DE3529383A1 - Praeparate zur verbesserung der futterverwertung von wiederkaeuern und verfahren zu ihrer herstellung sowie verwendung der ersteren - Google Patents

Description

DR.STEPHAN G. BESZEDES PATENTANWALT

DACHAU BEI MÖNCHEN

POSTFACH 1168

ZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT

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P 2 555

Patentansprüche und Beschreibung;

zur Patentanmeldung

RICHTER GEDEON VEGY^SZETI GY^R R.T.

Budap e st, Ungarn

betreffend

Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung der ersteren

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern und ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung der ersteren.

Die Tiere mit zusammengesetztem Magen, wie Schafe (Ovis aries aries), Rinder (Bosprimigenius taurus), Ziegen (Capra hircus) beziehungsweise ihre wild lebenden Artverwandten, bei qri elsareise Hirsche, Rehe und Mufflons, spielen als Pflanzenfresser eine unentbehrliche Rolle in der Ernährungskette. Sie haben große wirtschaftliche Bedeutung, da sie auch Futter verwerten können, das für andere Arten nicht nutzbar ist. Diese Tiere bauen in ihrem mehrteiligen Magen mittels ihnen eigener, größtenteils auf dem Metabolismus von Mikroorganismen beruhender Verdauungsvorgänge aus pflanzlichen Stoffen vollwertige Nahrung auf. Die im Magen unter anaeroben Bedingungen lebenden Mikroorganismen, die Pansenflora, paßt sich dem Futter, das dem Tier über längere Zeit verfüttert wird, an. So, wie sich Qualität und Zusammensetzung des verzehrten Futters ändern, ändert . ■ ).-sich auch die Pansenflora. Die Veränderung der Pansenflora geht jedoch langsam vor sich, sie stabilisiert sich nach einer Futterveränderung erst nach Wochen. Dies beeinflußt die Fleisch- und Milchproduktinn ungünstig, außerdem wird ein Teil des aufgenommenen Futters unverdaut oder in nicht völlig aufgeschlossener Form wieder ausgeschieden. Bei schneller, rücksichtsloser Futterumstellung ist die Wirkung noch stärker, die Umstellung kann das Verenden oder Erkranken des Tieres zur Folge haben.

Ferner ist es bekannt, daß sich im Wiederkäuerpansen pro Milliliter mehrere Millionen verschiedener Bakterien

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vermehren. Der unter anaeroben Bedingungen stattfindende Metabolismus der Bakterien ist unter dem Blickwinkel der geregelten Verdauung und Nahrungsaufnahme des Tieres von grundlegender Bedeutung. Die in den Pansen gelangende Nahrung wird von den einzelligen Mikroorganismen in für das Tier verwertbare Verbindungen, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, zerlegt. Die aus dem Pansen weitergelangende Biomasse findet dagegen an anderen Stellen des Verdauungstraktes, zum Beispiel als Eiweißquelle, Verwendung. Für die Milchproduktion und die Fleischausbeute ist die Versorgung mit Essigsäure und Propionsäure beziehungsweise das Verhältnis dieser beiden Verbindungen zueinander von grundlegender Bedeutung.

Deshalb haben die sich im Wiederkäuerpansen vermehrenden Mikroorganismen eine sehr große Bedeutung im Leben des Tieres und sind daher bei der Haltung von Nutztieren mit zusammengesetztem Magen von entscheidender Bedeutung. Die Mikroorganismenflora das Pansens bildet sich nach der Geburt spontan aus den in der aufgenommenen Nahrung beziehungsweise im Trinkwasser enthaltenen Einzellern heraus und erfüllt dann in stabilisierter Form ihre Funktion. Es ist jedoch keineswegs sicher, daß die zufällig entstandene Mikroorganismenkultur mit der bestmöglichen Wirksamkeit arbeitet. Es wäre sehr vorteilhaft, wenn ein Verfahren, das eine vom wirtschaftlichen Standpunkt aus vorteilhafte Herausbildung und Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden Mikroorganismenkultur ermöglicht, zur Verfügung stünd'e.

Die Erhöhung der Erzeugung von flüchtigen Fettsäuren innerhalb des Pansens und dadurch die Steigerung der Futterverwertung, letztendlich jedoch der Milcherzeugung

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oder der Fleischausbeute, ist ein seit langem angestrebtes Ziel. Auf diesem Gebiet wurden bisher mit dem als Coccidiostaticum verwendeten Monensin bestimmte Ergebnisse erzielt (siehe US-Patentschrift 4 085 255). Es laufen Versuche mit anderen, dem Monensin verwandten Polyätherverbindungen, zum Beispiel mit Salinomycin und Lasalocid, sowie ferner mit Phthalidderivaten (US-Patentschrift 4 333 923) und auch mit Glycopeptiden, wie . Avoparcin und Actaplanin (Ingle und Mitarbeiter, Abstr. Am. Soc. Anim. Sei. 424 [1978]). Die erreichten Wirkungen weichen jedoch bei verschiedenen Futtermitteln stark voneinander ab und sind alles in allem nicht von Bedeutung (Chalupa, W., Chemical control of rumen microbial metabolism, Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants, MTP Press, Lancester, England, 1980 und Chalupa, W. und Mitarbeiter: Manipulating rumen fermentation with monensin and amicloral, Abstr. Am. Soc. Anim. Sei., 410 [1978]).

Ein Präparat beziehungsweise ein Verfahren, mit welchem direkt durch Beeinflussung der im Wiederkäuerpansen lebenden Mikroorganismenkultur Ergebnisse erzielt werden, ist bisher nicht bekannt.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern, durch welche direkt durch Beeinflussung der im Wiederkäuerρansen lebenden Mikroorganismenkultur eine optimale Zusammensetzung der im Pansen erzeugten Fettsäuren, insbesondere ein optimales Gewichtsverhältnis der im Pansen erzeugten Essigsäure und Propionsäure, erzielt werden kann, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung der ersteren zu schaffen.

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Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

In eigenen Versuchen wurde nämlich nun festgestellt, daß zum Isolieren von Mikroorganismen, die sich in einem gegebenen Futtermittel vermehren und vorteilhaft metallisieren, die genetischen (gentechnologischen) Rekombinationsverfahren erfolgreich angewandt werden können. Diese Verfahren ermöglichen, daß praktisch jeder beliebige Mikroorganismus mit einem genetischen Marker, auf Grund dessen der betreffende Mikroorganismus neben anderen Mikroorganismen selektiv bestimmt werden kann, versehen werden kann. Der genetische Marker kann zum Beispiel ein Gen, das die Resistenz gegenüber einem Antibioticum bestimmt, sein. Zum Zweck der vom gegebenen Futtermittel abhängigen vorteilhaften Herausbildung der Mikroorganismenkultur des Pansens wurden aus dem Pansen von Tieren mit zusammengesetztem Magen Mikroorganismen isoliert, die einzelnen Stämme genetisch gekennzeichnet, dann nach-Ansetzaieiner Kultur in den Pansen zurückgebracht und ihr Vorhandensein durch von dort entnommene Proben unter selektiven Bedingungen bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß ein Teil der isolierten in verschiedenen Tierfuttermitteln in vitro fortpflanzungsfähigen und mit einem -vdrfceilhaftenStof&vechselbeziehurgsvveise Metabolismus ausgestatteten Bäcterien überraschenderweise auch im Pansen des Tieres unter Verwertung des gegebenen Futtermittels über lange Zeit die Fähigkeit zur Fortpflanzung und Erhaltung besitzt. Dadurch wird die Verdauung der Tiere und auf diese Weise die Futterverwertung günstig beeinflußt.

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Gegenstand der Erfindung sind daher Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit einem Gehalt an 1 oder mehr Wirkstoff(en) und gegebenenfalls in der Tierzucht und zur Fütterung üblichen Trägerstoff (en) und/oder Verdünnungsmittel(n) und/oder Konservierungsmittelin) und/oder anderen üblicherweise Wiederkäuern verabreichten Stoff(en), welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als Wirkstoff(e) 1 oder mehr Mikroorganismenkultur(en), welche das Gewichtsverhältnis der im Pansen erzeugten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 1,5 bis 4,0 : 1 einzustellen vermag beziehungsweise vermögen und fähig sind, im Pansen mindestens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren, enthalten.

Zweckmäßig liegt beziehungsweise liegen der beziehungsweise die Mikroorganismenkultur(en) in Mengen von höchstens 95 Gew.-% vor.

Nach einer vorteilhaften Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Präparate ist beziehungsweise sind die Mikroorganismenkultur(en) [eine] solchs, welche das Gewicht sverhältn is der im Pansen erzeugten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 2,0 bis 3»5 si» zum Beispiel 2:1, einzustellen vermag beziehungsweise vermögen. Diese ist besonders dann zu wählen, wenn die Präparate zur Erhöhung der Fleischausbeute der Wiederkäuer verwendet werden soILen.

Für die Milcherzeugung beträgt der Optimalwert des Gewichtsverhältnisses von Essigsäure zu Propionsäure etwa 3,0 : 1 und für die Trächtigkeit 4,0 : 1, während er bei der Aufzucht von Färsen 2,0 bis 3»0 : 1 ist. Daher sind für den jeweiligen Zweck Präparate, die Mikroorganismenkulturen, welche das Gewichtsverhältnis

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der Essigsäure zur Propionsäure auf den jeweils gewünschten Wert einstellen können, vorteilhaft. Die Wahl des vorteilhaftesten GewichtsVerhältnisses von Essigsäure zu Propionsäure innerhalb des festgelegten Bereiches hängt von der Art des Wiederkäuers, vom verwendeten Futtermittel und anderen ähnlichen Faktoren ab. (FachSchrifttum dazu siehe: Kaufmann, V/., Rohr, K.: Der Einfluß des Futters auf die bakterielle Fermentation in Vormagen, Handbuch der Tierernährung, Seite 263, 1969, Parey, Hamburg, Berlin).

3 Stämme, die im Pansen von mit Heu, Getreide beziehungsweise Melasse gefütterten Tieren fortpflanzungsfähig sind und über lange Zeit am Leben bleiben und die Verdauung günstig beeinflussen (von der Anmelderin mit Hh-GYOKI-1-123Sz, Hh-GYOKI-2-14AB beziehungsweise Hh-GY0KI-3-81Me bezeichnet), sind in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen [Orszagos Közegeszsegügyi Intezet], Budapest, Ungarn unter den Nummern 00287, 00288 beziehungsweise 00289 hinterlegt worden. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparate liegt be Ziehung sweise liegen däier alsMikroorganismenkultur(en) [eine] solche des Mikroorganisiaenstammes beziehungsweise der Mikroorganismenstämme, jeweils hinterlegt am 26. Juni 1984 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen [Orszagos Közegeszsegügyi Intezet], Budapest, Ungarn unter der Nummer 00287 und/oder 00288 und/oder 00289 vor.

Zweckmäßig ist beziehungsweise sind der Mikroorganismus beziehungsweise die Mikroorganismen in Pastenform, in gefriergetrockneter Form oder als.

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Suspension(en) zubereitet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) aus den Pansen von mit einem gegebenen Futtermittel gefütterten Wiederkäuern Proben entnommen werden,

b) der Stoffwechsel der aus den Proben isolierten Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht wird und von den Mikroorganismen, die einen vorteilhaften Stoffwechsel aufweisen, auf einem Nährboden, der das jeweilige Futtermittel als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur angesetzt wird,

'c) in die wachsenden Mikroorganismenzellen eine

Selektion ermöglichende genetische Marker eingeführt werden,

d) die genetisch markierten Stämme gezüchtet werden,

e) die Kulturen in den Pansen von mit dem jeweiligen Futtermittel ernährten Tieren zurückgebracht werden,

f) aus den Pansen von Zeit zu Zeit Proben entnommen werden,

g) die Anzahl der genetisch markierten Mikroorganismenzellen bestimmt wird und

h) dann die mindestens 60 Tage lang vorhandenen

und die Verdauung der Tiere günstig beeinflussen-

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den, insbesondere die zur Einstellung des Gewichtsverhältnisses von Essigsäure zu Propionsäure auf den gewünschten Wert fähigen, Mikroorganismenstämme abgesondert werden und

i) die letzteren gegebenenfalls gezüchtet werden,

j) sie gegebenenfalls in eine vom Standpunkt der Tierzucht und Fütterung verträgliche Form gebracht werden sowie

k) sie an sich oder mit 1 oder mehr in der Tierzucht und Fütterung verwendeten Tragerstoff(en), Verdünnungsmittel(n) und/oder Konservierungsmittel-(n) und/oder anderen üblicherweise Wiederkäuern verabreichten Stoff(en) vermischt zu Präparaten, insbesondere zur peroralen Verabreichung, zubereitet werden.

Es ist vorteilhaft, das Absondern der Mikroorganismenzellen in lyophilisierter Form vorzunehmen.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgernäßen Verfahrens wird wie folgt vorgegangen.

Aus den Pansen von mit Heu, Hafer und Melasse gefütterten Tieren werden durch eine dorihingebrachte Fistel opffHÜsr Proben entnommen und die die Pansenbakterien enthaltenden Kulturen werden auf einem festen Nährboden, der eine Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und Agar (Bryant und Burkey, J. Dairy Sei., 36 [1953], 205) enthält, selektiert. Die Kulturen werden unter anaeroben Bedingungen bebrütet und dann werden die getrennt aufwachsenden Kolonien auf Nährböden ähnlicher Zusammen-

setzung isoliert und gezüchtet.

Mit den ausgewachsenen Kulturen werden flüssige Nährböden, die eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Pansenflüssigkeit sowie ferner als Kohlenstoffquelle Heu oder Cellulose beziehungsweise Hafer oder Melasse enthalten, beimpft. Unter anaeroben Bedingungen wird so lange bebrütet, bis auf den Nährböden ein intensives Wachstum zu beobachten ist.

Die an als Kohlenstoffquelle Heu (Cellulose), Getreide (Stärke) beziehungsweise Melasse (Rohrzucker) enthaltenden Medien Wachstumsfähigen Zellen werden nach Selektieren und Ansehen einer Kultur auf einem festen Nährboden der obigen Zusammensetzung, das heißt welcher als Kohlenstoffquelle Cellulose beziehungsweise im Falle der in Gegenwart von Getreide und Melasse gewachsenen Zellen Glucose oder Rohrzucker enthält, isoliert.

Die so erhaltenen Kulturen werden genetisch markiert. Als Markierung kann ein beliebiger sich vererbender genetischer Marker, der den Nachweis der gekennzeichneten Mikroorganismen unter anderen Einzellern ermöglicht, verwendet werden. Dabei können nach einer speziellen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens resistenzbeetimmende Gene in die ausgewählten Zellen gebracht werden. Wenn die im Pansen lebenden Bakterien einem bestimmten Antibioticum gegenüber empfindlich sind und dem gleichen Antibioticum gegenüber resistente Bakterien unter sie gebracht werden, können die Vermehrung und das Absterben dieser letzteren Mikroorganismen gut verfolgt wer-

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den, indem die Proben auf einem das betreffende Antibioticum enthaltenden Nährboden selektiert werden. In diesem Fall werden nur die resistenten Zellen wachsen. So wird nach einer spezielleren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als genetischer Marker Antibioticumresistenz verwendet.

In die ausgewählten auf Cellulose, Getreideprodukten beziehungsweise Melasse wachsturnsfähigen Kulturen wird auf dem Wege der Transformation (Bergmans und Mitarbeiter, J. Bacteriol., 146 [1981], 564) nach einer vorteilhaften speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens Plasmid

p1011, welches die Resistenz gegenüber den Antibiotica Kanamycin und Chloramphenicol bestimmende Gene trägt (Simon und Mitarbeiter Proc. of the 8th North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitobe Press, [1983] eingebracht. Die Plasmid-DNS ist aus Zellen von Escherichia coli isoliert worden (Birriboim und DoIy, Nucl. Acids-Res., 7 1513 [179]. Dieser Stamm ist am 19. April 1983 unter der Nummer 00264 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen [Orszagos Közegeszsegügyi Intezet], Budapest, IfagarnKinterligt worden.

Nach der Transformation der DNS, welche die Antibioticumresistenz bestimmenden Gene enthält, werden die Zellen, welche die neue genetische Information stabil enthalten und ausdrücken (exprimieren), auf einem festen Nährboden von obiger Zusammensetzung, der mit Kanamycin ergänzt wurde, selektiert. Die resistenten Stämme werden gespeichert.

Mit den isolierten und gespeicherten Kulturen wird ein Nährboden, der eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Pansenflüssigkeit und die für eine halbfeste Kon-

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sistenz notwendige Agarmenge sowie ferner als Kohlenstoffquelle Cellulose beziehungsweise Glucose enthält, beimpft und die Kultur wird unter anaeroben Bedingungen 2 bis 6 Tage lang bebrütet. Die ausgewachsenen Kulturen werden in das Futtermittel von 1 Tag lang nicht gefütterten Schafen eingemischt und an die Tiere verfüttert. Vor dem Füttern und danach täglich wird je 1 Probe den Pansen entnommen. Die Proben werden auf einem festen Nährboden obiger Zusammensetzung, der durch Kanamycin ergänzt wurde, selektiert und es wird die Zahl der im Magen lebenden, gegenüber Antibiotica empfindlichen beziehungsweise resistenten Mikroorganismenzellen bestimmt. Weiterhin werden Art und Menge der während der Stoffwechselvorgänge der Mikroorganismen im Pansen entstehenden flüchtigen Fettsäuren bestimmt. Es ist bekannt, daß deren Verhältnis zueinander die Futterverwertung der Wiederkäuer beeinflußt (Eskeland und Mitarbeiter, J. An. Sei., ^l [1971], 282 und Church und Mitarbeiter, Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Band 2 [1971], Seiten 622 bis 625). Wie bereits erwähnt ist das vorteilhafte gewünschte Gewichtsverhältnis von Essigsäure zu Propionsäure bei der Mast 2,0 bis 3,5 : 1, bei der Milcherzeugung etwa 3"ί 1 und im Falle normaler Tierhaltung und von Trächtigkeit etwa 4. : 1.

Nach einer speziellen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden diese Bestimmungen durchgeführt, indem aus der den Pansen entnommenen Proben Bakterien isoliert werden und die Fähigkeit der einzelnen Isolate zur Biosynthese der flüchtigen Fettsäuren untersucht wird. Dazu wird auf einem mit durch das jeweilige Futtermittel ergänzten, Pansenflüssigkeit enthaltenden

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kompletten Nährboden unter anearoben Bedingungen eine Mikroorganismenkultur angesetzt und dann mittels gaschromatographischer Analyse die Essigsäure-, Propionsäure- und ButterSäurekonzentration der Kultur bestimmt. Die Mikroorganismenzellen, welche die genannten organischen Säuren in einem vorteilhaften Verhältnis erzeugen, werden genetisch markiert und dann wird ihre Vermehrung im Wiederkäuerpansen untersucht.

Die Stämme, die mindestens 60 Tage lang im Pansen des mit dem jeweiligen Futtermittel gefütterten Tieres teilungsfähig sind und den Abbau der im Futtermittel enthaltenen Kohlehydrate zu Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure günstig beeinflussen, werden ausgewählt, gezüchtet, getrennt, konserviert und gespeichert und ihre Kulturen können, gegebenenfalls in eine für die Tierzucht annehmbare Form gebracht, den Wiederkäuern zum Zwecke einer günstigen Herausbildung und Beeinflussung der Pansenflora peroral verabreicht werden.

Das Ansetzen einer aus dem Pansen stammenden Mikroorganismenkultur kann erfindungsgemäß auf Nährböden, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Salze, den entsprechenden reduzier "te η Zustand des Nährbodens gewährleistende Salze und die aus unbekannten Gründen für die Zellteilung von Fall zu Fall unentbehrliche Pansenflüssigkeit enthalten, unter anaeroben Bedingungen unter Ausschluß von Sauerstoff, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32 bis 37°Cj erfolgen. Als Kohlenstoffquelle werden vorzugsweise Glucose, Cellulose oder diese als Metaboliten bildende andere Zuschlagstoffe, zum Beispiel Heu, Getreide oder Melasse, verwendet. Als Stickstoffquelle können anorganische Salze oder organische Stoffe, zum Beispiel Hefeextrakt

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oder Casein, zum Nährboden zugegeben werden. So wird vorteilhaft die Entnahme der Proben und das Isolieren der Mikroorganismen aus den Pansen beziehungsweise das Zurückbringen in die Pansen von solchen Wiederkäuern, welche mit 1 oder mehr cellulosehaltigen Futtermittel^ n), instesandere Efeu, siärkehaltägen Rifctermitte](n), insbesondere GeireMepraiM(en),u5d/cder Mono- und/oder Disaccharide en-foaltenden Futtermittel(n), insbesondere Melasse, gefüttert worden sind, vorgenommen.

Ein wesentlicher Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß für die Beeinflussung der Pansenflora der Wiederkäuer Einzeller, die ein bestimmtes Futtermittel vorteilhaft metabolisieren können und unter den Bedingungen des Pansens lange Zeit lebensfähig bleiben, verwendet werden. Für die Auswahl solcher Bakterien werden wie bereits erwähnt für Selektionen geeignete genetische Marker verwendet. Ein derartiger genetischer Marker kann zum Beispiel ein Resistenz gegenüber einem Antibioticum kodierendes Gen sein, aber es kann auch ein Gen, das zum Beispiel ein beliebiges Enzym oder ein biologisch inaktives, aber durch eine Reaktion nachweisbares Eiweiß ausdrückt [exprimiert], sein. Es können auch auxotrophe Zellen verwendet werden.

Der genetische Marker kann mit Hilfe eines Vektor- -DNS-Moleküles, zum Beispiel mit einem Plasmid oder einem Ebagei, indie Zelle eingeführt werden aber auch durch spontane Selektion kann eine bestimmte selektierbare Eigenschaft, zum Beispiel Antibioticaresistenz, ausgelöst werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern.

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Die ausgewählte im Pansen eines Wiederkäuers vorteilhaft metabolisierende und dort lange Zeit am Leben bleibende Kultur kann dem Tier zur Herausbildung der Pansenflora nach der Geburt oder zur günstigen Beeinflussung der im Pansen von Tieren mit bereits ausgebildeter Pansenflora lebenden Mikroorganismenzusammensetzung in Form eines zweckmäßigen Präparates peroral verabreicht v/erden. Es ist zweckmäßig, das Präparat zusammen mit dem Futter oder Trinkwasser zu verabreichen.

Zur Herstellung der zu verabreichenden Kultur kann zweckmäßig wie folgt vorgegangen werden.

Vom ausgewählten Mikroorganismus wird auf einem Nährboden, der eine organische Kohlenstoffquelle und eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und organische oder anorganische Salze enthält, eine Kultur angesetzt, dann werden die Mikroorganismen in zur Verabreichung und zum Transport geeigneter Form getrennt und gegebenenfalls mit festen oder flüssigen Trägerstoffen und gegebenenfalls mit sonstigen Zusätzen vermischt und zubereitet. Die auf diese Weise erhaltenen Präparate können in die Futtermittel und das Trinkwasser der Tiere eingemischt oder auch gesondert verabreicht werden.

Im Falle von Schafen werden zum Beispiel im allgemeinen täglich mit 0,5 kg üblicher Nahrung 1 bis 20 g, vorzugsweise 5 g, erfindungsgemäßes Präparat verabreicht. Das Futtermittel kann beispielsweise ein Gemisch aus Maisschrot, Luzernenheu und Mastfuttermittel sein, wobei die genauen Verhältnisse entsprechend den jeweiligen Umständen und unter Berücksichtigung der angestrebten täglichen Gewichtszunahme festgelegt werden

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müssen. Im Falle von Kühen ist im allgemeinen die Verabreichung von 10 bis 200 g, vorzugsweise etwa 50 g, erfindungsgemäßes Präparat zweckmäßig, zum Beispiel mit etwa 5 kg üblicher Nahrung vermischt.

Aus der mittels der bereits früher erwähnten Gärung erhaltenen Gärbrühe werden auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Zentrifugieren oder Filtrieren, die Mikroorganismenzellen abgetrennt. Aus den abgetrennten Zellen können unter anderen Mikroorganismen-Pasten, gefriergetrocknete Präparate, Sporen oder vegetative Formen enthaltende Suspensionen hergestellt werden, dazu können für die Tierhaltung und Tierfütterung annehmbare Zuschlagstoffe zugegeben werden. Die Präparate können auch mit die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen erhaltenden ergänzenden Zuschlagstoffen, zum Beispiel Eiweißen, Aminosäuren oder Glycerin, versetzt sein. Auch können die zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern anwendbaren erfindungsgemäßen Präparate außer den oben genannten Substanzen auch in der Praxis verwendete und Wiederkäuern verabreichte Stoffe, beispielsweise Antibiotica, wie Monenzin, Nigericin oder Salinomycin, und ferner auch solche Stoffe, welche das Bewahren der verabreichten Mikroorganismen im Pansen begünstigen, zum Beispiel auch Antibiotica, enthalten.

Die erfindungsgemäßen Präparate ermöglichen also, daß sich mit ihrer Hilfe im Wie der käuer pans en eine lebende Mikroorganismenkultur, welche die Verdauung der Tiere günstig beeinflußt, herausbildet "beziehungsweise daß sich die bereits vorhandene vorteilhaft verändert.

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Während der Säugezeit befindet sich im Wiederkäuerpansen keine zur Metabolisierung des Futtermittels geeignete Mikroorganismenflora, diese entsteht spontan, zufällig und ist keineswegs mit Sicherheit vorteilhaft. Durch gezielte Fütterung mit vorher bestimmten Bakterien kann an Stelle der nach langer Zeit erfolgenden spontanen Herausbildung der Pansenflora schnell und in vorteilhafter Zusammensetzung sofort eine fertige Mikroflora, die zur optimalen Verwertung des gegebenen Futtermittels geeignet ist, gebildet werden.

Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß mit öen verwendeten Mikroorganismen, zum Beispiel den Stämmen mit den Kinterlegungsnummern 00287, 00288 beziehungsweise 00289;, bei Änderung des Futtermittels beziehungsweise nach der Säugeperiode die schnelle Anpassung der Pansenflora beziehungsweise ihre Herausbildung begünstigt wird, indem sich im Pansen Mikroorganismen vermehren, die das Futtermittel optimal abbauen können.

Die erfindungsgernäßen Präparate werden beispielsweise in den hier nur zum besseren Verständnis dargelegten nur beispielhaften folgenden Fällen angewandt.

Für Rinder bei der Milcherzeugung zur jähreszeitlidiaiFuttermiiiBlinisteIlLing, in den va-sMedenen Phasen der Milcherzeugung, am Ende der Trächtigkeit bei der physiologischen Futtermittelumstellung und bei betriebsbedingten Futtermittelumstellungen. In der Fleischerzeugung bei Änderung des Mastverfehrens, bei auf Massenfuttermittel beruhender Mast, bei intensiverer, auf Getreidefutter-_k mitteln beruhender Haltung, bei Beginn des Austreibens

und bei Veränderung der Weide.

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In der Schafhaltung bei jahreszeitlich bedingter FutteralttelumstelLung (Herbst-Winter-Sommer-Frühlings-Fütterung), bei Beginn der Weide und bei intensiver Aufzucht.

Ähnlich ist die Situation bei der in Ungarn weniger verbreiteten Ziegenzucht. Die erfindungsgemäßen Präparate können jedoch auch in einigen Spezialfallen, wie bei wild lebenden Wiederkäuern, bei der Tierhaltung in Wildgärten und in der Damwildzucht, verwendet werden.

Es ist zu bemerken, daß, obwohl in den erfindungsgemäßen Präparaten vorzugsweise Mikroorganismenkulturen aus dem Pansen verwendet werden, auch andere Essigsäure und/oder Propionsäure erzeugende Bakterien, die nicht unbedingt aus dem Pansen stammen, zu diesem Zweck verwendet werden können. Dies sind zum Beispiel Vertreter der Stämme Angerovibrio (lipolytica), Bacteroides, Sclenamonas (ruminanticum) und Propionibacterium.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Verwendung werden an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die Herstellung und Verwendung von Mikroorganismen, die 3 Grundfuttermittel, nämlich cellulosehaltiges Heu, hauptsächlich Stärke enthaltendes Getreidefuttermittel und Melasse, verwerten können und im Pansen über lange Zeit am Leben bleiben, werden für Schafe im einzelnen angegeben, die Erfindung umfaßt jedoch selbstverständlich auch die Herstellung von in anderen Futtermitteln wachstumsfähigen Mikroorganismen und Präparaten sowie deren Verwendung zur Herausbildung oder Beeinflussung der Pansenflora von anderen Wiederkäuern .

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Beispiel 1

Beeinflussung der Pansenflora von mit Heu gefütterten Tieren

A) Isolierung von bei Heufutter wachs turns fähigen Mikroorganismen

Schafe werden einen Monat lang mit Heu gefüttert, dann wird an der operativ in den Pansen eingeführten verschließbaren Fistel eine Probe entnommen. Die Probe wird direkt nach ihrer Entnahme auf einem Nährboden von nachstehender Zusammensetzung selektiert, nach Verdünnung:
Salzlösung I. 7,5 ml Dikaliunihydrogenphosr-hat 0,6 g

dest. Wasser a.d 100 ml

Salzlösung II. 7,5 ml Natriumchlorid 1,2g

Biammoniurnsuliat 1,2 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,6 g Ca Calciumchlorid 0,12 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,25 g

dest. Was se:

7-(0xy)-phenoxazon[2j-i0-(oxyd)
{ResazurirT)

0,1 faige Lösung 0,1 ml

Agar (Bacto)⁺ 2,5 g

Pansenflüssigkeit^' 10,0 ml

Glucose 0,05 g

Cellobiose 0,05 g

.Cystein-hydrochiοrid-

ad 100

-rnonohydrai
Natriumcarbonat,

8 %lge Lösung
dest. Wasser

0,05 g

5,0 ml ad 100 ml.

Bezeichnung des NäkrbosLess:

RGCA

ORIGINAL

⁺Difco Laboratories, Detroit, USA

⁺⁺Die aus dem Pansen entnommene Probe wird durch ein lockeres Gazefilter filtriert, das Filtrat wird dann unter CO₂ bei einer Temperatur von -20 ⁰C gelagert.

Der pH-Wert des Nährbodens wird auf 6,8 eingestellt, dann wird sterilisiert. Die Sterilisation wird in COp-Atmosphäre durchgeführt. Sterilisation, Nährtcdenbereitung unä Züchtung erfolgen nach Bryant und Burkey

(J. Dairy Sei., ^6, 205 /1353/).

Verdünnt wird mit einem sterilen Gemisch folgender

Zusammensetzung:

Sglzlösung I (siehe oben) 7,5 ml

Salzlösung II (siehe oben) 7,5 ml

Cystein-hydrochlorid-monohydrat 0,05 g

Natriumcarbonat - 0,3 g

Hesazurir-, 0,1 %ige Lösung 0,1 ml

öest. Wasser ad 100 ml. Bezeichnung des

Gemisches: HB

Die Kulturen werden bei 35 C unter anaeroben Bedingungen (siehe Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto und Imai, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, /1981/) 120 Stunden lang inkubiert, dann wird mit den einzelnen Kolonien ein Heu-extrakt enthaltender Nährboden von folgender Zusemir.ensettung geimpft: Salzlösung I (siehe oben) 15,0 Gew.-% SglzlösuTig II (siehe oben)

KO^)-pteixixaza{2]-10-(ax)d), 0,1%-ige Lösung

Tripton 142 (Oxoid)⁺ Befeextrakt (0xoid)⁺ Pensenf lüssigkeit" Natriumcarbonat Cystein-hydrochlorid-monohydrai Heuextrakt

⁸AD ORIGINAL

15,0	Gew.	-%
ο,ι	Gew.	-%
0,5	Gew.	"X
10,0	Gew.	-%
0,4	Gew.	-%
0,05	Gew.	-%
10,0 ,	Gew.	-% ZeJdientRGCF

'Oxoid Limited, London, Großbritannien Siehe vorn.

Zur Herstellung des Heuextraktes werden kleingeschnittene Pflanzenteile in Wasser suspendiert, gekocht und dann abfiltriert. Der Filterrückstand wird vor dem Sterilisieren zum Nährboden gegeben.

Der pH-Wert des Nährbodens wird mit Salzsäure auf 6,5 eingestellt, dann wird sterilisiert.

Die in Reagenzgläsern sterilisierten Nährböden von 5 ml Volumen werden mit einer· Zellsuspension, die aus auf dem festen Nährboden RGGA aufgewachsenen, isolierten Kolonien gewonnen wurde, geimpft. Die Kulturen werden 5 Tage lang bei 35 C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Das Wachstum wird durch mikroskopische Untersuchungen überprüft, dann wird die Kultur auf dem Nährboden RGCA der angegebenen Zusammensetzung selektiert, es werden jedoch weder Glucose noch Cellobiose in den Nährboden gegeben, statt dessen werden 2%Bacto Cellulose eingesetzt.

Die Kulturen werden bei einer Temperatur von 35 ⁰C 120 Stunden lang inkubiert, dann werden die einzelnen Kolonien, die sich aus den zur Celluloseverwertung fähigen Zellen entwickelt haben, auf den cellulosehaltigen RGCA-Fährboden isoliert.

Auf diese Weise werden aus dem Pansen stammende Mikroorganismen gewonnen, die auf Heu bzw. Cellulose wachsturnsfähig sind.

B) Markierung von heuabbauenden Ivüagenbakterien Die genetische Markierung erfolgt mit den

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Escherichia coli Plasmid ρ 1011, hinterlegt am 19. April 1933 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen [Orszagos Közegeszsegügyi Intezet], Budapest, Ungarn unter der Nummer 00264, (Simon und Mitarb., Proc. of the Eight North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada: Univ. of Maniota Press, /1983/) in an sich bekannter Weise. Aus dar Kultur vonE. coli wirdnachBirnboim und Doily (Nucl. Acids Res., 7, 1513 /1979/) die Plasmid-DNS isoliert und in einem Gemisch der folgenden Zusammensetzung gelöst:

75 mM Calciumchlorid

5 mM Magnesiumchlorid 10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer* pH 7,5

(Tri ε-(hydroxymethyl)-am inomet han)-hydro chlo rid

Wach den Angaben in Punkt A dieses Beispieles werden auf Heu wachstumsfahige Mikroorganismen auf dem Nährboden RGCF (siehe Punkt A) gezüchtet und durch Zentrifugieren in COp abgetrennt. Die Zellen

- 27 -

ν;erdeη in einem Gemisch folgender Zusammensetzung suspendiert:

75 mM Calciumchlorid 5 mM Magnesiumchlorid 10 mM TRIS-Kydrochlorid-Puffer pH 7,5 1 mM Cystein-hydrochlorid-monohydrat

1 mM iJatriumthio sulfat.

9 Die Suspensionen enthalten 5x10 Zellen pro

Milliliter. Die Zellsuspensioner. werden im Verhältnis 1:1 (0,1 ,ug/yul) mit dem die pl011-Plasmid-DI3S enthaltenden

ο Gemisch verdünnt und dann bei einer Temperatur· von 4 C 60 Minuten lang inkubiert. Die Inkubation wird danach zwei Minuten lang bei einer Temperatur von 41 C fortgesetzt, darauffolgend wird die Kultur auf feste Nährböden, die als Kohlenstoffquelle Cellulose enthalten, ausgestrichen und zu den Nährböden werden vor der Sterilisation 500 /Ug/ml Kanamycin B gigeben. Die Kulturen

ο werden 120 Ständen lang bei einer Temperatur von 35 C und unter anaeroben Bedingungen inkubiert, darm werden die in Gegenwart von 500 /ug/ml Kanamycin B wachstumsfähigen Kolonien untersucht.

Das Plasmid plOll trägt Kanamycin- und Chloramphenicolresistenz bestimmende Gene, enthält weiterhin die in den Zellen von E. coli die Replikation erlaubende Replikationsorigo. Da die Plasmid-DIvS über keine entsprechende Replikationsorigo verfügt, wird sie

- nachdem sie in ein anderes Bakterium gelangt ist entweder eliminiert oder aber ganz oder teilweise in das Chromosom eingebaut, es findet eine genetische Rekombination statt. Das in das Chromosom eingebaute Gen wird im günstigen Fall manifest und sichert Resistenz gegen Kanamycin bzw. Chloramphenicol.

Während dieser Versuche entstanden gegenüber

Kanamycin B resistente Kolonien, die Transformations-

—5 frequenz betrug 3x10 .

Einige resistente Kolonien wurden isoliert', und

- 28 - - ■

ORIGINAL

e£ wurde die Antibiotika-Empfindlichkeit der Ausgangs-

•ρ

starme und der gegenüber Kanamycin B resistenten (Km ) Stärke bestimmt. Die bei einigen Staminen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeber..

Tabelle 1

Kanamycin B-Empfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten, heuabbauenden Stämme

Mikroorganismus Kleinste wachstumshemmende

Konzentration von Kanamycin B /

Panseninhalt	31
Ausgangsstärme	4,0 - 7,5
Genetisch markierte Km L-Stämme
Kh-GYOKI-1-8	500
1-27	250
1-91	500
1-123	1000
1-142	500

Auf diese Weise erhält man Mikroorganismen, die aus dem Pansen stammen und fähig sind, Heu oder Cellulose zu vervverten. Sie sind in Gegenwart einer bedeutenden Menge Kanamycin B wachstumsfähig.

Der Stamm Hh-GYOKI-1-123 (Km^R) wird auf dem cellulosehaltigen Nährboden RGCA ausgestrichen, und zu den Nährböden werden 1000, 5000 bzw. 10000 ug/ml Kanamycin B gegeben. Die Kulturen werden 168 Stunden lang "bei. einer Temperatur von 35 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann werden die in Gegenwart von 1000 /ug/ml Antibiotikum wachsenden Stämme isoliert. Auf diese "Weise erhält man durch spotane Selektion aus dem Stamm-Hh-GYOKI-1-123 Kanamycin B gegenüber in starkem Maße resistente spontane Mutanten. Der.eine. Stamm erhielt. „ -.-

- 29 -

die Bezeichnung Hh-GY0KI-1-.123Sz [Hinterlegungsnummer: 0028?].

C) Das Wiedereinbringeη der genetisch markierten Mikroorganismen in den Pansen Mit der Kultur des auf Schrägagar bei +4 °C gelagerten Stamir.es Hh-GYOKI-1-123 (Km^R) wird der sterile Nährboden RGCPa von folgender Zusammensetzung geimpft:

1. Dikalium-hydrogen-phosphat 0,3 % 45 ml Lösung

2. Diammoniumsulfat
!Natriumchlorid
Magnesiumsulfat -mono hydrat
Calciumchloriä-dihydrat
KaliuTx-dihydrogen-phosphat 45 ml Gemisch

3· Bactc-Cellulose

Agar (Bacto)⁺ 65 ml Gemisch

4. Hefeextrakt 20 ml Gemisch

5. Cystein-hydrochlorid-monohydrat 20 ml Lösung

6. liatriumthiosulfat 20 ml Lösung Natriumcarbonat

7. Panser-flüssig>eit⁺⁺ 20 ml

⁺Difco Lsboratories, Detroit, USA "^Siehe oben.

Die angegebenen Mengen der sieben gesondert hergestellten Gemische werden in der angegebenen Reihenfolge miteinander vermischt.

Das Ansetzen der Kultur findet unter anaeroben Bedingungen in Kolben mit einem Volumen von 500 ml statt, die 150 ml. Nährmedium enthalten. Jiach 48 Stunden wird das Wachstum kontrolliert, dann wird die Kultur in das Putter von Schafen gemischt, die mit Heu gefüttert werden. Vor der Gabe und an den darauffolgenden Tagen werden an der in den Pansen einoperierten Pistel Proben eninommaa, das Volumen der Proben beträgt 50-200 ml

- 30 -

Die Proben werden nach entsprechender Verdünnung mit KB- -Lösung auf RGCÄ-Nährböden ausgestrichen, die kein Kanamycin und Antibiotikum enthalten. Die Kulturen werden 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 35 C und unter anseroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Zahl der entwickelten Bakterienkolonien bestimmt. Die Srgebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2 Veränderungen der Fansenflora von mit dem Stamm Hh-C-YOKI-

-1-123 (Km ) behandelten Tieren

Den: Tier wurden oral 340 ml Kultur verabreicht, die 4,7x10 Bakterien pro Milliliter enthält.

Vor der Gabe:
IvBch der Gabe

1. Tag

2. Tag

3. Tag
6. Tag
8. Tag

15. Tag

Zellenzahl/ml

Probe ohne Antibiotikum in Gegenwart von

1000 ug/ml Kanamycin B

"5x10'

5,9x10^ 3,2x10*' 2,4x1.0* 3,9x10' 9,8x10* 8,1x10-

2,0x10^ 4,1x1O⁴ 3,1x10⁴ 1,8x1O⁴ 1,05x10? 3,1x1O⁴

Aus den'Angaben der Tabelle geht hervor, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen ist und sich vermehrt.

Nach den obigen Angaben wurde eine Mikroorganismenkultur Hh-GYOKI-I-123Sz [HinterlegurgsnumEr: 00287] gezüchtet, die gegenüber 10 000 /ug/ml Kanamycin B resistent ist, und den

Tieren am Ip. Tag verabreicht. Nach der Züchtung der Proben auf die beschriebene Weise erhielt man die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse.

Tabelle 3

Veränderung der Pansenj.lo_{j r} ra ,^Von^^it-, 4gni Stamm Hh-GYOKI- -1-123Sz (Km^R) [Hinterlegungsninner: 002871 behandelten Tieren

Dem Tier wurden oral I40 ml Kultur verabreicht, die 2x10 Zellen pro Milliliter enthielt.

	Zellenzahl/ml	8000 /Ug/ml FsnamychB
Probe	ohne Antibiotikum in Gegenwart von	0
Vor der Gabe:	l,4xlO6	3, 2x104
Nach der Gabe: .		l,3xl04
1. Tag	■ 7,4xlOb	9,IxIO3 2xlO4
2. Tag	l,7xlO5	3,1'xlO4
5. Tag .7.'Tag	4xlO6 1,IxIO7 * *	6,2xlO4
14. Tag	8x10 b	8,IxIO4 l,8xlO4
21. Tag	7,IxIO5
28. Tag 35. Tag	8,2xlO6 8,7x10b

- 32 -

Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, da:": der verabreichte Mikroorganismus in bedeutender Menge im Pansen vorhanden ist, und in Anbetracht dessen, daß der verdaute Mageninhalt ständig enleert wird, sich auch unbedingt vermehrt. Die in den einzelnen Proben gemessenen Unterschiede in der Bakterienanzahl sind dadurch zu erklären, daß die Konsistenz des Mageninhalts von Probe zu Probe sehr verschieden war, von völlig viskos bis dünnfließend.

Beispiel 2 Beeinflussung der Pansenflora von mit

Getreideprodukten gefütterten Tieren k) Isolierung von bei Getreide futter wachsturasfähigen Mikroorganismen

Die Maßnahmen von Punkt A des Beispiels <L werden wiederholt mit dem Unterschied, daß die Ausgangsprobe aus dem Pansen von mit Getreideprodukten gefütterten Tieren entnommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCP-Mhrboden (siehe dort), der anstelle von Heuextrakt im Eeibmörser pulverisierte Körnernahrung enthält (2 %), geimpft. Die auf dem flüssigen RGCP-Nährboden herangewachsenen Kulturen werden auf einem festen RGCA- -Ivshrboden ausgestrichen, und auf einen solchen Nährboden werden die sich aus Zellen, die die Getreideprodukte verwerten können, entwickelten Kolonien isoliert. ' - :

So erhält man aus dem Pansen stammende Mikro-

Organismen, die auf Getreide als Kohlenstoffquelle ' 'j wachstumsfähig sind. _:

- 33 -

B) Genetische Markierung der stärkeabbauenden Pansenbakterien

Die Maßnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt mit dem Unterschied, daß bei der mit der plOll Plasmid-DNS stattfindenden Transformation anstelle der nach Punkt A des Beispiels 1 hergestellten Mikroorganismen die nach den Angaben des Punktes A des vorliegenden Beispielserhaltenen Stämme "verwendet werden.

Die Resistenz gegenüber Kanamycin B einiger transformierter und Km -Zellen wird in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Kanamycin-Bmpfindlichkeit der Pansenbakterien und der genetisch markierten stärkeabbauenden Stämme

Mikroorganismus Kleinste wachstumshemmende

Konzentration von Kanamycin B, /

Panseninhalt "31

Ausgangsstamme 1,8

•p

Genetisch ^markierte Km -Stämme

Hh-GYOKI-2-4 . 250

2-14Ab [ffinterlegungsnuimer: 002&sQ 250

2-37 250

2-81 ' 125

-34 -

V *

Vv¹ ie beschrieben, erhält man demnach aus dem ?82iSen stammende Mikroorganismen, öie fähig sind, Getreidestärke als'Kohlenstoffquelle zu verwerten und auf die vorhandenen Bakterien gerechnet gegenüber Kanamycin B 8>: resistenter sind.

C) Wiedereinbringen der genetisch markierten Mikroorganismen in den Pansen

Es wird nach den Angaben des Punktes C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, daß mit dem Stamm A-KM(I-Z-14Ab [HinterlegungsnumEr: 00288] anstelle des 1,8% Bacto-Cfellulose enthaltenden Nährbodens steriler RGCPa-Nährboden, der 1,8 % lösliche Stärke enthält, beimpft wird. Dann wird die Kultur in das Putter von Tieren gemischt, die mit Konifutter gefüttert werden. Vor der Ga"be und danach täglich wird eine Probe durch eine Fistel entnommen-.. Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km -Zellen ist in der folgenden Tabelle aufgeführt.

- 35 -

bad

Tabelle 5

Veränderungen der Pansenflora von mit dem Staren Hh-GYOKI-"2-14At) (Km ) Diinterlegungsnummer: .002883 behandelten Tieren

Dem Tier wurden oral 310 ml Kultur verabreicht/ die insgesamt 7,1x10 Bakterien enthält.

Zellenzahl/ml

Probe ohne Antibiotikum in Gegenwart von 250

/Ug/ml Kanamycin B

Vor der Gabe: 4,3x10 1,4.XlO¹ Kach der Gabe:

■ 1. Tag 4,lxl0⁶ l,8xlO³

2. Tag 3,2xl0⁶ 2,IxIO-³

3- Tag 8xlO³ 1,IxIO³

6. Tag ' 9,IxIO⁶ 7,IxIO²

8..Tag 8xlO⁶ 8,IxIO³

15. Tag 6,8xlO⁶ 8,TxIO³

22. Tag 5xlO^ö 9,8xlO³

29. Tag 8xlO⁶ I₅IxIO⁴

36. Tag 9,IxIO⁶ 7xlO³

43. Tag 7xlO^b 7,9xlO³

60. Tag 6,IxIO⁶ 7xlO³

Aus der Tabelle ist klar zu entnehmen, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen am Leben bleibt und sich vermehrt.

Beispiel 3 ■

Beeinflussung der Pansenflora von tti±t Melasse gefütterten Tieren

A) Isolierung, von bei Melassefütterung wachstums

fähigen Mikroorganismen

Es wird nach den Angaben des Punktes A des Beispiels 1 vorgegangen mit dem Unterschied, daß die Ausgangsprobe aus dem Pansen von mit Melasse gefütterten

- 36 BAD

* ♦ τ 1

Zieren entnommen wird. Die einzelnen Isolate werden auf einen RGCF-Kährboden geimpft, der anstelle von Heuextrakt Glucose enthält. Die in dem flüssigen Nährrnedium herangewachsenen Kulturen werden auf einem RGCA-Nährboden ausgestrichen. Auf den gleichen Nährboden werden die Kolonien geimpft, die sich aus zum Verwerten der M^eiasse fähigen Zellen entwickeln.

Auf diese Weise erhält man aus dem Pansen stsra-nende Mikroorganismen, welche die Melasse metabolisieren können.

B) Genetische Markierung von melasseverwertenden

Bakterien

Die Maßnahmen von Punkt B des Beispiels 1 werden wiederholt mit dem Unterschied, daß anstelle der nach den Angaben von Punkt A des Beispiels 1 erhaltenen Mikroorganismen die nach Punkt Ades vorliegenden Beispiels hergestellten Zellen mit der Plasmid-DNS von plOll transformiert werden.

■p

Die Resistenz einiger Km -Zellen gegenüber Kanamycin B ist in Tabelle 6 angegeben.

- 37 -

Tabelle 6

Kanamycin B-EnvpfindlichkeJT der Pansenbakterien und der genetisch markierten raelasseabba-genaen Stämme

Mikroorganismus . Kleinste wachstumshemmende

Konzentration von Kanamycin B ( /ug/ml)

Panseninhalt 31

Ausgangsstamme 7,5

R
Genetisch markierte Km -Stämme

Hh-GYOKI-3-2 250

3-14. 500

3-34 . 250

3-81Me QfintErlegungsruniEr: 00289] 500

3-132 500

Auf die beschriebene Welse erhält nan Melasse verwertende, gegenüber Kanamycin B in hohem 1.IeSe resistente Isolate.

C) Das Wiedereinbringen der genetisch markierten Zellen in den Pansen

Es wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, daß mit dan Staim Hh-GÄ3d-3-81Nte [HinterlegungsrumEr: 00289] ein RGCPa-Nährboden, der anstelle von 1,8 % Cellulose 1,8 % Glucose enthält, geimpft wird. Die Kultur wird, unter das Putter von mit Melasse gefütterten Tieren gemischt. Vor der Fütterung und danach täglich werden durch eine in-den Pansen eingeführte Pistel Proben entnommen. •Die Anzahl der in den Proben enthaltenen Km -Zellen ist in Tabelle 7 angegeben.

- 38 '_BAD

♦ 1 -.

• -J * ♦

Tabelle 7

Veränderung der Pansenflora von mit Hh-GYQEIO-SlMe (Km )-Zellen [Hmterlegungsnuinier: 00289] behandelten Tieren

Dem Tier wurden oral 380 ml Kultur -verabreicht, die 1,6x1O⁷ Zellen pro Milliliter enthält.

Zellenzahl/ml

Probe

Vor d	er Gabe:
Nach	der Gabe
1.	Tab
2.	Tag
3.	Tag
6O	Tag
8.	Tag
15	• -lag,
22	• Tag "
29	. Tag
■ 36	. Tag
43	. Tag
60	. Tag

Ohne Antibiotikum	in Gegenwart von
	500 /Ug/ml
	Kanamycin B
5xlOb	O
1,IxIO6	l,9xlO5
1,8x1O7	2,5xlO5
6,2xlO6	6,IxIO5
8,IxIO6	8,7xlO5
6,2x1O6	9,IxIO5
	1,3xlO2
3xlOfe ■	3,IxIO5
l,lxlOb	7xlO5
8xlO5	9,IxIO4
6,lxlOb	8,IxIO5
6,8xlO6	6,4xlO5

+Fehlerhafte Probenentnahme

Aus den Angaben der Tabelle ist zu entnehmen, daß der verabreichte Mikroorganismus lange Zeit im Pansen des mit L'elasse gefütterten Tieres ist·

- 39 -

BAD ORIGINAL

Beispiel 4

It

Die Änderung des Verhältnisses der im ?ar.sen produzierten flüchtigen Fettsäuren durch Gabe von Bakterien

Zwei Schafe bekommen komplettes Putter (Gemisch aus Heu und Schaffutter), dann wird nach 14 Tagen durch die Piste! eine Probe aus dem Pansen entnommen. 2 Liter Pansensaftwerden durch mehrschichtige Gaze filtriert, das Piltrat wird abgetrennt. Die in der Gaze zurückbleibenden Stücke werden in 1 Liter physiologischem Puffer suspendiert, dann nach Rühren auf die gleiche Weise wie vorher filtriert. Die beiden Filtrate werden vereinigt, stehengelassen, nach einer Stunde werden die sich an der Oberfläche absondernden festen Stoffe entfernt, und nur die Flüssigkeit wird für die Untersuchungen verwendet. Die Zusammensetzung des physiologischen Puffers ist wie folgt:

Dinatrium-hydrogen-phosphat 0,316 g/l

Kaliuni-dihydrogen-phosphat 0,152 g/l

Uatriumbicarbonat 2,260 g/l

Kaliumchlorid 0,375 g/l

Magnesiumsulfat 0,112 g/l

Calciumdichlorid-dihydrat 0,050 g/l

Eisen(II)sulfat-heptahydrat 0,008 g/l

Mangansulfat-monohydrat 0,004 g/l

Zinksulfat-heptahydrat 0,004 g/l

Kupfersulfat-pentahydrat 0,002 g/l

Eobaltdichlorid-hexahydrat 0,001 g/l

Der pH-Wert des Gemisches wird kontrolliert, notwendigenfalls mit verdünnter wässriger Lösung von "Salzsäure oder Natronlauge auf "7,2 eingestellt (Cheng-und Mitarb.: J. Dairy Sei., 1225, /1955/).

Bas auf diese Weise hergestellte Gemisch wird im Gewichtsverhä] tnis 1:1 mit dem erwähnten physiologischen Puffer verdünnt, und eine:. Liter der Lösung werden 4 g des dem Tier verabreichten Puttergeroisches zugesetzt. Je 30 ml der so erhaltenen Suspension werden in einen Erlenmeyerkolben von 100 ml Volumen gefüllt, dann werden zweihundert Portionen des so vorbereiteten riährbodens sterilisiert, zweihundert weitere werden nicht sterilisiert.

Die sterilen und die die lebenden Pansenbakterien enthaltenden Nährböden werden mit Bakterien geimpft, die unter dem Blickwinkel der Essigsäure-, Propionsäure- und Butt er säureprodukt ion zu untersuchen sind.

Es werden diejenigen Bakterien untersucht, von denen erwiesen ist, daß sie auch nach der Züchtung in vitro lange Zeit im Pansen erhalten bleiben. Weiterhin werden die aus der Pansenflüssigkeit von Tieren, die mit komplettem oder einem beliebigen Putter gefüttert wurden, nach Punkt A, B und C des Beispiels 1 isolierten Bakterienstämme untersucht.

BAD

15	few.-!
15	few.-!
0,3	few.-!
0,5	few.-!
10,0	few.-!
0*4	few.-!
0,05	few.-!
0,008	few.-!
0,3	few.-!
2,0	few.-!

Die zu untersuchenden Bakterien werden auf RGCA+CG-Nährboden der folgenden Zusammensetzung "bei einer Temperatur von 37 C, unter anaeioten Bedingungen und 48 Stunden lang inkubiert:
Salzlösung I (siehe Beispiel 1 Punkt A) Salzlösung II (siehe Beispiel 1 Punkt A) Spurenelementen-Lösung
Hefeextrakt (0xoid)⁺
Filtrierte Pansenflüssigkeit
Natriumcarbonat

Cystein-hydrochlorid-monohydrat Natriumthiosulfat
Cellulose (Bacto)⁺
Glucose .

siehe oben

Die Zusammensetzung der Spurenelementen-Lösung ist wie folgt:

Zinndichlorid 40 mg

Kupferdichlorid-dihydrat 10 mg

Dinatriumtetraborat-dekahydrat IO mg

Amnioniummolybdinat"-tetrahydrat 10 mg

Sisentrichiorid-hexahydrat 200 mg

laangandichlorid-tetraliydrat 10 mg

ionenfreies Wasser ad 1000 ml.

Mit den Kulturen werden die wie oben hergestellten vorbereiteten Nährböden in den Erlenmeyerkolben beimpft. Die Impfung wird im Verhältnis 2 ml Kultur/50 ml Nährboden durchgeführt. Mir jede Kultur werden zwei Ansätze bereitet. Auch die nicht sterile Kultur wird geimpft.

Nach der Impfung wird 40 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert, dann wird die Vermehrung mit 10 % konzentrierter Ameisensäure zum Stehen gebracht und der Gehalt der Kulturen an flüchtigen Fettsäuren untersucht.

Die Kulturen werden durch Gaze filtriert' und dann 15 Minuten lang in einem Rotor mit einer

Umdrehungszahl von 4000 zentrifugiert. Das Semisch wird nochmals filtriert und dann zur Bestimmung der Fettsäuren mit 2-5 C-Atomen auf die Trennsäule eines ' Gaschromatographen gebracht, der mit einem Flammenionisationsdetektor vom Typ Carlo Erba GI-452 ausgestattet ist.

Säulentemperatur: 150 C₀
Trennsäule: 2 m langes Glasrohr mit einem inneren

Durchmesser von 4 nun, Füllung: 10 % Äthylen-

* -.ir

■glykoladipat + 2 % Orthophosphorsäure, auf silanisiertem Silikagel-Träger (0,2-0,3 mn). Injektortemperatur: 190 C.
!^-Strömungsgeschwindigkeit: 50 ml/min. Hp-Strömungsgeschwindigkeit: 50 ml/min, Luft-Strömungsgeschwindigkeit: 200 ml/min. Papiergeschwindigkeit: l60 cm/h ■
Chroinatographierzeit: 20 min.
Probenmenge: 1 /ul.

Von jeder Probe werden 4 parallele Messungen durchgeführt. Die Standardlösung enthält Essigsäure, Propionsäure, i-Buttersäure, Buttersäure, i-Valeriansäure und Valerians äur-e . ■ ■

Von den aus den Pansen von mit komplettem Futter gefütterten Tieren isolierten'bzw. genetisch markierten Bakterien wurden mehr als 90 untersucht, im Falle positiver Ergebnisse mehrfach. Die repräsentativen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 8 aufgeführt. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Zeichen ist die folgende:

BAD ORiGiiX'AL

S: nach Sterilisation geimpft

NS: lebende Pansenflora enthaltende Kultur geimpft a.: geringe Menge

b. negative Kontrolle: Gehalt des Nährbodens (Pansenflüssigkeit, physiologiseller Puffer und Putter) an flüchtigen Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen) . ---

c. positive Kontrolle - Gehölt der die ursprünglichen Pensenbakterien enthaltenden und inkubierten Kultur

(Nährboden aus Pansenflüssigkeit, physiologischen! Puffer und Putter) an flüchtigen !Fettsäuren (Durchschnitt von 12 Messungen)

d. wie c, zum Nährboden wurden jedoch 5 ppm Monensin (Na-SaIz) (Eli Lilly, Indianapolis 4o206, USA) gegeben; Durchschnitt von 6 Messungen

e. wie c, der Fährboden wurde jedoch durch 10 ppm Monenzin (Na-SaIz) ergänzt (Durchschnitt von 6 Messungen)

- 44 -

Tabelle 8

Bakterien stamm	Bemerkung*	Essig säure /Ug/ml	Propion säure /Ug/ml	i-Butter- säure	Butter säure /Ug/ml	i-Valerian- säure /ug/ml	Valerian- säure	Essigsäure/ /Propionsäure	ι Λ • β & * ' t
Hh-GYOKI -1-123Sz	S [00287] NS	1.71 2,00	1,87 2,60	a a	0,35 0,5o	a a	-	0,91 0,77	* ■* * <0 Λ «
Hh-GYOKI· -2-14Ab	S [00288] NS	0,38 1,95	0,58 1,36	a a	0,35 0,52	a 0,12	a	0,65 1,43	■Κ
Hh-GYOKI- -3-81Me	S JÖ0289] NS	2,21 2,81	0,67 0,81	a a 1	a a	a a	-	3,29 3,47
- b		1,51	0,74	a ,	0,39	a	a	2,04	* 9 »9 Λ ** W * *
- C	Kontrolle	1,68	0,91	a	0,51	0,11	0,09	1,84	co /♦.: cn: : ro **
- ά		1,69	1,08	a	0,41	a	a	1,67
- β		1,61	0,91	a	0,37	a	a	1,77
Hh-GY0KI-48a S NS	1,26 1,21	1,60 2,38	a a	0,32 0,34 -	a 0,48	a	0,79 0,51
Hh-GY0KI-50a S NS	V.,73	1,56 2,01	a a	0,34 0,35	a	-	0,92 0,86

- 45 -

<£> CaJ OO CaJ

	S	Eaaig-	Propion	- 45'	-	Butter	i-Valerian-	Valerian-	ι ,	•	Essigsäure/	3529383
	NS	säure /Ug/ml	säure /Ug/ml	Tabelle 8	säure yug/ml	säure yug/ml	säure yug/rnl		/Propionsäure
	S	2,37	0,47	(Forts.)	0,36	a	-		5,04
	NS S	2,02	0,70	i-Butter-	0,35	0,15	-	2,89 ,
	NS	2,10	0,51	säure /ug/ml	0,34	a	-	4,12
	S	2,18 1,39	0,78 0,67	a	0,37 0,34	0,14		2,79 2,07
Bakterium-"" Bemerkung"1"	NS	1,77	0,60	a	0,27	-	-	2,95
atamm	S	1,31	0,87	a	0,31	-	-	1,50 :
Hh-GY0KI-51a	NS	2,02	0,91	a a	0,31	■ ■ -	-	2,22
	S	2,49	0,45	a	0,29	-	-	5,53
Hh-GYOKI-55a '	NS	2,92	0,36	a	0,30	. -	-	8,11 ■·■·
Hh-GYOKI-113		0,56	0,60	a	0,52	a	a	0,93
		0,83	1,14	a	1,55	0,11	0,70	0,73
Hh-GYOkl-122				a			- 46 -
			a
Hh-GYOKI-109b		a
Hh-GYOKI-126

<.„

Aus den Tabellenangaben ist ersichtlich, Ö.&L· durch Gabe der erfindungsgemäfren Mikroorganismenkultur-en das Verhältnis der durch die metabolische Tätigkeit der Pansenflora entstehenden flüchtigen Fettsäuren in einem breiten Bereich geändert werden kann. Mit der aus dem Stamm Hh-GY0KI-48a hergestellten Kultur kann zum Beispiel die Propionsäureproduktion gesteigert werden, gleichzeitig ist durch die Kultur des Mikroorganismus Hh-GYOKI-lO9b die Essigsäureproduktion erhöhbar. Die " Steigerung der Produktion der einseinen Fettsäuren kann auch auf Nährböden, die keine anderen Mikroorganismen enthalten (S), oder in Gegenwart der üblichen Pansenbakterien (NS) beobachtet werden. In dem verwendeten Versuchssystem mit Monenzin-Iia-Salz sank das Essigsäure/Propionsäure-Verhältnis (d,e) um 1-2 Zehntel.

Die nach dem Verfaliren des Beispiels ausgewählten Mikroorganismen werden durch Wiederholung der in Punkt 3 des Beispiels 1 beschriebenen Mainahmen genetisch gekennzeichnet, wiederkäuenden Tieren verabreicht, und ihre Vermehrung im Pansen wird untersucht. Der sich im Pansen lange Zeit vermehrende und mit einem günstigen Metabolismus ausgestattete Stamm wird in entsprechender Form zur Steuerung der Produktion von flüchtigen Fettsäuren verwendet.

Beispiel 5 Herstellung eines Bakterienpräparates,

das Tieren verabreicht werden kann

Die zu verabreichenden Bakterien werden auf RGCA+CG-Nährboden der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung unter anaeroben Bedingungen gezüchtet· Nach der Züchtung werden die Zellen auf bekannte Weise getrennt, z.B., durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die abgetrennten Zellen werden in physiologischem Puffer (siehe Beispiel 4) suspendiert und. gefriergetrocknet. Das« lyophilisierte Bakterienpräparat wird gespeicliert unäj

- 47 SAD

gegebenenfalls entsprechend zubereitet, Tieren verabreicht.

Bas Ansetzen einer Mikroorganismenkultur kann auch auf anderen dem Fachmann gut bekannten 1,'ährböden durchgeführt werden, beispielweise auf Kährpöden, die als Kohlenstoffquelle Glucose oder Stärke undals Stickstoff quelle anorganische Salze enthalten.

Das Präparat kann unter das Patter gemischt verabreicht werden, aber auch im Trinkwasser, an sich oder mit anderen biologisch aktiven Stoffen, wie z.B. mit Antibiotika und Vitaminen, zusammen.

Außer dem lyophilisierten Präparat können auch andere Produkte hergestellt werden. Der Mikroorganismus kann auch nach dem Mischen der durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennten Bakterienmasse mit den entsprechenden Träger- oder Verdünnungsstoffen, s.B. mit Calciumcarbonat, Getreide, Vormisdung (PramxJ. oder anderen Futtermitteln, verabreicht werden.

Abhängig vom verwendeten Putter und von der Produktionsrichtung wird festgelegt, welcher der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und die Pansenflora günstig bseinflussendenMlkroorganisnEn für das Präparat veiw=n3et und "verabreicht wird tnd in welcher Menge. Soll der Essigsäure-Propionsäure-Quotient gesenkt werden, wird 2.3. die aus dem Stamm Hh-GY0KI-48a hergestellte Kultur verwendet, soll er erhöht werden, wird beispiels--•weise die Kultur des Mikrooiganisrius Fh^Oa^-ei^QiintjerlegungsnLJmBr: 00289] gegeben. Werden stickstoffbindende Bakterien gegeben, so kann die Menge der den Wiederkäuern zu verabreichenden Menge an organischer Stickstoffquelle verringert werden. Die Festlegung der zum Erreichen der gewünschten Wirkung »notwendigen Zellenanzahl ist. iür einen Fachmann kein Problem. Die Zellen werden im allgemeinen in einer Menge verabreicht, daß sich in einem Milliliter des Pansen-

■ Inhalts die Zahl der gegebenen Mikroorganismen^eilen '

2 7 -

zwischen 5x10 und 5x10 bewegt. .. '

■ - 48 - l

J · · » · ft a

Beispiel 6

Die Verabreichung von die Stämme Hh-GYOKI-ASa und Hh-GY0KI-1-125Sz [HinterlegungsnuTnmer; 002873 enthaltenden erfindungsgemäßen Präparaten an Schafe

Auf dem Nährboden RGCA CG der in Beispiel

4 angegebenen Zusammensetzung wird eine Kultur des Mikroorganismus Hh-GY0KI-48a angesetzt. Die-Züchtung wird in zwei Fernentoren mit einem Hutζvolumeη von

5 Liter, bei einer Temperatur von 37 °C, unter anaerobes Bedingungen durchgeführt. Die Fermentation wird mit dem Impfen von 10 ml eines auf Nährboden gleicher Zusammensetzung hergestellten Inoculums begonnen und 48 Stunden hindurch fortgesetzt Danach werden die Zellen durch Zentrifugieren in einem Rotor mit einer Umdrehungszahl von 5000/min abgetrennt, und der so erhaltene zentrifugenfeuchte Niederschlag von 58 g wird sorgfältig mit 4 kg lüaissehrot vermischt. Das Gemisch wird in 8 Teile geteilt und an 8 Schafe verabreicht. Die Tiere ließ man vorher einen Tag lang hungern.

Der obige Vorgang wird wiederholt, anstelle des Mikroorganismus Hh-GY0KI-48a wird jedoch der.Stamm Hh- GÄKT-1-123-SZ [kinterlqgungiiiniBr: OO287J veiverriet. Das aus 53 g Biarasse \ΐύ 4 kg Kaisschrot bereitete Präparat wird 8 Schafen ver-

να. ii υ «

Die Tiere bekamen das Präparat in einem Alter vpja 3. Monaten. Als Kontrolle dienten B Tiere. Nach der Verabreiäung wunfe die Fütterung nach Belieben mit Heu fortgeführt und wöchentlich das Gewicht der Tiere bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben:

BAD ORIGINAi.

Tabelle 9

Gewichtsveräriderung von nach Belieben mit Wiesenheu gefütterten Schafen (kg)
^Futter: Wiesenheu nach Belieben (600-900 g/Tag) und

100 g/Tag. Mineralsalz- und Vitaminzusatz im Maisschrot- -Trägerstof fl.

Lfd.	Ausgangs	1.	2·	32,5	j ·	e	33,5	5.	V	15J'-
Ια«.	gewi clit		r O	27,0	ch		25,5			ZB, O
	Kontrolle			25,0			■29,0			3O3O
1	29,0	29j5	-~\ r.	•25,5	29,5	2έ,5	27; O	29,5	30,5
-2	27,0	27., 5	23,5	29,0	27,0	r- ' r	23 }0	ZB^O	31,0
3	22,5	27,0	27,0	30,5	27, 5	3O3O	29,5	26j5	32,0
4	30,0	30,5	30,0	29,5	30,5	29j5	30,5	29,0
5	29,5	30,0	23 ; O	30,5	30,5	26,0	30,5	30,0
6	25; 0	25,5	26,5	£ w · vJ	Zr1O	27,5
7	27, 0	27,0	■2-,5		ÜfinterlegixigsnunnEr: 00287}
	Behandslt mit	dan Starni fh-ÖOCI-1-123Sz		33,0
3	29,5	32_,0	28,5
9	■ ,25,5	26,5	23,0
10	25.0	25,5	27_,5
Il	25, 5	24 j 5	28,5
12	29,0	28,0	29,5
13	29,5	30,0	30,0
14	29,5	28,5	30,0
15	28,5	29,0

- 50 -

*■* «t Mti

t _t ,, art.»

ϊ i ι ζ' · · *

•Tabelle 9 (Ports.)

lfd.	Au sgangc-	1.	W	*-\	3.	4.	e	Hh-C-YOKI-48 a	32j0	5.
Er.	gewicht	mit dem	O	c h	31^0	29j0
	Behandelt	3OjO	Stamm	27 , 0	30^,5
16	2935	25j0	3O_,5	29; 5	29} 0	33^5
17	26^5	27,5	2635	28;0	32,5	30,0
18	27; 0	26^0	28_,5	31,5	29jO	31,0
19	26;0	30^5	27^0	' 2950	32^3	3Oj5
20	29^5	23,0	31j0	3OjO	31,0	33,0
21	23;0	30,5	23;0	29^0	3OjO
22	29;O	26;0	33,2
23	2 TyD		22,0

.Aus dem obigen Angaben wird die auf ein Tier entfallende durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme errechnet..Die Ergebnisse sind aus Tabelle 10 ersichtlich.

ORIGINAL - 51 -

Tabelle 10

Die durchschnittliche tägliche Gewichtsverlagerung der Versuchstiere, auf ein Tier gerechnet, -und die Durch-· schnittsgewichte

.Ausgangsgew. 1- - 2 · 3 · 4 .

W ο ' c h

Kontrolle

Durchschnitts- (kg) 28,00 28,14 28,36 28,43 28_,00 28j36 Tägliche Gewichtsverärei. (g) +20 +31 +10 -61 +51

Behandelt mit dem Stanm Hh-GCTI-T-123Sz QiinterlegungsninnEr: 00287]

Durchschnittsgew. 27,75 28.00 28.69 29,31 29j81 3Oj37

(kg) ·* ^J

TagUcte Gewiclitsveiänd. (g) +31 +86' +77 +62 +70

Behandelt mit dem Stamm Hh~GY0KI-48a

.Durchschnitts- (kg) 27*81 27,94 29,02 29,37 3Oj73 31,69

gew. ^J
Tägliche Gewichtsveiänd. (g) +16 +135 +44 +170 -*120

Bei den Tieren der Kontrollgruppe korkte bei kargem Putter innerhalb von 35 Tagen eine Gswiditszunahre vcn 360 g, bei dai mit dan Stamn Hh-GYOKI-1 -123Sz [Hinterlegungsnummer: 00287J behandelten Tieren eine GewdclitszunaJine _VOn 2620 g und .bei den mit dem Stamm Hh-GY0Kl-48a behandelten Tieren eine Gewichtszunahme von 3875 g verzeichnet werden.

Die Ausgangskörpergewichte zeigten keine signifikanten Abweichungen, im Gegensatz zu den End- -Körpergewichten und der täglichen Gewichtszunahme (Tabelle 11 und 121, wo signifikante Unterschiede gefunden wurden.

Die sich auf die Daten von 5 Wochen beziehenden mathematisch-statistischen Angaben sind in Tabelle 1*2 aufgeführt.

'■ » '■*

	isehes (kg) adrat. lat. St	Tabelle	11	,6875 ,281 ,1
		Mathematisch-s	tatΐετίsehe Angaben
	tatisti
		Kontrolle
Arithnei Mittel Korr. au Stremng Korr. re		28,357 1,476		DKI-48a
	Tabelle
	sehe A-UEVierturi;	Hh-GYOKI -1 -123Sz Hh-G¥CKI-48a £HinterlegungsnmiBr: 00287]
		30,375 31 3 5 910 2
	12
	g der Gewichszunahme
	Kontrolle Hh-QOCE-I-123Sz Hh-GVi fHinterlegunesixiiiTer: 00287?

Zahl der Tiere 7 8 8

gesamte Gewichtszunahme der Gruppe
(kg) 2,5 21,0 31,0

maximale Steigerung
(kg) 2,5 4,5 5,0

minimale Steigerung
(kg) -2,0 1,0 2,0

- 53 -

TabeOle_12
(Ports.)

Kontrolle Hh-GYOKI-I-l?3Ss Hh-GYOKl-4-Sa

durchschnittl.

Steiger./Schaf (kg) 0,3571 2,6250 3,6750

korr. auadrat

Streuung 2,143 1,768 0,539

Standardabweichung +1,355 +1,244 +0,857

Aus den obigen Angaben ist ersichtlich, dai: die Präparate die Gewichtszunahme der Schafe bedeutend steigern.

Beispiel 9

Erhalten . von genetisch markierten Bakterien

im Pansen von Kindern

Zs wird nach Punkt C des Beispiels 1 verfahren mit dem Unterschied, daß der gegenüber 10000 yUg/ml Kanamycin resistente Stanm Hh-GOCM -123Sz [HinterlegLFgsrumEr: 00287J in 4 1 RGGPa-Medium gezüchtet wird. Nach Erreichen der stationären Phase {38. Stunde) wird die Biomasse durch gen-trijafieren (5OOO Umdrehungen/min) abgetrennt, die Zellen werden gründlich mit 500 g Maismehl vermischt und darm an eine Kuh verfüttert. Durch die Pisteln werden wöchentlich Proben entnommen, das Vorhandensein des verabreichten Stammes im Pansen wird nach Punkt C des Beispiels 1 bestimmt.

Die Ergehnisse beweisen, daß der Stamm Hh- -G^XCr-1-123Sz rHinterleguqgsixmner: 00287J sich im Bansen von Mihen gut und dort mindestens 40 Tage lang am Leben bleibt.

_BAD 0BK3INAI.

Claims (10)

■*■■*■·■ ■* F. tf ΐ S Patentansprüche

1.) Präparate zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit einem Gehalt an 1 oder mehr Wirkstoff(en) und gegebenenfalls in der Tierzucht und zur Fütterung üblichen Trägerstoff(en) und/oder Verdünnungsmittel(n) und/oder Konservierungsmittelin) und/oder anderen üblicherweise Wiederkäuern verabreichten Stoff(en), dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff(e) 1 oder mehr Mikroorganismenkultur(en), welche das Gewichtsverhältnis der im Pansen erzeugten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 1,5 bis 4,0 : 1 einzustellen vermag beziehungsweise vermögen und fähig sind, im Pansen mindestens 60 Tage lang am Leben zu bleiben und sich zu vermehren, enthalten. *

2.) Präparate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, * daß der beziehungsweise die Mikroorganismenkultur (en) in Mengen von höchstens 95 Gew.-% vorliegt beziehungsweise vorliegen.

3.) Präparate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenkultur(en) [eine] solche, welche das Gewichtsverhältnis der im Pansen erzeugten Essigsäure und Propionsäure auf einen Bereich von 2,0 bis 3,5 : 1 einzustellen vermag beziehungsweise vermögen, ist beziehungsweise sind.

4.) Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismenkultur(en) [eine] solche des Mikroorganismenstammes beziehungsweise der Mikroorganismen-

stamme, jeweils hinterlegt am 26. Juni 1984 in der Nationalen Sammlung für Mikroorganismen beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen [Orszagos Közegeszsegügyi Intezet], Budapest, Ungarn unter der Nummer 00287 und/oder 00288 und/oder 00289 vorliegt beziehungsweise vorliegen.

5.) Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus beziehungsweise die Mikroorganismen in Pastenform, in gefriergetrockneter Form oder als Suspensionen) zubereitet ist beziehungsweise sind.

6.) Verfahren air EsrstelLung der Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) aus den Pansen von mit einem gegebenen Futtermittel gefütterten Wiederkäuern Proben entnimmt,

b) den Stoffwechsel der aus den Proben isolierten Mikroorganismen in vitro und/oder in vivo untersucht und von den Mikroorganismen, die einen vorteilhaften Stoffwechsel aufweisen, auf einem Nährboden, der das jeweilige Futtermittel als Kohlenstoffoder Stickstoffquelle enthält, eine Kultur ansetzt,

c) in die wachsenden Mikroorganismenzellen eine Selektion ermöglichende genetische Marker einführt,

d) die genetisch markierten Stämme züchtet,

e) die Kulturen in den Pansen von mit dem jeweiligen Futtermittel ernährten Tieren zurückbringt,

f) aus den Pansen von Zeit zu Zeit Proben entnimmt,

g) die Anzahl der genetisch markierten Mikroorganismenzellen bestimmt und

h) dann die mindestens 60 Tage lang vorhandenen und die Verdauung der Tiere günstig beeinflussenden Mikroorganismenstämme absondert und

i) die letzteren gegebenenfalls züchtet,

3) sie gegebenenfalls in eine vom Standpunkt der Tierzucht und Fütterung verträgliche Form bringt sowie

k) sie an sich oder mit 1 oder mehr in der

Tierzucht und Fütterung verwendeten Trägerstoff (en), Verdünnungsmittel(n) und/oder Konservierungsmittelη) und/oder anderen üblicherweise Wiederkäuern verabreichten Stoff(en) vermischt zu Präparaten, insbesondere zur peroralen Verabreichung, zubereitet.

■/,7

7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als genetischen Marker Antibioticumresistenz verwendet.

8.) Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Entnahme der Proben und das Isolieren der Mikroorganismen aus den Pansen beziehungsweise das Zurückbringen in die Pansen von solchen Wiederkäuern, welche mit 1 oder mehr cellulosehaltigen Futtermittel(n), insbes ondere Heu, stärkehaltigen Futtermittel (η ), insbesondere Getreideprodukt(ei), und/oder Mono- und/oder Disaccharide enthaltenden Futtermittel(n^ insbesondere Melasse^gefüttert worden sind, vornimmt.

9.) Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Absondern der Mikroorganismenzellen in lyophilisierter Form vornimmt.

10.) Verv/endung der Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern.

Beschreibung