CN101817745A

CN101817745A - 一种3,5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的化学合成方法

Info

Publication number: CN101817745A
Application number: CN200910273434A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 李荣强; 陶燕飞; 潘源虎; 黄玲利; 王玉莲; 王绪; 陈冬梅; 刘振利; 翟长友; 富泽林; 张西亚; 卢洪涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: CN101817745B

Abstract

本发明属于药物代谢物的化学合成技术领域，具体涉及一种阿维拉霉素体内代谢物3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的化学合成方法。本发明的特征是，从现有“效美素”预混剂中通过反向工程得到阿维拉霉素粗品，对其纯化，通过一步反应制得3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的粗品，对该粗品进行重结晶纯化，制得其纯品，仪器分析该合成的产品纯度达99.5％以上。本发明的合成方法路线短，收率高，条件易控，原料价廉易得，所得产物纯度高。合成的产品不仅为阿维拉霉素的代谢研究和残留检测提供了化学对照品，也为同类化合物的合成提供了相应的工艺参考。

Description

一种3,5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的化学合成方法

技术领域

本发明属于药物代谢物的化学合成技术领域，具体涉及一种阿维拉霉素体内代谢物3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的化学合成方法。

背景技术

3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸(DIA)为阿维拉霉素在动物体内的代谢物，食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧洲药物评审组织(EMEA)都规定了DIA为阿维拉霉素的残留标示物，并且规定了DIA作为阿维拉霉素在动物体内的检测目标和其在组织中的最大残留限量。目前无法从市场上购得阿维拉霉素原料药，只能够获得阿维拉霉素的饲料预混剂效美素。目前国内外尚未有公司出售DIA，因此制备DIA对于阿维拉霉素的代谢、药理毒理和残留研究具有重要意义。

关于DIA的合成方法已有如下相关文献报道：Dornhagen和Scharf采用五步法合成DIA，选用2，4-二羟基-6-甲基-苯甲酸甲酯为原料，经过4位羟基成醚保护，3、5位加氯，2位羟基反应生成甲氧基，1位酯键水解生成羧酸，4位醚在金属钯催化下与氢气还原生成DIA。反应步骤多，合成过程繁琐，消耗的试剂多；原料2，4-二羟基-6-甲基-苯甲酸甲酯价格昂贵，不易获得；反应过程中副反应较多，尤其在3、5位加氯步骤中，存在只反应一个氯的副反应，反应的总收率低；每步反应的后处理复杂，一般需要柱层析纯化(Dornhagen J，Scharf H D.Synthesis of dichloroisoeverninic acid.Tetrahedron 1985，41(1)：173-175)。

Dornhagen和Scharf通过改进了的五步法合成DIA，也选用2，4-二羟基-6-甲基-苯甲酸甲酯为原料，4位羟基酯化，3、5位加氯，2位羟基反应生成甲氧基，4位酯键水解生成羟基，1位酯键水解生成羧基得到DIA。此反应路线长，反应过程复杂，消耗的有机试剂多；原料2，4-二羟基-6-甲基-苯甲酸甲酯价格昂贵，不易获得，合成目标产物的成本高；反应过程中副反应较多，4位羟基酯化的同时2位羟基也发生酯化反应，反应的总收率低；此路线用到吡啶和四氯化碳等毒性较大的试剂；每步反应的后处理复杂，一般需要柱层析纯化(Dornhagen J，Scharf H D.Improved synthesis of dichloroisoeverninic acid.Zeitschrift fuerNaturforschung，Teil B：Anorganische Chemie，Organische Chemie 1985，40B(11)：1541-1549)。

Herzog等采用0.1mol/L的NaOH溶液水解扁枝衣菌素得到DIA，但是扁枝衣菌素已经退出市场，无法购得(Herzog H L，Meseck E，DeLorenzo S，Murawski A，Charney W，Rosselet J P.Chemistry of antibioticsfrom Micromonospora.III.Isolation and characterization of everninomicin D and everninomicin B.AppliedMicrobiology，1965，13(4)：515-520)。Galmarin等采用0.1mol/L的NaOH溶液水解居拉霉素得到DIA，但是居拉霉素也退出市场，无法购得(Galmarini O L，Deulofeu V.Curamycin.I.Isolation and characterizationof hydrolysis products.Tetrahedron，1961，15：76-86)。

以上文献所述的方法存在的主要问题有：

1)反应的路线长，合成的过程繁琐，消耗的试剂多，且用到一些毒性较大的试剂如四氯化碳，吡啶等；2)反应过程中副反应较多，获得目标产物的收率较低；3)原料和一些试剂价格昂贵不易获得，合成目标产物的成本教高；4)每步反应的后处理复杂，一般需要柱层析纯化；5)扁枝衣菌素和居拉霉素已经退出市场，无法获得。

发明内容

本发明目的在于克服现有五步反应路线长，反应过程繁琐，且扁枝衣菌素和居拉霉素无法购得的缺陷；提供从效美素中提取阿维拉霉素，然后水解阿维拉霉素得到DIA的简化路线；此路线方便易行，原料和试剂价廉易得，低毒或无毒，目标产物收率较高且纯化方法简单，所得DIA纯度高的合成方法。

本发明的目的是分别通过如下措施达到：

1)将效美素的质量与二氯甲烷或乙酸乙酯或丙酮的体积以1g∶5mL～1g∶15mL的比例(优选地，效美素的质量与乙酸乙酯的体积比为1g∶8mL～1g∶12mL)，加入到锥形瓶中，在10℃～50℃的条件下(优选地，在15℃～35℃条件下)浸泡5～10小时，每隔一小时，摇晃一次。抽滤，滤液减压蒸馏得固体，然后将固体放入30℃～50℃的真空干燥箱中干燥，即为阿维拉霉素提取的粗品。

2)将干燥好的阿维拉霉素粗品先用溶剂为丙酮和水的混合溶液重结晶1～3次，丙酮与水的体积比为1∶1～5∶1(优选地，体积比为3∶1)；再用溶剂为乙醇和水的混合溶液重结晶1～3次，乙醇与水的体积比为3∶1～9∶1(优选地，乙醇与水的体积比为9∶1)。将重结晶后的白色固体放入30℃～50℃的真空干燥箱中干燥，即得阿维拉霉素纯品。

3)在反应器中，依次加入阿维拉霉素纯品和氢氧化钠溶液，其中阿维拉霉素纯品的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g∶30mL～1g∶80mL(优选地，阿维拉霉素纯品的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g∶50mL～1g∶60mL)，所选用的氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L～4mol/L(优选地，氢氧化钠的浓度为0.5mol/L～2mol/L)。在10℃～30℃下避光反应，反应时间为8～24h(优选地，反应时间为10～16h)。反应完全后用等摩尔浓度的盐酸调反应液的pH值至2～3，乙酸乙酯适量萃取三次，合并乙酸乙酯水适量反洗一次，加入适量的无水硫酸镁干燥5小时，抽滤，滤液减压蒸干，即得白色固体，将固体放入30℃～50℃的真空干燥箱中干燥，即得DIA粗品。

4)将DIA粗品先用N，N-2-甲基甲酰胺和乙腈混合溶液重结晶1～3次，所选用的N，N-2-甲基甲酰胺与乙腈的体积比为1∶5～1∶9(优选地，体积比为1∶9)；再用甲醇和水的混合溶液重结晶1～3次，所选用的甲醇与水的体积比为1∶1～9∶1(优选地，甲醇与水的体积比为3∶1)。将重结晶后所得白色针晶状固体放入30℃～50℃的真空干燥箱中干燥，即得3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸化学对照品。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

1)本发明是从阿维拉霉素的预混剂商品(混合物)“效美素”中提取阿维拉霉素粗品，然后纯化后经一步反应，获得DIA，方法简单，操作简便；2)原料易得，效美素在市场上容易购得，且价格低廉，用到的其他的试剂价廉且低毒或无毒，获得目标产物所需的成本低；3)一步反应将阿维拉霉素纯品水解得到DIA，反应步骤少，平均收率在95％以上；4)环境污染小，本发明所用到的乙酸乙酯、甲醇、乙醇可以反复回收利用，其余试剂稍加处理后即环保无污染；5)提供了DIA的重结晶方法，所得产物纯度达99.5％以上，达到色谱用化学对照品纯度要求。

本发明与现有技术对比见表1

表1本发明与现有技术对比的特点及效果

附图说明

图1是DIA的核磁共振氢谱图(DMSO-d₆)。

图2是DIA的核磁共振碳谱图(DMSO-d₆)。

图3是DIA的紫外光谱图(溶剂为甲醇)。

图4是DIA的红外光谱图(KBr)。

图5是DIA的电喷雾质谱图(负离子扫描)。

图6是DIA的HPLC-DAD全波长扫描谱图。

具体实施方式

实施例1

将效美素预混剂(购自美国礼来公司)32.12g放入到500mL的锥形瓶中，向锥形瓶中加入350mL乙酸乙酯浸泡，每隔1h摇晃1次，8h后抽滤，滤液减压蒸馏，回收的乙酸乙酯再次用于阿维拉霉素的提取，蒸干得到淡黄色固体，将固体放入45℃的真空干燥箱中干燥4h，得4.51g阿维拉霉素粗品。

将4.26g阿维拉霉素的粗品放入装有球形冷凝管的三口烧瓶中，90℃水浴，先用50mL丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液搅拌至溶解，趁热抽滤，将滤液缓慢降至室温然后冷却至4℃，放置6～9h后抽滤，滤饼用无水乙醇冲洗得阿维拉霉素一次重结晶产品，产品经干燥后再用丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液重结晶1次。产品再用乙醇与水体积比为9∶1的混合溶液重结晶3次，获得的产品放入45℃的真空干燥箱中干燥6h，即得阿维拉霉素的纯品1.26g。

将100mL的单口烧瓶固定在磁力搅拌器上，向烧瓶内加入磁子和1.12g阿维拉霉素纯品，然后加入1mol/L的氢氧化钠52mL搅拌溶解，在25℃的条件下避光反应，反应14h后，用1mol/L的盐酸调反应液的pH值为2～3。混合液分别用100mL的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，水100mL反洗一次。加入无水硫酸镁15.21g干燥乙酸乙酯5h后抽滤，滤液减压蒸馏，乙酸乙酯回收液用于下次反应的再萃取，所得的白色固体放入45℃的真空干燥箱中干燥5h，即得186mg的DIA粗品。

将175mg的DIA粗品，先用N，N-2-甲基甲酰胺与乙腈的体积比为1∶9的混合溶液重结晶2次，所得的产品干燥后，再用甲醇与水体积比为3∶1的混合溶液重结晶3次，得到白色针晶状固体，所得固体在45℃的真空干燥箱中干燥5h，得到DIA纯品103mg。

实施例2

将100.26g效美素放入到1.5L的锥形瓶中，向锥形瓶中加入1100mL乙酸乙酯浸泡，每隔1h摇晃1次，6h后抽滤，滤液减压蒸馏，回收液再次用于阿维拉霉素的提取，减压蒸干得到淡黄色固体，将固体放入45℃的真空干燥箱中干燥5h，得到12.65g阿维拉霉素的粗品。

将11.24g阿维拉霉素的粗品放入装有球形冷凝管的三口烧瓶中，90℃水浴，先用145mL丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液搅拌至溶解，趁热抽滤，将滤液缓慢降至室温然后冷却至4℃，放置8h后抽滤，滤饼用无水乙醇冲洗得阿维拉霉素一次重结晶产品，产品经干燥后再用丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液重结晶1次。产品然后再用乙醇与水体积比为9∶1的混合溶液重结晶2次，获得的产品放入45℃的真空干燥箱中干燥6h，即得阿维拉霉素的纯品5.18g。

将500mL的单口烧瓶固定在磁力搅拌器上，向烧瓶内加入磁子和5.06g阿维拉霉素纯品，然后加入0.5mol/L的氢氧化钠270mL搅拌溶解，在25℃的条件下避光反应，反应16h后，用0.5mol/L的盐酸调反应液的pH值为2～3。混合液分别用300mL的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，水200mL反洗一次。加入无水硫酸镁52.21g干燥5h后抽滤，滤液减压蒸馏，获得的乙酸乙酯回收液用于下次反应再次萃取，所得的白色固体放入50℃的真空干燥箱中干燥5h，即得0.86g DIA粗品。

将0.80g的DIA粗品，先用N，N-2-甲基甲酰胺和乙腈的体积比为1∶9的混合溶液重结晶2次，所得的产品干燥后，再用甲醇与水的体积比为3∶1的混合溶液重结晶2次，得到白色针晶状固体，所得固体在45℃的真空干燥箱中干燥5h，得到DIA纯品0.51g。

实施例3

将202.58g效美素放入到3L的锥形瓶中，向锥形瓶中加入2150mL乙酸乙酯浸泡，每隔1h摇晃1次，7h后抽滤，滤液减压蒸馏，乙酸乙酯回收液用于阿维拉霉素的再次提取，蒸干得淡黄色固体，将所得固体放入45℃的真空干燥箱中干燥6h，得到28.72g阿维拉霉素的粗品。

将25.12g阿维拉霉素的粗品放入装有球形冷凝管的三口烧瓶中，90℃水浴，先用270mL丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液搅拌至溶解，趁热抽滤，将滤液缓慢降至室温然后冷却至4℃，放置6h后抽滤，滤饼用无水乙醇冲洗得阿维拉霉素1次重结晶产品，产品经干燥后再用丙酮与水的体积比为3∶1的混合溶液重结晶1次。产品然后再用乙醇与水体积比为9∶1的混合溶液重结晶2次，获得的产品放入45℃的真空干燥箱中干燥5h，即得阿维拉霉素的纯品12.36g。

将1L的单口烧瓶固定在磁力搅拌器上，向烧瓶内加入磁子和10.25g阿维拉霉素纯品，然后加入2mol/L的氢氧化钠560mL搅拌溶解，在25℃的条件下避光反应，反应10h后，用2mol/L的盐酸调反应液的pH值为2～3。混合液分别用500mL的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，水400mL反洗一次。加入无水硫酸镁91.57g干燥5h后抽滤，滤液减压蒸馏，所得的白色固体放入50℃的真空干燥箱中干燥6h，即得1.75 g的DIA粗品。

将1.62 g的DIA粗品，先用N，N-2-甲基甲酰胺和乙腈的体积比为1∶9的混合溶液重结晶2次，所得的产品干燥后再用甲醇与水的体积比为3∶1的混合溶液重结晶2次，得到白色针晶状固体，所得固体在50℃的真空干燥箱中干燥6h，得到DIA纯品1.18g。

DIA(3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸)的结构：

¹H-NMR图谱：图中2.25ppm为ArCH₃的氢化学位移，3.78ppm为ArOCH₃的氢化学位移，10.45ppm为-COOH的氢化学位移，¹H-NMR图谱见图1。

¹³C-NMR图谱：图中17.25ppm为ArCH₃的碳化学位移，61.63ppm为ArOCH₃的碳化学位移，113.89ppm为3位碳，118.30为5位碳，123.73为1位碳，131.59为6位碳，150.50为4位碳，151.23为2位碳，167.34为-COOH基碳，¹³C-NMR图谱见图2。

UV(溶剂为甲醇)谱：该图谱中max＝289nm，代表苯环上的取代基与其发生共轭使苯环红移而形成的吸收，其中-COOH与苯环发生π-π共轭，-OH、-OCH3和-Cl与苯环发生p-π共轭，UV谱见图3。

IR(KBr)谱：3471cm^-1宽吸收峰为-COOH和-OH的伸缩振动，1693cm^-1强吸收为羧基中C＝O的伸缩振动，1401cm^-1和1571cm^-1的较强吸收表明了苯环的骨架振动，1287cm^-1为甲氧基的O-C伸缩振动峰，IR(KBr)谱见图4。

ESI-MS：其中m/z 248.64为DIA的M-1峰，m/z204.92为DIA脱去-COOH后的碎片离子峰，m/z 189.49为DIA脱去-COOH后再脱去甲氧基中-CH₃的碎片离子峰，ESI-MS谱见图5。

元素分析：实测值C：42.86％，H：3.46％，O：25.03％；理论值C：43.03％，H：3.19％，O：25.50％；各元素百分含量误差绝对值均不超过0.5％。

HPLC图谱：DIA经高效液相色谱全波长检测为一单一峰，见图6。

通过¹H-NMR、¹³C-NMR、IR、UV、MS及元素分析，确证该化合物的结构与给出的结构一致。

Claims

1.一种3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸的化学合成方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将效美素的质量与二氯甲烷或乙酸乙酯或丙酮的体积以1g∶5mL～15mL的比例，加入到锥形瓶中，在10～50℃的条件下浸泡5～10小时，每隔一小时，摇晃一次；抽滤，滤液减压蒸馏得固体，将所得固体放入30～50℃的真空干燥箱中干燥，得到阿维拉霉素粗品；

2)将干燥好的阿维拉霉素粗品先用溶剂丙酮和水的混合溶液重结晶1～3次，所述的丙酮与水的体积比为1∶1～5∶1；再用溶剂为乙醇和水的混合溶液重结晶1～3次，所述的乙醇与水的体积比为3∶1～9∶1；将重结晶后的白色固体放入30～50℃的真空干燥箱中干燥，得到阿维拉霉素纯品；

3)在反应器中，依次加入阿维拉霉素纯品和氢氧化钠溶液，所述的阿维拉霉素纯品的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g∶30mL～80mL，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L～4mol/L；在10～30℃下避光反应，反应时间为8～24h；反应完全后用等摩尔浓度的盐酸调反应液的pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥乙酸乙酯5小时，抽滤，滤液减压蒸干，即得白色固体，将所得白色固体放入30～50℃的真空干燥箱中干燥，得到3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸粗品；

4)将3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸粗品先用N，N-2-甲基甲酰胺和乙腈的混合溶液重结晶1～3次，所述的N，N-2-甲基甲酰胺与乙腈的体积比为1∶5～1∶9；再用甲醇和水的混合溶液重结晶1～3次，所述的甲醇与水的体积比为1∶1～9∶1；将重结晶后的产品放入30～50℃的真空干燥箱中干燥，得到3，5-二氯-4-羟基-2-甲氧基-6-甲基-苯甲酸化学对照品。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是步骤1)中效美素的质量与乙酸乙酯的体积比为1g∶8mL～12mL，在15～35℃条件下浸泡7～9小时。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是步骤2)所述的的丙酮与水的体积比为3∶1，所述的乙醇与水的体积比为9∶1。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是步骤3)阿维拉霉素纯品的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g∶50mL～60mL，氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L～2mol/L，反应时间为10～16h。

5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是步骤4)所述的N，N-2-甲基甲酰胺和乙腈的体积比为1∶9，所述的甲醇与水的体积比为3∶1。