 고체를 아세톤에 녹이고 진공에서 증발 건고시켜 A-28086 인자 D 아세틸에스테르 유도체를 수득한다.

[실시예 27-30]

항생물질 A-28086 인자 D 푸로피오닐 에스테르 유도체는 실시예 26의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 A-28086 인자를 푸로피온산 무수물과 반응시켜 제조한다.

항생물질 A-28086 인자 D n-부티릴 에스테르 유도체는 실시예 26의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 A-28086 인자 D를 n-부티린산 무수물과 반응시켜 제조한다.

항생물질 A-28086 인자 D n-카푸로일 에스테르 유도체는 실시예 26의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 A-28086 인자 D를 카푸로인산 무수물과 반응시켜 제조한다.

항생물질 A-28086 인자 D n-발레릴 에스테르 유도체는 실시예 26의 방법에 따라 피리딘 존재하에서 A-28086 인자 D를 바레린산 무수물과 반응시켜 제조한다.

[실시예 31]

A-28086 인자 D 나트륨염의 제조

항생물질 A-28086 인자 D 를 아세톤에 녹인다. 일당량의 물을 가하고 충분량의 5N-수산화나트륨을 가하여 용액의 pH를 약 11로 맞춘다. 생성된 용액을 약 1시간 교반한 다음 초산에틸로 추출한다. 초산에틸 추출액을 진공에서 증발시켜 A-28086 인자 D 나트륨염을 수득한다.

[실시예 32-34]

항생물질 A-28086 인자 D 칼륨염은 실시예 31의 방법을 사용하여 A-28086 인자 D 및 5N-수산화칼륨으로부터 제조한다.

항생물질 A-28086 인자 D 바륨염은 실시예 31의 방법을 사용하여 A-28086 인자 D 및 포화수산화바륨으로부터 제조한다.

항생물질 A-28086 인자 D 세슘염은 실시예 31의 방법을 사용하여 A-28086 인자 D 및 1N-수산화세슘으로부터 제조한다.

[실시예 35]

콕시디움증을 저해시키기 위한 A-28086 인자 D를 함유하는 병아리의 사료

체중을 급격히 증가시키기 위하여 병아리 사료에 가해지는 고에너지 사료는 다음과 같이 제조된다.

이들 물질들을 표준사료 혼합법에 따라 혼합한다. 상기와 같은 사료를 필요량의 물과 함께 먹인 고양이를 콕씨디움증의 노출로부터 보호하고 체중 증가는 약물을 가하지 않은 똑같은 사료를 먹인, 콕씨디움증이 없는 고양이의 체중증가와 비교한다.

[실시예 36]

A-28086 인자 D를 함유하는 개량소의 사료

곡식이 많은 사료는 다음과 같이 제조한다.

혼합된 사료를 압착시켜 환약으로 만든다. 15파운드의 사료/동물의 평균 하루 소화율에서 이 사료는 동물 한마리에 대하여 하루 300㎎의 A-28086 인자 D를 제공한다.

Claims (1)

1. 스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 5758이나 스트랩토마이세스 아우레오화시엔스 NRRL 8092를 탄수화물, 질소 및 무기염류를 함유하는 영양 배지 중에서 영양배지 중에 기본량의 항생작용이 생길 때까지 심부 호기성 발효조건하에서 배양시켜 인자 A , 인자 B 및 인자 D를 함유한 항생물질 A-28086 복합체를 제조하는 방법.

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