DE2722656A1

DE2722656A1 - Verfahren und zusammensetzung fuer die tierzucht

Info

Publication number: DE2722656A1
Application number: DE19772722656
Authority: DE
Inventors: David Huw Davies; Richard John Ernill; Geoffrey Lightfoot Floy Norris
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1976-05-19
Filing date: 1977-05-18
Publication date: 1977-12-01
Also published as: AR215136A1; SE7705805L; DD129737A5; BR7703207A; IE45039L; BE854821A; IT1143662B; ZA772627B; NL7705489A; IE45039B1; FR2351661A1; IE45038L; ATA358777A; GB1516916A; AT353592B; NO771752L; AU2491477A; PL198087A1; FI771526A; ES458939A1

Description

PATENTANWÄLTE

DR-ING. H. FINiCKE DIPL. -IN G . H. BOHR DIPL.-ING. S. STAEGER DR. rer. nat. R. KNEISSL

PA 3r. F.ncle Ebhr - Suejer Dr. Kneml Mullerilr 31 - 8000 München S

β Mönchen 5. 18. Mai 1977

Müik-rttroße 31

Teiegromme: Claims AAünch Teiex: S 239 03 cloirr, d

Ma_PPenc. 24257 - Dr.K/hö

BiH* in d«r Antwort angeben

ICI CASE PH 28794

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LTD. London - Großbritannien

"Verfahren und Zusammensetzung für die Tierzucht"

Priorität: 19. Mai 1976 - Großbritannien - 20675/76

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Zusammensetzung für die Verwendung in der Tierzucht zwecks Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit von Tieren und der Ausnutzung der Tiernahrung.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Verwendung in der Tierzucht, welches dadurch ausgeführt wird, daß man

-2-

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Bonkverbindung: Bayer. Ver_ti-,,cürk Münchtn, Konto £20 404 ■ Posfsdwdckonto: MOndien 27044-102

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an fleischerzeugende Haustiere, wie z.B. Hühner, Truthähne, Enten, Gänse, Schweine, Schafe, Rinder oder Kaninchen, eine Verbindung der Aureolsäuregruppe verabreicht.

Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "Aureolsäuregruppe" umfaßt:

(1) Aureolsäure, die von Grundy et al., Antibiotics an.. Chemotherapy, Band 3, Seiten 12-15 (1953) und von Philip et al., ibid., Seite 1218 beschrieben wurde und welche auch von Sensi et al., ibid. , Band 8, Seite 241 (1958) als LA 7017 und in der US-PS 3 906 093 als Mithramycin beschrieben wurde. In der letzteren US-PS ist auch die Trennung der drei als Mithramycine A, B und C identifizierten Formen angegeben.

(2) Gemische aus zwei oder allen drei Mithramycinen A, B und C.

(3) Die Aburamycine A, B, C und D, die von Nishimira et al., Journal of Antibiotics (Tokyo) Serie A10, Seite 205 (1957) beschrieben wurden, wobei die Aburamycine A, B bzw. D auch von Shibata et al., ibid., Serie BI3, Seite 1 (1960) als Chromomycine A-, A, und A. beschrieben wurden.

(4) Gemische aus zwei oder mehr Aburair.ycinen A, B, C und D.

(5) Gemische aus zwei oder allen drei Chromomycinen A_, A₃ und A₄, einschließlich solcher, die von Yoshida, Annual Report of Shionogi Research Laboratories, Band 15, Seite 212 (1965) als SK 229 und von GaIe et al., Antibiot. Ann., Seite 489 (1958) als M5-18903 beschrieben wurden.

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(6) Die Olivomycine A, B, C und D, die von Gauze et al., Antibiotiki, Band 7, Seite 34 (1962) und Braznihikova et al., ibid., Seite 39, beschrieben wurden.

(7) Gemische aus zwei oder mehr Olivomycinen A, B, C und D, einschließlich desjenigen, das von Schmitz et al.. Antibiotics and Chemotherapy, Band 1O, Seite 740 (1960) als NSC A-649 beschrieben wurde.

(8) Die Antibiotika 232, 2014, 7193 und 11296, die von Ukholina et al., Mikrobiologia, Band 34, Seite 147 (1965), beschrieben wurden.

(9) Eine einzelne Verbindung oder eine Mischung von Verbindungen, die durch Fermentation von Streptomyces pilosus, NCIB 11238 erhalten wird.

(10) Variamycin, das von Zhdanovich et al., Chemistry of Natural Compounds, Band 7, Seite 625 (1971) beschrieben wurde.

(11) Ammonium-, Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Ubergangsmetallsalze, -komplexe oder -chelate einer Verbindung oder einer Mischung von Verbindungen, die oben unter

(1) bis (10) beschrieben wurden, wie z.B. die Ammonium-, Natrium-, Kalium-, Lithium-, Magnesium-, Calcium-, Barium- und Kupfersalze.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verbindung der Aureolsäuregruppe vorzugsweise den Tieren als Ergänzung zu ihrer Nahrung oral verabreicht, d.h. also in Mischung mit fester Nahrung, als Lösung in Trinkwasser oder, bei jungen Tieren, wie z.B. Schweinen oder Kälbern, als Lösung in Vollmilch oder

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Magermilch. Es ist im allgemeinen zweckmäßig, die Verbindung in Mischung mit der normalen, nährwertinäßig ausgewogenen festen Nahrung der Tiere zu verabreichen. Eine solche ergänzte Nahrung sollte vorzugsweise 0,0001% G/G (1 g je Tonne) bis 0,005% G/G (50 g je Tonne) der Verbindung enthalten. Die Tiere können mit einer solchen ergänzten Nahrung während im wesentlichen der gesamten Wachstumsperiode oder auch nur während eines Teils ihres Wachstumsperiode, beispielsweise zu Beginn und/oder bei Annäherung an den Schlachtzeitpunkt, gefüttert werden. Die Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, die Tiere in einer kürzeren Wachstumszeit aLs normal auf Marktgewicht oder Schlachtgewicht zu bringen, oder ermöglicht es, schwerere Tiere am Ende der normalen Wachstunisperiode zu erhalten.

Bei Mengen, die das Wachstum optimal fördern, wurden keinerlei Anzeichen giftiger Wirkungen auf die Tiere beobachtet.

Bevorzugte Verbindungen der Aureolsäuregruppe für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren sind die Natrium- und Magnesiumsalze, -chelate oder -komplexe von Mithramycin A sowie ein Gemisch aus Mithramycinen.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin eine Zusammensetzung für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschlagen, welche eine Verbindung der Aureolsäuregruppe zusammen mit einem flüssigen oder festen verzehrbaren nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Ein geeignetes flüssiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch.

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mm Of mm

ΑΌ

Ein geeignetes festes verzehrbares nicht-giftiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel kann beispielsweise eine nährwertmäßig ausgewogene Tiernahrung sein, wie z.B. eine übliche Standardhühnchennahrung aus gemahlenen Körnern und Körnernebenprodukten sowie tierischem Protein, ergänzt durch Vitamine und Mineralien; eine handelsübliche Standardschweinemastnahrung; oder irgendeine andere übliche Tiernahrung. Es kann auch ein inertes festes Verdünnungsmittel oder Trägermittel ohne Nährwert verwendet werden, wie z.B. Kc;.. Lin, Talkum, Kaliumcarbonat, Fuller'sehe Erde, Attapulgitton, gemahlene Austernschalen, gemahlener Kalkstein. Andere Beispiele sind Stärke und Lactose.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann die Form einer ergänzten Nahrung haben, die direkt an Tiere verabreicht werden kann, in welchem Falle sie vorzugsweise 0,0001% G/G bis 0,005% G/G einer Verbindung der Aureolsäuregruppe in Mischung mit einer herkömmlichen, nährwertmäßig ausgewogenen Tiernahrung enthält; oder sie kai... die Form einer konzentrierten Vormischung aufweisen, die mit einer herkömmlichen Tiernahrung gemischt werden kann, um eine ergänzte Tiernahrung zu erzeugen, die sich für die direkte Verfütterung an Tiere eignet, in welchem Fall ein solches Vorgemisch vorzugsweise 0,005% bis 50% G/G einer Verbindung der Aureolsäuregruppe in Mischung mit entweder einer nährwertmäßig ausgewogenen Tiernahrung, einem inerten festen Verdünnungsmittel ohne Nährwert, wie z.B. gemahlener Kalkstein, oder Stärke oder Lactose, enthält. Ein solches Vorgemisch kann in üblicher Heise verdünnt werden, wobei das Verdünnungsmittel vorzugsweise hintereinander in zwei oder mehr Stufen zugegeben wird, um ein gleichmäßiges Mischen sicherzustellen.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer festen erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorgeschlagen,

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welches dadurch ausgeführt wird, daß man eine Verbindung der Aureolsäuregruppe in einem festen verzehrbaren nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel gleichmäßig verteilt.

Gemäß der Erfindung wird schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gemischs von Mithramycinen vorgesch' "»gen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man einen Mithram^v in erzeugenden Stamm von Streptomyces pilosus in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Sauerstoff enthält, unter gerührten aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 15 und 45°C, kultiviert, die Kultur filtriert und die Säurefraktion aus dem FiItrat durch herkömmliche Maßnahmen isoliert.

Ein geeigneter Mithramycin erzeugender Stamm von S. pilosus ist in der National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland unter der Bezeichnung NCIB 11238 deponiert. Dieser Stamm von S. pilosus besitzt die folgende Beschreibung:

A. Morphologie (Hefe-Malz-Agar, 25°C, 8 Tage)

Luftmycel mit einfacher Verzweigung. Sporenketten lang (mehr als 10 Sporen) in Spiralen (spira). Sporenoberfläche (unter dem Elektronenmikroskop) haarig.

B. Aussehen des Wachstums nach 12 Tagen bei 25°C auf:

1 . Hefe-Malz-Agar

Typische Streptomycetenkolonie. Luftmycel zuerst weiß , dann während des Fortschreitens der Sporenbildung grau (graue Serie), Sporenbildung reichlich. Substratmycel braun. Kein diffundierbares Pigment.

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-vT-

2. Stärke-Salze-Agar

Luftmycel blaßgrau, Sporenbildung schwach. Substratmycel lederfarben. Kein diffundierbares Pigment.

3. Glucose-Asparagin-Agar

Luftmycel grau, Sporenbildung reichlich. Substratmycel grau. Kein diffundierbares Pigment.

4. Glycerin-Asparagin-Agar

Luftmycel grau, Sporenbildung reichlich. Substratmycel lederfarben. Kein diffundierbares Pigment.

5. Hafermehl-Agar

Kein Luftmycel. Substratmycel weiß. Kein diffundierbares Pigment.

6. Saccharose-Nitrat-Agar

Luftmycel blaßgrau. Sporenbildung gut. Substratmycel grau-lederfarben. Kein diffundierbares Pigment.

7. Tyrosin-Agar

Luftmycel blaßgrau. Sporenbildung gut. Substratmycel grau. Kein diffundierbares Pigment.

8. Nähragar

Luftmycel weiß. Geringe Sporenbildung. Substratmycel lederfarben, wird nahezu schwarz. Kein diffundierbares Pigment.

9. Eisen-Pepton-Agar

Luftmycel grauweiß. Sporenbildung schwach. Substratmycel braun, wird schwarz. Etwas diffundierbares braunes Pigment. (Melanin +, aber schwach).

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10. Melanoid-Pigment-Agar Kein Luftmycel. Substratmycel dunkelbraun. Schwach diffundierbares braunes Pigment (Melanin + , aber schwach).

C. Physiologische Eigenschaften

Ausnutzung als einzige Kohlenstoffquelle (in Pridham-Gottlieb-Agar) von:

Glucose +

Xylose +

Arabinose +

Rhamnose +

Fructose +

Galactose +

Raffinose

Mannit +

Inosit +

Salicin hh (sehr schwach)

Saccharose ^f (schwach)

Hydrolyse von:
Gelatine + Stärke +

Kasein + (Milchagar)

Wirkung in Lackmusmilch

Peptonisierung und Säurebildung. Keine Verfestigung.

Wachsturnstemperatüren

Wachstum auf Hefe-Malz-Agar nach 14 Tagen:

2° 5° 10° 15° 20° 25° 30° 37° 45°

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Beim erfindungsgemäßen Verfahren besteht eine geeignete assimilierbare Kohlenstoffquelle aus beispielsweise einem mehrwertigen Alkohol, wie z.B. Glycerin, Glucose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Galactose, Mannit oder Inosit. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glycerin. Glycerin wird zweckmäßig in das Medium in einer Rate von 2 bis 5% G/V einverleibt.

Eine geeignete Quelle für assimilierbaren Stickstoff ist beispielsweise Pepton, welches zweckmäßig in einer Rate von 0,5 bis 2% G/V einverleibt wird.

Das Nährmedium enthält zusätzlich kleinere Mengen anderer Elemente, wie z.B. Phosphor, beispielsweise in Form von Kalium-dihydrogen-orthophosphat oder Diammonium-hydrogenphosphat; Magnesium, beispielsweise in Form von Magnesiumsulfat oder Magnesiumcarbonat; Schwefel, beispielsweise in Form eines Sulfatsalzes; Kalium, beispielsweise in Form von Kaliumchlorid, Kaliumcarbonat oder Kalium-dihydrogenorthophosphat; und Spuren von Salzen solcher Elemente, wie Kupfer, Zink, Eisen, Mangan und Molybdän.

Eine geeignete Temperatur für die Fermentation ist 32 C. Das Säureprodukt kann aus dem Kulturfiltrat durch herkömmliche Maßnahmen extrahiert werden, beispielsweise dadurch, daß man das Filtrat mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel bei einem neutralen oder basischen pH-Wert extrahiert, um unerwünschte neutrale und basische Produkte zu entfernen, die wäßrige Phase ansäuert und das gewünschte saure Produkt mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert.

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-IJD-

Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein verbessertes Verfahren zur Reinigung des sauren Produkts vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man es in das Magnesiumchelat oder -salz überführt, indem man eine Lösung des sauren Produkts in einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel mit Magnesiumsilicat zusammenbringt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert-

BEISPIEL 1

Streptomyces pilosus NCIB 11238 wurde als Schrägkultur auf vier Schrägen eines Trypton-Hefe-Agar-Mediums in medizinischen Böden 7 Tage bei 32°C gezüchtet. Das Mycel und die Sporen einer jeden Schräge wurden mit sterilem Wasser (100 ml) in einen 21 fassenden Kolben gespült, der 1 eines Mediums der folgenden Formulierung enthielt:

Glycerin 5,0% G/V

Pepton (Difco-Warenzeichen) 0,5% G/V

Kaliumcarbonat 0,1% G/V

Kaliumdihydrogenorthophosphat 0,024% G/V

Magnesiumsulfat.7H₂O 0,02% G/V

Spurenelementkonzentrat 0,1% G/V entsalztes Wasser auf 100

Das Spurenelementkonzentrat besaß die folgende Zusammensetzung :

Eisen(II)sulfat.7H₂O 0,1% G/V

Kupfer(II)sulfat.5H₂O 0,015% G/V

Zinksulfat.7H₂O 0,1% G/V

Mangansulfat.4H₂O 0,01% G/V

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-H-

Ab

Kaliummolybdat 0,01% G/V

entsalztes Wasser auf 100

Die Salze wurden zu einem Teil des entsalzten Wassers zugegeben, und das Gemisch wurde mit ausreichend konzentrierter Salzsäure angesäuert und mit entsalztem Wasser auf Volumen gebracht. Die Lösung wurde dann in einem Autoklaven bei 1,05 kg/cm² während 1/2 st sterilisiert.

Die auf diese Weise vorbereiteten vier 2 1-Kolben wurden 2 Tage auf einem Orbitalschüttler bei 3 2°C geschüttelt. Der Inhalt der vier Kolben wurde dann vereinigt, um einen Fermentator zu beimpfen, der 80 1 eines Mediums mit der folgenden Formulierung enthielt:

Glycerin
Kalziuracarbonat
Kaliuitidihydrogenorthophosphat Magnesiumsulfat.7H-0

Spurenelementkonzentrat (wie oben beschrieben) Pepton (Difco-Warenzeichen) entsalztes Wasser

und in einem Autoklaven bei 1,05 kg/cm 1/2 st sterilisiert. Der Inhalt des Fermentators wurde 45 st bei 32°C gerührt, wobei ein Turbinenmischer mit 6 flachen Schaufeln verwendet wurde, der sich mit 260 U/min drehte. Dabei fand eine Belüftung mit einer Rate von 40 l/min statt. Polypropylenglycol wurde nach Bedarf zugegeben,um das Schäumen zu unterdrücken. Die Fermentationsbrühe wurde filtriert, und das Filtrat (pH ungefähr 7,3) wurde mit 25 1 Äthylacetat extrahiert, welches dann verworfen wurde. Die wäßrige Phase wurde mit 5n Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt und mit 2 χ je 25 1 Äthylacetat extrahiert.

5,0%	G/V
0,1%	G/V
0,024%	G/V
0,02%	G/V
0,1%	G/V
0,5%	G/V
auf 100

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Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet und filtriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1 1 konzentriert. Das gewünschte Produkt konnte aus dem obigen Konzentrat nach zwei verschiedenen Verfahren gewonnen werden: A.

Das Äthylacetatkonzentrat wurde mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung gewaschen (5OO ml Wasser mit ausreichend gesättigter Natriumbicarbonatlösung, so daß ein pH zwischen 9 und 10 erhalten wird). Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit 1 1 Chloroform gewaschen und verworfen. Die wäßrige Phase wurde dann durch Zusatz von verdünnter Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt, zweimal mit je 1 1 Diäthyläther gewaschen, der verworfen wurde und zweimal ir.it je 1 1 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet und filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Diäthyläther trituriert, wobei ein rohes Gemisch von Mithratnycinen als gelbbrauner Feststoff erhalten wurde. B.

Das Äthylacetatkonzentrat wurde bis zu einem rohen Gummi zur Trockene eingedampft. Der Gummi (11 g) wurde in Methanol aufgelöst und die Lösung wurde auf ungefähr 2 g Kieselgur adsorbiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und das getrocknete Material wurde auf die Obers ite einer Kieselgurkolonne (40 χ 6,5 cm) aufgebracht, die mit Chloroform vorbereitet war. Die Kolonne wurde mit Chloroform eluiert, und 15 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatografie auf Si 1icagelplatten (Merck 254) unter Elution mit einem 84/8/8-Volumengemisch aus Chloroform/Methanol/98%iger V/V-Anieisensäure auf die Anwesenheit der gewünschten Mithrarnycinprodukte untersucht. Die Fraktionen

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4*

50 bis 250, die dieses Produkt enthielten, wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, wobei 1,9 g eines rohen Gen»ischs aus Mithramycinen als gelbbrauner Feststoff erhalten wurde.

BEISPIEL 2

Eine Lösung von 3,4g des rohen Gemischs aus Mithramycinen von Beispiel 1 in wäßrigem Methanol wurde auf die Oberseite einer vorgequollenen Kolonne (28 χ 5 cm) von vernetzten! Dextran (Sephadex G-25-Warenzeichen) aufgegeben, und die Kolonne wurde mit Wasser eluiert. Das Mithramycin passierte die Kolonne als grünlich-gelbes, sich rasch bewegendes Band nach unten, und die entsprechende Fraktion des Eluats wurde gesammelt. Entweder wurde

A. das Eluat gefriergetrocknet, wobei gemischte Mithramycine als gelber, lyophilisierter Feststoff (2,5 g) erhalten wurden, oder wurde

B. das Eluat mit verdünnter Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei gemischte Mithramycine als gelbes Pulver (2,3 g), Fp 169-172°C, erhalten wurde.

Die so erhaltenen gemischten Mithramycine konnten in ein Magnesiumchelat der Hauptkomponente wie folgt überführt werden:

6 g Magnesiumsilicat ("Florisil" eingetragenes Warenzeichen) wurden zu einer Lösung von 4OO g der gemischten Mithramycine in Äthylacetat zugegeben, und das Äthylacetat wurde dann abgedampft. Das Magnesiumsilicat, welches die adsorbierten gemischten Mithramycine enthielt, wurde auf die Oberseite einer Kolonne (40 χ 2 cm) aufgegeben, die mit dem gleichen Magnesiimsilicat gepackt war und die Kolonne wurde aufeinanderfolgend

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r-

mit den folgenden Mitteln eluiert:

1) Äthylacetat

2) 5% V/V Methanol in ÄtWylacetat

3) 10% V/V Methanol in Äthylacetat

4) 15% V/V Methanol in Äthylacetat.

Die Fraktionen (3) und (4) wurden vereinigt, die Lösungsmittel wurden abgedampft und der Rückstand wurde aus t thanol/ Äthylacetat kristallisiert, wobei ein Magnesiumchelat in Form gelber Kristalle erhalten wurde, Fp 210-217 C Zersetzung,

23 ο /ß(.7_D = +85 (C = 0,5 in Methanol). Analyse: gefunden C = 56,0, H = 7,2. Berechnet für (C₅₂H₇₅O₃₄) ₂Mg. 2H,,0, C = 56,0, H = 7,0%. Diese Daten stimmen sehr gut mit den - jenigen überein, die in der US-PS 3 906 093 für das Magnesium- chelat von Mithramycin A beschrieben sind, das durch Fermentation von Streptomyces argillaceus ATCC 12956 oder S. plicatus ATCC 12957 erhalten wurde.

BEISPIEL 3

Eine Lösung von 250 mg des rohen Mithramycingemischs von Beispiel 1 wurde in der geringsten Menge Methanol aufgelöst und auf die Oberseite einer Silicagelkolonne (25 χ 2 cm) aufgegeben, die mit der Bodenphase eines Gemischs aus gleichen Volumina Chloroform, Methanol und Amnoniumhydroxydlösung vorbereitet worden war. Das gleiche Bodenphasengeirisch wurde zur Eluierung der Kolonne verwendet, und das hautpsächlich gelbe Band wurde gesammelt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei ein gelbes Pulver erhalten wurde, das in 10 ml Wasser aufgelöst wurde. Die Lösung wurde unter Verwendung von verdünnter Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt und mit 2mal je 15 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden zur Trockene eingedampft, wobei gemischte Mithramycine in Form

BAD ORIGINAL

3ο

eines gelben Pulvers (100 mg) erhalten wurden, Fp 169-172 C.

BEISPIEL 4

Gruppen von 20 willkürlich ausgewählten einen Tag alten Küken wurden in kleine Gehege eingebracht, die mit Holzwolle ausgebettet und mit einer automatischen Trinkanlage ausgerüstet waren. Die Küken in 16 willkürlich ausgewählten solchen Gehegen wurden 6 Tage mit einer nährwertmäßig ausgewogenen Vergleichsnahrung, die keinen Wachstumsförderer enthielt, gefüttert, und die Küken in anderen Gehegen (4 Gehege je behandelte Nahrung) wurden während der gleichen Zeit mit der gleichen Grundnahrung gefüttert, welcher das angegebene Gewicht von gemischten Mithramycinen, die gemäß Beispiel 2 oder 3 erhalten worden waren, oder eines bekannten Kükenwachstumsförderers, Penicillin oder Nitrovin, als positiver Vergleich, zugegeben worden war. Am Ende der Testperiode wurde das mittlere Gewicht je Küken in der Vergleichsgruppe und in jeder Testgruppe bestimmt, und die prozentuale Gewichtszunahme einer jeden Testgruppe wurde mit der Vergleichsgruppe verglichen. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	mittleres Endgewicht je Küken (g)	% Wirkung gegenüber Vergleich
Grundnahrung - Vergleich	38,15
Grundnahrung + 25 ppn Penicillin	42,57 ⁺	11 ,6
Grundnahrung +10 ppm Nitrovin	42,99 ⁺	12,7
Grundnahrung + 25 ppn gemischte Mithramycine	48,12 ⁺	26,1
Grundnahrung +10 ppn gemischte Mithramycine	46,12 ⁺	20,9

bedeutsam bei einem Wert p^.0,001.

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-ΚΑΙ

BEISPIEL 5

Bei einem weiteren Wachstumsversuch wurde das Verfahren von Beispiel 4 wiederholt. In diesem Fall wurden aber die Gewichte als mittleres Gesamtgewicht eines Geheges von 20 Küken ausgedrückt. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	mittleres Endgewicht von 20 Küken (q)	% Wirkung gegenüber Vergleich
Grundnahrung - Vergleich Grundnahrung + 25 ppm Penicillin Grundnahrung +10 ppm Nitrovin Grundnahrung +25 ppn gemischte Mithramycine Grundnahrung +10 ppm gemischte Mithramycine Grundnahrung + 5 ppn gemischte Mithramycine Grundnahrung + 2,5 ppn gemischte Mithramycine	7 40 876 826 984 926 825 792	18,25 11,6 32,8 24,6 11,5 7.0

BEISPIEL 6

In einem weiteren Wachstumsversuch wurde das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wiederholt, aber in diesem Fall wurden alle Nahrungen durch ein einfaches Preßverfahren pelletisiert, Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

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1%

Nahrung	mittleres Endgewicht von 20 Küken (g)	% Wirkung gegenüber Vergleich
Grundnahrung - Vergleich	774
Grundnahrung + 25 ppn genischte Mithramycine	1063	37,2
Grundnahrung + 10 ppn genischte Mithramycine	1047	35,3
Grundnahrung + 5 ppn genischte Mithramycine	920	18,9
Grundnahrung +2,5 ppn genischte Mithranycine	856	10,4
BEISPIEL 7

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei jedoch
die gemischten Mithramycine verwendet wurden, die durch Kultivierung von Streptomyces argillaceus A.T.C.C. 12956 in bekannter Weise erhalten worden waren. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	mittleres Endgewicht je Küken (g)	% Wirkung gegenüber Vergleich
Grundnahrung - Vergleich Grundnahrung +25 ppn Penicillin Grundnahrung + 10 ppn Nitrovin Grundnahrung + 25 ppn gemischte Mithranycine	40,1 47,6 45,2 46,4	18,8 12,9 15,9 I

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BEISPIEL 8

Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei das am Ende von Beispiel 2 beschriebene Magnesiumchelat verwendet wurde. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	mittleres Endgewicht je Küken (g)	% Wi] 'ing gegenu. /st Vergleich
Grundnahrung - Vergleich Grundnahrung + 25 ppm Penicillin Grundnahrung +10 ppm Nitrovin Grundnahrung +10 ppm Mg-Chelat Grundnahrung + 5 ppm Mg-Chelat Grundnahrung +2,5 ppn Mg-Chelat	41,30 47,95 ⁺ 45,67 ⁺ 49,65 ⁺ 47,97 ⁺ 43,65 """	16,1 ⁺ 10,6 ⁺ 20,2 ⁺ 16,2 ⁺ 5,7 ~

P <O,OO1

P<0,01

BEISPIEL 9

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei das Magnesiumchelat von Mithramycin A verwendet wurde, das in bekannter Weise aus der Fermentation von S. argillaceus A.T.C.C. 12956 erhalten worden war. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

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ι ι Nahrung	mittleres Endgewicht je Küken (g)	% Wirkung igegenüber Vergleich
Grundnahrung - Vergleich	41,30	MB
Grundnahrung + 25 ppn Penicillin	47,95 ⁺	16,1 ⁺
Grundnahrung + 10 ppn Nitrovin	45,67 ⁺	10,6 ⁺
Grundnahrung + 10 ppn Mg-Chelat	48,69 ⁺	17,9 ⁺
Grundnahrung +5 ppn Mg-Chelat	46,38 ⁺	12,3 ⁺
Grundnahrung + 2,5 ppn Mg-Chelat I	43,75 ⁺⁺ I	5,9 ⁺⁺

P < 0,001;

P< 0,01

BEISPIEL 10

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei vier Gehege von jeweils 30 als unbrauchbar aussortierten Hähnchen für jede Nahrung verwendet wurden und die Versuche 4 Wochen laufen gelassen wurden. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	mittleres Endgewicht je Küken (g)	Nahrungs- umwandlungs- verhältnis
Grundnahrung - Vergleich Grundnahrung + 10 ppn Nitrovin Grundnahrung +10 ppn ganischte Mithranycine Grundnahrung + 5' ppn gemischte Mithranycine	329 339 360 ⁺ 360 ⁺	1,876 1,800 ⁺⁺ 1,782 ⁺⁺ 1,789 ⁺⁺

bedeutsam beim Wert ρ ^0,01 bedeutsam beim Wert ρ< 0,001

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-2Λ-

BEISPIEL 11

72 Schweine mit einem Gewicht von jeweils annähernd 20 kg wurden auf der Basis von Geschlecht und Lebendgewicht in acht ausgewogenen Behandlungsgruppen aus jeweils 9 Schweinen unterteilt. Jede Behandlungsgruppe wurde auf eine bestimmte Diät gesetzt, und ein jedes Tier in einer jeden Gruppe wurde einzeln mit der entsprechenden Nahrung gefüttert, die gemäß einem Fütterungsschema, das auf dem Lebendgewicht basierte, genau gewogen und wöchentlich nachgestellt wurde. Die tägliche Lebendgewichtzunahme in Gramm (DLWG) und das Nahrungsujiwundlun-jsverhältnis (FCR, das Verhältnis von kg Nahrung je kg Lobendgewichtzunahme) wurde am Ende der neunwöchigen Versuchäpericde für jede Gruppe bestimmt. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Nahrung	DLWG	FCR	I ί	2,564
Nahrung mit wenig Kupfer		2,381
Grundnahrung - Vergleich	522,9	2,292
Grundnahrung +10 ppm Nitrovin	567,0	2,201⁺
Grundnahrung + 20 ppn Carbadox	630,6⁺
Grundnahrung + 25 ppm gemischte Mithranycine	640,2⁺⁺	2,349
Nahrung mit viel Kupfer		2,308
Grundnahrung - Vergleich	575,2	2,184 ⁺
Grundnahrung +10 ppm Nitrovin	579,2	2,245⁺
Grundnahrung + 2O ppm Carbadox	672,7⁺⁺
Grundnahrung + 25 ppm gemischte Mithramycine	612,8⁺

bedeutsam beim Wert p< 0,05
bedeutsam beim Wert ρ\ 0,01

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BAD ORIGINAL BEISPIEL 12

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei Chromomycin A,, das von Takeda Chemical Industries Ltd. Isaka, Japan erhalten worden war, anstelle der gemischten Mithramycine verwendet wurde. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

	mittleres	% Wirkung
Nahrung	Endgewicht	gegenüber
	je Küken	Vergleich
	(g)
Grundriahrung - Vergleich	41 ,46
Grundnahrung + 25 ppn Penicillin	46,73⁺	12,7
Grandnalirung + 10 ppn Nitrovin	45,46⁺	9,7
Grundnahrung + 10 ppn Chrananycin A~	43,68⁺⁺⁺	5,4
Grundnahrung + 5 ppm Chrananycin A₃	44,51⁺⁺	7,3

bedeutsam beim Wert p·. 0,001
bedeutsam beim Wert p< 0,01
bedeutsam beim Wert p<O,O5

BEISPIEL 13

4,2 g des kristallinen Magnesiumchelats von Beispiel 2 wurden in 100 ml Wasser aufgelöst, und der pH wurde durch sorgfältige Zugabe von 0,1 η Salzsäure auf 3,0 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wurde dann zweimal mit je 100 ml Äthylacetat extrahiert, der Extrakt wurde über Na₃SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde eingedampft, wobei ein gelber Gummi erhalten wurde.

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Beim Reiben mit Äther ergab der Gummi 2,5 g eines gelben Pulvers, das aus Äthylacetat kristallisiert und bei 100⁰C unter Hochvakuum getrocknet wurde.*" Es wurde ein Material irit einem Fp von 17 3-176°C erhalten, das mit Mithramycin A gemäß Infrarot- und NMR-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) identisch war.

BEISPIEL 14

1 1 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsbrühe wurde mit 20%iger Natriumchloridlösung geschüttelt, der pH wurde auf 3,5 eingestellt und das Gemisch wurde mit zweimal 300 ml Methyläthylketon extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und getrocknet, auf 10 ml konzentriert und mit 2 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung rückextrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann mit 5 ml Methanol behandelt. Es wurde eine feine Ausfällung von 30 mg Mithramycin-Natriumsalz erhalten.

BEISPIEL 15

Vorgemische, die sich für die Verdünnung mit Tiernahrung eignen, können dadurch hergestellt werden, daß man 1, 5, 10, 25 oder 50 g gemischte Mithramycine in eine Standardhühnchennahrung, die gemahlenes Mais- und Fischmehl unter Zusatz von Lysin, Methionin, Vitaminen und Mineralien enthält, so einverleibt, daß das Gewicht 500 g beträgt.

Andere Vorgemische können in ähnlicher Weise hergestellt werden, indem man die gemischten Mithramycine durch andere Verbindungen der Aureolsäuregruppe ersetzt.

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3515F-IEL lc

Vergerisehe, die sich für die Verdünnung mit einer Tiernahrung

eigner., kennen durcr. das Verfahren von Beispiel 15 hergestellt

weräer., wcbei jedoch gemahlener Kalkstein anstelle der Standard-

hü.-.ncr.enr.ar.rur.g verwendet wird.

EEISPIEL 17

Eire für die direkte Verfütterung an Geflügel geeignete Nahrung kann dadurch erhalten werden, da3 man innig SOO g eines Vor— gerisrns, das ger ä2 3eispiel 15 oder 16 erhalten werden ist, ~it 4,5 kg Siandardhühnchennahrung mischt und dar..: das se err.airene gleichfcrrr.ige Gemisch .-r.it 995 kg Standardhühnchenr.ahr-n? nischt, so daß eine Geflügelnahrung erhalten wird, die 1, 5, 10, 25 oder 50 g einer Verbindung der Aureolsäuregrjppe je Tenne, ze nach der Konzentration der Verbindung in verwendeten Vcrgerr.isch, enthält.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Tierzuchtverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß

man an fleischerzeugende Haustiere oral eine Verbin-un-j dar Aureolsäuregruppe verabreicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Aureolsäuregruppe oral an die Tiere als Ergänzung ihrer Nahrung verabreicht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Aureolsäuregruppe oral an die Tiere als Lösung im Trinkwasser verabreicht.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Aureolsäuregruppe oral an die Tiere als Lösung in Vollmilch oder Magermilch verabreicht.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Aureolsäuregruppe oral an die Tiere in Mischung mit ihrer nährwertmäßig ausgewogenen festen Nahrung verabreicht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die normale nährwertmäßig ausgewogene feste Nahrung mit 0,0001% G/G bis 0,005% G/G der Verbindung der Aureolsäuregruppe ergänzt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Aureolsäuregruppe das feste Mithramycin A oder das Magnesiumsalz, das Magnesium- chelat oder der Magnesiumkomplex von Mithramycin A ist.

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BAD ORIGINAL

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Aureolsäuregruppe ein Gemisch aus Mithramycinen ist.

"9) Zusammensetzung für die Verwendung beim Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Verbindung der Aureolsäuregruppe und einem flüssigen oder festen, verzehrbaren, nicht-giftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel besteht.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, da3 das flüssige, verzehrbare, nicht-giftige Verdünnungs mittel oder Trägermittel aus Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch besteht.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, welche sich für die direkte Verfütterung an Tiere eignet, dadurch gekennzeichnet, daß das feste, verzehrbare, nicht-giftige Verdünnungsmittel oder Trägermittel aus einer nährwertrnäßig ausgewogenen Tiernahrung besteht.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die nährwertmäßig ausgewogene Tiernahrung aus einer üblichen Standardhühnchennahrung von gemahlenen Körnern oder Körnernebenprodukten und tierischem Protein unter Ergänzung mit Vitaminen und Mineralien, aus einer handelsüblichen Standardschweinemastdiät oder aus einer anderen herkömmlichen Tiernahrung besteht.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,0001% G/G bis 0,005% G/G der Verbindung der Aureolsäuregruppe enthält.

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14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form eines konzentrierten Vorgemischs für die Verdünnung mit einer herkömmlichen Tiernahrung aufweist, mit welcher eine ergänzte Tiernahrung für die direkte Verfütterung an Tiere hergestellt werden kann.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das feste, verzehrbare, nicht-giftige Verdünnungsmittel oder Trägermittel aus einer nährwertmäßig ausgewogenen Tiernahrung, einem inerten festen Verdünnungsmittel ohne Nährwert, Stärke oder Lactose besteht.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nährwertmäßig ausgewogene Tiernahrung aus einer herkömmlichen Standardhühnchennahrung, einer herkömnlichen Standardschweinemastnahrung oder einer anderen herkömmlichen Tiernahrung besteht.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15,

dadurch gekennzeichnet, daß das inerte feste Verdünnungsmittel ohne Nährwert aus Kaolin, Talkum, Calciumcarbonat, Fuller'scher Erde, Attapulgitton, gemahlenen Austernschalen oder gemahlenem Kalkstein besteht.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,005% G/G bis 50% G/G einer Verbindung der Aureolsäuregruppe enthält.

19. Verfahren zur Herstellung einer festen Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Aureolsäuregruppe gleichmäßig in einem festen, nichtgiftigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel verteilt.

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-yi-

20. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Mithramycinen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mithramycin erzeugenden Stamm von Streptomyces pilosus in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter gerührten aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 15 und 45°C kultiviert, die Kultur filtriert und die saure Fraktion vom Filtrat durch herkömmliche Maßnahmen isoliert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß als Mithramycin erzeugender Stamm von Streptomyces pilosus derjenige verwendet wird, der in der National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG., Scotland unter der Bezeichnung NCIB 11238 deponiert ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, daß als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff Glycerin, Glucose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Galactose, Mannit oder Inosit verwendet wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß

das wäßrige Nährmedium 2 bis 5 % G/V Glycerin als assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält.

24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß

das wäßrige Nährmedium 0,5 bis 2% G/V Pepton als assimilierbare Stickstoffquelle enthält.

25. Verfahren zum Reinigen des sauren Produkts des Verfahrens nach Anspruch 2O, dadurch gekennzeichnet, daß man es in ein Magnesiumsalz, ein Magnesiumchelat oder einen Magnesiumkomplex überführt, indem man eine Lösung des sauren Produkts

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in einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel mit Magnesiumsilicat zusammenbringt.

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