AT392287B - Futterverwertung von wiederkaeuern - Google Patents

Description

AT 392 287 B

Die Erfindung betrifft die Herstellung von zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern verwendbaren Mikroorganismenkulturen.

Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Pansen von mit einem gegebenen Futter gefütterten Wiederkäuern Proben genommen werden, der Stoffwechsel der aus den Proben isolierten 5 Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht wird und von den Mikroorganismen, die fähig sind, im Pansen flüchtige Fettsäuren zu produzieren, auf einem Nährboden, der das jeweilige Futter als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur angelegt wird, in die wachsenden Mikroorganismenzellen; eine Selektion ermöglichende genetische Marker, vorzugsweise ein Antibiotikumresistenz-Marker eingeführt werden, die genetisch markierten Stämme gezüchtet und die Kulturen in den Pansen von mit dem jeweiligen Futter ernährten 10 Tieren zurückgebracht werden, aus den Pansen Proben genommen werden, die Anzahl der genetisch markierten Mikroorganismenzellen bestimmt wird, worauf die das Essigsäure-Propionsäure-Verhälmis auf 1,5-4,0:1 einstellenden und sich gleichzeitig im Pansen des Tieres auf dem gegebenen tierischen Nährstoff vermehrenden und sich mindestens 60 Tage lang haltenden Mikroorganismenstämme isoliert werden.

Die Tiere mit mehrteiligem Magen, wie Schaf (Ovis aries aries), Rind (Bos primigenius taurus), Ziege 15 (Capra hircus) bzw. ihre wild lebenden Verwandten (Hirsch, Reh, Mufflon usw.) spielen als Pflanzenfresser eine unentbehrliche Rolle in der Emährungskette. Sie haben große wirtschaftliche Bedeutung, da sie auch Futter verwerten können, das für andere Arten nicht nutzbar ist. Diese Tiere bauen in ihrem mehrteiligen Magen mittels ihrer eigenen, größtenteils auf dem Metabolismus von Mikroorganismen basierenden Verdauungsvorgänge aus pflanzlichen Stoffen vollwertige Nahrung auf. Die im Magen unter anaeroben Bedingungen lebenden 20 Mikroorganismen, die Pansenflora, paßt sich dem Futter an, das man dem Tier über längere Zeit verfüttert. So, wie sich Qualität und Zusammensetzung des verzehrten Futters ändern, ändert sich auch die Pansenflora. Die Veränderung der Pansenflora geht jedoch langsam vor sich, sie stabilisiert sich nach einer Futterveränderung erst nach Wochen. Dies beeinflußt die Fleisch- und Milchproduktion ungünstig, außerdem wird ein Teil des aufgenommenen Futters unverdaut oder in nicht völlig aufgeschlossener Form wieder ausgeschieden. Bei 25 schneller, rücksichtsloser Futterumstellung ist die Wirkung noch stärker, die Umstellung kann das Verenden, Erkranken des Tieres zur Folge haben.

Es ist weiterhin bekannt, daß sich im Wiederkäuerpansen pro Milliliter mehrere Millionen verschiedener Bakterien vermehren. Der unter anaeroben Bedingungen stattfindende Metabolismus der Bakterien ist unter dem Aspekt der geregelten Verdauung und Nahrungsaufnahme des Tieres von grundlegender Wichtigkeit. Die in den 30 Pansen gelangende Nahrung wird von den einzelligen Mikroorganismen in für das Tier verwertbare Verbindungen, z. B. in Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure usw., zerlegt. Die aus dem Pansen weitergelangende Biomasse findet dagegen an anderen Stellen des Verdauungstraktes, z. B. als Eiweißquelle, Verwendung. Für die Milchproduktion und die Fleischausbeute ist die Versorgung mit Essigsäure und Propionsäure bzw. das Verhälmis dieser beiden Verbindungen zueinander von grundlegender Wichtigkeit 35' Deshalb haben die sich im Wiederkäuerpansen vermehrenden Mikroorganismen eine sehr große Bedeutung im Leben des Tieres und sind daher in der Haltung von Nutztieren mit zusammengesetztem Magen von entscheidender Bedeutung. Die Mikroorganismenflora des Pansen bildet sich nach der Geburt spontan aus den in der aufgenommenen Nahrung bzw. im Trinkwasser enthaltenen Einzellern heraus und erfüllt dann in stabilisierter Form ihre Funktion. Es ist jedoch keineswegs sicher, daß die zufällig entstandene Mikroorganismenkultur mit 40 der bestmöglichen Wirksamkeit arbeitet. Es wäre sehr vorteilhaft, wenn ein Verfahren zur Verfügung stünde, das eine vom wirtschaftlichen Standpunkt aus vorteilhafte Herausbildung und Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden Mikroorganismenkultur ermöglicht.

Die Erhöhung der Produktion von flüchtigen Fettsäuren innerhalb der Pansen und dadurch die Steigerung der Futterverwertung, letztendlich jedoch der Milchproduktion oder der Fleischausbeute, ist ein seit langem 45 angestrebtes Ziel. Auf diesem Gebiet wurden bisher mit dem als Coccidiostatikum verwendeten Monensin bestimmte Ergebnisse erzielt (siehe US-PS 4 085 255). Es laufen Versuche mit anderen, dem Monensin verwandten Polyätherverbindungen, zum Beispiel mit Salinomycin, Lasalocid usw., ferner mit Phtalid-Derivaten (US-PS 4 333 923) und auch mitGlykopeptiden, wie mit Avoparcin, Actaplanin usw. (Ingle und Mitarb., Abstr. Am. Soc. Anim. Sei. 424/1978/). Die erreichten Wirkungen weichen jedoch bei verschiedenen Futtermitteln 50 stark voneinander ab und sind alles in allem nicht von Bedeutung (Chalupa, W., Chemical control of mmen microbial metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, MTP Press, Lancester, England, 1980 und Chalupa, W. und Mitarb.: Manipulating rumen fermentation with monensin and amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sei., 410 /1978/).

Weiters sind in der EP-Al-0019 809 Tierfuttergemische beschrieben worden, die außer dem Futter saure und 55 neutrale Proteasen, Antibiotika oder verschiedene organische Säuren als Zusätze enthalten. Die Proteasen werden mit Hilfe verschiedener Mikroorganismen hergestellt. Die Futtergemische werden allerdings nur zur Fütterung von verschiedenen Haustieren, wie Tageshühnchen, Ferkel oder Schweine, verwendet

Aus der DE-OS 22 33 523 ist eine Herstellung von Biomassen mit hohen Eiweißgehalten mit Hilfe von Pilzen, die aus dem Mageninhalt von Kaninchen isoliert werden, bekannt. Die Biomassen können als 60 Futterzusätze beim Füttern von Tieren mit einfachem Magen, wie z. B. Kaninchen oder Schweinen, verwendet werden.

Gemäß der GB-PS 2 026 027 können Tierfuttermittel mit Hilfe von thermophilen Bakterien hergestellt -2-

AT 392 287 B werden, wobei das Futter mit Hilfe von Bakterien aufbereitet wird. Auch dieses Futter wird nur an Schweine oder Geflügel verabreicht.

Aus der US-PS 4 243 685 ist eine Lösung zur Herstellung von Fermentationsnährböden, die der Züchtung von tierischer Futterhefe und zur Herstellung von Proteinen aus pflanzlichen Abfällen dienen kann, bekanntgeworden.

Gemäß AU-PS 507 926 können für Wiederkäuer unverdauliche pflanzliche Substanzen mittels z. B. alkoholische oder saure Gärung verursachenden Mikroorganismen zu einem für Wiederkäuer verdaulichen Futter fermentiert werden.

Alle hier behandelten Schriften diskutieren Probleme, welche in keinem Zusammenhang mit dem Ziel der vorliegenden Erfindung stehen, da sie sich alle nicht auf die effektive Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern beziehen.

Ein Verfahren, mit dem direkt durch Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden Mikroorganismenkultur Ergebnisse erzielt werden, ist bis zum heutigen Tage nicht bekannt geworden.

In eigenen Versuchen wurde nun festgestellt, daß zur Isolierung von Mikroorganismen, die sich in einem gegebenen Futter vermehren und vorteilhaft metabolisieren, die genetischen (gentechnologischen) Rekombinationsmethoden erfolgreich angewendet werden können. Diese Methoden ermöglichen, daß praktisch jeder beliebige Mikroorganismus mit einem genetischen Marker versehen werden kann, auf Grund dessen der betreffende Mikroorganismus neben anderen Mikroorganismen selektiv bestimmt werden kann. Der genetische Marker kann z. B. ein Gen sein, das die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum bestimmt. Zum Zweck der vom gegebenen Futter abhängigen, vorteilhaften Herausbildung der Mikroorganismenkultur des Pansen werden aus dem Pansen von Tieren mit zusammengesetztem Magen Mikroorganismen isoliert, die einzelnen Stämme genetisch gekennzeichnet, dann nach Anlegen einer Kultur in den Pansen zurückgebracht und ihr Vorhandensein durch von dort entnommene Proben unter selektiven Bedingungen bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß ein Teil der isolierten, in verschiedenen Tierfuttem in vitro fortpflanzungsfähigen und mit einem vorteilhaften Metabolismus ausgestatteten Bakterien überraschenderweise auch im Pansen des Tieres unter Verwertung des gegebenen Futters über lange Zeit die Fähigkeit zur Fortpflanzung und Erhaltung besitzt. Dadurch wird die Verdauung der Tiere und auf diese Weise die Futterverwertung günstig beeinflußt.

Was die Offenbarung der der Erfindung näher zu liegen scheinenden AU-PS 489 367 betrifft, so besteht das Wesen des dortigen Vorschlages darin, daß ein aus einem Futter mit gegebener Zusammensetzung hergestellter Nährboden mit einer aus dem Magen eines Wiederkäuers entnommenen Probe beimpft wird, dann die gemischte Population gezüchtet wird, bis man eine Kultur, die > 0,05 mg/ml Milchsäure und/oder > 3,5 mg/ml flüchtige Fettsäuren enthält, gewinnt. Daraus wird die Mikroorganismenmasse isoliert, und diese wird den Wiederkäuern gefüttert. Die erhaltenen Produkte enthalten verschiedene Mikroorganismenkulturen mit nicht reproduzierbarer Zusammensetzung, da sich die einzelnen Zellen in einer in vitro Kultur in Abhängigkeit vom verwendeten Inokulum entwickeln und vermehren.

Im Gegensatz dazu ist das erfindungsgemäße Verfahren bzw. das danach erhältliche Präparat in Abhängigkeit von der Produktionsrichtung, wie z. B. Milchproduktion oder Fleischproduktion, gezielt auf die Erhöhung des Essigsäure-Propionsäure - oder Propionsäure-Essigsäure Verhältnisses mittels eines gegebenen - hinsichtlich Stabilität, Toxizität usw. definierten und im Magen lange Zeit bestehenden - Mikroorganismus gerichtet. Es ermöglicht durch Einführen des genetischen Markers die Isolierung individueller Mikroorganismen und auf diese Weise die Herstellung von Mikroorganismenpräparaten mit konstanter Zusammensetzung und somit kontrolliertem Wirkstoff. Die mit den erfindungsgemäß erhältlichen Kulturen herstellbaren Präparate sind also völlig verschieden von jenen gemäß der Lehre der AU-PS 489 367, da das Verfahren von der Isolierung bis zum Füttern durchgehend gut definiert und unter Kontrolle zu halten ist und somit gut reproduzierbare Ergebnisse liefert.

Es ist also festzuhalten, daß gemäß AU-PS 4 89 367 die Pansenprobe im Wesen in vitro weitergezüchtet wird, was im wesentlichen dem Verfahren entspricht, das seit Jahrhunderten geübt wird; der Panseninhalt wird dem Wiederkäuer verabreicht. Dies kann aber für die Tiere gefährlich sein, weil hiebei nicht kontrolliert wird, ob die gefressene Kultur pathogene Mikroorganismen enthält.

Erfindungsgemäß wird hingegen ein gegebener Mikroorganismus angewendet, der zur Erhöhung des Verhältnisses Essigsäure/Propionsäure oder Propionsäure/Essigsäure in Abhängigkeit von der gewünschten Produktion, z. B. Milch- oder Fleischproduktion, mit definierbarer Stabilität und Toxität befähigt ist und sich im Pansen kontrollierbar für lange Zeit erhält.

Gegenstand der Erfindung ist weiters ein Präparat zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es neben gegebenenfalls in der Tierzucht und zur Fütterung üblichen Trägerstoffen, Verdünnungs- und/oder Konservierungsmitteln und/oder anderen üblicherweise an Wiederkäuer verabreichten Stoffen als Wirkstoff eine, wie einleitend angegebene, erfindungsgemäß hergestellte Mikroorganismenkultur enthält.

Bevorzugt sind, solche Präparate in welchen der Wirkstoff höchstens an einer Menge von 95 Gew.% enthalten ist. Für Präparate zur Erhöhung der Fleischausbeute ist es vorteilhaft, als Wirkstoff Mikroorganismenkulturen zu verwenden, die das Verhältnis Essigsäure:Propionsäure auf einen Bereich von 2,0-3,5:1, z. B. auf einen Wert von -3-

AT 392 287 B 2:1, einstellen können. Für die Milchproduktion beträgt der Optimalwert des Essigsäure-Propionsäure-Verhältnisses etwa 3,0:1, für Trächtigkeit 4,0:1, während der Wert bei der Aufzucht von Färsen 2,0-3,0:1 beträgt. Deshalb ist es vorteilhaft, für den jeweiligen Zweck Präparate zu verwenden, die Mikroorganismenkulturen enthalten, welche das Essigsäure:Propionsäure-Verhältnis auf den jeweils gewünschten Wert einstellen können. In der Fachliteratur gibt es im Zusammenhang mit dem Essigsäure:Propionsäure-Verhältnis noch Unklarheiten, die Wahl des vorteilhaftesten Verhältnisses ist Aufgabe des Fachmannes und hängt von der Art des Wiederkäuers, vom verwendeten Futter und anderen ähnlichen Faktoren ab. (Fachliteratur dazu siehe: Kaufmann, W., Rohr, K.: Der Einfluß des Futters auf die bakterielle Fermentation in Vormägen, Handbuch der Tieremährung, S. 263, 1969, Parey, Hamburg, Berlin).

Aus den Pansen werden von Zeit zu Zeit Proben genommen, und die Zahl der genetisch markierten Mikroorganismen wird bestimmt, dann werden diejenigen Stämme, die mindestens 60 Tage am Leben bleiben und das Gewichtsverhältnis von Essigsäure und Propionsäure auf eine Optimalwert, vorzugsweise auf 1,54,0:1, einstellen können, isoliert, und gewünschtenfalls nach Anlegen einer Kultur in einer vom Standpunkt der Tierzucht und Fütterung aus verträglichen Form formuliert.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen aus dem Pansen von mit cellulosehaltigem Futter, vorzugsweise Getreideprodukten, gefütterten oder Mono-und/oder Disaccharide enthaltendem Futter, vorzugsweise Melasse, gefutterten Tieren isoliert, dann die genetisch markierten Stämme zum Zwecke von Untersuchungen in den Pansen der mit einem der obigen Futter gefütterten Tiere zurückgebracht. Aus dem Pansen der wie oben angeführt gefütterten Tiere werden durch eine dorthin operierte Fistel Proben genommen, und die die Pansenbakterien enthaltenden Kulturen werden auf einem festen Nährboden, der eine Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und Agar (Bryant und Burkey, J. Dairy Sei., 26,205 /1953/) enthält, selektiert Die Kulturen werden unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die getrennt aufwachsenden Kolonien auf Nährböden ähnlicher Zusammensetzung isoliert und gezüchtet.

Mit den ausgewachsenen Kulturen werden flüssige Nährböden, die eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit, weiterhin als Kohlenstoffquelle Heu oder Cellulose bzw. Hafer oder Melasse enthalten, geimpft. Unter anaeroben Bedingungen wird so lange inkubiert, bis auf den Nährböden ein intensives Wachstum zu beobachten ist.

Die an als Kohlenstoffquelle Heu (Cellulose), Getreide (Stärke) bzw. Melasse (Saccharose) enthaltenden Medien wachstumsfähigen Zellen werden nach Selektieren und Anlegen einer Kultur auf einem festen Nährboden mit der obigen Zusammensetzung - als Kohlenstoffquelle Cellulose bzw. im Falle der in Gegenwart von Getreide und Melasse gewachsenen Zellen Glucose oder Saccharose enthaltend - isoliert

Die so erhaltenen Kulturen werden genetisch markiert. Als Markierung kann ein beliebiger, sich vererbender genetischer Marker verwendet werden, der den Nachweis der gekennzeichneten Mikroorganismen unter anderen Einzellern ermöglicht.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden resistenzbestimmende Gene in die ausgewählten Zellen gebracht. Wenn die im Pansen lebenden Bakterien einem bestimmten Antibiotikum gegenüber empfindlich sind und dem gleichen Antibiotikum gegenüber resistente Bakterien unter sie gebracht werden, können die Vermehrung und das Absterben dieser letzteren Mikroorganismen gut verfolgt werden, indem die Proben auf einem das betreffende Antibiotikum enthaltenden Nährboden selektiert werden. In diesem Fall werden nur die resistenten Zellen wachsen.

In die ausgewählten, auf Cellulose, Getreideprodukten bzw. Melasse wachstumsfähigen Kulturen gibt man auf dem Wege der Transformation (Bergmans und Mitarb., J. Bacteriol., 146.564 /1981/) das Plasmid plOl 1, das die Resistenz gegenüber den Antibiotika Kanamycin und Chloramphenicol bestimmende Gene trägt (Simon und Mitarb., Proc. of the 8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Maitobe Press, /1983/). Die Plasmid-DNS wurde aus Zellen von Escherichia coli isoliert (Bimboim und Doly, Nucl. Acids. Res., 7 1513 /179/). Der Stamm ist unter der Nummer 00264 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert.

Nach der Transformation der DNS, die die Antibiotikaresistenz bestimmenden Gene enthält, werden die Zellen, welche die neue genetische Information stabil enthalten und exprimieren, auf einem festen Nährboden von obiger Zusammensetzung, der mit Kanamycin ergänzt wurde, selektiert. Die resistenten Stämme werden gespeichert.

Mit den isolierten und gespeicherten Kulturen wird ein Nährboden beimpft, der eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und die für eine halbfeste Konsistenz notwendige Agarmenge, weiterhin als Kohlenstoffquelle Cellulose bzw. Glucose enthält. Die Kultur wird unter anaeroben Bedingungen 2-6 Tage lang inkubiert. Die ausgewachsenen Kulturen werden unter das Futter von einen Tag lang nicht gefütterten Schafen gemischt und den Tieren verfüttert. Vor dem Füttern, danach täglich, wird eine Probe aus dem Pansen entnommen. Die Proben werden auf einem festen Nährboden von obiger Zusammensetzung, der durch Kanamycin ergänzt wurde, selektiert, und es wird die Zahl der im Magen lebenden, gegenüber Antibiotika empfindlichen bzw. resistenten Mikroorganismuszellen bestimmt. Weiterhin werden Art und Menge der während der metabolischen Vorgänge der Mikroorganismen im Pansen entstehenden flüchtigen Fettsäuren bestimmt. Es ist bekannt, daß das Verhältnis dieser zueinander die Futterverwertung der Wiederkäuer beeinflußt -4-

AT 392 287 B (Eskeland und Mitarb., J. An. Sei., 21, 282 /1971/ und Church und Mitarbeiter, Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Band 2, S. 622-625 /1971/). Wie bereits erwähnt, ist das gewünschte Verhältnis Essigsäure:Propionsäure bei der Mast 2,0-3,5:1, z. B. 2:1, bei der Milchproduktion etwa 3:1, im Falle normaler Tierhaltung bzw. Trächtigkeit etwa 4:1.

Vorteilhaft werden diese Bestimmungen durchgeführt, indem man aus der dem Pansen entnommenen Probe Bakterien isoliert und die Fähigkeit der einzelnen Isolate zur Biosynthese der flüchtigen Fettsäure untersucht. Auf einem mit durch das jeweilige Futter ergänzten, Pansenflüssigkeit enthaltenden kompletten Nährboden wird unter anaeroben Bedingungen eine Mikroorganismenkultur angelegt, dann wird mittels gaschromatographischer Analyse die Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäurekonzentration der Kultur bestimmt. Die Mikroorganismuszellen, die die genannten organischen Säuren in einem vorteilhaften Verhältnis produzieren, werden genetisch markiert, dann wird ihre Vermehrung im Wiederkäuerpansen untersucht.

Die Stämme, die mindestens 60 Tage lang im Pansen des mit dem jeweiligen Futter gefütterten Tieres teilungsfähig sind und den Abbau der im Futter enthaltenen Kohlenhydrate zu Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure günstig beeinflussen, werden ausgewählt, gezüchtet, getrennt, konserviert, gespeichert, und ihre Kulturen können gewünschtenfalls, in eine für die Tierzucht annehmbare Form gebracht, den Wiederkäuern zum Zwecke einer günstigen Herausbildung und Beeinflussung der Pansenflora oral verabreicht werden.

Drei Stämme, die im Pansen von mit Heu, Getreide bzw. Melasse gefütterten Tieren fortpflanzungsfähig sind und über lange Zeit am Leben blieben und die Verdauung günstig beeinflussen (mit Hh-GYOKI-1-123 Sz, Hh-GYOKI-2-14Ab bzw. Hh-GYOKI-3-81Me bezeichnet), sind unter den Nummern 00287,00288 bzw. 00289 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. Dementsprechend sind erfindungsgemäße Präparate bevorzugt, welche eine Kultur zumindest eines der genannten 3 Stämme enthält.

Das Anlegen einer aus dem Pansen stammenden Mikroorganismenkultur erfolgt im Sinne der Erfindung auf Nährböden, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Salze, den entsprechenden reduzierten Zustand des Nährbodens gewährleistende Salze und die aus unbekannten Gründen für die Zellteilung von Fall zu Fall unentbehrliche Pansenflüssigkeit enthalten, unter anaeroben Bedingungen, unter Ausschluß von Sauerstoff, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 32 °C und 37 °C. Als Kohlenstoffquelle werden vorzugsweise Glucose, Cellulose oder diese als Metaboliten bildende andere Zuschlagstoffe, z. B. Heu, Getreide oder Melasse, verwendet Als Stickstoffquelle können anorganische Salze oder organische Stoffe z. B. Hefeextrakt, Casein oder ähnliches zum Nährboden gegeben werden.

Ein wesentlicher Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß für die Beeinflussung der Pansenflora der Wiederkäuer Einzeller verwendet werden, die ein bestimmtes Futter vorteilhaft metabolisieren können und unter den Verhältnissen des Pansens lange Zeit lebensfähig bleiben. Für die Auswahl solcher Bakterien werden, wie schon erwähnt, für Selektionen geeignete genetische Marker verwendet Ein derartiger genetischer Marker kann z. B. ein Resistenz gegenüber einem Antibiotikum aufweisendes Gen sein, aber es kann auch ein Gen sein, das z. B. ein beliebiges Enzym oder ein biologisch inaktives, aber durch eine Reaktion nachweisbares Eiweiß exprimierL Es können auch auxotrophe Zellen verwendet werden.

Der genetische Marker wird mit Hilfe eines Vektor-DNS-Moleküls, z. B. mit einem Plasmid oder einem Phagen, in die Zelle eingeführt, aber auch durch spontane Selektion kann eine bestimmte selektierbare Eigenschaft, z. B. Antibiotikaresistenz, ausgelöst werden.

Die ausgewählte, im Pansen eines Wiederkäuers vorteilhaft metabolisierende und dort lange Zeit am Leben bleibende Kultur kann dem Tier zur Herausbildung der Pansenflora nach der Geburt oder zur günstigen Beeinflussung der im Pansen von Tieren mit bereits ausgebildeter Pansenflora lebenden Mikroorganismenzusammensetzung in Form eines zweckmäßigen Präparates oral verabreicht werden. Es ist zweckmäßig, das Präparat zusammen mit dem Futter oder Trinkwasser zu verabreichen.

Zur Herstellung der zu verabreichenden Kultur wird von dem ausgewählten Mikroorganismus auf einem Nährboden, der eine organische Kohlenstoffquelle und eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und organische oder anorganische Salze enthält, eine Kultur angelegt, dann werden die Mikroorganismen in zur Verabreichung und zum Transport geeigneter Form getrennt und gewünschtenfalls mit festen oder flüssigen Trägerstoffen und gegebenenfalls mit übrigen Zusätzen vermischt und formuliert. Die auf diese Weise erhaltenen Präparate können in das Futter und Trinkwasser der Tiere gemischt oder auch selbständig gegeben werden.

Im Fall von Schafen werden zum Beispiel im allgemeinen täglich zu 0,5 kg üblicher Nahrung 1 - 20 g, vorzugsweise 5 g der erfindungsgemäß erhältlichen Mikroorganismenkultur gegeben. Das Futter kann beispielsweise ein Gemisch aus Maisschrot, Luzemeheu und Mastfutter sein, wobei die genauen Verhältnisse entsprechend den jeweiligen Umständen und unter Berücksichtigung der angestrebten täglichen Gewichtszunahme festgelegt werden müssen. Im Fall von Kühen ist im allgemeinen die Gabe von 10 - 200 g, vorzugsweise von etwa 50 g erfindungsgemäß erhaltener Mikroorganismenkultur zweckmäßig, z. B. mit etwa 5 kg üblicher Nahrung vermischt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren, das zur Verbesserung der Nahrungsverwertung von Wiederkäuern dient. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß diesen Tieren eine wirksame Menge der wie oben beschrieben hergestellten Mikroorganismuskultur verabreicht wird. Dabei sind Kulturen der 3 oben mit Hinterlegungsnummem genau angebenen Stämme besonders bevorzugt. -5-

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Aus der mittels der bereits früher erwähnten Fermentation erhaltenen Fermentbrühe werden auf bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtern, die Mikroorganismuszellen abgetrennt. Aus den abgetrennten Zellen können unter anderem Mikroorganismen-Pasten, gefriergetrocknete Präparate, Sporen oder vegetative Formen enthaltende Suspensionen hergestellt werden, dazu werden die für die Tierhaltung und Tierfütterung annehmbaren Zuschlagstoffe gegeben. Zu den Präparaten können auch die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen erhaltende ergänzende Zuschlagstoffe gegeben werden, z. B. Eiweiße, Aminosäuren oder beispielsweise Glycerin. Zu den zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern anwendbaren erfindungsgemäßen Präparaten können außer den oben genannten Substanzen auch in der Praxis verwendete und Wiederkäuern verabreichte Stoffe, beispielsweise Antibiotika wie Monenzin, Nigericin, Salinomycin usw., gegeben werden, ferner können auch solche Stoffe dosiert werden, z. B. auch Antibiotika, die die Erhaltung der verabreichten Mikroorganismen im Pansen begünstigen.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mikroorganismenkulturen ermöglichen demnach, daß sich mit ihrer Hilfe im Wiederkäuerpansen eine lebende Mikroorganismenkultur herausbildet, die die Verdauung der Tiere günstig beeinflußt, bzw. daß sich die bereits vorhandene vorteilhaft verändert. Während der Säugezeit befindet sich im Wiederkäuerpansen keine zur Metallisierung des Futters geeignete Mikroorganismenflora, diese entsteht spontan, zufällig und ist keineswegs mit Sicherheit vorteilhaft. Durch gezielte Fütterung mit vorher bestimmten Bakterien kann anstelle der langsamen, spontanen Herausbildung der Pansenflora schnell und in vorteilhafter Zusammensetzung sofort eine fertige Mikroflora gebildet werden, die zur optimalen Verwertung des gegebenen Futters geeignet ist.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß mit den gemäß der Beschreibung hergestellten Mikroorganismen (z. B. den Stämmen 00287,00288,00289) bei Änderung des Futters bzw. nach der Säugeperiode die schnelle Anpassung der Pansenflora bzw. ihre Herausbildung begünstigt wird, indem sich im Pansen Mikroorganismen vermehren, die das Futter optimal abbauen können.

Die erfindungsgemäßen Präparate werden beispielsweise in den hier nur zum besseren Verständnis dargelegten und nicht als Einschränkung zu betrachtenden folgenden Fällen angewendet. Für Rinder bei der Milchproduktion zur jahreszeitlichen Futterumstellung, in den verschiedenen Phasen der Milchproduktion, am Ende der Trächtigkeit, bei der physiologischen Futterumstellung, bei betriebsbedingten Futterumstellungen usw. In der Fleischproduktion bei Änderung der Mastmethode, bei auf Massenfutter basierender Mast oder bei intensiverer, auf Getreidefutter basierender Haltung, bei Beginn des Austreibens, bei Veränderung da Weide usw.

In der Schafhaltung bei jahreszeitlich bedingter Futterumstellung (Herbst-Winter-Sommer-Frühlings-Fütterung), bei Beginn der Weide, bei intensiver Aufzucht. Ähnlich ist die Situation bei der in Ungarn weniger verbreiteten Ziegenzucht. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mikroorganismenkulturen können jedoch auch in einigen Spezialfällen bei wild lebenden Wiederkäuern, bei der Tierhaltung in Wildgärten oder in der Damwildzucht angewendet werden.

Es ist zu bemerken, daß - obwohl in den erfindungsgemäßen Präparaten vorzugsweise Mikroorganismenkulturen aus dem Pansen verwendet werden - auch andere Essigsäure und/oder Propionsäure produzierende Bakterien, die nicht unbedingt aus dem Pansen stammen, zu diesem Zweck verwendet werden können.

Dies sind z. B. Angehörige der Stämme Angerovibrio (lipolytica), Bacteroides, Sclenamonas (ruminanticum) und Propionibacterium.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit den nachstehenden Beispielen veranschaulicht. Die Herstellung und Verwendung von Mikroorganismen, die drei Grundfutter, nämlich das cellulosehaltige Heu, das hauptsächlich Stärke enthaltende Getreidefutter und die Melasse, verwerten können und im Pansen über lange Zeit am Leben bleiben, werden für Schafe detailliert angegeben, der Schutzumfang der Erfindung erstreckt sich jedoch selbstverständlich auch auf die Herstellung von in anderen Futtermitteln wachstumsfähigen Mikroorganismen und Präparaten sowie deren Anwendung zur Herausbildung oder Beeinflussung der Pansenflora von anderen Wiederkäuern.

Beispiel 1

Beeinflussung der Pansenflora von mit Heu gefütterten Tieren A) Isolierung von bei Heufutter wachstumsfähigen Mikroorganismen

Schafe werden einen Monat lang mit Heu gefüttert, dann wird an der operativ in den Pansen eingeführten verschließbaren Fistel eine Probe genommen. Die Probe wird direkt nach ihrer Entnahme auf einem Nährboden von nachstehender Zusammensetzung selektiert, nach Verdünnung: -6-

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Salzlösung I. 7,5 ml Dikaliumhydrogenphosphat 0,6 g dest. Wasser ad 100 ml Salzlösung II. 7,5 ml Natriumchlorid 1,2 g Diammoniumsulfat 1,2 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,6 g Ca Calciumchlorid 0,12 g Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,25 g dest. Wasser ad 100 ml Resazurin 0,1 %ige Lösung 0,1 ml Agar(Bacto)+ 2,5 g Pansenflüssigkeit++ 10,0 ml Glucose 0,05 g Cellobiose 0,05 g Cystein-hydrochlorid-monohydrat 0,05 g Natriumcarbonat, 8 %ige Lösung 5,0 ml dest. Wasser ad 100 ml. Bezeichnung des Nährbodens: RGCA

+ Difco Laboratories, Detroit, USA ++ Die aus dem Pansen entnommene Probe wird durch ein lockeres Gazefilter filtriert, das Filtrat wird dann unter COj bei einer Temperatur von -20 °C gelagert.

Der pH-Wert des Nährbodens wird auf 6,8 eingestellt, dann wird sterilisiert. Die Sterilisation wird unter CC^-Atmosphäre durchgeführt. Sterilisation, Nährbodenbereitung und Züchtung erfolgen nach Bryant und Burkey (J. Dairy Sei., 26, 205 /1953/).

Verdünnt wird mit einem sterilen Gemisch folgender Zusammensetzung:

Salzlösung I (siehe oben) 7,5 ml

Salzlösung Π (siehe oben) 7,5 ml

Cystein-hydrochlorid-monohydrat 0,05 g

Natriumcarbonat 0,3 g

Resazurin, 0,1 %ige Lösung 0,1 ml

dest. Wasser ad 100 ml. Bezeichnung des Gemisches: HB

Die Kulturen werden bei 35 °C unter anaeroben Bedingungen (siehe Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto und Imai, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, /1981/) 120 Stunden lang inkubiert, dann wird mit den einzelnen Kolonien ein Heuextrakt enthaltender Nährboden von folgender Zusammensetzung geimpft:

Salzlösung I (siehe oben) Salzlösung Π (siehe oben) Resazurin, 0,1 %ige Lösung Tripton L42 (Oxoid)+ Hefeextrakt (Oxoid)+ Pansenflüssigkeit++ Natriumcarbonat Cystein-hydrochlorid-monohydrat HeuextraktH1 15.0 % 15.0 % 0,1 % 1,5% 0,5 % 10.0 % 0,4% 0,05 %

10,0 % Zeichen: RGCF + Oxoid Limited, London, Anglia. ++ Siehe oben +++ Zur Herstellung des Heuextraktes werden kleingeschnittene Pflanzenteile in Wasser suspendiert, gekocht und dann abfiltriert. Der Filteirückstand wird vor dem Sterilisieren zum Nährboden gegeben.

Der pH-Wert des Nährbodens wird mit Salzsäure auf 6,5 eingestellt, dann wird sterilisiert.

Die in Reagenzgläsern sterilisierten Nährböden von 5 ml Volumen werden mit einer Zellsuspension, die aus auf dem festen Nährboden RGGA aufgewachsenen, isolierten Kolonien gewonnen wurde, geimpft. Die Kulturen werden 5 Tage lang bei 35 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Das Wachstum wird durch mikroskopische -7-

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Untersuchungen überprüft, dann wird die Kultur auf dem Nährboden RGCA der angegebenen Zusammensetzung selektiert, es werden jedoch weder Glucose noch Cellobiose in den Nährboden gegeben, statt dessen werden 2 % Bacto Cellulose eingesetzt.

Die Kulturen werden bei einer Temperatur von 35 °C 120 Stunden lang inkubiert, dann werden die einzelnen Kolonien, die sich aus den zur Celluloseverwerkung fähigen Zellen entwickelt haben, auf die cellulosehaltigen RGCA-Nährboden isoliert.

Auf diese Weise werden aus dem Pansen stammende Mikroorganismen gewonnen, die auf Heu bzw. Cellulose wachstumsfähig sind. B) Markierung von heuabbauenden Magenbakterien

Die genetische Markierung erfolgt mit dem Escherichia coli Plasmid plOll (Simon und Mitarb., Proc. of the Eight North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada: Univ. of Maniota Press, /1983f) in an sich bekannter Weise. Aus der e. coli-Kultur wird nach Bimboim und Doily (Nucl. Acids Res., 2,1513 /1979/) die Plasmid-DNS isoliert und in einem Gemisch der folgenden Zusammensetzung gelöst: 75 raM Calciumchlorid 5 mM Magnesiumchlorid 10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer+ pH 7,5 + (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-hydrochlorid

Nach den Angaben in Punkt A des Beispiels 1 werden auf Heu wachstumsfähige Mikroorganismen auf dem Nährboden RGCF (siehe Beispiel 1 Punkt A) gezüchtet und durch Zentrifugieren unter CO2 abgetrennt. Die

Zellen werden in einem Gemisch folgender Zusammensetzung suspendiert: 75 mM Calciumchlorid 5 mM Magnesiumchlorid 10 mM TRIS-Hydrochlorid-Puffer pH 7,5 1 mM Cystein-hydrochlorid-monohydrat 1 mM Natriumthiosulfat.

Die Suspensionen enthalten 5x10^ Zellen pro Milliliter. Die Zellsuspensionen werden im Verhältnis 1:1 (0,1 μg/μl) mit dem die plOl 1 Plasmid-DNS enthaltenden Gemisch verdünnt und dann bei einer Temperatur von 4 °C 60 Minuten lang inkubiert. Die Inkubation wird danach zwei Minuten lang bei einer Temperatur von 41 °C fortgesetzt, darauffolgend wird die Kultur auf feste Nährböden, die als Kohlenstoffquelle Cellulose enthalten, ausgestrichen, und zu den Nährböden werden vor der Sterilisation 500 μg/ml Kanamycin B gegeben. Die Kulturen werden 120 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 °C und unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die in Gegenwart von 500 μg/ml Kanamycin B wachstumsfähigen Kolonien untersucht

Das Plasmid plOll trägt Kanamycin- und Chloramphenicolresistenz bestimmende Gene, enthält weiterhin das in den Zellen von E. Coli die Replikation erlaubende Replikationsorigo. Da die Plasmid-DNS über kein entsprechendes Replikationsorigo verfügt wird sie - nachdem sie in ein anderes Bakterium gelangt ist - entweder eliminiert oder aber ganz oder teilweise in das Chromosom eingebaut es findet eine genetische Rekombination statt. Das in das Chromosom eingebaute Gen wird im günstigen Fall manifest und sichert Resistenz gegen Kanamycin bzw. Chloramphenicol.

Während dieser Versuche entstanden gegenüber Kanamycin B resistente Kolonien, die Transformationsfrequenz betrug 3 x loA

Einige resistente Kolonien wurden isoliert, und es wurde die Antibiotika-Empfindlichkeit der Ausgangsstämme und der gegenüber Kanamycin B resistenten (Km ) Stämme bestimmt. Die bei einigen Stämmen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. -8-

AT 392 287 B

Tabelle 1

Kftnamvcin B-EmpfindlichkeitderPansenhakterien und der genetisch markierten, heiiahhauenden Stämme

Mikroorganismus Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B Mfi/ml Panseninhalt 31 Ausgangsstämme 4,0 - 7,5 Genetisch markierte Km**-Stämme Hh-GYOKI-1-8 500 -27 250 -91 500 -123 1000 -142 500

Auf diese Weise erhält man Mikroorganismen, die aus dem Pansen stammen und fähig sind, Heu oder Cellulose zu verwerten. Sie sind in Gegenwart einer bedeutenden Menge Kanamycin B wachstumsfähig.

Der Stamm Hh-GYOKI-1-123 (Km**) wird auf dem cellulosehaltigen Nährboden RGCA ausgestrichen, und zu den Nährböden werden 1000, 5000 bzw. 10000 μg/ml Kanamycin B gegeben. Die Kulturen werden 168 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die in Gegenwart von 1000 μg/ml Antibiotikum wachsenden Stämme isoliert. Auf diese Weise erhält man durch spontane Selektion aus dem Stamm Hh-GYOKI-1-123 Kanamycin B gegenüber in starkem Maße resistente spontane Mutanten. Der eine Stamm erhielt die Bezeichnung Hh-GYOKI-l-123Sz und wurde in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. C) Das Wiedereinbringen der genetisch markierten Mikroorganismen in den Pansen Mit der Kultur des auf Schrägagar bei + 4 °C gelagerten Stammes Hh-GYOKI-1-123 (Km**) wird der sterile Nährboden RGCFa von folgender Zusammensetzung beimpft: 1. Dikalium-hydrogen-phosphat 03 % 2. Diammoniumsulfat Natriumchlorid Magnesiumsulfat-monohydrat Calciumchlorid-dihydrat Kalium-dihydrogen-phosphat 3. Bacto-Cellulose+ Agar (Bacto)+ 4. Hefeextrakt 5. Cystein-hydrochlorid-monohydrat 6. Natriumthiosulfat Natriumcarbonat 7. Pansenflüssigkeit++ + Difco Laboratories, Detroit, USA ++ Siehe oben. 45 ml Lösung 45 ml Gemisch 65 ml Gemisch 20 ml Gemisch 20 ml Lösung 20 ml Lösung 20 ml

Die angegebenen Mengen der sieben gesondert hergestellten Gemische werden in der angegebenen Reihenfolge miteinander vermischt.

Das Anlegen der Kultur findet unter anaeroben Bedingungen in Kolben mit einem Volumen von 500 ml statt, die 150 ml Nährmedium enthalten. Nach 48 Stunden wird das Wachstum kontrolliert, dann wird die Kultur in das Futter von Schafen gemischt, die mit Heu gefüttert werden. Vor der Gabe und an den darauffolgenden Tagen werden an der in den Pansen einoperierten Fistel Proben genommen, das Volumen der Proben beträgt 50-200 ml.

Die Proben werden nach entsprechender Verdünnung mit HB-Lösung auf RGCA-Nährböden ausgestrichen, die -9-

AT 392 287 B kein Kanamycin und Antibiotikum enthalten. Die Kulturen werden 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 °C und unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Zahl der entwickelten Bakterienkolonien bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Veränderungen der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-1-123 (Km^l behandelten Tieren Dem Tier wurden oral 340 ml Kultur verabreicht, die 4,7x10^ Bakterien pro Milliliter enthält.

Zellenzahl/ml Probe ohne Antibiotikum in Gegenwart von 1000 pg/m 1 Kanamycin B Vor der Gabe: Nach der Gabe: 1,4 x 106 0 1. Tag 5x 106 2,0 x 104 2. Tag 5,9 x 106 4,1 x 104 3. Tag 3,2 x 107 3,1 x 104 6. Tag 2,4 x 106 1,8 x 104 8. Tag 3,9 x 107 1,05 x 105 15. Tag 9,8 x 106 3,1 x 104 28. Tag 8,1 x 105 8,1 x 104 35. Tag 8,7 x 106 1,8 x 104

Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen ist und sich vermehrt

Nach den obigen Angaben wurde eine Mikroorganismenkultur Hh-GYOKI-l-123-Sz gezüchtet, die gegenüber 10000 μg/ml Kanamycin B resistent ist, und den Tieren am 15. Tag verabreicht Nach der Züchtung der Proben auf die beschriebene Weise erhielt man die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse.

Tabelle 3

Veränderung der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz (Km**! behandelten Tieren

Q

Dem Tier wurden oral 140 ml Kultur verabreicht, die 2 x 10 Zellen pro Milliliter enthielt

Zellenzahl/ml Probe ohne Antibiotikum in Gegenwart von 8000 pg/ml Kanamycin B Vor der Gabe: Nach der Gabe: 1,4 x 106 0 1· Tag 7,4 x 106 3,2 x 104 2. Tag 1,7 x 105 1,3 x 104 5. Tag 4 x 106 9,1 x 103 7. Tag 1,1 x 107 2x 104 14. Tag 8x 106 3,1 x 104 21. Tag 7,1 x 105 6,2 x 104 28. Tag 8,2 x 106 8,1 x 104 35. Tag 8,7 x 106 1,8 x 104 -10-

AT3922B7B

Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, daß der verabreichte Mikroorganismus in bedeutender Menge im Pansen vorhanden ist, und in Anbetracht dessen, daß der verdaute Mageninhalt ständig entleert wird, sich auch unbedingt vermehrt. Die in den einzelnen Proben gemessenen Unterschiede in der Bakterienanzahl sind dadurch zu erklären, daß die Konsistenz des Mageninhalts von Probe zu Probe sehr verschieden war, von völlig viskos bis dünnfließend.

Beispiel 2

Beeinflussung der Pansenflora von mit Getreideprodukten gefütterten Tieren A) Isolation von bei Getreidefutter wachstumsfähigen Mikroorganismen

Die Maßnahmen von Punkt A des Beispiels 1 werden wiederholt, mit dem Unterschied, daß die Ausgangsprobe aus dem Pansen von mit Getreideprodukten gefütterten Tieren genommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCF-Nährboden (siehe dort), der anstelle von Heu im Reibmörser pulverisierte Kömemahrung enthält (2 %), geimpft. Die auf dem flüssigen RGCF-Nährboden herangewachsenen Kulturen werden auf einem festen RGCA-Nährboden ausgestrichen, und auf einen solchen Nährboden werden die sich aus Zellen, die die Getreideprodukte verwerten können, entwickelten Kolonien isoliert.

So erhält man aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, die auf Getreide als Kohlenstoffquelle wachstumsfahig sind. B) Genetische Markierung der stärkeabbauenden Pansenbakterien

Die Maßnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt, mit dem Unterschied, daß bei der mit der plOll Plasmid-DNS stattfindenden Transformation anstelle der nach Punkt A des Beispiels 1 hergestellten Mikroorganismen die nach den Angaben des Punktes A des Beispiels 2 erhaltenen Stämme verwendet werden. p

Die Resistenz gegenüber Kanamycin B einiger transformierter und Km -Zellen wird in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Kanamvcin-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten stärkeabbauenden Stämme

Mikroorganismus Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B, pg/ml Panseninhalt 31 Ausgangsstämme p Genetisch markierte Km -Stämme 1,8 Hh-GYOKI-2-4 250 -14Ab 250 -37 250 -81 125

Wie beschrieben, erhält man demnach aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, die fähig sind, Getreidestärke als Kohlenstoffquelle zu verwerten und auf die vorhandenen Bakterien gerechnet gegenüber Kanamycin B 8x resistenter sind. Der Stamm Hh-GYOKI-2-14Ab wurde unter der Nummer 00288 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. C) Wiedereinbringen genetisch markierter Mikroorganismen in den Pansen

Es wird nach den Angaben des Punktes C des Beispiels 1 verfahren, mit dem Unterschied, daß mit dem Stamm Hh-GYOKI-2-14Ab anstelle des 1,8 % Bacto-Cellulose enthaltenden Nährbodens steriler RGCFa-Nährboden, der 1,8 % lösliche Stärke enthält, beimpft wird. Dann wird die Kultur in das Futter von Tieren gemischt, die mit Komfutter gefüttert werden. Vor der Gabe und danach täglich wird eine Probe an der Fistel genommen. Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km^-Zellen ist in der folgenden Tabelle aufgeführt. -11 -

AT 392 287 B

Tabelle 5

Veränderungen der Pansenflora von mit dem Stamm Hh-GYOKI-2-14Ah fKmfi) behandelten Tieren Dem Tier wurden oral 310 ml Kultur verabreicht die insgesamt 7,1 x 103 Bakterien enthält.

Zellenzahl/ml

Probe ohne Antibiotikum in Gegenwart von 250

μg/ml Kanamycin B

Vor der Gabe: Nach der Gabe: 4,3 x 106 1,4 x 101 1. Tag 4,1 x 106 1,8 x 103 2. Tag 3,1 x 106 1,8 x 103 3. Tag 8x 103 1,1 x 103 6. Tag 9,1 x 106 7,1 x 102 8. Tag 8x 106 8,1 x 103 15. Tag 6,8 x 106 8,7 x 103 22. Tag 5x 106 9,8 x 103 29. Tag O O X OO 1,1 x 104 36. Tag 9,1 x 106 7 x 103 43. Tag 7x 106 7,9 x 103 60. Tag 6,1 x 106 X 1—* O OJ

Aus der Tabelle ist klar zu entnehmen, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen am Leben bleibt und sich vermehrt

Beispiel 3

Beeinflussung der Pansenflora von mit Melasse gefütterten Tieren A) Isolation von bei Melassefütterung wachstumsfähiger Mikroorganismen

Es wird nach den Angaben des Punktes A des Beispiels 1 vorgegangen mit dem Unterschied, daß die Ausgangsprobe aus dem Pansen von mit Melasse gefütterten Tieren genommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCF-Nährboden geimpft, der anstelle von Heuextrakt Glucose enthält. Die in dem flüssigen Nährmedium herangewachsenen Kulturen werden auf einem RGCA-Nährboden ausgestrichen. Auf den gleichen Nährboden werden die Kolonien geimpft die sich aus zum Verwerten der Melasse fähigen Zellen entwickeln.

Auf diese Weise erhält man aus dem Pansen stammende Mikroorganismen, welche die Melasse metabolisieren können. B) Genetische Markierung von melasseverwertenden Bakterien

Die Maßnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt, mit dem Unterschied, daß anstelle der nach den Angaben von Punkt A des Beispiels 1 erhaltenen Mikroorganismen die nach Punkt A des Beispiels 3 hergestellten Zellen mit der Plasmid-DNS von plOl 1 transformiert werden. p

Die Resistenz einiger Km -Zellen gegenüber Kanamycin B ist in Tabelle 6 angeben. -12- AT 392 287 B Tabelle 6

Kanamvcin B-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten melasseabbauenden Stämme

Mikroorganismus Kleinste wachstumshemmende Konzentration von Kanamycin B (jig/ml) Panseninhalt 31 Ausgangsstämme 7,5 Genetisch markierte Km^-Stämme Hh-GYOKI-3-2 250 -14 500 -34 250 -81Me 500 -132 500

Auf die beschriebene Weise erhält man Melasse verwertende, gegenüber Kanamycin B in hohem Maße resistente Isolate.

Der Stamm Hh-GYOKI-3-81Me wurde unter der Nummer 00289 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert. C) Das Wiedeieinbringen der genetisch markierten Zellen in den Pansen

Es wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren, mit dem Unterschied, daß mit dem Stamm Hh-GYOKI-3-81 Me ein RGCFa-Nährboden, der anstelle von 1,8 % Cellulose 1,8 % Glucose enthält, geimpft wird. Die Kultur wird unter das Futter von mit Melasse gefütterten Tieren gemischt. Vor der Fütterung und danach täglich werden durch eine in den Pansen eingeführte Fistel Proben genommen.

D

Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km -Zellen ist in Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Veränderung der Pansenflora von mit Hh-GYOKT-3-81Me (Km^l-Zellen behandelten Tieren Dem Tier wurden oral 380 ml Kultur verabreicht, die 1,6 x 107 Zellen pro Milliliter enthält.

Zellenzahl/ml Probe Ohne Antibiotikum in Gegenwart von 500 μg/ml Kanamycin B Vor der Gabe: Nach der Gabe: 5x 106 0 1. Tag 1,1 x 106 1,9 x 105 2. Tag 1,8 x 107 2,5 x 105 3. Tag 6,2 x 106 6,1 x 105 6. Tag 8,1 x 106 8,7 x 105 8. Tag 6,2 x 106 9,1 x 105 15. Tag+ 1,3 x 103 1,3 x 102 22. Tag 3x 106 3,1 x 105 29. Tag 1,1 x 106 7xl05 36. Tag 8x 105 9,1 x 104 43. Tag 6,1 x 106 8,1 x 105 60. Tag 6,8 x 106 6,4 x 105 -13-

AT 392 287 B + Fehlerhafte Probenentnahme

Aus den Angaben der Tabelle ist zu entnehmen, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen des mit Melasse gefütterten Tieres ist

Beisniel 4

Die Änderung des Verhältnisses der im Pansen produzierten flüchtigen Fettsäuren durch Gahe von Bakterien

Zwei Schafe bekommen komplettes Futter (Gemisch aus Heu und Schaffutter), dann wird nach 14 Tagen durch die Fistel eine Probe aus dem Pansen genommen. 2 Liter Pansensaft werden durch mehrschichtige Gaze filtriert, das Filtrat wird abgetrennt. Die in der Gaze zurückbleibenden Stücke werden in 1 Liter physiologischem Puffer suspendiert, dann nach Rühren auf die gleiche Weise wie vorher filtriert. Die beiden Filtrate werden vereinigt, stehengelassen, nach einer Stunde werden die sich an der Oberfläche absondemden festen Stoffe entfernt, und nur die Flüssigkeit wird für die Untersuchungen verwendet. Die Zusammensetzung des physiologischen Puffers ist wie folgt:

Dinatrium-hydrogen-phosphat 0,316 g/1 Kalium-dihydrogen-phosphat 0,152 g/1 Natrium-hydiügen-carbonat 2,260 g/1 Kaliumchlorid 0,375 g/1 Magnesiumsulfat 0,112 g^ Calciumdichlorid-dihydrat 0,050 g/1 Eisen(II)sulfat-heptahydrat 0,008 g/1 Magansulfat-monohydrat 0,004 g/1 Zinksulfat-heptahydrat 0,004 g/1 Kupfersulfat-penthaydrat 0,002 g/1 Kobaltdichlorid-hexahydrat 0,001 g/1 Der pH-Wert des Gemisches wird kontrolliert, notwendigenfalls mit verdünnter wäßriger Lösung von

Wasserstoffchlorid Salzsäure oder Natronlauge auf 7,2 eingestellt (Cheng und Mitarb.: J. Dairy Sei., 38, 1225, /1955f).

Das auf diese Weise hergestellte Gemisch wird im Verhältnis 1:1 mit dem erwähnten physiologischen Puffer verdünnt, und einem Liter der Lösung werden 4 g des dem Tier verabreichten Futtergemisches zugesetzt. Je 30 ml der so erhaltenen Suspension werden in einen Erlenmeyerkolben von 100 ml Volumen gefüllt, dann werden zweihundert Portionen des so vorbereiteten Nährbodens sterilisiert, zweihundert weitere werden nicht sterilisiert.

Die sterilen und die die lebenden Pansenbakterien enthaltenden Nährböden werden mit Bakterien geimpft, die unter dem Aspekt der Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäureproduktion zu untersuchen sind.

Es werden diejenigen Bakterien untersucht, von denen erwiesen ist, daß sie auch nach der Züchtung in vitro lange Zeit im Pansen erhalten bleiben. Weiterhin werden die aus der Pansenflüssigkeit von Tieren, die mit komplettem oder einem beliebigen Futter gefüttert wurden, nach Punkt A, B und C des Beispiels 1 isolierten Bakterienstämme untersucht

Die zu untersuchenden Bakterien werden auf RGCA+CG-Nährboden der folgenden Zusammensetzung bei einer Temperatur von 37 °C, unter anaeroben Bedingungen und 48 Stunden lang inkubiert:

Salzlösung I (siehe Beispiel 1 Punkt A) 15 % Salzlösung II (siehe Beispiel 1 Punkt A) 15 % Spurenelemente-Lösung 0,3 % Hefeextrakt (Oxoid)+ 0,5 % Filtrierte Pansenflüssigkeit 10,0 % Natriumcarbonat 0,4 % Cystein-hydrochlorid-monohydrat 0,05 % Natriumthiosulfat 0,008 % Cellulose (Bacto)+ 0,3 % Glucose 2,0 % + siehe oben -14-

AT 392 287 B

Die Zusammensetzung der Spurenelemente-Lösung ist wie folgt:

Zinkdichlorid 40 mg

Kupferdichlorid-dihydrat 10 mg

Dinatriumtetraborat-dekahydrat 10 mg

Ammoniummolybdinat-tetrahydrat 10 mg

Eisentrichlorid-hexahydrat 200 mg

Mangandichlorid-tetrahydrat 10 mg ionenfireies Wasser ad 1000 ml.

Mit den Kulturen werden die wie oben hergestellten vorbereiteten Nährböden in den Erlenmeyerkolben beimpft. Die Impfung wird im Verhältnis 2 ml Kultur/50 ml Nährboden durchgeführt. Für jede Kultur werden zwei Ansätze bereitet. Auch die nicht sterile Kultur wird geimpft.

Nach der Impfung wird 40 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Vermehrung mit 10 % konzentrierter Ameisensäure zum Stehen gebracht und der Gehalt der Kulturen an flüchtigen Fettsäuren untersucht

Die Kulturen werden durch Gaze filtriert und dann 15 Minuten lang in einem Rotor mit einer Umdrehungszahl von 4000 zentrifugiert. Das Gemisch wird nochmals filtriert und dann zur Bestimmung der Fettsäuren mit 2-5 C-Atomen auf die Trennsäule eines Gaschromatographen gebracht, der mit einem Rammenionisationsdetektor vom Typ Carlo Erba GI-452 ausgestattet ist Säulentemperatur: 150 °C.

Trennsäule: 2 m langes Glasrohr mit einem inneren Durchmesser von 4 mm, Füllung: 10 % Äthylenglycoladipat + 2 % Ortho-Phosphorsäure, auf silanisiertem Silikagel-Träger (0,2-0,3 mm).

Injektortemperatur 190 °C. ^-Strömungsgeschwindigkeit: 50 ml/min. ^-Strömungsgeschwindigkeit: 50 ml/min.

Luft-Strömungsgeschwindigkeit: 200 ml/min.

Papiergeschwindigkeit: 160 cm/h

Chromatographierzeit: 20 min.

Probenmenge: 1 μΐ.

Von jeder Probe werden 4 parallele Messungen durchgeführt. Die Standardlösung enthält Essigsäure, Propionsäure, i-Buttersäure, Buttersäure, i-Valeriansäure und Valeriansäure.

Von den aus den Pansen von mit komplettem Futter gefütterten Tieren isolierte bzw. genetisch markierten Bakterien wurden mehr als 90 untersucht, in Falle positiver Ergebnisse mehrfach. Die repräsentativen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 8 aufgeführt. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Zeichen ist die folgende: + S: nach Sterilisation geimpft NS: lebende Pansenflora enthaltende Kultur geimpft a. ny: geringe Menge b. negative Kontrolle: Gehalt des Nährbodens (Pansenflüssigkeit, physiologischer Puffer und Futter) an flüchtigen Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen) c. positive Kontrolle - Gehalt der die ursprünglichen Pansenbakterien enthaltenden und inkubierten Kultur (Nährboden aus Pansenflüssigkeit, physiologischem Puffer und Futter) an flüchtigen Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen) d. wie c., zum Nährboden wurden jedoch 5 ppm Monenzin (Na-Salz) (Eli Lilly, Indianapolis 46206, USA) gegeben; Durchschnitt von 6 Messungen e. wie c., der Nährboden wurde jedoch durch 10 ppm Monenzin (Na-Salz) ergänzt (Durchschnitt von 6 Messungen) -15-

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AT 392 287 B

Aus den Tabellenangaben ist ersichtlich, daß durch Gabe der erfindungsgemäßen Mikroorganismenkulturen das Verhältnis der durch die metabolische Tätigkeit der Pansenflora entstehenden flüchtigen Fettsäuren in einem breiten Bereich geändert werden kann. Mit der aus dem Stamm Hh-GYOKI-48a hergestellten Kultur kann zum Beispiel die Propionsäureproduktion gesteigert werden, gleichzeitig ist durch die Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-109b die Essigsäureproduktion erhöhbar. Die Steigerung der Produktion der einzelnen Fettsäuren kann auch auf Nährböden, die keine anderen Mikroorganismen enthalten (S), oder in Gegenwart der üblichen Pansenbakterien (NS) beobachtet werden. In dem verwendeten Versuchssystem mit Monenzin-Na-Salz sank das Essigsäure/Propionsäure-Verhältnis (d,e) um 1-2 Zehntel.

Die nach dem Verfahren des Beispiels ausgewählten Mikroorganismen werden durch Wiederholung der in Punkt B des Beispiels 1 beschriebenen Maßnahmen genetisch gekennzeichnet, wiederkäuenden Tieren verabreicht, und ihre Vermehrung im Pansen wird untersucht. Der sich im Pansen lange Zeit vermehrende und mit einem günstigen Metabolismus ausgestattete Stamm wird in entsprechender Form zur Steuerung der Produktion von flüchtigen Fettsäuren verwendet

Beispiel 5

Herstellung eines Bakterienpräparates- das Tieren verabreicht werden kann

Das zu verabreichende Bakterium wird auf RGCA+CG-Nährboden der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Nach der Züchtung werden die Zellen auf bekannte Weise getrennt z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die abgetrennten Zellen werden in physiologischem Puffer (siehe Beispiel 4) suspendiert und gefriergetrocknet. Das lyophilisierte Bakterienpräparat wird gespeichert und gegebenenfalls, entsprechend formuliert, Tieren verabreicht

Das Anlegen einer Mikroorganismenkultur kann auch auf anderen, in Fachkreisen gut bekannten Nährböden durchgeführt werden, beispielweise auf Nährböden, die als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke usw., als Stickstoffquelle anorganische Salze enthalten.

Das Präparat kann unter das Futter gemischt verabreicht werden, aber auch im Trinkwasser, selbständig oder mit anderen biologisch aktiven Stoffen, wie z. B. mit Antibiotika, Vitaminen, zusammen.

Außer dem lyophilisierten Präparat können auch andere Produkte hergestellt werden. Der Mikroorganismus kann auch nach dem Mischen der durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennten Bakterienmasse mit den entsprechenden Träger- oder Verdünnungsstoffen, z. B. mit Calciumcarbonat, Getreide, Premix oder anderen Futtermitteln, verabreicht werden.

Abhängig vom verwendeten Futter und von der Produktionsrichtung wird festgelegt, welcher der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und die Pansenflora günstig beeinflussenden Mikroorganismen verabreicht wird, und in welcher Menge. Soll der Essigsäure-Propionsäure-Quotient gesenkt werden, wird z. B. die aus dem Stamm Hh-GYOKI-48a hergestellte Kultur verabreicht, soll er erhöht werden, wird beispielsweise die Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-3-81Me gegeben. Werden stickstoffbindende Bakterien gegeben, so kann die Menge der den Wiederkäuern zu verabreichenden Menge an organischer Stickstoffquelle verringert werden. Die Festlegung der zum Erreichen der gewünschten Wirkung notwendigen Zellenanzahl ist für einen Fachmann kein Problem. Die Zellen werden im allgemeinen in einer Menge verabreicht, daß sich in einem

Milliliter des Panseninhalts die Zahl der gegebenen Mikroorganismenzellen zwischen 5 x 10^ und 5 x 10^ bewegt

Beispiel 6

Die Gabe der Stämme Hh-GYOKI48a nnd Hh-GYOKT-1 -123Sz an Schafe

Auf dem Nährboden RGCA+CG der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung wird eine Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-48a angelegt. Die Züchtung wird in zwei Fermentoren mit einem Nutzvolumen von 5 Liter, bei einer Temperatur von 37 °C, unter anaeroben Bedingungen durchgeführt Die Fermentation wird mit dem Impfen von 10 ml eines auf Nährboden gleicher Zusammensetzung hergestellten Inokulums begonnen und 48 Stunden hindurch fortgesetzt. Danach werden die Zellen durch Zentrifugieren in einem Rotor mit einer Umdrehungszahl von 5000/min abgetrennt, und der so erhaltene zentrifugenfeuchte Niederschlag von 58 g wird sorgfältig mit 4 kg Maisschrot vermischt. Das Gemisch wird in 8 Teile geteilt und an 8 Schafe verabreicht. Die Tiere ließ man vorher einen Tag lang hungern.

Der obige Vorgang wird wiederholt, anstelle des Mikroorganismus Hh-GYOKI-48a wird jedoch der Stamm Hh-GYOKI-l-123-Sz verwendet. Das aus 53 g Biomasse und 4 kg Maisschrot bereitete Präparat wird 8 Schafen verabreicht

Die Tiere bekamen das Präparat in einem Alter von 3 Monaten. Als Kontrolle dienten 8 Tiere. Nach der Gabe wurde die Fütterung ad libitum mit Heu fortgeführt und wöchentlich das Gewicht der Tiere bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben: -18-

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Tabelle 9

Gewichtsveränderung von ad libitum mit Wiesenheu gefütterten Schafen fkgl (Futter: Wiesenheu ad libitum (600-900 g/Tag) und 100 g/Tag Mineralsalz- und Vitaminzusatz im Maisschrot-Trägerstoff).

Lfd. Nr. Ausgangs gewicht 1. 2. W 3. och 4. e 5. Kontrol 1 29.0 29.5 30.0 29.5 29.5 29.5 2 27.0 27.5 28.5 27.0 26.5 28.0 3 28.5 27.0 27.0 27.5 26.5 26.5 4 30.0 30.5 30.0 30.5 30.0 29.0 5 29.5 30.0 29.0 30.5 29.5 30.0 6 25.0 25.5 26.5 26.0 26.0 27.5 7 27.0 27.0 27.5 28.0 28.0 28.0

Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz 8 29.5 32.0 32.5 33.0 33.5 34.0 9 25.5 26.5 27.0 28.5 29.5 29.0 10 25.0 25.5 25.0 28.0 29.0 28.5 11 25.5 24.5 25.5 27.5 27.0 28.0 12 29.0 28.0 29.0 28.5 29.0 30.0 13 29.5 30.0 30.5 29.5 29.5 30.5 14 29.5 28.5 29.5 30.0 30.5 31.0 15 28.5 29.0 30.5 30.0 30.5 32.0

Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a 16 29.5 30.0 30.5 31.0 32.0 33.5 17 26.5 25.0 26.5 27.0 29.0 30.0 18 27.0 27.5 28.5 29.5 30.5 31.0 19 26.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.5 20 29.5 30.5 31.0 31.5 32.5 33.0 21 28.0 28.0 28.0 29.0 29.0 30.0 22 29.0 30.5 33.2 30.0 32.8 33.5 23 27.0 26.0 27.5 29.0 31.0 32.0

Aus den obigen Angaben wird die auf ein Tier entfallende durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme errechnet Die Ergebnisse sind aus Tabelle 10 ersichtlich. -19-

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Tabelle 10

Die durchschnittliche tägliche Gewichts Veränderung der Versuchstiere, auf ein Tier gerechnet, und die

Durchschnittsgewichte

Ausgangsgew. 1. 2. W o 3. c h 4. e 5. Kontrolle Durchschnittsgew. (kg) 28.00 28.14 28.36 28.43 28.00 28.36 Gewichtsveränd. (g) +20 +31 +10 -61 +51 Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz Durchschnittsgew. (kg) 27.75 28.00 28.69 29.31 29.81 30.37 Gewichtsveränd. (g) +31 +86 +77 +62 +70 Behandelt mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a Durchschnittsgew. (kg) 27.81 27.94 29.02 29.37 30.73 31.69 Gewichtsveränd. (g) +16 +135 +44 +170 +120

Bei den Tieren der Kontrollgmppe konnte bei kargem Futter innerhalb von 35 Tagen eine Gewichtszunahme von 360 g, bei den mit dem Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz behandelten Tieren eine Gewichtszunahme von 2620 g und bei den mit dem Stamm Hh-GYOKI-48a behandelten Tieren eine Gewichtszunahme von 3875 g verzeichnet werden.

Die Ausgangskörpergewichte zeigten keine signifikanten Abweichungen, im Gegensatz zu den End-Körpergewichten und der täglichen Gewichtszunahme (Tabelle 11 und 12, wo signifikante Unterschiede gefunden wurden.

Die sich auf die Daten von 5 Wochen beziehenden mathematisch-statistischen Angaben sind in Tabelle 12 aufgeführt.

Tabelle 11

Mathematisch-statistische Angaben

Kontrolle Hh-GYOKI-l-123Sz Hh-GYOKI-48a Arithmetisches Mittel (kg) 28,357 30,375 31,6875 Korr, quadrat. Streuung 1,476 3,910 2,281 Korr, relat. Streuung <5,0 <0,1 -20-

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Tabelle 12

Statistische Auswertung der Gewichtszunahme

Kontrolle Hh-GYOKI-l-123Sz Hh-GYOKI-48a Zahl der Tiere 7 8 8 gesamte Gewichtszunahme der Gruppe (kg) 2,5 21,0 31,0 maximale Steigerung (kg) 2,5 4,5 5,0 minimale Steigerung (kg) -2,0 1,0 2,0 durchschnittl. Steiger./Schaf (kg) 0,3571 2,6250 3,8750 korr. quadrat. Streuung 2,143 1,768 0,839 Standardabweichung ±1,355 ±1,244 ±0,857

Aus den obigen Angaben ist ersichtlich, daß die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparate die Gewichtszunahme der Schafe bedeutend steigern.

Beispiel 7

Erhaltung von genetisch markierten Bakterien im Pansen von Rindern

Es wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, daß der gegenüber 10000 μg/ml Kanamycin resistente Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz in 4 1 RGCFa-Medium gezüchtet wird. Nach Erreichen der stationären Phase (38. Stunde) wird die Biomasse durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen/min) abgetrennt, die Zellen werden gründlich mit 500 g Maismehl vermischt und dann an eine Kuh verfüttert. Durch die Fisteln werden wöchentlich Proben entnommen, das Vorhandensein des verabreichten Stammes im Pansen wird nach Punkt C des Beispiels 1 bestimmt.

Die Ergebnisse beweisen, daß der Stamm Hh-GYOKI-l-123Sz sich im Pansen von Kühen gut vermehrt und dort mindestens 40 Tage lang am Leben bleibt.

Beispiel 8

Vergleich der gewichtssteigernden Wirkung der Mikroorganismen Hh-GYOKI-48a mit der negativen und positiven Kontrolle

Die Mikroorganismen Hh-GYOKI-48a werden auf die im Beispiel 6 angegebene Weise gezüchtet, mit dem Unterschied, daß in den Nährboden keine Pansenflüssigkeit gegeben wird, 41g zentrifugenfeuchte Bakterienpaste werden mit 1,2 kg Maisschrot vermischt, dann wird das Präparat in 12 gleiche Teile geteilt.

Im weiteren wird wie in Beispiel 6 verfahren, mit dem Unterschied, daß insgesamt 36 Tiere (Schafe) in drei Gruppen geteilt und den Tieren der positiven Kontrolle außer dem Prämix und dem ad libitum gefütterten Heu täglich auch 100 g Futter gegeben werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben (n bezeichnet die Anzahl der Tiere). -21-

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Tabelle 13

Negative Kontrollgruppe. n = 12

Nummer des Körnereewicht (kel Gewichts- Tieres 0. Woche 1. W. 2. W. 4. W. Zunahme (kg) innerhalb 4 Wochen 1 32,8 31,0 33,2 34,1 1,3 2 34,8 33,0 35,4 37,0 2,2 3 26,7 27,4 28,5 30,1 3,4 4 32,5 35,4 36,3 35,7 3,2 5 32,6 30,6 32,0 34,0 1,4 6 35,0 35,1 34,9 35,2 0,2 7 34,7 36,6 36,4 37,7 3,0 8 35,8 36,8 37,5 38,1 2,3 9 32,0 32,7 34,0 35,0 3,0 10 30,0 30,3 32,0 34,2 4,2 11 34,0 33,9 35,5 36,6 2,6 12 35,8 35,0 36,1 38,0 2,2

Insgesamt: 396,7 397,8 411,8 425,7 29,0 Durchschnitt: 33,06 33,15 34,3 35,475 2,4 Positive Kontrolleruppe, n = 12 13 35,2 37,6 38,0 39,0 3,8 14 31,6 32,7 33,4 35,3 3,7 15 33,3 34,6 36,3 37,0 3,7 16 33,2 34,0 35,6 36,0 2,8 17 34,5 36,8 39,0 39,6 5,1 18 27,3 29,5 31,4 32,4 5,1 19 34,5 36,0 37,4 37,7 3,2 20 31,7 31,6 34,0 35,0 3,3 21 31,0 36,8 38,0 38,7 7,7 22 35,5 37,0 38,9 39,8 4,3 23 34,4 35,5 37,7 38,8 4,4 24 34,0 34,9 37,2 37,9 3,9 Insgesamt: 396,2 417,0 436,9 447,2 51,0 Durchschnitt: 33,0 34,75 36,40 37,266 4,3 25 33,2 35,9 37,4 38,1 4,9 26 33,6 35,7 37,0 37,9 4,3 27 34,7 36,4 37,4 38,0 3,3 28 33,5 35,0 36,8 37,3 3,8 29 28,8 32,0 33,2 34,2 5,4 30 27,6 31,9 33,4 35,0 7,4 31 32,0 32,5 35,5 36,1 4,1 32 30,5 35,6 35,9 38,0 7,5 -22-

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Tabelle 13 (Ports.)

Nummer des Tieres Kömersrewicht ikfr) Gewichtszunahme (kg) innerhalb 4 Wochen 0. Woche 1. W. 2. W. 4. W. 33 33,4 33,7 34,5 35,3 1,9 34 31,3 36,0 37,3 38,9 7,6 35 34,7 33,5 34,1 36,8 2,1 36 31,6 34,8 36,1 37,2 5,4 Insgesamt: 384,9 413,0 428,6 442,8 57,7 Durchschnitt: 32,075 34,42 35,7 36,98 4,8

Ergebnisse der mathematischen Analyse

Zwischen negativer Positive Kontroll- Negative Kontroll- und positiver Kontrollgruppe und Versuchsgruppe und Versuchsgruppe S = ± 1,613 Δ = 2,4 t = 3,645 p < 0,05 signifikant S = + 1,664 Δ = 0,5 t = 0,736 P < 0,5 schwach signifikant S = + 1,236 Δ= 1,9 1 = 3,766 p < 0,01 stark signifikant (Bemerkungen: S, Δ, t und p sind statistische Konstanten. S = Standarddeviation; Δ = Differenz der Durchschnittswerte; t = t-Probe, p = Signifikanz)

Aus den Versuchsergebnissen ist ersichtlich, daß das Körpergewicht der in die mit Mikroorganismen behandelte Gruppe gehörenden Tiere innerhalb von 28 Tagen auf ein Tier gerechnet das Gewicht des Kontrolltieres um 2,4 kg übertraf. Die Gewichtszunahme der in die positive Kontrollgruppe gehörenden Tiere beträgt im Durchschnitt 4,3 kg, das sind 0,5 kg weniger als die durchschnittliche Gewichtszunnahme der in die behandelte Gruppe gehörenden Tiere. Das kann bedeuten, daß bei Gabe des erfindungsgemäßen Präparates in gegebener Menge an Lämmer bei gleichbleibender Gewichtszunahme pro Tier mindestens 100 g teures Futter eingespart werden können.

Beispiel 9

Herstellung von den Mikroorganismus Hh-GYOKI-48a enthaltenden Präparaten A. Herstellung eines gefriergetrockneten Präparates

Die gemäß Beispiel 6 hergestellte zentrifugenfeuchte Bakterienpaste OE-950 eines Gewichtes von 100 g wird in einer Lyophillisiereinrichtung (Labor MIM, Ungarn) lyophilisiert, dann werden die erhaltenen 54 g Produkt mit 486 g Weizenkleie sorgfältig vermischt und in einen den Bakterienschutz gewährleistenden (für Bakterien undurchlässigen) Sack oder Behälter gegeben. So erhält man ein 10 % Wirkstoff enthaltendes Präparat. B. Herstellung eines als Trägerstoff Weizenkleie enthaltenden Präparates 100 g gemäß Beispiel 6 hergestellte zentrifugenfeuchte Mikroorganismenpaste werden mit 100 g bzw. 900 g Weizenkleie gleichmäßig vermischt, dann in einen den Schutz der Bakterien gewährleistenden Sack oder Behälter gegeben. So erhält man 5 % bzw. 10 % Wirkstoff enthaltendes Präparat -23-

AT 392 287 B C. Herstellung eines Bentonit-Trägerstoff enthaltenden Präparates 100 kg Bentonitpulver "Veegum neutral" (vertrieben von: Lehmann und Voss Co., Hamburg, BRD) werden bei 160 °C 2 Stunden lang sterilisiert, dann nach Kühlung auf Raumtemperatur in einem Mischer des Typs Lödige FM 130 (Hersteller: Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Paderborn, BRD) gegeben. Der Mischer wird in Betrieb gesetzt, und durch seinen Flüssigkeitsdosieraufsatz werden 10 kg gemäß Beispiel 6 hergestellte, sprühbare Mikroorganismensuspension zum Bentonit gesprüht. Die erhaltene Dispersion wird bei 30 °C bis zum Erreichen eines Feuchtigkeitsgehaltes von 6 - 8 % getrocknet und in den Schutz der Bakterien gewährleistende Säcke (Behälter) gegeben.

Jeweils 5 g des Produktes werden bei einer Temperatur von 4 °C, bei Raumtemperatur bzw. bei 37 °C gelagert, am 0., 20., 51. und 72. Tag werden Proben genommen, das Präparat wird in einem sterilen HB-Gemisch der in Beispiel 1 gegebenen Zusammensetzung suspendiert und nach entsprechender Verdünnung auf den an gleicher Stelle beschriebenen RGCA-Agar geimpft. Die Züchtung findet in 46 Stunden unter anaeorben Bedingungen statt, dann wird die Zahl der herausgewachsenen Kolonien bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 angegeben.

Tabelle 14

Stabilität des Bentonit-Trägerstoff enthaltenden Produktes

Temperatur _Zahl der Bakterien/g Produkt 0. Tag 20. Tag 51. Tag 72. Tag 4 °C 4,3 x 107 2,5 x 108 8x 108 Raumtemperatur 2x 108 6 x 107 9x 106 8x 107 37 °C 3x 107 9x 106 5x 106

Aus den Tabellenangaben ist ersichtlich, daß sich der Bakteriengehalt des Bentonit enthaltenden Produktes unter Berücksichtigung der Streuung der Messung wenig verändert. D. Herstellung eines Attapulgit-TrägerstofF enthaltenden Präparates 100 kg kolloider Attapulgit "Pharmasorb HVM" (vertrieben von: Chemie-Mineralien KG, Bremen, BRD) werden bei 160 °C 2 Stunden lang sterilisiert, dann nach Abkühlen auf Raumtemperatur in einen Mischer des Typs Diosna P-250-A (Herstellen Dierks Söhne Maschinenfabrik, Osnabrück, BRD) gegeben.

Der Mischer wird in Betrieb gesetzt, und durch seinen Flüssigkeitsdosieraufsatz werden 10 kg gemäß Beispiel 6 hergestellte sprühbare Mikroorganismensuspension zum Attapulgit gesprüht.

Die erhaltene Dispersion wird bei 30 °C bis zum Erreichen eines Feuchtigkeitsgehaltes von 6 % getrocknet und in den Schutz der Bakterien gewährleistende Säcke (Behälter) gegeben.

Jeweils 5 g des Produktes werden bei einer Temperatur von 4 °C, bei Raumtemperatur bzw. bei 37 °C gelagert, dann werden am 0., 20., 51. und 72. Tag Proben genommen. Das Präparat wird in einem sterilen HB-Gemisch der in Beispiel 1 gegebenen Zusammensetzung suspendiert und nach entsprechender Verdünnung auf den an gleicher Stelle beschriebenen RGCA-Agar geimpft. Die Züchtung wird in 46 Stunden unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, dann wird die Zahl der herausgewachsenen Kolonien bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 angegeben.

Tabelle 15

Stabilität des Attapulgit-Trägerstoff enthaltenden Präparates

Temperatur _Zahl der Bakterien/g Produkt 0. Tag 20. Tag 51. Tag 72. Tag 4°C 2x 108 1,5 x 107 3x 107 Raumtemperatur 9 x 107 3x 108 9 x 107 5 x 108 37 °C 2x 108 9 x 107 8χ 105 -24-

Claims (7)

1. AT 392 287 B Aus den Tabellenangaben ist ersichtlich, daß sich der Bakteriengehalt des Attapulgit enthaltenden Produktes unter Berücksichtigung der Streuung der Messung wenig verändert. Die gemäß den Punkten A - D dieses Beispieles und in ähnlicher Weise hergestellten Produkte können durch andere Trägerstoffe, z. B. Luzernenmehl, zerstückelte Maiskolben, gemahlenes Kalziumcarbonat, Dikalziumphosphat oder andere, bei der Herstellung von Prämixen und anderen Produkten in der Fütterung im allgemeinen verwendete und anerkannte Stoffe ergänzt werden. Das Präparat wird vor seiner Verabreichung in wirksamer Menge in Prämixe, Futter oder das Trinkwasser der Tiere gemischt PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern verwendbaren Mikroorganismenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Pansen von mit einem gegebenen Futter gefütterten Wiederkäuern Proben genommen werden, der Stoffwechsel der aus den Proben isolierten Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht wird und von den Mikroorganismen, die fähig sind, im Pansen flüchtige Fettsäuren zu produzieren, auf einem Nährboden, der das jeweilige Futter als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur angelegt wird, in die wachsenden Mikroorganismenzellen eine Selektion ermöglichende genetische Marker, vorzugsweise ein Antibiotikumresistenz-Marker, eingeführt werden, die genetisch markierten Stämme gezüchtet und die Kulturen in den Pansen von mit dem jeweiligen Futter ernährten Tieren zurückgebracht werden, aus den Pansen Proben genommen werden, die Anzahl der genetisch markierten Mikroorganismenzellen bestimmt wird, worauf die das Essigsäure-Propionsäure-Verhälmis auf 1,5 bis 4,0:1 einstellenden und sich gleichzeitig im Pansen des Tieres auf dem gegebenen tierischen Nährstoff vermehrenden und sich mindestens 60 Tage lang haltenden Mikroorganismenstämme isoliert werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus dem Pansen von mit cellulosehaltigem Futter, vorzugsweise Heu, gefütterten, mit stärkehaltigem Futter, vorzugsweise Getreideprodukten, gefütterten oder Mono- und/oder Disaccharide enthaltendem Futter, vorzugsweise Melasse, gefütterten Tieren isoliert werden, dann die genetisch markierten Stämme zum Zwecke von Untersuchungen in den Pansen der mit einem der obigen Futter gefutterten Tiere zurückgebracht werden.
3. 3. Präparat zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, daß es neben gegebenenfalls in der Tierzucht und zur Fütterung üblichen Trägerstoffen, Verdünnungs- und/oder Konservierungsmitteln und/oder anderen üblicherweise Wiederkäuern verabreichten Stoffen als Wirkstoff eine nach Anspruch 1 hergestellte Mikroorganismenkultur enthält.
4. 4. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff höchstens in einer Menge von 95 Gew.-% enthalten ist.
5. 5. Präparat nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismenkultur einer der in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter der Nummer 00287 oder 00288 oder 00289 deponierten Mikroorganismenstämme enthalten ist.
6. 6. Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, dadurch gekennzeichnet, daß diesen Tieren eine wirksame Menge einer nach Anspruch 1 hergestellten Mikroorganismenkultur verabreicht wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismenkultur die Kultur eines der unter der Nummer 00287 oder 00288 oder 00289 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponierten Mikioorganismenstämme verwendet wird. -25-