DE3728702A1 - Organisch-chemische verbindung, mikrobiologische verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue organisch-chemische Verbindung, mikrobiologische Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Mittel zur Leistungsförderung bei Tieren.

Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich durch die folgenden Eigenschaften und Parameter charakterisieren:

• 1. IR-KBr-Absorptionsspektrum
  Es zeigt, bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in cm^-1) charakteristische Absorptionsbanden:
• 2. 13C-Kernresonanzspektrum in CDCl₃ gemäß Abb. 1, angegeben in Teilen pro Million.
  Es wurde mit einer Feldstärke von 75 MHz an einer Lösung des Antibiotikums in deuteriertem Methylenchlorid mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
• 3. Das UV-Spektrum in Acetonitril gemäß Abb. 2, angegeben in nm.
• 4. Das FAB-Massenspektrum mit m-Nitrobenzylalkohol als Matrix gemäß Abb. 3. Es wurde mit 6 KeV Xenonatomen mit einer Beschleunigungsspannung von 3 KV erstellt. Die Substanz besitzt ein Quasimolekülion von 889 (M + H).
• 5. Das FAB-Massenspektrum der acetylierten Verbindung gemäß Abb. 4. Es wurde mit n-Nitrobenzylalkohol als Matrix in einer Beschleunigungsspannung von 3 KV und 6 KeV Xenonatomen erstellt. Das Molekülion 1057 (M + H) zeigt eine vierfache Acetylierung des Antibiotikums.

Die neue erfindungsgemäße Verbindung erhält die Bezeichnung Annorumin.

Man erhält die erfindungsgemäße Verbindung, wenn man geeignete Mikroorganismen der Familie Streptomycetaceae in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann insbesondere der Streptomyceten-Stamm 33 855 (sowie seine Mutanten und Varianten) Verwendung finden. Dieser Stamm gehört zu den Bakterien der Ordnung Actinomycetales, der Familie Streptomycetaceae und der Gattung Streptomyces an.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung neue Mikroorganismen der Familie Streptomycetaceae, die bei der Kultivierung in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium eine Verbindung produzieren, welche die oben unter (1) bis (5) aufgeführten Eigenschaften und Parameter aufweist.

Besonders bevorzugt ist der Stamm Streptomyces spp. 33 855. Dieser wurde am 13. April 1987 unter der Nummer DSM 4085 bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Grisebachstraße 8, D 3400 Göttingen hinterlegt.

Der Stamm 33 855 wurde aus einer Probe des Streptomyceten Stammes erhalten der bei Agricultural Culture Collection (NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61 604 USA unter der Nummer NRRL 5739 hinterlegt worden ist (US-PS 39 84 564).

Für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung verwendet man Nährmedien, die die üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die notwendigen Salze enthalten. Als Kohlenstoffquelle können verwendet werden:
Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z. B. Stärke, Oligosaccharide, wie z. B. Raffinose und Monosaccharide, wie z. B. Mannose und Galaktose. Weiterhin sind auch Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit und Glyzerin, als Kohlenstoffquelle geeignet. Außerdem können auch natürlich vorkommende Gemische, wie z. B. Malzextrakt oder Distiller soluble, sowie Gemische aus den erwähnten Kohlenstoffquellen verwendet werden.

Als Stickstoffquellen können die üblichen stickstoffhaltigen Nährmedienbestandteile Verwendung finden, so z. B. Aminosäuren, Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Ammoniumsalze, natürlich vorkommende komplexe Stoffe, wie Sojabohnenmehl, Milchpulver und geeignete Mischungen derselben.

Als Hilfsstoffe werden im Nährmedium Mineralsalze benötigt, z. B. Phosphate, Sulfate oder Chloride von Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen schwanken, z. T. sind die notwendigen Konzentrationen der Mineralsalze in den o. a. Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder im verwendeten Wasser als Verunreinigungen enthalten.

Weiterhin können als Hilfsstoffe noch Antischaummittel der verschiedensten Art Verwendung finden, wie z. B. Polyole oder Silikone.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung kann mit Hilfe üblicher fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig flüssige Nährmedien.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt dabei nach allgemein üblichen Methoden, z. B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z. B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung in aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kultur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Bei der Durchführung des Herstellungsverfahrens wird unter aeroben Bedingungen gearbeitet; die Kultur kann gemäß üblicher Methoden, so z. B. unter Verwendung von Schüttelkulturen oder von belüfteten Fermenterkulturen, durchgeführt werden. Die Prozentverhältnisse der Nährlösungsbestandteile können in weiten Bereichen schwanken, im allgemeinen machen die Kohlenstoffquellen 0,5 bis 8%, vorzugsweise 0,6 bis 6% aus, die Stickstoffquellen 0,1 bis 5%, vorzugsweise 0,5 bis 2%, aus, die Salze liegen in üblichen Konzentrationen vor, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,001 bis 0,5 Gew.-%. Die Antischaummittel liegen in bis zu 0,5%iger Konzentration vor. Die zur Sterilisation angewendeten Temperaturen liegen bei 100 bis 140°C, bevorzugt bei 120 bis 130°C.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8,5, insbesondere zwischen 6,5 und 8,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z. B. H₂SO₄, oder sterile Lauge, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 16 und etwa 42°C, vorzugsweise zwischen 24 und 32°C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 28°C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 7, vorzugsweise 4 bis 6 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtung können z. B. die Dampf- oder Trockensterilisation verwendet werden.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können übliche chemische Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octodecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Die isolierte Verbindung kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da die gegebenenfalls vorhandenen Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen.

Um bei den o. a. Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, wird bevorzugt die Bestimmung der antibiotischen Aktivität herangezogen werden. Als Testkeim eignet sich dabei besonders Bac. subtilis ATCC 27 859.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden: Nach seiner Anreicherung im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert z. B. durch Zentrifugation.

Aus dem Kulturfiltrat kann die erfindungsgemäße Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden. Als Absorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamiden, z. B. acetyliertes Polyamid oder Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist. Bevorzugt wird Methanol, Ethanol oder ein Gemisch aus Essigester : Isopropanol : H₂O im Verhältnis 64 : 25 : 11 eingesetzt.

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung Chromatographie-Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an hydrophobe Sorbentien oder andererseits Geldiffusionschromatographie.

Für die kommerzielle Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung bevorzugt man die Gewinnung durch Adsorption und anschließende Desorption an einem hydrophoben Trägerharz (z. B. Lewapol®; ein hydrophobes Trägerharz der Bayer AG). Die Desorption kann z. B. mit kurzkettigen aliphatischen Alkoholen durchgeführt werden, bevorzugt Methanol oder Ethanol.

Eine derart vorgereinigte Fraktion kann wiederum mit den üblichen Methoden gereinigt werden. Bevorzugt kann hier die Geldiffusionschromatographie eingesetzt werden. Die Chromatographie an Sephadex LH-20® verläuft erfolgreich. Ein derartig gewonnenes Produkt ist im allgemeinen reiner als 40%.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem Myzelium isoliert werden. Dazu wird das Myzelium von der Kulturbrühe vorzugsweise durch Zentrifugation abgetrennt und mit einem, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel mehrfach, vorzugsweise zweimal extrahiert. Als Lösungsmittel können niedere Alkylalkohole (C₁-C₄) wie Ethanol oder Isopropanol sowie Ketone wobei besonders bevorzugt Aceton ist, verwendet werden. Die wäßrig organische Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis die organische Phase abdestilliert ist. Nun wird mit Wasser auf das entsprechende Volumen der Kulturbrühe verdünnt, gefriergetrocknet und die Aufarbeitung wie unten angegeben weitergeführt.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch aus dem Kulturfiltrat durch Adsorption an Aktivkohle bzw. an geeignete Harze isoliert werden. Als besonders geeignete Methode erwies sich die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindung an unspezifische Adsorberharze auf Polystyrolbasis (z. B. Amberlite XAD® der Fa. Roehm & Haas oder Lewapol OC 1031® der Fa. Bayer). Die Desorption der erfindungsgemäßen Verbindung wird fraktioniert, durch Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, insbesondere Wasser/Methanol und vorzugsweise reinem Methanol vorgenommen. Die durch Test gegen BAC. subtilis 27 859 ermittelten aktiven Fraktionen werden unter reduziertem Druck bis zur vollständigen Entfernung des organischen Lösungsmittels konzentriert und der Rückstand in ca. ¹/₅₀ des Volumens des Kulturfiltrates suspendiert und gefriergetrocknet.

Die Isolierung aus dem Kulturfiltrat ist bevorzugt. Das Lyophylisat wird mit Wasser extrahiert, zentrifugiert und der Rückstand erneut in Wasser suspendiert und gefriergetrocknet. Danach wird das so erhaltene Lyophylisat in Methanol gelöst. Der Wirkstoff kann aus der Lösung durch übliche chromatographische Methoden vorzugsweise Chromatographie an Sephadex LH 20® oder Adsorptionschromatographie gewonnen werden.

Der Wirkstoff eignet sich bei günstiger Warmblütertoxizität als Mittel zur Leistungsförderung bei Zucht- und Nutztieren. Er dient dabei zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums, der Milch- und Wollproduktion, sowie zur Verbesserung der Futterverwertung, der Fleischqualität und zur Verschiebung des Fleisch-Fett-Verhältnisses zugunsten von Fleisch.

Zu den Nutz- und Zuchttieren gehören Säugetiere wie z. B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kamele, Wasserbüffel, Esel, Kaninchen, Damwild, Rentiere, Pelztiere wie z. B. Nerze, Chinchilla, Waschbär, Vögel wie z. B. Hühner, Gänse, Puten, Enten, Süß- und Salzwasserfische wie z. B. Forellen, Karpfen, Aale.

Der Wirkstoff wird unabhängig vom Geschlecht der Tiere während allen Wachstums- und Leistungsphasen der Tiere eingesetzt. Bevorzugt wird der Wirkstoff während der intensiven Wachstums- und Leistungsphase eingesetzt. Die intensive Wachstums- und Leistungsphase dauert je nach Tierart von einem Monat bis zu 10 Jahren. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei Aufzucht und Haltung von Jung- und Masttieren.

Die Anwendung des Wirkstoffs erfolgt direkt oder in Form von für Tiere geeigneten Zubereitungen enteral oder parenteral. Die enterale Anwendung des Wirkstoffs geschieht z. B. oral in Form von Pulvern, Tabletten, Kapseln, Pasten, Tränken, Granulaten, Boli, über oral applizierbare Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen sowie über das Futter oder über das Trinkwasser. Die parenterale Anwendung geschieht z. B. in Form der Injektion (intramuskulär, subcutan, intravenös oder durch Implantate).

Besonders hervorgehoben seien Zubereitungen zur Verabreichung über das Futter oder das Trinkwasser. Dabei können die Wirkstoffe dem Futter direkt oder in Form von Prämixen oder Futterkonzentraten zugesetzt werden.

Zum Futter zählen Einzelfuttermittel pflanzlicher Herkunft wie Heu, Rüben, Getreide und Getreidenebenprodukte, Melasse, Silage, Einzelfuttermittel tierischer Herkunft wie Fleisch, Fette, Milchprodukte, Knochenmehl, Fischprodukte, die Einzelfuttermittel wie Vitamine, Proteine, Zucker, Stärke, Mehle, Aminosäuren z. B. DL-Methionin, Salze wie Kalk und Kochsalz. Zum Futter zählen auch Ergänzungs-, Fertig- und Mischfuttermittel. Diese enthalten Einzelfuttermittel in einer Zusammensetzung, die eine ausgewogene Ernährung hinsichtlich der Energie- und Proteinversorgung sowie der Versorgung mit Vitaminen, Mineralsalzen und Spurenelementen sicherstellt.

Prämixe und Futterkonzentrate sind Mischungen des Wirkstoffs mit Trägerstoffen und gegebenenfalls weiteren Hilfsstoffen. Zu den Trägerstoffen zählen alle Einzelfuttermittel oder Gemische derselben.

Der Wirkstoff kann in den Zubereitungen allein oder in Mischung mit anderen leistungsfördernden Wirkstoffen, mineralischen Futtermitteln, Spurenelement-Verbindungen, Vitaminen, stickstoffhaltigen nicht-Protein-Verbindungen, Farbstoffen, Antioxidantien, Aromastoffen, Emulgatoren, Fließhilfsstoffen, Konservierungs- und Preßhilfsstoffen vorliegen.

Andere leistungsfördernde Wirkstoffe sind z. B. Antibiotika wie Tylosin und Virginiamycin.
Mineralische Futtermittel sind z. B. Dicalciumphosphat, Magnesiumoxid, Natriumchlorid.
Spurenelement-Verbindungen sind z. B. Eisenfumarat, Natriumjodid, Kobaltchlorid, Kupfersulfat, Zinkoxid, Selenverbindungen.
Vitamine sind z. B. Vitamin A, Vitamin B, Vitamin D₃, Vitamin E.

Stickstoffhaltige nicht-Protein-Verbindungen sind z. B. Biuret, Harnstoff.
Farbstoffe sind z. B. Carotinoide wie Canthaxidin, Zeaxanthin, Capsanthin oder Farbstoffe, die zur Färbung von Lebensmitteln zugelassen sind.
Antioxidantien sind z. B. Ethoxyquin, Butylhydroxy-Toluol, Ascorbinsäure.
Aromastoffe sind z. B. Vanillin.
Emulgatoren sind z. B. Ester der Milchsäure, Lecithin.
Fließhilfsstoffe sind z. B. Natriumstearat, Calciumstearat, Kieselsäuren, Bentonite, Ligninsulfonate.

Konservierungsstoffe sind z. B. Propionsäure, Calciumpropionat, Sorbinsäure, Ascorbinsäure.
Preßhilfsstoffe sind z. B. Ligninsulfonate, Celluloseether.

Die Konzentration des Wirkstoffs im Futter beträgt normalerweise etwa 0,001-500 ppm, bevorzugt 10-200 ppm.

Die Konzentration des Wirkstoffs in den Prämixen oder Futterkonzentraten beträgt ca. 0,5 bis 50 Gewichtsprozent, bevorzugt 1 bis 20 Gewichtsprozent.

Die Menge des Wirkstoffs, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften des Wirkstoffs weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,001 bis 50 mg/kg insbesondere 0,01 bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die passende Menge des Wirkstoffs sowie die passende Dauer der Verabreichung hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung und Fütterung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Der Wirkstoff wird den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Gesundheitszustand der Tiere ab.

Der Wirkstoff kann einmalig verabreicht werden. Der Wirkstoff kann aber auch während der ganzen oder während eines Teils der Wachstums- und Leistungsphase temporär oder kontinuierlich verabreicht werden. Bei kontinuierlicher Verabreichung kann die Anwendung ein- oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen erfolgen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Kükenaufzuchtfutters, das erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:
200 g Weizen, 340 g Mais, 361 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung der unten angegebenen Zusammensetzung und 2,5 g Wirkstoff-Prämix der unten angegebenen Zusammensetzung ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

In einem kg Vitamin-Mineral-Mischung sind enthalten: 600 I. E. Vitamin A, 100 I. E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg Nn SO₄ × H₂O, 140 mg Zn SO₄ × 7 H₂O, 100 mg Fe SO₄ × 7 H₂O und 20 mg Cu SO₄ × 5 H₂O in Getreidemehl als Trägerstoff.

1 kg Wirkstoff-Prämix enthalten 100 g Wirkstoff, 900 g Weizenmehl.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweineaufzuchtfutters, das erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 60 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung (Zusammensetzung wie beim Kükenfutter) 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Prämix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter. 1 kg Wirkstoff-Prämix enthält 200 g Wirkstoff, 20 g Pflanzenöl, 780 g Calciumcarbonatpulver.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Futters für Rinder, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:
69,95% Futtergetreideschrot, 10% gemahlene Maiskolben, 8% Sojabohnenmehl, 5% Luzernemehl, 5% Melasse, 0,6% Harnstoff, 0,5% Calciumphosphat, 0,5% Calciumcarbonat, 0,3% Kochsalz, 0,15% Vitamin-Mineral-Mischung und 0,2% Wirkstoff-Prämix der beim Schweineaufzuchtfutter angegebenen Zusammensetzung. Die Vitamin-Mineral-Mischung enthält pro kg 70 000 i. E. Vitamin A, 70 000 i. E. Vitamin D₃, 100 mg Vitamin E, 50 mg Mn SO₄ × H₂O, 30 mg Zn SO₄ × 7 H₂O in Getreidemehl als Trägerstoff.

Der Wirkstoff-Prämix wird der Vitamin-Mineral-Mischung in der erforderlichen Menge beigemischt und diese anschließend sorgfältig mit den übrigen Bestandteilen vermischt.

Es ist nicht unbedingt erforderlich, gereinigten und isolierten Annorumin zu verwenden. Es ist auch möglich, das bei seiner Herstellung anfallende Gemisch oder sogar die anfallende Kulturbrühe oder das Myzelium ohne Reinigung, gegebenenfalls nach Trocknung, einzusetzen. Für viele Zwecke ist es auch ausreichend, Rohformen des erfindungsgemäßen Wirkstoffs und seiner Gemische ohne vorherige Feinreinigung einzusetzen.

Annorumin zeigt schwach antibiotische Wirksamkeit gegen grampositive Keime. Besonders zu erwähnen ist seine Wirkung zu Prophylaxe und Therapie von Schweinedysenterie und Ketose bei Milchkühen.

Die biologische Wirkung und Herstellung von Annorumin kann durch die folgenden Beispiele erläutert werden:

Beispiel A In-vitro Wiederkäuer-Fütterungsversuch

Einem Hammel, der pro Tag 650 g grob gemahlenes Schaf-Fertigfutter und 250 g Trockengrün Cobs erhielt, wurde Pansenflüssigkeit durch eine Pansenfistel entnommen. 2,5 ml Pansenflüssigkeit wurden unmittelbar nach der Gewinnung in einem mit Kohlendioxid begasten Reagenzröhrchen von 13 ml Volumen mit 100 mg fein gemahlenem Schaf-Fertigfutter, 7,5 ml Pufferlösung und 0,5 ml einer 5% wäßrigen Ethanollösung mit bzw. ohne erfindungsgemäßen Wirkstoff, vermischt.

Die Pufferlösung, welche vor Anfang des Versuchs mit Kohlendioxid gesättigt wurde, enthielt pro Liter Wasser: 4,61 g Na₂HPO₄, 12,25 g NaHCO₃, 0,59 g NaCl, 0,71 g KCl, 0,32 g MgCl₂, 0,13 g CaCl₂.

Die Reagenzröhrchen wurden verschlossen und bei 39°C bebrütet. Nach 24stündiger Bebrütung wurde 1,0 ml der Fermentationsflüssigkeit aus den Ansätzen entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß pipettiert, das 0,2 ml 10%ige Phosphorsäure (enthaltend 5,7 µmol 2-Methylvaleriansäure) enthielt. Die Proben wurden bie 11 000 g zentrifugiert und aus dem Überstand die Essigsäure- und Propionsäurekonzentration gaschromatographisch bestimmt.

Bei jedem Versuch wurde das Verhältnis Essigsäure zu Propionsäure errechnet. Der bei den Negativkontrollen erhaltene Wert wurde mit 100 angesetzt und die Abweichungen im Verhältnis dazu angegeben. Je mehr Propionsäure gebildet wurde, um so niedriger liegt der Zahlenwert des Verhältnisses Essigsäure zu Propionsäure und um so kleiner wird die Verhältniszahl im Vergleich zur Kontrolle (niedrige Verhältniszahl = verringertes Essigsäure/Propionsäure-Verhältnis = verbesserte Futterverwertung).

Tabelle A

Beispiel B Wiederkäuer-Fütterungsversuch

Zwölf Schwarzkopfhammel, die jeweils mit Pansenfisteln versehen waren, wurden in 2 Gruppen von 6 Tieren verteilt. Die Tiere erhielten über einen Zeitraum von 4 Wochen pro Tag 650 g grob gemahlenes Schaffertigfutter, 250 g Trockengrün Cobs und 400 g grob gehäckseltes Heu. Die erfindungsgemäße Verbindung wurde im Fertigfutter einer Gruppe ab dem 22. Tag beigemischt, so daß die tägliche Aufnahme des Wirkstoffes 40 mg betrug. Das Fertigfutter der anderen Gruppe enthielt die erfindungsgemäße Verbindung nicht (Kontroll-Gruppe). Am 17., 19., 21., 23., 25. und 27. Tag des Versuches wurden Pansensaftproben entnommen und die Konzentrationen der flüchtigen Fettsäuren gaschromatografisch bestimmt.

Die Wirkung auf den Propionsäuregehalt und die Konzentration der Gesamtfettsäuren der beiden Versuchsgruppen sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Wie aus der Tabelle zu entnehmen ist, erhöhte die Verfütterung der erfindungsgemäßen Verbindung Annorumin die Konzentration an Propionsäure, ohne die Summe der Fettsäuren zu beeinträchtigen.

Tabelle

Beispiel 1 Herstellung des Impfgutes für die Vorkultur

150 ml sterile, in 1-Ltr.-Erlenmeyerkolben befindliches Vorkulturmedizin der Zusammensetzung

Bacto-Trypton (Difco)|5 g
Bacto-Yeast Extract (Difo)	3 g
Mannit	10 g
Wasser	1000 ml
pH 7,0

werden mit vegetativen Zellen des Streptomyceten-Stammes 33 855 beimpft und 4 Tage auf der Rundschüttelmaschine mit 280 Upm bei 28°C inkubiert. Die gewachsenen Kulturen dienen als Impfgut für weitere Fermentationsansätze.

Beispiel 2 Tankfermentation

30 l der Nährlösung der folgenden Zusammensetzung

Magermilchpulver|10 g
Hefeautolysat	1,5 g
Dextrin	40 g
D-Glucose	5 g
Antischaummittel	1 ml
(SAG 5693 Union Carbide) @	ad	1000 ml Wasser

werden in einem 40 l Fermenter auf pH 7 eingestellt, 60 Minuten bei 121°C sterilisiert, auf 28°C abgekühlt und mit 12 × 150 ml des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Inoculums angeimpft. Es wird bei 28°C, einer Belüftungsrate von 180 l steriler Luft pro Minute (0,45 VVm), bei einem Überlagerungsdruck von 1,0 bar mit 100 Umdrehungen (Blattrührer) pro Minute fermentiert. Wenn nach 4- bis 6-tägiger Fermentation Annorumin gebildet worden ist, wird die Kultur geerntet.

Beispiel 3

• a) Die gemäß Beispiel 3 gewonnene Kulturbrühe einer 400 l Fermentation wird in einen Westfalia-Separator separiert. Der Überstand und der gemäß b) unten erhaltene Mycelextrakt wird über eine mit Lewapol OC 1031® (Bayer) beschickte Säule von 10 cm Durchmesser und 50 cm Länge gegeben. Nacheinander wird mit 300 l entmineralisiertem Wasser 300 l (30%igem) wäßrigem Methanol gewaschen und mit reinem Methanol dem 0,1% Ameisensäure zugesetzt wurde, desorbiert. Das Desorbat wird unter reduziertem Druck konzentriert, in ca. 2 l Wasser suspendiert und lyophylisiert, wobei 20,3 g des rohen erfindungsgemäßen Wirkstoffes 4% erhalten werden. Der Wirkstoffgehalt beträgt 3%.
• b) Das Myzel wird mit 2 l Aceton 30 min gerührt und danach filtriert. Der Filterkuchen wird nochmals mit 2 l Aceton 30 min gerührt und erneut filtriert. Nun werden die gereinigten Filtrate unter reduziertem Druck auf ca. 1 l konzentriert und danach mit entmineralisiertem Wasser auf 10 l verdünnt und gemeinsam mit dem Überstand aus 4a verarbeitet. Die Rohprodukte aus 4a und 4b werden vereinigt.

Beispiel 4 Reindarstellung der erfindungsgemäßen Verbindung durch Gelchromatographie und Adsorptions-Chromatographie

20 g des Rohproduktes gemäß Beispiel 3 werden in 30 ml Methanol gelöst und einer Gelfiltration auf Sephadex LH 20® unterworfen. Unlösliche Restbestandteile werden durch Zentrifugation abgetrennt. Es wird eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Länge von 1 m verwendet.

Die Fließrate beträgt 160 ml/Std. 9 ml Fraktionen werden genommen. Die nach Antibiographie gegen Bac. subtilis ATCC 27 859 wirksamen Fraktionen werden vereinigt, unter reduziertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet. Man erhält 1,35 g mit einem Wirkstoffgehalt von 59%.

1,35 g des so erhaltenen Präparates werden in MeOH gelöst und über eine präparative Lobar-C®-Säule (Merck) gefüllt mit LiChroprep® Si60 (40-63 µm) getrennt. Die Fließrate beträgt 60 ml/Std.

Es werden 7,8 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch analysiert und die mit Anisaldehyd/H₂SO₄ anfärbbaren, einheitlichen und biologisch aktiven Fraktionen vereinigt (180 ml) und unter reduziertem Druck konzentriert auf ca. 15 ml. Die milchig trübe Suspension wird gefriergetrocknet.

Claims (9)

1. Organisch chemische Verbindung die durch die folgenden chemischen und physikalischen Parameter charakterisiert ist:

• a) IR-KBr-Absorptionsspektrum zeigt bei folgenden Wellenlängen (in cm^-1) charakteristische Absorptionsbanden:
• b) 13C-Kernresonanzspektrum des Antibiotikums in CDCl₃, gemäß Abb. 1, angegeben in Teilchen pro Million.
  Es wurde mit einer Feldstärke von 75 MHz an einer Lösung des Antibiotikums in deuteriertem Methylenchlorid mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
• c) Das UV-Spektrum des Antibiotikums in Acetonitril gemäß Abb. 2, angegeben in nm.
• d) Das FAB-Massenspektrum des Antibiotikums mit m-Nitrobenzylalkohol als Matrix gemäß Abb. 3. Es wurde mit 6 KeV Xenonatomen mit einer Beschleunigungsspannung von 3 KV erstellt. Die Substanz besitzt ein Quasimolekülion von 889 (M + H).
• e) Das FAB-Massenspektrum der acetylierten Verbindung gemäß Abb. 4. Die acetylierte Verbindung wurde mit m-Nitrobenzylalkohol als Matrix in einer Beschleunigung von 3 KV und 6 KeV Xenonatomen aufgenommen. Das Molekülion 1057 (M + H) zeigt eine vierfache Acetylierung des Antibiotikums.

2. Verfahren zur Herstellung der organisch chemischen Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Familie Streptomycetaceae insbesondere der Gattung Streptomyces und vorzugsweise den Streptomyces-Stamm 33 855 (entsprechend DSM Nr. 4085) in einem Nährmedium welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung isoliert.

3. Organisch-chemische Verbindung gemäß Anspruch 1, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2.

4. Leistungsfördernde Mittel gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung die in den Ansprüchen 1-3 gekennzeichnet ist.

5. Prämixe und/oder Futterzusatzmittel gekennzeichnet durch den Gehalt an der Verbindung die in den Ansprüchen 1-3 gekennzeichnet ist.

6. Verwendung der Verbindung, die in den Ansprüchen 1-3 gekennzeichnet ist bzw. der Prämixe und/oder Futterzusatzmittel gemäß Anspruch 4 zur Leistungsförderung bei Tieren.

7. Mikroorganismen der Familie Streptomycetaceae, insbesondere der Gattung Streptomyces, die bei einer Kultivierung in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltendem Nährmedium die Verbindung, die in den Ansprüchen 1 und 2 gekennzeichnet ist, produzieren.

8. Streptomyces-Stamm 33 855 (gemäß DSM Nr. 4085) sowie seine Mutanten und Varianten.

9. Verwendung von Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 6 und 7 zur Herstellung der Verbindung, wie sie in den Ansprüchen 1 und 2 gekennzeichnet ist.