KR900005858B1

KR900005858B1 - 신규의 항생물질 6270의 제조법

Info

Publication number: KR900005858B1
Application number: KR1019850002175A
Authority: KR
Inventors: 요오코 히사카베; 노부코 타카하시; 아키오 키요노; 야스오 이와가야
Original assignee: 카켄 세이야꾸 가부시끼가이샤; 사와 케이쇼오
Priority date: 1984-04-13
Filing date: 1985-04-01
Publication date: 1990-08-13
Also published as: HUT37816A; JPS60217896A; SU1409132A3; JPH0153876B2; ES8608044A1; CN85101157A; CN1007267B; EP0158179A2; EP0158179B1; RO91600B1; EP0158179A3; HU197981B; AU4121785A; ATE56722T1; AU580992B2; KR850007276A; DE3579725D1; ES542079A0; RO91600A2; HU196626B

Abstract

내용 없음.

Description

신규의 항생물질 6270의 제조법

제1도는 취하칼륨정으로 측정한 항생물질 6270의 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.

제2도는 TMS를 내부 표준으로 하여 중클로로포름중에서 측정한 항생물질 6270 물질의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제3도는 TMS를 내부 표준으로 하여 중클로로포름중에서 측정한 항생물질 6270 물질의¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 신규의 항생물질 6270의 제조법에 관한 것이다.

본 발명자들은 새로운 항생물질의 탐색을 목적으로 다수의 미생물을 토양으로부터 분리하고, 그 미생물이 생성하는 항생물질의 분리를 시도하였다. 그 결과 일본국 혹카이도 아바시리시에서 채취한 토양으로부터 단리한 노카르디옵시스(Nocardiopsis)속에 속하는 미생물을 적당한 배지에서 배양하면, 그람 양성균(G⁺)에 높은 항균력을 나타내는 항생물질이 배지중에 축적되는 것을 발견하였다. 축적된 항생물질을 단리하고, 그 이화학적성질 및 생물학적 성질을 검토하였던바, 신규의 항생물질로 확인되었고, 이것을 항생물질 6270물질이라 명명하였다.

본 발명은 상기한 지견에 기초를 둔 것으로 항생물질 6270물질을 생산하는 능력을 가진 노카르디옵시스속 균을 배양하고, 그 배양물질로부터 항생물질 6270물질을 분리하는 것을 특징으로 하는 항생물질 6270물질의 제조법에 관한 것이다.

항생물질 6270물질의 제조에 사용되는 미생물로는, 항생물질 6270물질의 생성능을 갖는 모든 노카르디옵시스속 미생물을 사용할 수 있으나, 예를 들어 본 발명자들이 새로이 분리한 노카르디옵시스에 속하는 에스피-6270호 균주(수탁번호: FERM BP-717)가 바람직하다.

이 노카르디옵시스 에스피 6270균주는 분류학상으로 노카르디옵시스 메이어 1076에 속하며 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-10144호에 기탁 보관되어 있다.

본 발명에 사용되는 노카르디옵시스 에스피 6270호 균주는 분지하는 진정균사를 가지며, 공중으로 뻗는 공중균사는 분단된 긴 포자의 사슬로 되어 있다.

전 세포의 가수분해물로부터 메소-아미노 피메린산과, 당성분으로 갈락토스와 리보스가 검출되나, 아라비노스와 마두로스(madurose)는 검출되지 않는다. 또 미콜린산(mycolic acid)도 검출되지 않는다. 메나퀴논(menaquinone)조성은 MK-9(H₃) 및 (H₈)가 다량 성분으로 검출되었고, 미량성분으로 MK-9(H₄)가 검출되었다. 표면 균사의 폭은 약 0.5㎛였다. 이상의 성질로 보아 6270호주는 방선균류중 노카르디옵시스속에 속하는 균주로 사료된다.

노카르디옵시스 에스피-26270호 주는 다음과 같은 균학적 성질을 갖는다.

Ⅰ. 형태학적 성질

표면균사는 잘 발달하고 분지하며, 균사의 폭은 약 0.4㎛였다. 수종의 배지, 예를 들면, 슈크로스 초산염 한천배지(디프코), 전분한천배지(ISP-4, 디프코), 오트밀 한천배지(ISP-8) 또는 글루코스-아스파라진 한천배지 등에서는 양호하게 공중균사를 생성한다. 공중균사는 직선상 또는 곡선상으로 전체적으로 거미줄 모양이다. 성숙한 공중균사는 폭이 약 0.4㎛-0.6㎛가 된다.

배양후 10일만에 적당한 한천배지 상에서는 공중균사는 분단되어 10개 이상의 긴 포자의 연쇄가 된다. 포자의 연쇄는 나선형으로는 되지 않는다. 크기는 약 0.4×1.2㎛이다. 포자낭, 균핵, 균사 다발은 관찰되지 않는다.

Ⅱ. 배양상의 제성질

실험방법은 이 비 셔링 등의 보고(International Journal of Systematic Bacteriology 16:313-340, 1966)에 준하였고, 기타의 공지의 배지 및 실험방법을 병용했다. 색조를 결정할때는 크세논 램프를 광원으로 하는 표준광원하에서 표준색표로서 칼럼, 하모니, 매뉴얼 제4판을 사용하고, 일치되는 색표가 있으면 처음에 일반명을 표기하고, 다음에 괄호내에 색표코드를 병기하였다. 계속하여 같은 색이 나타났을때는 색표코드만을 표기하였다. 이하에서 특기하지 않는한, 28℃, 3주째의 생육상태이고, 한천 평판 배양이고, a란에는 생육상태, b란에는 공중균사의 상태, c란에는 용성색소 및 d란에는 기타의 성질을 기재하였다.

(1) 슈크로스-초삼연 배지(디프코)

a : 양호, 유회색(near gray, 2ba)

b : 백색, 분상

c : 만들지 않음

(2) 글루코스 아스파라진 배지

a : 양호, 엷은 호박색(light amber, 3ic)-베이지색(3ge)

b : 유회색(3ba)

c : 만들지 않음

(3) 글리세롤, 아스파진 배지

a : 불량, 2ba

b : 조금 착생함

c : 만들지 않음

(4) 전분 한천배지

a : 왕성, 3ic-셸(3ca)

b : 분상, 백색

c : 만들지 않음

d : 전분의 가수분해는 음성

(5) 타이로신 한천배지

a : 불량, 3gc

b : 만들지 않음

c : 만들지 않음

(6) 영양 한천배지(디프코, 박토 뉴트리언트 아가)

a : 불량, 엷은 백색(2ea)

b : 만들지 않음

c : 만들지 않음

(7) 이스트, 말토 엑기스 배지

a : 왕성, 선상, 황옥색(topaz, 3ne)

b : 백색

c : 만들지 않음

(8) 오트밀 배지

a : 양호, 셸(2ca)

b : 2ba

c : 만들지 않음

Ⅲ. 생리학적 성질

(1) 생육온도범위(전분 한천배지 사면, 온도구배장치):6.5℃-38℃(5℃ 이하 및 39.5℃이상에서는 생육되지 않는다). 적당한 온도:27℃-38℃

(2) 글루코스-펩톤, 젤라틴 배지 천자배양의 액화:양성

(3) 전분 가수분해:음성

(4) 탈지유의 응고, 펩톤화:응고하지 않고 펩톤화한다(37℃).

(5) 멜라닌 색소의 생성

ISP 타이로신 한천배지:음성

ISP 트립톤 이스트액기스 액체배지:음성

ISP 펩톤 이스트-철(Fe) 한천배지:음성

(6) 내염성:4℃에서 생육되지 않는다.

(7) 크산틴, 하이포크산틴, 아데닌의 용해성:음성

Ⅳ. 탄소원의 이용능(프리드함 고트리브 기초배지)

이용양성:D-글루코스, D-아라비노스, D-크실로스, 살리신

이용양성:D-프럭토스, 슈크로스

이용음성:이노시톨, L-람노스, 라피노스, D-만니톤

이상의 제성질로부터 6270호 균은 방선균중 공중균사상에 긴 포자연쇄를 만들고, 전 균체 가수분해물중에 메소-디아미노피메린산과 갈락토스를 함유하나, 아라비노스 및 마두로스를 함유하지 않으며, 또 미콜린산이 검출되지 않는 점에서 노카르디옵시스(블록루소, 1904)(메이어, 1976)의 한 균주로 동정되었다.

본 발명을 실시함에 있어서는, 항생물질 6270물질 생산균을 공지의 방선균의 배양법으로 행할 수 있으나, 공업적으로는 통기교반 배양하는 것이 가장 적합하다. 생산배지로는 방선균의 배양에 사용되는 통상의 원료가 사용된다. 즉 각종의 탄소원, 질소원 및 유기 또는 무기염류 및 경우에 따라 소포제등을 적당하게 조합시켜 사용할 수가 있다. 일반적으로 탄소원으로는 글루코스, 전분, 글리세린, 덱스트린, 슈크로스, 동식물유등, 질소원으로는 대두분, 콘 스팁 리쿼, 소맥배아, 암모니아 등을 사용할 수가 있다. 기타 필요에 따라, 탄산칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산염등의 무기염을 첨가하고, 또 균의 발육을 도와 항생물질 6270물질의 생산을 촉진하는 작용이 있는 유기 또는 무기염을 적당히 첨가할 수도 있다.

배양온도는 일반적으로 25-35℃의 범위이지만, 30℃ 부근이 바람직하다. 배양시간은 여러 조건에 따라 다르지만, 통상 72-148시간으로 항생물질 6270물질의 생산 축적량은 최대로 된다.

배양물로부터 항생물질 6270물질을 단리, 정제하기 위해서는 본 물질의 이화학적 성질을 이용하고, 공지의 수단, 예를 들어, 불순물과의 용해도 차를 이용하는 수단, 이온교환수지 또는 각종 흡착제에 대한 흡착력의 차를 이용하는 수단, 물과 혼합되지 않는 유기 용매에 의한 추출 또는 침전, 불순물의 제거, 투석, 건조, 재결정 등의 수단을 적당히 선택하여 조합시켜 행할 수 있다.

배양물줄에 생산된 항생물질 6270물질은 예를 들어 다음과 같이 분리하는 방법이 바람직하다. 배양액에 여과보조제, 예를 들면 규조토, 라디오라이트 700 등을 가하여 배양액을 여과하고, 여액 및 균체를 각기 적용한 용매, 예컨대, 초산에틸, 아세톤등으로 추출한다. 다음에 균체 추출액과 여액추출액을 합치고, 이 추출액으로부터 용매를 증류 제거시켜 생성된 항생물질 6270물질의 조결정에서 항생물질 6270물질을 단리하기 위해서는, 예컨대 크로마토그라피를 행한다. 용출액을 감압 농축한다음 잔사를 적당한 용매, 예를 들면, 초산에틸에 녹이고 희염산 용액으로 처리하고, 용매층을 농축하면 항생물질 6270물질이 유리산 형태로 결정화된다.

나트륨 염으로서 얻기 위해서는 전기 희염산 용액으로 처리한 용매층을 희탄산 나트륨용액으로 처리하고, 용매층을 농축하면 항생물질 6270물질이 나트륨염으로 된다. 여기서 얻은 유리산형 및 나트륨염 형의 항생물질 6270물질을 적당한 용매, 예를 들면, n-헥산, 초산에틸 등으로 재결정함으로서 순수한 결정으로 얻을 수 있다. 이리하여 얻어진 유리산 형의 항생물질 6270물질의 성상은 다음과 같다.

(1) 무색 침상결정, 산성물질

(2) 융점:115-118℃

(3) 원소분석치(실측치 %):C 62.72%, H 9.49%, O 27.78%

(4) 비선광도

=-11.5°(C 1.0, 메탄올)

(5) UV:메탄올 용액중에서 측정하면 210nm 이상에서 흡수극대가 나타나지 않는다.

(6)IR(KBr)(cm^-1):3470,2980,2945,2890,1735,1460,1380,1315,1165,1102, 1075, 987,980

제1도에 흡수 스펙트럼을 도시하였다.

(7) 용해성:메탄올, 에탄올, 초산에틸, 클로로포름, 에테르, 아세톤, 벤젠등에 가용, 물에 불용.

(8) 발색반응:바닐린 황산반응, 드라겐도프반응 양성, 닌히드린반응 음성, 요오드 반응 양성.

(9) TLC(Merck, 키젤겔 GF₂₅₄):

(10)¹H-NMR:TMS를 내부표준으로 하여, 중클로포름중에서 100MHz로 측정한 결과를 제2도에 표시함. δppm 3.39(3H), 3.49(6H)에 3개의 메톡실기의 존재를 나타냄.

(11)¹³C-NMR:TMS를 내부표준으로 하여, 중클로포름중에서 25MHz로 측정한 결과를 제3도에 도시하였다.

(12) 항균 스펙트럼을 표 1에 나타냈다.

[표 1]

a : 영양한천배지

b : 글리세린 영양한천배지

c : 감자당 한천배지

이상의 이화학적 및 생물학적 성질에 대한 실험결과, 본 물질이 폴리에테르 균이라 총칭되는 항생물질균에 속한다.

본 물질은¹H-NMR 스펙트럼으로부터 분자중에 3개의 메톡실기를 가지는 것으로 추정되나, 폴리에테르군 항생물질중 분자중에 3개의 메톡실기를 갖는 기지의 항생물질로는 C20-12(특개소 58-53919호), A-204B(Handbook of Microbiology 410, Vol 3, CRC Press), T-42082(특개소 50-10581호), T-40517(특개소 50-10581호), 38295(특개소 51-125793호), No. 6016(특개소 54-84576호), X-14868C(특개소 56-120696호), CP-47433(특개소 57-154108호), 47434(특개소 57-154187호), LL-C23024β(특개소 58-78598호)를 들 수 있다.

그러나 6270물질은 융점, 비선광도, 원소분석치 또는 적외선 흡수 스펙트럼 등의 성질이 전기한 기지 물질과 다르고, 신규인 항생물질이다.

항생물질 6270물질은 특히 그람 양성군에 대하여 강력한 항균작용을 갖기 때문에, 한균제로서 유용하다. 또 저농도에서 항콕시디쥼작용, 살진드기작용, 및 항바이러스 작용을 갖고, 그외에 소, 돼지 등의 가축의 설사 예방 및 치료제, 사료효과율 개선제 및 발육촉진제로서 유용하다.

[실시예 1]

글루코스 6.0%, 대두분 2.0%, 톨라이스트 1.0% 및 탄산칼슘 0.5%의 조성을 가진 배지(pH 6.0) 1l에 노카르디옵시스 에스피-6270호 주(수탁번호: 미공연균조기제 717호(FERM BP-717)를 접종하고, 30℃에서 48시간 배양한다. 이 배양액을 전기한 것과 같은 조성의 배지 100l에 접종하고, 30℃에서 96시간, 200l용 탱크속에서 통기교반 배양한다. 통기량은 100l/분, 회전수는 250rpm으로 한다. 이 배양액에서 여과보조제(상품명: 라디오라이트 700)를 가하여 여과하고, 여액과 균체로 분리한다.

이어서 세액을 초산에틸 40l로 추출하고, 균체는 아세톤 30l로 추출한다. 균체의 아세톤 추출액을 감압농축하여 아세톤을 제거한 후, 초산에틸 20l로 추출한다. 이 추출액과 여액의 추출액을 합치고, 이것을 감압 농축하고 잔사를 실리카겔(와코겔 C-200) 750g을 클로로포름으로 충진한 칼럼에 흡착시키고, 클로로포름 메탄올(100:1)의 혼액을 통과시킨다. 활성부분을 감압하에 농축건조하면 오일상의 잔사를 얻을 수 있다. 이것을 가급적 소량의 아세톤에 녹이고, 아세톤으로 충진한 세파덱스 LH-20의 칼럼에 흡착시키고, 아세톤으로 전개용출을 하고 얻어진 활성 분획을 농축시키면 항생물질 6270물질의 조결정이 얻어진다. 이것을 초산에틸에 용해하고, 희염산과 함께 진탕시킨 후, 초산에틸 층을 감압하에서 농축시킨다. 생성된 결정을 n-헥산, 초산에틸로부터 재결정시키면 항생물질 6270물질의 유리산 23.4g이 무색 침상결정 형태로 얻어진다. 이렇게 얻어진 항생물질 6270물질 유리산은 전기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 나타낸다.

[시험예 1]

[항콕시쥼 작용]

공시약제 및 사료:

항생물질 6270물질은 공시농도가 되도록 오리엔탈사 제품의 유추용 완전배합 사료에 균등하게 혼합하고, 오시스트의 접종 2일전부터 시험종료일(감염 8일후)까지 투약을 계속했다. 먹이는 자유로이 먹게 했다. 또 비교약제는 항콕시쥼제로 알려져 있는 모넨신을 사용했다.

공시 병아리:

공시 병아리는 산란계종 세바스타크로스의 숫병아리로, 콕시쥼의 감염을 완전히 방지하여 사육한 생후 7일(감염시 생후 9일)된 것을 한군당 5마리씩 사용하였다.

접종 오시스트 및 접종량:

일본국 농림수산성 가축 위생 시험장에서 분리 동정된 아이메리아테네라의 감수성주를 사용했다. 그 접종량은 병아리 한 마리당 성숙 오시스트 3×10⁴개를 각기 금속제의 경구 주사기로 경구적으로 접종하였다.

효과의 판정:

효과의 판정은 병아리의 상대증체율, 생존율 오시스트치 및 장관의 병변치로부터 항콕시즘 지수(A.C.I)를 계산하고, 치수치에 의한 판정을 했다.

항콕시쥼 지수(A.C.I.)=(상대증체율+생존율)-(오시스트치+병변치)

120이하는 항콕시쥼제로서 부적당.

160이하는 항콕시쥼제로서 효력이 적다.

160-180 항콕시쥼제로서 중간정도 유효.

180 이상은 항콕시쥼제로서 극히 유효

a) 체중측정

체중은 시험 종료시에 각군 마다의 증체량(실험종류시 체중-감염시 체중)을 구하고, 무감염 무투약 대조군을 100으로 하여 상대증체율을 구하였다.

b) 오시스트 치

감염후 8일만에 장관 호모지네이트에 의해 맹장내 오시스트를 세고, 오시스트 치도 다음과 같이 정했다.

[장관 호모지네이트에 의한 방법]

c) 장관 병변도

병아리는 시험종료시(감염후 8일째)에 죽여서 장관을 육안적으로 정사하고, 병변도를 판정했다. 또 병변도는 다음과 같이 정했다.

(-) 0:맹장은 완전히 정상, 출혈반이 있으면 +로 한다.

(+) 1:맹장의 형은 정상, 내용물은 약간 유동성을 띄고, 색도 황색으로 된다. 맹장은 부분적으로 가벼운 종장이 있고, 백색으로 된다.

(++) 2:맹장의 형은 거의 정상, 점막의 종장은 전면에 보인다. 내용에 출혈이 없고, 점막은 황색으로 퇴색해 있다. 점막내에는 소수의 백색점 모양의 괴사과나 출혈반이 보인다.

(+++) 3:맹장의 위축 및 변형은 명료하고 직장보다도 약간 긴 정도로 된다. 정상적인 내용물은 전혀 없고 응혈 또는 회백색 치즈상의 변성물이 충만해 있을때가 많다. 맹장벽의 비후는 현저하게 무르게 되고, 점상의 출혈반이 아직 남아 있을 경우도 있다. 병변은 맹장 기부에까지 달하나 맹장에까지 달하지는 않는다.

(++++) 4:맹장의 위측 및 변형은 현저. 일반적으로 소시지상을 나타내며, 그 길이는 직장과 같거나 짧아져 있다. 병변은 직장의 1/3-1/4정도 되는 곳까지 달한다.

제1-3군은 오시스트 접종 2일전부터 소정의 농도의 항생물질 6270물질을 함유하는 사료로 사육하고, 제4군은 비교약제의 항생물질 모넨신을 함유하는 사료로 사육하고, 제5군은 오시스트 접종, 공시 약제를 함유하지 않는 기초 사료로 사육한 감염, 무투약 대조군, 제6군은 무감염, 무투약 대조군이다.

이 시험의 결과에서 항생물질 6270물질은 항콕시쥼 작용을 갖는 것을 알수 있다.

[표 2]

[시험예 2]

[돼지의 사료 효율시험]

공시돼지:란드레스 종

기초사료:

a) 시험개시-4주간

곡류(옥수수, 소맥, 대맥) 60%, 대두유박 15%, 동물질성사료(탈지분유, 어분) 15%, 기타(효소, 탄산칼슘, 인산칼슘, 식염 등) 10%

b) 4-12주간

곡류(옥수수, 마일로, 소맥) 78%, 대두유박 13%, 어분 5%, 기타(효소, 탄산칼슘, 인산칼슘, 식염 등) 4%

방법:

평균 생후 35일된 새끼돼지 15마리를 평균 체중이 거의 비슷하게 1군 5마리씩 3군으로 나누고, 기초사료에 항생물질 6270물질을 0, 12.5, 25ppm의 비율로 첨가하고, 12주간 먹이를 공급하고, 체중 및 사료섭취량을 측정하였다.

또 시험개시일로부터 4주간 설사를 한 돼지의 연일수를 조사하였다. 그 결과를 표 3에 표시하였다.

본 항생물질 6270물질을 첨가한 사료를 급여함으로써, 농후 사료의 요구율은 5-8% 개선되고, 증체량은 5-11% 향상되었다.

또 돼지의 설사 발생이 현저하게 감소되는 것도 관찰되었다.

[표 3]

[시험예 3]

[반추동물의 사료효율시험]

시험소:홀스타인종

농후사료:곡류(옥수수, 마일로, 대맥) 71.5%, 조강류(콘 구루텐피드, 밀기울 , 쌀겨유박) 5.5%, 기타(알팔파밀, 당밀, 인산칼슘, 식염) 11.5%.

방법:

생후 8개월된 종거세황소 15마리를 평균체중이 비슷하게 1군 5마리씩 3군으로 나누고, 기초 농후 사료에 항생물질 6270물질을 0, 7.5, 15ppm이 비율로 첨가하여 240일간 급여하였다.

[표 4]

본 항생물질 6270물질을 첨가한 사료의 급여에 의해 농후사료의 요구율은 7-10% 개선되고, 증체량은 9-11% 향상되었다.

Claims

항생물질 6270을 생산하는 능력을 가지는 노카르디옵시스에스피 6270균주를 배양하고, 그 배양물로부터 항생물질 6270을 분리하는 것을 특징으로 하는 항생물질 6270을 제조하는 방법.