DE3005696A1

DE3005696A1 - Wirkstoffgemisch, ein verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung als futterzusatzstoff

Info

Publication number: DE3005696A1
Application number: DE19803005696
Authority: DE
Inventors: Dipl.-Bio.-Chem. Dr. Erwin Bischoff; Dipl.-Mikrobiologe Hasso von Hugo; Martin Dr. Scheer; Dipl.-Chem. Dr. Theo 5600 Wuppertal Schröder; Dietmar Dr. 3350 Marburg Schäfer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1980-02-15
Publication date: 1981-08-20

Description

Wirkstoffgemisch, ein Verfahren zu seiner Herstellung
sowie seine Verwendung als Futterzusatzstoff Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Wirkstoffgemisch, ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung als Mittel zur Förderung des Wachstums und zur ,steigerung der Futterverwertung bei Tieren.
Es wurde gefunden, daß man in Wirkstoffgemisch erhält, wenn man den Streptosporangienstamin SS-48 züchtet und dieses nach bekannten Methoden aus dem Nährmedium isoliert. Das neue Wirkstoffgemisch besitzt die Eigenschaft, bei Tieren das Wachstum zu beschleunigen bzw.
zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern. Das Wirkstoffgemisch enthält est:erartig gebundene Dichlorisoeverninsäure der Formel und darüber hinaus einen Oligosaccharidanteil mit Orthoesterstrukturen. Das Gemisch ist durch die folgenden physikalisch-chemischen Parameter charakterisiert: 1. Elementaranalyse: C: 50,9 % H: 6,2 % 0: 37,9 % Cl: 4,9 % 2. Das UV-Spektrum des komplexen Antibiotikagemisches wird in Abb. 1 wiedergegeben.
Abszisse: Wellenlänge in µm, Ordinate: Extinktion #max 208 nm /Ecm1% 216,3/ #max 292 nm /Ecm1% 51,1/ C = 1,653 mg in 50 ml Methanol.
3. Das Infrarotabsorptionsspektrum wird in Abb. 2 wiedergegeben (Abszisse: Wellenzahl in cm 1 und Ordinate: Absorption). Es zeigt, wenn es zu KBr-Presslingen verpreßt wird, bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Zentimetern) Absorptionsbanden: 4000.0, 3915.4, 3441.9, 2984.0, 2942.8, 1740.3, 1640.6, 1581.3, 1451.8, 1408.4, 1386.2, 1253.8, 1199.6, 1174.0, 1100.9, 1038.4, 0987.8, 0909.7, 0867.4, 0835.0, 0769.3, 0738.8, 0696.7, 0600.0.
4. Hochdruckflüssigkeitschromatogramm (gemäß Fig. 3) aufgenommen bei 254 nm, getrennt auf einer 4 x 250 mm Stahlsäule, gefüllt mit Kieselgel RP-8 (10«m) im System Methanol/H2O 60/40, Konzentration 2 mg/ml, Fließrate 3 ml/Min., Druck 120 Bar, Einspritzung 10 ßl.
Das Wirkstoffgemisch ist gut löslich in Chloroform, Aceton, Essigsäureethylester, Acetonitril und niedrigen Alkoholen, z.B. Methanol und Ethanol, schlecht löslich ist es dagegen in Wasser, Diethylether, Petrolether und Hexan.
Das Wirkstoffgemisch ist ein farbloses neutrales Pulver. Bei kräftiger saurer Hydrolyse werden verschiedene Zucker abgespalten (z.B. mit wäßriger Salzsäure 10 % w/w bei 800C), wobei es sich u.a. wahrscheinlich um ein Disaccharid der Formel handelt. Dadurch ist es leicht möglich, das Gemisch bei der Dünnschichtchromato-raphie mit Zuckerreagentien, z.B. Anisaldehyd-Schwefelsäure, Thymol-Schwefelsäure oder Vanillin-Perchlorsäure oder mit Molybdatophosphorsäure sichtbar zu machen. Einige Färbungen, die zur Identifikation dienen können, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 Nr. Reagenz Farbe Untergrund 1 10 % H2SO4 braun weiß 2 Thymol-H2 SO4 braunrot weiß 3 Anisaldehyd-H2SO4 grau weiß 4 Molybdatophosphorsäure blaugrün hellgrün 5 Vanillin-HCLO4 braun farblos 6 Jod braun braungelb Die Reagentien werden nach den üblichen Vorschriften (vgl. E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, 2. Auflage, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York (1967)) angesetzt. Das Wirkstoffgemisch liefert bei der Dünnschichtchromatographie auf neutralen Kieselgelplatten (Fa. Merck-Darmstadt, BRD) in den sechs beschriebenen Systemen nur eine Zone mit den in Tabelle 2 angegebenen Rf-Werten, Tabelle 2 Nr. Laufmittel Wirkstoffgemisch Tylosin Erythromycin Rf-Wert Rf-Wert Rf-Wert Chloroform + Methanol 1 95 + 5 0,27 0,14 0,03 2 9 + 1 0,49 0,28 0,08 3 4 + 1 0,68 0,51 0,13 Chloroform + Methanol + Ammoniak* 4 20 + 3 + 0,5 0,11 0,73 0,73 5 40 + 10 + 0,2 0,41 0,75 0,55 6 Aceton 0,64 0,35 0,03 *25 Gew.-% Ammoniak enthaltende wäßrige Lösung Zum Vergleich werden Erythromycin und Tylosin als interner Standard mitgemessen.
Die gefundenen R Werte des Wirkstoffgemisches unterscheiden sich von den literaturgenannten Werten der unter der Bezeichnung Everninomycine bekannten Verbindungen, die ebenfalls Dichlorisoeverninsäure enthalten.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch ist demnach mit keinem der bekannten Everninomycine identisch.
Lvernilsomycilae sind beschricben in -US-PS 3 499 078, Il.L.
Herzog et al., Applied Microbiology 13 (1965) Seite 515 und Journal of Chromatography Library Vol. 1, "Chromatography c,f Antibiotics", H. Wagmann, I. Weinstein, Elsevier Amsterdam, London, New York 1973.
Aus dem Hochdruckflüssigkeitschromatogramm geht hervor, daß das erfindungsgemäße Produkt kein chemisch einheitlicher Wirkstoff, sondern ein Wirkstoffgemisch ist, dessen Bestandteile aufgrund der übrigen Befunde chemisch sehr ähnlich sind. Die Erfindung betrifft sowohl das Wirkstoffgemisch als auch dessen Einzelkomponenten.
Das Wirkstoffgemisch weist überraschenderweise die Eigenschaft auf, bei Tieren das Wachstum zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern, ohne toxische Nebeneffekte zu bewirken, wobei die bekannten Nachteile herkömmlicher Mittel fehlen, z.B. Xreuzresistenz gegenüber bekannten Makrolidantibiotika wie Erythromycin, Tylosin und Lincomycin und Wirksamkeit gegen Gram-negative Bakterien. Der erfindungsgemäß verwendbare Stamm Streptosporangium species SS-48 gehört der Klasse der Schizomyceten, der Ordnung Actinomycetales, der Familie Actinoplanaceae und der Gattung Streptosporangium an. Der Stamm SS 48 zeigt gute Ubereinstimmung mit der Art Streptosproangium roseum, unterscheidet sich jedoch durch die fehlende charakteristische Rosafärbung des sporulierenden Luftmycels,das fehlende blass weinrot-braune substratverfärbende Pigment dieser Art. Der Stamm SS-48 wurde aus naturgedüngter Humuserde isoliert. Der Stamm SS-48 hat die folgenden Merkmale: Die Substratmyzel ist 0,3 - 0,8in breit und ist verzweigt. Das Luftmyzel ist 0,7 - 1,04 breit, teils hin und her gebogen, mit geschlängelten Abschnitten und ist verzweigt. Die Seitenhyphen sind teils kurz, teils länger und dann oft von der Haupthyphe nicht mehr unterscheidbar. Die Myzelfarbe ist weiß, auch schmutzigweiß bis cremefarben; auf geeigneten Närböden (z.B.
Haferflocken-Agar) bald die ganze Kolonie bedeckend und dicht mit zahlreichen Sporangien besetzt. Die Sporangien sind kugelig und haben einen Durchmesser von 4 - 10 meist 7 - 10in, einzelne bis 13. Altere Sporangien sind häufig etwas eingefallen und nicht mehr kugelig. Sie sitzen einzeln, aber oft dicht gedrängt, an den Enden der Haupt- und Seitenhyphe des Luftmyzels.
Die Sporangienwand ist nicht sehr fest und platzt leicht auf. Die Sporen sind ellipsoid, etwa 1,5 - 2 mal so lang wie breit, manche auch annähernd kugelig, und sind unbegeißelt. Ihre Größe beträgt 1 - 1,3 x 1,2 -(gemessen in unfixiertem Zustand in wäßrigem Milieu).
Die Kulturmethode auf verschiedenen Nährböden (nach 4 - 8-wöchiger Wachstumsdauer bei Zimmertemperatur und diffusem Tageslicht beobachtet) geht aus der nachstehenden Aufstellung hervor: Melaninbildung auf Tyrosin-Agar CPC-Agar Milch-Agar Gelatine PEH-Agar Nitriatreduktion + Gelatineverflüssigung + Mi lchpeptoni s ierung + Tyrosin-Auflösung + Wachstum bei 150C + 20 + 27 ++ 32 ++ 37 42 Kochsalzverträglichkeit 2 % + 3 (+) 4 Cellulose-Abbau Stärke-Abbau + Wachstum unter Zusatz von: D-Fructose + Glucose i-Inosit Lacton D-Mannit Raffinose L-Rhamnose + D-Xylose + Wachstum auf verschiedenen Nährmedien: Haferflocken- W gut Hefe-Agar SM gelbbraun (HaH) LM ++, weiß und schmutzig weiß Sp -Spg ++ RK (aus 2 Sporangium nach 9 Wochen): 20 mm , im mittleren Teil (ca.
11 mm ) kompakt, leicht über die Agaroberfläche emporgehoben, mit radialen Rinnen, gelblichbraun, bedeckt mit schmutzigweißem, wabig gefeldertem Luftmycel; breite, hofartige transparente Randzone unter der Agaroberfläche Hefe-Stärke- W gut Agar SM gelbbraun (E) LM ++, schmutzig weiß, zum Teil gelblich cremefarben Sp -Spg + RK (aus 1 Sporangium nach 9 Wochen): 22 mm , kompakte Mittelzone 15 mm , braun; bedeckt von kleinen cremefarbenen Luftmycelpusteln; hofartige Randzone.
Casamino-Pepton- W mäßig (bis gut) Czapek-Agar SM blaß ocker, gelbbraun (CPC) LM wenig, dünn reifartig, weiß SP - (bis schwach gelblich) RK (nach 6 Wochen): 18 mm , flach mit einigen radial verlaufenden Rinnen, blaß ocker, nur wenig schwach entwickeltes Luftmycel; schmaler Hof mit verästeltem Rand.
Casamino-Pepton- W mäßig bis gut Czapek-Agar mit SM gelbbraun Erdzusatz LM ++, schmutzig weiß (CPCE) Spg +, aber größtenteils Kümmerformen NO3-Agar W mäßig (bis gut) SM farblos bis blaß ocker LM -SP -Nitrit aus Nitrat ++ Magermilch-Agar W gut (Ca) SM blaß hellbraun LM -SP -Milch peptonisiert Tyrosin-Agar W gut (Ty) SM gelbbraun LM -SP -Kristallauflösung + Czapek-Agar W gering SM blaß ocker LM wenig SP -Erd-Glucose-Hefe-Agar (EGH) W mäßig SM gelbbraun LM ++, schmutzigweiß SPg ++ Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar W gut (PEH) Medium Nr. 6- SM blaß braun LM -SP schwach gelbbraun W = Wachstum SM = Substratmyzel LM = Luftmyzel SP = substratverfärbender Farbstoff SPg = Sporangium RK = Riesenkolonie - = Fehlen + = ausgeprägtes Vorhandensein ++ = sehr ausgeprägtes Vorhandensein Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.
Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z.B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.
Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z.B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z.B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kultur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.
Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlen- stoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Stärke, Melasse, Molkepulver, Dextrin, Zucker, wie Saccharose, Maltose, Glucose und Glycerin genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche l'roteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleic;chextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z.B. NH4C1, (NH4)2SO4, NaNO3 und KNO3 aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z.B. folgende Ionen: Mg++, Na+, K +, Ca++, NH4+, Cl , S04 , P04 und NO3 sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthält, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen.
Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO3 vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z.B. H2SO4, oder sterile Lauge, z.B. NaOH, in Abständen in die Kulturlösun; eingespritzt wird.
Es ist zweckmäßig :;icherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.
Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 20 und etwa 400C, vorzugsweise zwischen 25 und 350C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 28"C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.
Die Menge des sich in der Kulturbrühe anreichernden Wirkstoffgemisches hat im allgemeinen ihr Maximum etwa 2 - 8, vorzugsweise 3 - 5 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.
Fremdinfektionen der Kulturmedien werden vermieden durch Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z.B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden.
Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z.B. flüssige Fette und Öle, Cl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octodecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen gedämpft oder beseitigt werden.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert. Die Isolierung kann z.B. gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Das isolierte Wirkstoffgemisch kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da die gegebenenfalls vorhandenen Verunreinigungen die Wirksamkeit des Wirkstoffgemisches nicht nachteilig beeinflussen. Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß p-Werte von 7,0 oder mehr, vorzugsweise zwischen 7,0 bis 9,0, eingehalten werden.
Zur Erhöhung des pH-Wertes können anorganische und organische Basen verwendet werden, z.B. Ammoniak, Alkali-oder Erdalkalihydroxide, Alkali- und Erdalkalicarbonate und Hydrogencarbonate, z.B. KOH, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, CaCO3. Um bei den obengenannten Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen das Wirkstoffgemisch in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z.B. messen der W-Bande bei 292 nm, der Rf-Werte oder vorzugsweise die Untersuchung der dem Wirkstoffgemisch eigenen antimikrobiellen Aktivität herangezogen werden. Besonders günstig ist im vorliegenden Fall die Untersuchung der Aktivität gegen Staphylococcus aureus SG 511 mit Hilfe des üblichen Plattentests (vgl.
z.B. P. Klein, Bakteriologische Grundlagen der chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer-Verlag, Göttingen (1957), Seiten 86 ff).
Die Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemischs wird z.B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden: Zur Kulturbrühe einschließlich Mycelium wird ein mit Wasser mischbates organisches Lösungsmittel gegeben und gut vermischt, wodurch einerseits Wirkstoffgemisch aus dem Mycelium extrahiert wird und andererseits eine Klärung der Kulturbrühe erreicht wird.
Als Lösungsmittel können z.B. niedere Alkylalkohole (C1-C4), wie Methanol, Ethanol, n- und i-Propanol oder t-Butanol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und besonders bevorzugt Aceton verwendet werden. Die Menge des Lösungsmittels kann in weiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt wird etwa das gleiche Volumen, wie es die Kulturbrühe hat, zugesetzt. Anschließend werden die nicht gelösten Bestandteile (Mycelium, ausgefällte Proteine usw.) durch Filtration, Zentrifugation, Absetzenlassen usw. abgetrennt.
Die wäßrig-organische Lösung wird zweckmäßigerweise im Vakuum z.B. etwa auf das Volumen des eingesetzten Kulturmediums eingeengt.
Gegebenenfalls wird mit einer Base (vgl. oben), vorzugsweise mit NaOH, ein pH-Wert von über 7,0, z.B. von pH 7,5, eingestellt. Die so erhaltene Lösung soll im folgenden als "Lösung 1" bezeichnet werden. Die Isolierung des Wirkstoffgemischs kann auch dadurch erfolgen, daß das geklärte Kulturfiltrat über ein Kunstharz auf Polystyrolbasis filtriert wird. Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird dabei an das Harz adsorbiert. Salze und andere Nährlösungsbestandteile werden z.B. mit Das ser und wäßrigen Lösungen von Methanol oder anderen niederen Alkoholen bzw. Ketonen ausgewaschen.
Das Wirkstoffgemisch wird z.B. mit reinem Methanol oder niederen Alkoholen bzw. Ketonen desorbiert. Das zur Desorption verwendete Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck abdestilliert und der verbleibende Rückstand in Wasser suspendiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird z.B. in organischen Lösungsmitteln, bevorzugt Ethylacetat, gelöst und das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird durch Zugabe eines organischen Fällungsmittels, in dem das erfindungsgemäße Antibio- tikum schwer löslich ist, z.B. von Diethylether oder von gesättigten, geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petrolethern, n-Hexan oder Cyclohexan, nach den üblichen Methoden ausgefällt.
Aus der "Lösung 1" wird das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt. Die Chromatographie wird z.B. in Form der Säulenchromatographie oder der präparativen Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Als Adsorptionsmittel sind alle üblichen nicht sauren anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel geeignet, wie Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, Derivate von Polyamiden usw., z.B.
acetyliertes Polyamid oder Dextrangele. Als Laufmittel bei der präparativen Dünnschichtchromatographie werden die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet, in welchen das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch löslich ist. Bevorzugt wird ein Gemisch aus Chloroform und Methanol (z.B. 9:1 Volumenteile) eingesetzt. Auch als Laufmittel für die Säulenchromatographie werden Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische verwendet, in welchen das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch löslich ist. Beispielhaft seien Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid und bevorzugt Chloroform genannt.
Bevorzugt werden zur Isolierung des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemisches Extraktionsverfahren, gegebenenfalls in Kombination mit Chromatographie-Verfahren und Fällungsverfahren verwendet. Bei der Durchführung der Extraktionsschritte ist darauf zu achten, daß je nach dem, ob das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch in der wäßrigen oder organischen Phase vorhanden sein soll, die Extraktionsmittel so gewählt werden, daß in ihnen das Wirkstoffgemisch schwer bzw. leicht löslich ist.
Das Extraktionsverfahren wird z.B. wie folgt durchgeführt: Die "Lösung 1" wird mit in Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln nach üblichen Methoden (Schütteln, Gegenstromverfahren usw.) extrahiert. Als Lösungsmittel werden z.B. die üblichen Extraktionsmittel, z.B.
Ester, wie Ethylacetat und Butylacetat, höhere Alkohole, wie Amylalkohole, z.B. n-Amylalkohol, in Wasser nicht mischbare Ketone, z.B. Methylisobutylketon, chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, z.B. Chloroform, Methylenchlorid und Tetrachlorkohlenstoff eingesetzt. Bevorzugt werden Ethylacetat und Butylacetat, insbesondere Ethylacetat verwendet.
Wenn bei der Extraktion der "Lösung 1" Ethylacetat und/oder Butylacetat eingesetzt werden, wird die wäßrige Phase verworfen, da sich das erfindungsgemäße Antibiotikum in der organischen Phase befindet.
Die organische Phase wird z.B. auf etwa 1/10 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Anschließend wird das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch durch die Zugabe eines organischen Fällungsmittels, in welchem das erfindungsgemäße Antibiotikum schwer löslich ist, z.B. von Diethylether oder von gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petrolethern, n-Hexan, oder Cyclohexan nach den üblichen Methoden ausgefällt.
Das rohe Wirkstoffgemisch wird nach den üblichen chromatographischen Methoden (Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie) feingereinigt, wobei als Adsorptionsmittel z.B. die üblichen nicht sauren anorganischen und organischen Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Runstharz wie Polyamide, Derivate von Polyamiden, z.B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele, Ionenaustauscher, usw. verwendet werden.
Wenn bei der Extraktion der "Lösung 1" nicht Ethylactat oder Butylacetat, sondern ein anderes Lösungsmittel, z.B. CCl4 verwendet wird, wird die wäßrige Phase verworfen, da sich das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch in der organischen Phase befindet. In diesem Falle wird das organische Lösungsmittel vorzugsweise auf etwa 1/10 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt und durch die Zugabe eines geeigneten organischen Fällungsmittels, in welchem das erfindungsgemäße Antibiotikum schwer löslich ist, z.B. von Diethylether oder von gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petrolether, n-Hexan oder Cyclohexan nach den üblichen Methoden gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser aufgelöst und die Lösung gefriergetrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wird gegebenenfalls durch Extraktion mit Ethylacetat oder Butylacetat, worin unerwünschte Begleitstoffe zum größten Teil nicht löslich sind, angereichert und nach den üblichen chromatographischen Methoden, z.B. durch Säulenchromatographie, präparativen Dünnschichtchromatographie mit Hilfe der üblichen Adsorptionsmittel (vgl. auch die obigen Ausführungen) oder durch die flüssig-flüssig-Verteilung gereinigt werden.
Zur Reinigung wird auch aus einer Lösung des Rohproduktes in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Methylenchlorid das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch mit Hilfe eines geeigneten organischen Fällungsmittels, in welchem das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch schwer löslich ist, z.B. von Diethylether, gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petrolether, n-Hexan und Cyclohexan, ausgefällt.
Aus seinen Lösungen wird das Antibiotikum nach den üblichen Methoden, z.B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw., erhalten.
Der neue Actinoplanesstamm mit der Laborbezeichnung SS-48 wurde unter folgender Nummer bei offiziellen Hinterlegungsstellen hinterlegt: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen unter der Bezeichnung Streptosporangium spec. DSM 1748 am 6.2.1980.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch kann in allen Bereichen der Tierzucht als Mittel zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei gesunden und kranken Tieren verwendet werden.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemisches ist hierbei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweist sich der erfindungsgemäße Wirkstoff bei der Aufzucht und Haltung von Jung- und Masttieren. Als Tiere, bei denen der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung eingesetzt werden kann, seien beispielsweise folgende Nutz- und Zietrtiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z.B. Nerze und Chinchilla, Geflügel, z.B. Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie Fische, z.B. Karpfen und Reptilien, z.B.
Schlangen.
Die Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemisches, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften des Wirkstoffes weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 5 bis 500, insbesondere 10 bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird den Tierennach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Gesundheitszustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen oral oder parenteral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhytmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch kann als reiner Stoff oder in formulierter Form, also in Mischung mit nichttoxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, z.B. mit Trägerstoffen und in Formulierungen, wie sie bei nutritiven Zubereitungen üblich sind, verabreicht werden.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird gegebenenfalls in formulierter Form zusammen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Fetten, Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen in geeigneter Form verabreicht.
Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf das Wirkstoffgemisch der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder des Trinkwassers zugegeben wird.
Das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch wird nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als reiner Stoff, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls in Form eines Praemix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder Trinkwasser beigefügt.
Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise den erfindungsgemäßen Wirkstoff in einer Gewichtskonzentration von etwa 5 bis 500, insbesondere 10 bis 100 ppm enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs in dem Futter und/oder Tinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und/oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.
Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Aufbaustoffen einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z.B. Heu, Rüben, Getreide, Getreidenebenprc>dukten, tierischen Stoffen, z.B. Fleisch, Fetten, Knochenmehl, Fischprodukten, Vitaminen, z.B. Vitamin A, D-Komplex und B-Komplex, Proteinen, Aminosäuren, z.B. DL-Methionin und anorganischen Stoffen, z.B. Kalk und Kochsalz.
Futterkonzentrate enthalten das erfindungsgemäße Wirstoffgemisch neben eßbaren Stoffen, z.B. Roggenmehl, Maismehl, Sojabohnenmehl oder Kalk, gegebenenfalls mit weiteren Nähr- und Aufbaustoffen sowie Proteinen, Mineralsalzen und Vitaminen. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.
Vorzugsweise in Praemixen und Futterkonzentraten kann der Wirkstoff gegebenenfalls auch durch seine Oberfläche bedeckende geeignete Mittel, z.B. mit nichttoxischen Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/ oder Feuchtigkeit geschützt werden.
Beispiel für die Zusammensetzung eines Kükenaufzuchtfutters, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält: 200 g Weizen, 340 g Mais, 361 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischun; und 2,5 g Wirkstofl-Praemix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus: 600 I.E. Vitamin A, 100 I.E. Vitamin D3, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K3, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mg Vitamin B12, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg Mn SO4 x H20, 140 mg Zn SO4 x 7 11201 100 mg Fe SO4 x 7 H20 und 20 mg Cu SO4 x 5 H2O.
Der Wirkstoff-Praemix enthält den erfindungsgemäßen Wirkstoff in der g(wünschten Menge, z.B. 100 mg und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, daß 2,5 g Praemix entstehen.
Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweineaufzuchtfutters, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält: 630 g Futtergetrei(leschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 60 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z.B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchemehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Praemix (Zusammensetzung z.B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küker bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Firkstoffgemisch wurden mehrere Fütterungsversuche an Broilerküken ülJer einen Zeitraum von 14 Tagen durchgefthrt.

Dabei ergab sich folgende Gewichtsentwicklung:

Präparat ppm Anzahl der Gewichtsent- Futterver-

Versuchstiere wichtlung in % brauch in %

Negativ-

Kontrolle - 79 100 100

Beispiel 3 10 50 104,1 107,5

Beispiel 3 30 50 108,6 102,8

Beispiel 3 100 50 109,7 101,5

Broiler: Beispiel 3 Gewichtsentwicklung Futterverbrauch ppm in z in 10 103,0 94,8* 30 103,7 97,0 Ferkel: Beispiel 3 Gewichtsentwicklung Futterverbrauch ppm in 8 in % 50 111,6* 89,9** *signifikant **hochsignifikant Die Herstellung des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemischs wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Alle %-Angaben in der Beschreibung beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf Gewichtsprozente.

Beispiel 1 Auf Schrägagar der Zusammensetzung Mais-stärke 2 % D(+)-Glucose 1,0 % NZ-Amine (Sheffield Chem.) 0,5 % Hefeautolysat 1,0 % CaCO3, p.a. 0,4 % Agar 2,0 % Wasser ad 100 % gewachsenes Myzel des Stammes Streptosporangium SS-48 wird auf je 140 m3 steriler, in 1-Ltr.-Erlenmeyerkolben befindlicher Nährlösung (im folgenden "Nährlösung A" genannt) der Zusammensetzung Sojamehl, entfettet 3,0 % Glycerin, reinst 3,0 % Ca03, p.a. 0,2 % Wasser ad 100 % und Hydroxylgruppen enthaltendes neutrales Polyol, z.B.
Niax Polyol LIHT 67 (Warenzeichen der Union Carbide Belg.
N.V.), 1 Tropfen/140 ml Nährlösung zur Entschäumung überimpft. Die Kolben werden 4 Tage bei 280C auf der Rundschüttelmaschine inkubiert. Je 20 l Nährlösung A und 60 ml Hydroxylgruppen haltiges neutraleS Polyol (z.B. Niax Polyol LHT) je 20 1 Nährlösung werden in Fermentern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung abgefüllt und bei 1210C sterilisiert. Nach Abkühlung der Lösungen werden die Fermenter mit je 900 ml von 4 Tage in Nährlösung A gewachsenen Schüttelkulturen des Streptosporangium-Stammes SS-48 beimpft, mit etwa 20 1 Luft/Min. bei etwa 300 U/Min. des Rührwerks belüftet und bei einer Temperatur von 280C gehalten.
Je 200 1 Nährlösung A und 609 ml Hydroxylgruppen-haltiges neutrales Polyol je 20() 1 Nährlösung werden in Fermentern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtunabgefüllt und bei 1210C sterilisiert. Nach Abkühlung der Lösungen werden die Fermenter mit je 20 1 von 3 ulage in Nährlösung A gewachsenen Vorfermentern mit dem Stamm SS-48 beimpft und mit etwa 200 1 Luft/Min. bei etwa 300 Umdrehungen des Rührwerkes pro Min. belüftet und bei einer Temperatur von 280C gehalten.
Je 2000 1 Nährlösung der Zusammensetzung Glucose 2,0 % Fleischhydrolysat (Danimex) 0,5 % Primaton (Sheffield Chem.) 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % CaCO3 0,3 % Wasser ad 100 % und 900 ml Hydroxylgruppen-haltiges neutrales Polyol (z.B. Niax Polyol LHT 67/Warenzeichen der Union Carbide Belg. N.V./) je 2000 1 Nährlösung werden in Fermentern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung abgefüllt und bei 1210C sterilisiert. Nach Abkühlen der Lösungen werden die Fermenter mit je 200 1 (10 % Volumen) von 3 Tage in Nährlösung A gewachsenen Vorfermentern des Streptosporangium-Stammes SS-48 beimpft, mit etwa 2000 1 Luft/Min. bei etwa 120 Umdrehungen des Rührwerks pro Min. belüftet und bei einer Temperatur von 280C gehal- ten. Nach 3-tägiger Fermentation des Stammes werden Proben der Kulturen zentrifugiert. Die klare überstehende Lösung wird im Agarplattenlochtest gegen Staphylococcus aureus SG-511 getestet. Das in der Kulturlösung befindliche erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch verursacht Wachstumshemmzonen von etwa 29 mm Durchmesser.
Die Isolierung des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemischs aus den Kulturbrühen geschieht wie in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 2 Die gemäß Beispiel 2 erhaltene Kulturbrühe aus einer 2000 Ltr.-Fermentation wird mit einem Schlammseparator geklärt. Das Myzel wird verworfen und das Kulturfiltrat über 120 kg eines unspezifischen Adsorptionsharzes auf Polystyrolbasis (Lewapol OC 1031 Bayer AG> filtriert.
Das Harz wird mit 750 1 entionisertem Wasser und 750 l wäßrigem 30 %igem (Volumenprozent) Methanol gewaschen. Nun wird das Antibiotikum mit 750 1 reinem Methanol desorbiert. Das Methanol wird unter reduziertem Druck abdestilliert, der verbleibende Rückstand in 20 1 entmineralisiertem Wasser suspendiert. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 505 g des rohen erz in dungsgemäßen Wirkstoffgemischs.
Beispiel 3 Reindarstellung des erfindungsgemäßen Wirkstoffgemischs.
50 g des rohen erfindungsgemäßen Wirkstoffgemischs aus Beispiel 2 werden in 2,5 1 Wasser suspendiert und auf pH 7,0 mit 0,1 N NaOH eingestellt. Nun wird mit 2,5 1 Essigsäureethylester 30 Min. gerührt. Nach Abtrennung der organischen Phase im Scheidetrichter wird die Wasserphase nochmals auf die gleiche Weise extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit 0,2 mL Ammoniak (23 %ige w/w wäßrige Lösung) versetzt und unter reduziertem Druck auf 0,2 1 konzentriert. Diese Lösung wird mit Q,75 1 n-Hexan versetzt. Der entstehende Niederschlag wird abfiltriert. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 8,7 g des noch rohen Wirkstoffgemischs.
3 g dieses Produkts werden auf einer Kieselgelsäule (LobarR-Fertigsäule LiChroprep Si 60 /63-125;im/ von Merck) mit einem Lösungsmittelgradienten, bestehend aus Chloroform und Chloroform + Methanol im Volumenverhältnis 9 zu 1, chromatographiert. Aufgefangen werden die antibiotisch gegen Staphylococcus aureus (SG 511) aktiven Hauptfraktionen. Das Eluat wird unter reduziertem Druck eingedampft und aus Essigsäureethylester/n-Hexan umgefällt. Das Wirkstoffgemisch wird unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 195 mg.
Das so erhaltene komplexe Gemisch liefert im Dünnschichtchromatogramm (Tabelle 2)- nur eine Zone, im HPLC-Hochdruckflüssigkeitschromatogramm dagegen das Spektrum der Abb. 3.

Claims

Patentansprüche 1. Wirkstoffgemisch und seine Einzelkomponenten welche a) esterartig gebundene Dichlorisoeverninsaure der Formel enthalten, b) eine Oligosaccharidkette mit Orthoesterstrukturen enthalten, c) im W-Spektrum Maxima bei 20& nm und 292 nm aufweisen d) im IR-Spektrum Absorptionsbanden ausgedrückt in reziproken Zentimetern bei 400.0, 3915.4, 3441.9, 2984.0, 2942.8, 1740.3, 1640.6, 1581.3, 1451.8, 1408.4, 1386.2, 1253.8,1199.6, 1174.0, 1100.9, 1038.4, 0987.8, 0909.7, 0867.4, 0835.0, 0769.3, 0738.8, 0696.7, 0600.0 besitzen, e) in Chloroform, Aceton, Essigsäureethylester, Acetonitril und niedrigen Alkoholen gut in Wasser, Diethylether, Petrolether und Hexan schlecht löslich sind und f) folgende Rf-Werte aufweisen: 0,27 (CHCl3:CH30H 95:5), 0,49 (CH2Cl2: CH2OH 9:1), 0,68 (CHCl3: CH3OH 4:1), 0,11 (CHCl3: CH3OH : 25 % wss. NH3 20 : 3 : 0,5), 0,41 (CHCl3 : CH3OH 25 % wss. NH3 40 : 10 : 0,2) und 0,64 (Aceton).
2. Wirkstoffgemisch und seine Einzelkomponenten nach Anspruch 1, welche die in den Figuren 1 bis 3 angegebenen UV-, IR- und HPLC-Spektren besitzen.
3. Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffgemischs und seiner Einzelkomponenten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptosporangium species SS-48 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kohlenstoff-, Stickstoff-und MineralE;toffe enthaltenden Nährmedium züchtet und das Wirkstoffgemisch nach üblichen Methoden aus der Kulturbrühe und/oder dem Mycelium isoliert, gegebenenfalls reinigt und gegebenenfalls in die Einzelkomponenten auftrennt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei welchem die Züchtungstemperatur zumischen etwa 20°C und etwa 400C liegt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei welchem der pH-Wert der wachsenden Kultur bei etwa pH 6 bis etwa pH 8 liegt.
6. Verwendung des Wirkstoffgemischs und seiner Einzelkomponenten gemäß Anspruch 1 zur Förderung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei Tieren.
7. Tierfutter enthaltend das Wirkstoffgemisch oder seine Einzelkomponenten gemäß Anspruch 1.