JPS5950647B2 - 動物成長調節剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトミセス属菌の培養によって得られ
る新抗生物質エンジュマイシンを含有する動物成長調節
剤に関する。

本発明者らは、静岡県小笠郡菊用町の土壌から分離した
ストレプトミセス属に属する一菌株（微工研菌寄第２４
４４号）を培養することにより、培養物から新抗生物質
を生産しうろことを見出した。

本発明者らの研究によれば、本菌は下記の菌学的性質を
有することが知られた。

■ 形態学的特性 気菌糸は主軸に互生又は対生に分岐し、胞子柄は密なら
線状を呈するが、直状、ループ状も一部に見られる。

また胞子の連鎖は１０個以上の比較的長い連鎖を形成し
、胞子はとげ状で楕円形（１，１〜１．２μ×１．２〜
１．３μ）である。

２ 培養基上の諸性質 蔗糖−硝酸塩−寒天培地 生育：普通、明灰色（２ｅｃ）。

気菌糸：普通、砂色でわずかに濃淡のまだら状（２ｅｃ
）。

可溶性色素：なし。

グルコース−アスパラギン−寒天培地 生育：普通、黄色から次第にレモン色がかる（２ｉａ）
。

気菌糸：豊富、白から次第に灰色となり、わずかに白黄
色のまだら状となる（２ｆｅ）。

可溶性色素：わずかに黄味がかるが消失する。

グリセリン−アスパラギン−寒天培地 生育：普通、白から明るいレモン様黄色となる（Ｉｇａ
）。

気菌糸：少ない、白（ａ）。

可溶性色素：なし。

殿粉−寒天培地 生育：良好、濁ったクリーム色から灰色となる（ １１
／２ｇｅ）。

気菌糸：豊富、粉状、灰色でわずかに褐色味をおびてく
る（３ｉｇ）。

可溶性色素：なし。

チロシン−寒天培地 生育：良好、黄味がかった褐色から暗褐色となる （２
ｐｉ）。

気菌糸：豊富、やや線状、白から灰色となる（２ｆｅ）
。

可溶性色素：なし。

栄養寒天培地 生育：弱い。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：わずかに褐色気味となるが消失する。

酵母−麦芽−寒天培地 生育：良好、少ししわ状、褐色（３ｐｇ）。

気菌糸：豊富、線状、白と灰色のまだら状（ａ〜３ｆｅ
）。

可溶性色素：なし。

オートミル−寒天培地 生育：良好、レモン様黄色から黄色となる（ １１／２
１ｅ）。

気菌糸：豊富、灰色（２ｆｅ）。

可溶性色素：わずかに黄味がかるが消失する。

ポテトプラグ培地 生育：レモン様黄色から明褐色となる。

気菌糸：自から明灰色となる。

可溶性色素：黒色から暗褐色となる。

ペプトン−酵母゛−鉄鉄基寒天培 地育：明褐色。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：明褐色。

ゼラチン培地 生育：黄色（円板状）。

気菌糸：灰色。

可溶性色素：褐色。

脱脂牛乳培地 生育：しわ、円板状、褐色様クリーム色。

可溶性色素：褐色。

３ 生理的特性 − 生育温度範囲：２０〜５５℃、適正温度２８℃。

ゼラチンの消化：陽性。

殿粉の加水分解：弱い陽性。

脱脂牛乳の凝固：陰性。

脱脂牛乳のペプトン化：陽性。

メラニン様色素の生成：陽性。

炭素源の同化性： よく利用するもの（＋）： Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ −グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｌ− ラムノース、Ｄ−マンニット。

利用するもの（＋）： イノシトール、ラフィノース。

わずかに利用するもの（±）： 蔗糖。

前記の各試験は、イー・ビー・シャーリングらの報告「
メソーズ・フォー・キャラクタリゼーション・オブ・ス
トレプトミセス・スペシーズ」、Ｉｎｔ −Ｊ −５ｙ
ｓｔ −Ｂａｃｔ−１第１６巻３号３１３〜３４０頁（
１９６６年）により行ない、また生育の色調等はキセノ
ンランプ標準光源下で測定し、イー・ジャコブソンらの
カラー・ハーモニー・マニュアルと対照して適合色のあ
る場合はその記号を付した。

前記の諸性質について、ニス・ニー・ワクスマン著「ザ
・アクチノマイセテス」第２巻（１９６１年）その他文
献に記載のストレプトミセス属に属する菌種と比較した
結果、本菌はストレプトミセス・フラボクロモゲネス及
びストレプトミセス・ピロサスに近縁の菌株と考えられ
る。

しかしストレプトミセス・フラボクロモゲネスはグルコ
ース−アスパラギン−寒天培地及び栄養寒天培地におい
て褐色の可溶性色素を産生するが、本菌はその産生が認
められないか、あるいは初期にわずかに認められても培
養が成熟すると消失してしまう。

また殿粉−寒天培地における基調色も黄色と灰色（本菌
）で異なっている。

ストレプトミセス・ピロサスと本菌は、殿粉−寒天培地
上の生育の色調がストレプトミセス・ピロサスは黄色で
あるのに対し本菌は灰色であり、また牛乳培地において
前者は灰色でペプトン化が弱いのに対し、本菌はクリー
ム色でペプトン化が強いなどの点で異なっている。

さらに本菌は後述のように新抗生物質エンジュマイシン
を生産するのに対し、公知菌はその性質を欠如している
。

このように本菌の諸性質を既知菌種のそれと比較検討し
た結果、本菌は新菌種と判断され、ストレプトミセス・
エンシュウエンシスと命名された。

本発明者らはさらに研究を進めた結果、この新抗生物質
エンジュマイシンは動物に対して優れた成長調節作用を
示すことを見出した。

本発明は、有効成分としてエンジュマイシンを含有する
ことを特徴とする動物成長調節剤である。

本発明に用いられるエンジュマイシンは、たとえば次ぎ
のようにして製造される。

エンシュマイシン生産菌の培養は一般の放線菌の培養方
法と同様に行ないうるが、培養基としては、一般には炭
素源としてたとえば殿粉、グルコース、グリセリン、マ
ルトース等、窒素源としてたとえばペプトン、肉エキス
、大豆粉、コーンスチープリカー、綿実粉、酵母等及び
無機質としてたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム、
炭酸カルシウム、その他の燐酸塩等を加えたほぼ中性の
液体培養基が用いられる。

培養基にエンジュマイシン生産菌を接種し、２５〜３５
℃の温度で通気攪拌下に培養する。

通常３５〜９０時間の培養時間で生産される抗生物質の
濃度は最高に達するが、この時間は同一温度及び同一組
成の培地においても通気条件、攪拌条件等によって変化
するので、その都度力価検定により定めることが好まし
い。

抗生物質エンジュマイシンは培養Ｐ液及び菌体のいずれ
にも生産されるが、菌体には培養Ｐ液の約５〜１０倍多
く生産される。

こうして得られる培養物から目的とする抗生物質を採取
するためには、通常使用される物理化学的方法を用いる
ことができるが、たとえば次ぎのように操作する。

培養物を濾過してＰ液と菌体に分ける。

Ｐ液は１３〜８の範囲で抽出する。抽出溶媒としては、
低級脂肪酸と低級アルコールのエステルたとえば酢酸エ
チル、酢酸ブチル等、ブタノール、ベンゼン等、その他
の水に難溶でかつエンジュマイシンの物性に合致した有
機溶剤が用いられる。

次いで抽出物をたとえば希塩酸、水等で洗浄したのち硫
酸ナトリウム等で脱水し、減圧下に濃縮する。

一方菌体は、たとえば含水アセトン、含水メタノール等
を菌体の２〜１０倍量加えて菌体中の抗生物質を抽出し
、沢過して菌体抽出残香を除去したＰ液を減圧下に濃縮
する。

次いでこの濃縮液を前記の培養Ｐ液からの抽出法と同様
にして抽出し、脱水したのち濃縮する。

こうして培養Ｐ液及び菌体から抽出し濃縮して得られる
濃縮液をそれぞれ一緒にし、さらに減圧下に濃縮して用
いた有機溶剤を留去したのち、残香を適当量のアセトン
、メタノール、酢酸エチル等に溶解し、約１０〜２０倍
量のｎ−ヘキサン、石油エーテル等中に滴下して沈殿を
生成させる。

この沈殿を沖取して乾燥すると、エンジュマイシンを含
有する淡褐色の粗粉末が得られる。

さらに純粋なエンジュマイシンを得るには適宜の物理化
学的方法を用いることができるが、たとえば次ぎのよう
に操作する。

前記により得られた粗粉末を少量のクロロホルムに溶解
し、この溶液をあらかじめクロロホルムで充填したシリ
カゲルカラムに導通し、クロロホルムで洗浄したのち溶
出溶媒としてメタノール含有クロロホルムを用いて溶出
する。

溶出液を減圧下に濃縮して溶媒を完全に留去し、残香を
適当量の酢酸エチルに溶解し、塩酸処理により活性化し
たアルミナカラム中を流下させ、続いてメタノールを流
下して溶出を行なう。

抗生物質を含有するメタノール溶出液を減圧下に濃縮し
、溶媒を留去したのち残香を少量の酢酸エチルに溶解し
、溶出溶媒として酢酸エチルを用い、シリカゲルカラム
中を流下させて溶出する。

活性区分を集め、減圧下に濃縮し、溶媒を留去したのち
残香を少量のアセトンに溶解し、ｎ−？キサンを加えて
析出する沈殿を採取し、冷ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥
すると、純粋な抗生物質エンジュマイシンが白色粉末と
して得られる。

こうして得られるエンジュマイシンは文献未載の新抗生
物質であって、細菌類に対して高い活性を示す。

エンジュマイシンの生物活性は次ぎのとおりである。

毒性：ＬＤｓｏ＞６５０ｍｇ／ｋｇ （”ウス、経口）
抗菌スペクトル： エンジュマイシンの理化学的性質は下記のとおりである
。

融点：２１５〜２１９℃ 元素分析値（％）：Ｃ＝５４．８６、Ｈ＝ ５．９３、
Ｎ＝１３・７５、Ｓ＝３．７０ 分子量ニラスト法８３４．５ 蒸気圧降下法８２２．８（ＣＨＣ１３） 分子式：Ｃ３８Ｈ４９Ｎ８０□１Ｓ Ｃ＝５５．２７％、Ｈ＝ ５．９４％、 Ｎ ＝ １３．５８％、Ｓ＝３．８８％、０ ＝２１．
３３％ 紫外線吸収スペクトル：同日出願明細書Ａ参照。

赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ中）：同日出願明細書Ａ
参照。

Ｒｆ値ニ ジリカゲル薄層クロマトグラフィー ０．０ クロロホルム ０．７ クロロホルム−メタノール（５：０，１）０
．８ 水飽和ｎ−ブタノール ０．２ ベンゼン−メタノール（９５：５）ペーパー
クロマトグラフィー ０．９ 水飽和ｎ−ブタノール、５０％アセトン−水
、ベンゼン−メタノール（８： ２）、ｎ−ブタノール−メタノール・ −水（４： １ ： ２） ０．０水 溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、酢酸ブチル、ベンゼン、クロ ロホルム等に易溶 水、ｎ−ヘキサン等に難溶 呈色反応：ニンヒドリン、ビウレット、ニジユバツバ等
の反応は陽性 モーリッシュの反応は陽性 安定性：アルカリには不安定であるが、酸性ないし中性
ではきわめて安定であり、ｐＨ２〜８で６０℃、１時間
の加温では活性はほとんど消失しない。

紫外線照射に対しては、含水メタノー ル中の溶液を２０Ｗケミカルランプによ り３０ｃｍ下で２４時間照射すると活性の約７０゜％が
消失する。

エンジュマイシンはそれ自体でも用いられるが、きわめ
て少量で有効であるめで一般には動物飼料などに添加混
合して用いることが好ましい。

飼料としては一般の動物用飼料が用いられ、その成分と
しては、たとえばとうもろこし、マイロ、ふすま、米、
麦、米ぬか、大豆粕、魚粉、アルファルファ−１炭酸カ
ルシウム、燐酸カルシウム、食塩、塩化コリン、ビタミ
ン剤たとえばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ビ
タミンＢ１、ビ。

タミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１□、パントテ
ン酸、メチオニン等、無機塩たとえば硫酸銅、硫酸鉄、
マグネシウム、硫化亜鉛、硫酸コバルト等があげられ、
このほか疾病予防剤たとえばサルファ剤、フラン剤、各
種コクシジウム予防剤、抗生物質、駆虫剤その他を混合
してもよい。

エンジュマイシンの添加濃度は０．５〜５００ｐｐｍが
好ましい、またエンジュマイシンは抽出精製されたもの
でも、抽出粗製物としても用いられる。

本発明の成長調節剤は各種動物に対して有効であり、家
畜、家禽としてはたとえば採卵用鶏、肉用鶏、七面鳥、
あひる、牛、馬、豚、羊、山羊、ミンク等、愛がん用動
物としてはたとえば犬、猫等、実験用動物としてはたと
えばマウス、ラット等があげられる。

本発明の成長調節剤は動物の体重を著しく増加させ、飼
料要求率を改善し、また受精率及び産卵率を高めると共
に細菌性疾患にも有効である。

参考例 １０個の５００ｍ１容三角フラスコに、可溶性殿粉１％
、ペプトン１％、糖蜜１％及び肉エキス１％の組成を有
する液体培地（ｐＨ７，０）をそれぞれ１００ｍ１ずつ
入れ、１２０℃で１５分間滅菌したのちエンジュマイシ
ン生産菌を接種し、２７〜２８℃で４８時間振盪培養し
、これを種菌として次ぎのタンク培養に用いた。

２００１容タンクに、グルコース２％、硫酸アンモニウ
ム０．５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化カリウム０
．４％、乾燥酵母０．２５％、燐酸二カリウム０．０２
％、水酸化ナトリウム０．１％及び綿実粉１％の組成を
有する液体培地（ｐｉ（７，０） １００１を入れ、１
２０℃で３０分間滅菌したのち前記種菌を接種し、２７
〜２８℃で毎分４０１の無菌空気を通気しながら回転数
２００回／分で攪拌培養した。

バチルス・ズブチリスを被検菌として用いて力価を検定
したところ、約４０時間で抗生物質の力価は最高に達し
た。

得られた培養物から超遠心分離機を用いて菌体を分取し
、８０％アセトン−水２０１°を用いて２回攪拌抽出し
、アセトン−水抽出液を減圧下に濃縮した。

得られた約６１の濃縮液を酢酸エチル３１を用いて２回
抽出し、酢酸エチル層を分離して減圧下に約２１まで濃
縮した。

この濃縮液を０．０５Ｎ塩酸約１１を用いて１回、次い
で純水１１を用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水
したのち、エンジュマイシンを含有する酢酸エチル層を
さらに減圧下に濃縮して酢酸エチルを留去した。

残金をアセトン約７００ｍ１に溶解し、攪拌下にｎ−ヘ
キサン約５１中に滴下して淡褐色の沈殿を生成させ、沈
殿を戸数して乾燥すると、エンジュマイシンの粗粉末１
０ｇが得られた。

この粗粉末を次ぎのように操作してカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。

まず前記粗粉末１ｇをクロロホルム約５ｍｌに溶解した
溶液を、１００メツシユのシリカゲル２０ｇをクロロホ
ルムで充填した直径２０ｍｍ、長さ５０ｃｍのガラスカ
ラムに流下させたのち、１％メタノール−クロロホルム
８００ｍ１を流下させて活性区分を溶出し、これを減圧
下に濃縮してメタノール及びクロロホルムを留去した。

次いで残金を酢酸エチル約２０ｍ１に溶解し、この溶液
を塩酸で処理して活性化したアルミナ２０ｇを充填した
ガラスカラムに流下させたのちメタノール約１００ｍ１
で溶出すると、抗生物質を含有する淡黄色のメタノール
溶液が得られた。

この溶液を減圧下に濃縮してメタノールを留去し、残金
を酢酸エチル約５ｍｌに溶解し、この溶液を１００メツ
シユのシリカゲル１５ｇを充填した同じ大きさのガラス
カラムに流下させ、溶出溶媒として酢酸エチルを用いて
フラクションコレクターにより溶出液を約３ｍｌずつに
分画し、活性区分を集めて減圧下に溶媒を留去濃縮した
。

残金をアセトン約５ｍｌに溶解し、ｎ−ヘキサンを攪拌
しながら滴下すると、エンジュマイシンは白色沈殿とし
て析出した。

これを戸数し、少量の冷ｎ−ヘキサンで洗浄して乾燥す
ると、純粋なエンジュマイシン９５ｍｇが白色粉末とし
て得られた。

このエンジュマイシンは前記のような理化学的性質を有
する。

実施例 １ 卵芋化後１日令の肉用鶏（バーバード）４００羽（雌雄
同数）を１区１００羽（雌雄同数）の４区に分け、その
３区に下記の組成から成る飼料にエンジュマイシンをそ
れぞれ１ｐＩｌｒｎ、５ｐＩＩ′ｒｌ及び１０ｐｐｍ添
加した飼料を床面給温による平飼い方式により８週間連
続給与した。

なお対照としてエンジュマイシン無添加の飼料を同様に
して給与した。

飼料組成 ０〜４週に使用したちの ％とうもろ
こし ４５．０マイロ
１８．０大豆粕
２３．５ルーサンミール
３．０魚粉
７．３食塩
０．２炭酸カルシウム １．５
第二燐酸カルシウム １．０プレミ
ツクス ０．５アンプロール
プラス １２５ ｐＩｌｒｒ１５〜８週に
使用したちの ％とうもろこし
４７．０マイロ
２１．０大豆粕
１１．５魚粉 １
０．５油脂 ５・０ル
ーサンミール ２．３食塩
０．２炭酸カルシウム
１．５第二燐酸カルシウム
１．０プレミツクス
０．５アンプロールプラス １
２５ｐＩＩＴ１なおアンプロールプラスはコクシジウム
予防薬として添加した。

プレミックスはビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ
、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、パント
テン酸、ニコチン酸、塩化マリン、葉酸、硫酸鉄、硫酸
銅、コバルト及び亜鉛を含む。

平均体重の推移及び飼料要求率を第１表に示す。

なお飼料要求率は次式により求められる。第１表に示す
ように、８週令時で平均体重は対照区より６．６〜８．
７％の増加を示し、飼料要求率は０．２４〜０．２６向
上したことが認められる。

実施例 ２ 卯字化後１日令の白色レグホーン鶏の雌２００羽を１区
５０羽の４区に分け、その３区に下記の組成から成る飼
料にエンジュマイシンをそれぞれ０，５ｐ１ｍ、３ｐＩ
］Ｔ１及び５ｐｐｍ添加した飼料を与え、電熱加温バタ
リーで３週間、次いで沖雛ケージで３週間飼育した。

飼料組成 ０〜４週に使用したちの ％とうもろ
こし ５１．０マイロ
１７．０大豆粕
１５．８ルーサンミール
４．０魚粉
９．０食塩 ０．
２炭酸カルシウム １．５第二
燐酸カルシウム １．０プレミツクス
０．５アンプロールプラス
１２５ｐＩｒｎ５〜８週に使用したち
の ％とうもろこし
４５．０マイロ
１５．０大豆粕 ２２．
８魚粉 ７．０ルー
サンミール ３．０食塩
０．２脱脂米糠
４．０菌体粕
０．７炭酸カルシウム
１．０第二燐酸カルシウム
０．８プレミツクス ０．５
アンプロールプラス１２５ｐＩｌｒｎ なおプレミックスは実施例１と同様の成分を含む。

平均体重の推移及び飼料要求率を第２表に示す。

第２表に示すように、エンジュマイシンを１添加した飼
料で飼育した鶏は、対照区に比して体重増加量は５〜１
６％優れ、飼育要求率も０．５１〜０．５８向上した。

実施例 ３ 生後２１０日令の採卵鶏（白色レグホーン種）４００羽
を１区１５０羽ずつの３区に分け、その２区に採卵鶏用
市販飼料（全膜製）にエンジュマイシンをそれぞれ１ｐ
Ｈ汲び１０ｐＩ］１１添加した飼料を６力月間連続給与
した。

なお対照としてエンジュマイシン無添加の飼料を給与し
た。

平均産卵率の推移を第３表に示す。

第３表に示すように、エンジュマイシンを添加した飼料
を給与することにより、産卵率が明らかに向上した。

実施例 ４ 離乳直後の汗腺（２１日令）３０頭を１０頭ずつの６区
に分け、その２区に市販の汗腺飼料にエンジュマイシン
をそれぞれ臼耳ｍ及び５０ｐＩＩＴＩ添加した飼料を４
週間給与した。

なお対照としてエンジュマイシン無添加の飼料を給与し
た。

平均体重の推移及び飼料要求率を第４表に示す。

第４表に示すように、エンジュマイシンを添加した飼料
で飼育した豚は、対照区に比して体重増加は７．１〜１
２．４％優れ、飼料要求率も０．３１〜０．３７向上し
た。

実施例 ５ 生後１２週令のランドレース豚４０頭を１区１０頭（雌
雄同数）ずつの４区に分け、その３区に下記の組成から
成る飼料にエンジュマイシンをそれぞれ３ｐｐｍ、３０
ｐｐｍ及びＩ）Ｏｐｐｍ添加した飼料を１０週間給与
した。

なお対照としてエンジュマイシン無添加の飼料を給与し
た。

飼料組成 ％とうも
ろこし ５０．０マイロ
１３．０°大豆粕
１０．０脱脂米糠
８．０大麦
７．５魚粉
７．５アルファルファ−３，０ 炭酸カルシウム １．４燐酸カ
ルシウム ０．９食塩
０．５プレミツクス
０．５なおプレミックス
は実施例１と同様の成分を含む。

平均体重の推移及び飼料要求率を第５表に示す。

第５表に示すように、エンジュマイシンを添加した飼料
で飼育した豚は、対照区に比して体重増加は９．８〜１
３．２％優れ、飼料要求率も０．２７〜０．４５向上し
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 有効成分としてエンジュマイシンを含有することを
   特徴とする動物成長調節剤。