KR800000378B1 - 항생물질 라살로시드의 제조방법 - Google Patents

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Description

항생물질 라살로시드의 제조방법

본 발명은 항포자충증(胞子庄症)제 및 항균제로서 유효한 다음 구조식(I)의 항생물질 및 이들의 약리적으로 무독한 염의 제조방법에 관한 것이다.

상기 구조식에서

R₂, R₂, R₃및 R₄는 메틸과 에틸중의 하나이며, 단, 이들중 하나만이 에틸을 나타낸다.

본 발명의 제조방법에 의해 상기의 항생 물질 및 이들의 염은 스트렙토마이세스 X-537종에 속하는 미생물을 수화물과 질소의 동화성 공급원을 함유하는 액체 영양배지 내에서, 이 배지에 실제적인 항생 작용이 나타날때 까지 통기성 액칭 조건에서 배양하고, 생성된 구조식(I)의 화합물을 배지로부터 분리해내고. 필요하다면, 이 생성물을 의약적으로 무독한 염으로 전환시켜 제조한다.

본 발명에 유용한 항생물질을 생성하는 미생물은 미국 매사추세츠주 하이드 파크에서 채취된 토양에서 분리해 낸 스트렙토마이세스 미생물이다. 연구실에서 X-537이라는 번호를 부여한 이 미생물의 배양물의 동결 건조된 시험관은 미국 일리노이 주 페오리아에 위치한 미 농무성, 농업 연구소, 북부 실용 연구 및 개발부에 보관되어 있다. 위탁된 균 배양물은 농업연구소에 의하여 NRRL3382라는 번호가 부여되었다.

다음은 전형적인, 스트렙토마이세스 X-537균주에 대한 일반적 기술이다.

Stirling, E.B. 와 D. Gottlieb의 Methods of Characterization of Streptomyces species Intern. J. Systematic Bacteriol 16, 313-340, 1966(차후로는 "스터링 및 고트리브, 1966"으로 나타냄)에 지시된 방법으로 시험할 때, 균의 배양물은 느슨하게 감겨진 체닌(Ralf H

tter의 systematic der streptomyceten, p 101, publ. S. karger, 1967의 용어에 따른 Retinaculum-apertum의 명칭) 내에 포자를 가진 가지가 있는 잘자란 균사체를 생성해내며; 각 체인 마다 평균 25개의 포자를 가지는데 ; 포자의 표면은 거칠다. 여러가지 한천 배지상에서의 콜로니의 형태는 다음과 같다.

1) 스터링과 고트리브, 1966에 따른 배지

2) 트레스너-박커스의 색상안내

3) 프라우저(1964)의 색상 안내

4) 0.05N의 염산이나 수산화나트륨 내에서 번환되지 않음.

스터링과 고트리브, 1966의 방법에 따르면 다음과 같은 탄수화물을 사용하여 배양한다:

즉, 아라비노즈 3+, 셀루로즈±, 과당 3+, 포도당 3+, 이노시톨 4+, 만니톨 4+, 라피노즈+, 람노즈 2+, 서당+, 크실로즈 3+.

R.E. Gordon, Ecology of Soil Bacteria, T.R.G. Gray ＆ Parkinson, Eds. Liverpool University Press, Liverpool 1967 중 "토양 세균의 분류"에 의해 시험할 때 다음과 같은 생리적 반응이 관찰된다.

1) 아데닌 +, 카제인 ±, 하이포크산틴 +, 티로신 +, 감자전분 ± 등의 가수분해.

2) 우레아제 -, 질산염 환원효소 -와 같은 효소의 생성.

3) 시트레이트 +, 락데이트 -, 말레이트 +, 무케이트 -, 옥살레이트 -, 석시네이트 +의 사용.

4) 아도니톨 -, 아라비노즈 -, 듈시톨 -, 에리트리톨 -, 갈락토즈 +, 글루코즈 +, 이노시톨 +,락토즈 +, 말토즈 +, 만니톨 +, 만노스 +, 멜리비오즈 +, α-메틸-D-글루코시드 +, 라피노즈 -, 람노즈 +, 소르비톨 -, 트레할로스 +, 크실로즈 +로 부터 산을 생성.

5) 생장온도 : 10 ℃+, 42℃ +, 53℃ -.

6) 생장배지 : 라이소자임 브로트 -, 살리실레이트브로트 -, 글리세롤 브로트 +.

인터내셔날 스트렙토마이세스 프로젝트(ISP)(스터링과 고트리브, 1966)와 노노무라의 요지(H. Nonomura:ISP에 설명된 458종의 스트렙토마이세스의 분류와 확인의 요지 : J. Ferment. Technol. 52 : 78-92, 1974)에 따른 결과, 본 발명에서 사용된 배양물은 그 분야의 어떠한 스트렙토마이세트와도 일치하지 않으며 그것은 디아미노멜린산의 L-이성체를 함유한다.

본 발명에 따라 제조된 항생물질중 항생물질 X-537(라살로시드 A)로서 정의된 항생물질을 분석한 결과 그의 명칭은6-{7(R)-[5(S)-에틸-5-} 5(R)-에틸 테트라하이드로-5-하이드록시-6(S)-메틸-2H-피린-2(R)-일}-테트라하이드로-3(S)-메틸-2(S)-푸릴]-4(S)-하이드록시-3(R), 5(S)-디메틸-6-옥소노닐}-2, 3-크레소틴산이고 구조식은 다음과 같다는 것을 발견하였다.

본 발명은 항생제 라살로시드 A 및 이들의 약학적으로 무독한 염의 동족체에 관한 것이며 특히 본 발명의 라살로시드 동족체는 다음의 구조식 및 명칭을 가진다.

라살로시드 B : 6-{7(R)-[5(S)-에틸-5-{5(R)-에틸 테트라하이드로-5-하이드록시-6(S)-메틸-2H-피란-2(R)-일}-테트라하이드로-3(S)-메틸-2(S)-푸릴]-4(S)-하이드록시-3(R), 5(S)-디메틸-6-옥소노닐}-2-하이드록시-3-에틸 벤조산.

라살로시드 C : 6-{7(R)-[(5(S)-에틸-5-{5(R)-에틸 테트라하이드로-5-하이드록시-6(S)-메틸-2H-피린-2(R)-일-테트라하이드로-3(S)-메틸-2(S)-푸릴]-3(R)에틸-4(S)-하이드록시-5(S)-메틸-6-옥소노닐}-2,3-크레소틴산.

라살로시드 D: 6-{7(R)-[5(S)-5{5(R)-에틸에틸테트라하이드로-5-하이드록시-6(S)-메틸-2H-피란-2(R)-일}-테트라하이드로-3(S)메틸-2(S)-푸릴]-5(S) 에틸-4(S)-하이드록시-3(R)-메틸-6-옥소노닐}-2,3-크레소틴산

라살로시드 E : 6-{7(R)-[5(S)-에틸-5-{5(R)-에틸테트라하이드로-5-하이드록시-6(S)-메틸-2H-피란-2(R)-일}-테트라하이드로-3(S)-에틸-2(S)-푸릴]-4(S)-하이드록시-3(R), 5(S)-디메틸-6-옥소노닐}-2,3-크레소틴산.

상기 동족체들은 발효 배지액의 pH를 중성 정도(예 : 6.5-7.5 정도)로 맞추고 액침 통기 조건하에서 스트렙토마이세스 X-537를 발효시켜 제조한다. 사용되는 배지는 효모, 효모부생물, 옥수수, 콩 등(이중대두가 가장 바람직하다)과 같은 질소공급원: 인산칼륨, 탄산칼륨과 작은 염과 미량원소; 당밀, 서당 등과 같은 탄수화물 공급원(이중 흑설탕이 가장 좋다) 대두유나 라드유와 같은 동물성이나 식물성 지방 및 오일(이는 탄소원으로서 이용되며 또 거품을 제거하고 최종 생성물의 수율을 증가시킨다)과 같은 것들을 함유한다. 발효는 25°내지 35℃와 같이 약간 가온된 상태에서(바람직하기로는 28℃정도에서) 수행한다.

약 4 내지 6일 동안 배양시킨 후 발효 배지액을 여과하고, 생성된 항생제는 추출하여 회수한다.

발효가 완료된 후에 생성된 동족체의 분리 및 정제를 위한 여러가지 공정을 수행할 수 있다. 적당한 분리방법 및 정제 방법으로는 배취식 추출이나 또는 연속유 등성 액체-액체추출 컬럼에 역류 분배하는 것과 같은 용매 추출기술과 비-수용성계에서의 겔 침투크로마토그라피와 같은 방법이 있다.

본 발명의 동족체의 약학적으로 무독한 염은 통상적인 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이들 염은 항생제의 유리산 형태나 그의 유도체들로 부터 기지의 방법에 의해 용이하게 제조되는데, 그 예를 들면, 용액내에서 유리산을 적절한 염기나 염으로 세척하여 제조한다. 본 발명의 염을 형성시키는데 사용되는 의약용 염기 물질로서는 수산화 나트륨, 수산화칼륨, 수산화 리튬 등과 같은 알칼리금속 염기; 수산화칼슘, 수산화 바륨 등과 같은 알칼리 토금속 염기 및 수산화 암모늄 등을 들 수 있다. 적절한 알칼리 금속이나 알칼리 금속염으로서는 탄산염, 중탄산염 및 황산염과 같은 음이온을 들 수 있다.

시험관내 시험으로 미생물 바실러스 TA에 대한 라살로시드 동족체 B, C, D 및 E의 상대적 항생작용력을 추정하는데 이때 컵-플레이트 한천 확산 방법을 사용하여 순수한 라살로시드 A의 나트륨염과 이 4가지의 동족체들을 비교함으로서 수행하였다. 5가지의 라살로시드 항생물질의 작용력은 라살로시드 A 염기를 100으로 하고 이를 기준으로 계산하여 그 결과를 다음의 표에 나타내었다.

항생물질 라살로시드 A의 동족체 또는 그의 의약적으로 무독한 염들을 활성 성분으로서 함유하는 항-포자충증 조성물은 그 활성 성분을 불활성 성분과 혼합하여 제조한다. 불활성 성분으로는 사료 또는 증량제 등과 같은 것이 있다. "불활성 성분"이라 함은 구충제, 예를 들어 항포자충증제로 작용하지 않으며 활성 물질과도 반응하지 않는 것을 말하며 치료할 동물에게 안전하게 섭취될 수 있어야 한다. 따라서 이 불활성 물질은 본 발명의 목적에 대하여 불활성인 물질이다.

포자충증에 민감한 가금, 특히 칠면조 및 닭에게 본 항생물질을 사료의 한 성분으로 하여 경구 투여하면 이 질병을 예방하거나 질병이 걸린 후에는 치료작용을 나타냄으로써 포자충증을 효과적으로 구제하게된다. 또한, 본 항생물질로서 처리된 가금들은 대조군들에 비해 그들의 몸무게가 변하지 않거나 증가된다. 따라서 본 발명에 따른 항생물질들은 포자충증에 대해 유효할 뿐만이 아니라 사료가 체중의 증가분으로 전환되는 효율도 높이게 된다.

동물 사료중의 활성 성분 농도는 물론 대상동물 각각의 필요에 따라 조절할 수 있으며 이는 넓은 범위로 변경할 수 있다. 물론, 최소 농도란 포자충증의 구제에 효과를 나타내기에 충분한 분량의 활성물질을 공급할 수 있는 농도이며 최대농도란 동물이 사료를 섭취하였을때 바람직하지 않은 부작용을 초래치 않는 농도를 말한다.

예를들면, 동물의 일일 사료 섭취량에 대해 0.006-0.03중량% 바람직하기로는 0.015-0.03중량%의 활성 성분을 함유하는 예비 혼합사료 또는 완전혼합 사료가 있다.

일반적으로 포자층증을 구제하려면 0.015%의 활성 성분을 사용하면 충분하다. 0.015% 이상을 사용하면, 포자충증에 대해서는 소기의 효과를 발휘하는 반면에 0.015% 이상 더 사용된 량만큼 그 효과가 더 나타나지는 않으며 때로는 생장, 사료 효율 및 치사율 등에 역작용을 초래하기도 한다.

0.03% 초과 분량은 포자층증의 구제에는 효과적이나 경제적인면(즉, 효율단위에 대한 경비가 이 범위 내에서 가장 낮다) 때문에 이 분량이 바람직한 분량의 상한 선이다. 0.006% 이하의 분량은 포자충증에 대해 유효하지 못하다. 바람직한 분량의 하한선은 0.015%인데 이 분량은 효과가 확실하기 때문이다. 가장 바람직한 투여량은 가금의 일일 사료 섭취량의 0.015중량%인데 이 분량이 칙소의 량으로 최대의 효과를 얻을 수 있는 분량이기 때문이다.

적정한 투여량은, 물론 동물의 크기에 따라 변한다. 본 발명에 따른 학생물질을 포자충증의 치료나 예방의 목적으로 사용할 때는, 먼저 사료 성분이나 담체와 함께 혼합시키거나 조합하여 사료 첨가용 예비혼합물, 사료 농축물, 또는 사료첨가 보층제로 만들 수 있다. 사료첨가물, 농축물 또는 예비 혼합물은 다음에 사료로서 희석하여 완전한 사료 즉, 하나의 정량의 사료로서 만들어 투여된다.

사료첨가 보층제는 직접 동물에 급여하거나, 희석하여 완전한 사료로 만들어 내서 사용하거나 또는 다른 식량(사료)에 대한 보충제로서 급여되거나 사용할 수 있다. 사료 첨가 보충제, 농축물 및 예비혼합물들은 항포자충증제를 비교적 높은 비율로 함유한다. 즉 활성성분을 적합한 담체와 혼합하여 담체내에 항포자충증제가 실제상 균일하게 분산된 분산제를 제조한다. 적합한 담체물질로서는 활성 물질에 대하여 불활성이고 치료 대상 동물에 대해 안전한 고체물질이 있다. 이와 같은 담체 물질중 대표적인 고체담체의 예를 들면, 시판되는 가금응사료, 곡류, 곡류-부산물, 식물 단백농축물(대두, 땅콩등), 발효 부산물, 염, 석희석, 무기 화합물 등이나 이들의 혼합물을 들 수 있다.

물이나 식물유를 사용하여 액체 분산제를 제조할 수 있으며 이 분산액은 개면활성제, 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 유화제 및 응해제를 함유하는 것이 좋다. 적절한 담체나 중량제는 모두 고체형태로서 구충제에서 불활성 성분으로서 사용할 수 있으나 활성물질에 대해 불활성이어야하고 치료하려는 대상 동물에 대해 비독성이어야 한다.

활성 성분은 불활성 담체나 중량제 고체물질과 통상적인 방법으로 혼합하여 가루포이, 펜릿 또는 기타의 제제형태로 만들 수 있다. 예를 들면, 조성물은 활성성분과 불활성 성분을 사료물질과 함께, 또는 사료물질 없이 통상적인 혼합분쇄기나 미분쇄기 등을 사용하여 마쇄하거나 미세분말화 함으로서 제조할 수 있다. 문료물질이 없이 마쇄하거나 미세분말화 하였을 경우 수득된 물질은 본 발명의 방법에 의해 통상적인 사료물질과 함께 다시 혼합시킬 수 있다. 본 발명에 따른 활성물질과 함께 약제화할 수 있는 가금용사료에는 여러가지의 성분을 함유할 수 있다.

예를 들면, 옥수수, 밀, 붉은 밀가루, 오트밀, 밀로 등과 같은 고급 에너지 곡류 ; 귀리 보리, 밀가루 등과 같은 중간 및 저급에너지 곡류, 안정화 지방 ; 대두박, 옥수수, 글루렌박, 땅콩박 등과 같은 식물성 단백질 ; 어분, 가용성어분, 육류편 등과 같은 동물 단백질 ; 분유, 건조시킨 양조용 효모, 건조 알코올 박즙, 발효 박즙 등과 같은 비타민-B 운반체와 UGF(미확인된 생장요소)원 ; 탈수된 알팔파 가루 ; 리보플라빈, 비타민 B₁₂, 판토텐산나트륨, 나이아신, 콜린, 비타민 K 및 비타민 E 및 안정화시킨 비타민 A, 비타민 D₃(D-활성화된 동물 스테롤) 등과 같은 특수첨가제 ; 디칼슘 포스페이트, 증기처리된 벼가루, 탈불소화인, 석회석 등과 같은 칼슘 및 인의 보충제 ; 요드화염, 황산 망간, 탄산아연, 항생제 사료 보충물메티오닌 또는 이의 수산화 동족체 및 항산화제 등과 같은 것을 들 수 있다.

이상 설명된 바로부터, 항 포자충중제 조성물은 경구 섭취용 임을 알 수 있다. 이 조성물은 치료코저하는 동물의 일상 사료에 첨가하거나, 또는 정제, 환제 대형환제 등으로 만들어 동물에제 강제로 투여하는 방법도 있다. 활성 성분을 동물에게 투여할 때는 농업상 기르게 되는 특수한 동물에 대한 고려를 해야만 한다.

다음에는 본 발명의 구조식(I)의 항생제를 제조하는 실시예와 그의 항포자충중제로서의 효과를 확인한 시험예가 기술되어 있다. 그러나 이들이 본 발명에 범위에 대해 어떤 제한을 주지는 않는다는 것을 밝혀둔다.

[실시예 1]

라살로시드 동족체 B, C,D 및 E의 제조

스트렙토마이세스 미생물을 진탕 플라스크 내에서 통기성 액침 배양으로 배양하였다. 배양육즙은 수산화 칼륨을 사용하여 pH를 6.5-7.5로 조정한 후 살균한다. 통기성 배양기 내에서 3일간 액침 배양시킨 것을 발효 탱크에 5 내지 10% 접종하였다. 배지는 대두분 2%. 흑설탕 2%, K₂HPO₄0.1% 및 콘스립액 0.5를 함유한다. 발효는 발효 배지액 40 내지 80갈론당 1분간에 5 내지 10ft³의 공기가 흐르도록 공기 정압하의 28℃에서 수행한다. 4 내지 6일간 발효시킨 다음에 육즙 여과하고 생성된 항생물질을 추출에 의해 회수한다.

추출공정은 다음과 같다:

204리터의 육즙을 여과하고, 젖은 여과 케이크를 100리터의 n-부틸 아세테이트에 현탁시키고 그 혼합물을 실온에서 철야 교반한다. 이 혼합물을 여과하고 물충을 분리하여 따라낸다. 3천만 바실러스 E단위가 되는 n-부틸 아세테이트 용액을 진공에서 농축시켜 3리터로 되게하고, 10% 탄산나트륨 용액으로 세척한 후 무수 황산 나트륨으로 탈수시킨다. 300ml가 되도록 다시 농축시킨 후 350ml의 석유 에테르(비점: 50 내지 60℃)로 희석하여 2,500만의 바실러스 E 단위가 되는 고형물 41g을 분리하였다. 이 고형물을 4리터의 석유에테르(비점 : 50 내지 60℃)를 사용하여 속실텔장치로 40시간 동안 추출한다. 이 추출물을 진공에서 건조시켜 얻어진 결정 잔유물을 석유에테르에 현탁시킨 후 여과한다. 이를 다시 결정화시킴으로서, 상기 동족체가 많아진 모액을 얻었다.

[실시예 2]

라살로시드 동족체의 B, C, D 및 E의 분리

실시예 1에서 대규모로 제조되어 수득된 최종 모액중의 일부분(고형물 22g에 상응하는 량)을 200개의 튜브(각용량 80ml)로 된 역류 분배장치에서 크로마토그라피한다. 시료를 160ml의 혼합 용매계(헵틴-에틸아세테이트-메탄올-물 ; 26 : 18 : 18 : 2)에 용해시키고 이 용액을 처음의 2개의 튜브에 넣었다. 380회 전이 시킨 후에, 다음과 같은 획분이 회수되며 이를 증발시켜 고형물을 수득하였다.

획분 A : 라살로시드 동족체 B, C, D 및 E의 혼합물

획분 B : 라살로시드 A

획분 C : 이소라살로시드 A(라살로시드 A∼E와는 다른 구조를 가진, 라살로시드 A의 이성체이다)

휙 분 A를 헵틴-에틸 아세테이트-에탄올-물-빙초산(10 : 5 : 9 : 3 : 1)으로 이루어진 혼합 용매계 20ml에 용해시키고 500개의 튜브로 된 역류 분배 장치에서 크로마토그라피하였다. 2,800회전이 시킨 후에, 각각 약 200mg씩의 라살로시드 B, C, D 및 E가 분리되었다. 이들의 융점은 다음과 같다.

라살로시드 B : 85 내지 87℃

라살로시드 C : 97 내지 100℃

라살로시드 D : 102 내지 104℃

라살로시드 E : 90℃

[실시예 3]

라살로시드 동족체 E의 나트륨염

약 l00mg의 라살로시드 E를 염화메틸렌에 용해시키고 탄산나트륨 포화수용액으로 처리한다. 용매층을 헥산으로 농축시켜 결정성 라살로시드 E 나트륨염(융점 182 내지 182.5℃) 104mg을 수득한다.

[실시예 4]

본 실시예는 항-포자충중에 대한 항생제 혼합물을 동물에 사용하는 것을 기술하였다.

다음 표에 기술된 성분들로 이루어진 가금용 기초사료에 라살로시드 B와 C(50/50)의 혼합물 0.015%(중량비)와 라살로시드 D와 E(50/50)의 혼합물 0.006(중량비)를 가하여 혼합시켜 양계용 약제 사료로 만들었다.

실험실 병아리에 대한 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella)의 감염

시험방법-이 시험은 투약 그룹당 10마리의 병아리를 사용한다. 병아리 10마리는 체중 대조용으로 하고 10마리는 감염용 대조용으로 하였다. 병아리를 감염시키기 48시간전에 약을 투약한다. 1g의 시험약제를 목적하는 용량을 공급하기에 충분한 분량의 병아리용 사료와 함께 기계적 혼합기로 혼합시키었다. 병아리는 약 20만개의 난모세포를 피펫을 사용하여 경구 투여하여 감염시킨다. 시험을 11일간 지속시킨 후에 생존한 병아리를 검시하고 전체적인 병해를 조사하고 생존한 병아리의 수와 병해를 입은 병아리의 수를 센다. 그 결과는 평균 감염율(A.D.I)로서 다음의 표에 표시하였다. 평균 감염을 1.5 이하가 중요한 것으로 고려된다.

다음의 표에서 보는 바와 같이 본 항생제 혼합물은 포자충증의 치료를 위한 용량에서 유효함을 알 수 있다.

[실시예 5]

본 실시예는 동물 사료에 한가지의 항 포자충증제 항생물질을 사용한 시험예이다. 실시예 4에서와 같이 양계용 약제 배합 사료를 제조한다. 실시예 4에서 사용된 가금용 기조사료에 라살로시드 D를 0.01중량% 혼합한다. 실시예 4와 동일한 방법으로 에이메리아 테넬라에 대한 작용력을 시험하여 다음의 표에 그 결과를 나타내었다. 데이타에서 보는 바와 같이 본 항생제는 포자충증의 치료에 바람직한 용량에서 유효함을 알 수 있다.

Claims (1)

1. 동화성 탄소원과 질소원을 함유하는 수용성 액체 영양 배지에서 호기성 액침 조건하에 스트렙토마이세스 X-537(NRRL 3382)을 배지에 실질적 항생물질 활성이 생길 때까지 배양하고, 생성된 구조식(I)의 화합물을 상기 수용성 배지로부터 분리시킴을 특징으로 하는 구조식(I)의 항생제 라살로시드 및 이들의 염의 제조방법.

   

   상기 구조식에서

   R_l, R₂, R₃및 R₄는 메틸 또는 에틸기이며,

   단, R₁내지 R₄중의 하나만이 에틸기이다.