DE60018567T2

DE60018567T2 - Verwendung von propionäure bakterien für die herstellung von propionsäure im dickdarm

Info

Publication number: DE60018567T2
Application number: DE60018567T
Authority: DE
Inventors: Daniel Edmond ROUSSEL; Gabriel Charles LEGRAND; Henri Marc LEGRAND; Nathalie Roland; Dominique Bougle
Original assignee: LABORATOIRES STANDA SA; STANDA LAB SA
Current assignee: LABORATOIRES STANDA SA; STANDA LAB SA
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: AU6577600A; DK1194154T3; FR2796554A1; RU2225215C2; BR0012681A; ES2239610T3; DE60018567D1; HK1047400B; MXPA02000542A; CA2379727C; WO2001005413A1; CA2379727A1; EP1194154B1; KR100523661B1; PT1194154E; HK1047400A1; KR20020072273A; AU765371B2; PL201183B1; EP1194154A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Propionsäure-Bakterien mit dem Ziel, die Produktion von Propionsäure und/oder Propionaten und ggf. von Essigsäure und/oder Acetaten im Bereich des Kolons zu optimieren.
Seit einigen Jahren raten die Ernährungsfachleute ihren Patienten eine Ernährung an, die reich an Faserstoffen ist, denen sie physiologische und metabolische Wirkungen zuschreiben, die die Gesundheit günstig beeinflussen.
Es ist bekannt, daß die Nährstoffasern gegenüber einer enzymatischen Verdauung im Dünndarm resistent sind und erst im Bereich des Kolons abgebaut und assimiliert werden, d.h. im Endbereich des Darms. Die oben erwähnte vorteilhafte Wirkung kann sich somit nur unter der Bedingung einstellen, daß dieser Abbau und diese Assimilierung an dieser präterminalen Stelle, dem Kolon, so vollständig wie möglich erfolgt sind.
Es konnte nun festgestellt werden, daß diese biologischen Reaktionen die Folge einer anaeroben Fermentation der Nährstoffasern unter der Wirkung von Mikroorganismen im Kolon sind. Dieser Fermentation führt zur Produktion von kurzkettigen Fettsäuren (KKFS), Wasserstoff, Kohlendioxid und Biomasse.
Die kurzkettigen Fettsäuren sind im wesentlichen Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure; im gesunden Organismus können sie nur im Bereich des Kolons produziert werden, im Hinblick darauf, daß es sich hierum die einzige Stelle des menschenlichen Körpers handelt, wo strikte anaerobe Bedingungen herrschen, die die Fermentation an der Basis ihrer Synthese ermöglichen, mit Ausnahme der Essigsäure, von der eine sehr kleine Menge im Leberbereich erzeugt werden kann.
Verschiedene Untersuchungen haben nun die Bedeutung der kurzkettigen Fettsäuren, die sich günstig auf die Gesundheit auswirken, bestätigt.
Nach der Literatur scheint es, daß die physiologische Rolle dieser drei kurzkettigen Fettsäuren voneinander verschieden ist: die Essig- und Propionsäuren würden demnach direkt zur Leber geführt, wo die Propionsäure insgesamt metabolisiert würde, während ein Teil der Essigsäure anschließend zu verschiedenen Geweben geführt würde, wohingegen die Buttersäure eher spezifisch im Innenbereich der Kolonwand verwendet würde.
Die Synthese von kurzkettigen Fettsäuren impliziert somit im Kolon das Vorhandensein von einerseits einem Substrat auf Faserbasis, das durch die Nahrung leicht zugeführt werden kann, und andererseits einer entsprechenden ausgewogenen Bakterienflora, die sich in optimaler Weise und beständig darbietet.
Diese Bakterienflora kann entweder aus der körpereigenen Flora, die in jedem Individium vorherrscht, oder aus der Nahrung stammen.
Es ist nun allgemein bekannt, daß der Inhalt des menschlichen Verdauungstraktes, der für jedes Individuum spezifisch ist und etwa 1 : 1,5 kg Nahrungsmasse im Ver lauf der Verdauungsumwandlung entspricht, eine beachtliche Population an Mikroorganismen enthält, die von einem Gemisch zahlreicher Arten gebildet ist, das man mit 10¹¹ bis 10¹² Zellen pro Gramm im Kolon annehmen kann; diese Population bildet eine Bakterienmasse mit einem bestimmten Gewicht, deren gute oder schlechte Ausgewogenheit nur schwierig grundsätzlich und insbesondere dauerhaft allein über die tägliche Ernährung verändert werden kann.
Im übrigen ist die Nahrung, die man täglich zu sich nimmt, niemals steril und somit mehr oder weniger mit Bakterien belastet (Milch, fermentierte Milchprodukte, Käse, Cidre, Wein, Bier, Wurstwaren usw.). Die Veränderungen der Kolonflora als Folge der Absorption dieser Bakterien können jedoch nur zeitweilig sein.
Es ist ferner zu bemerken, daß bereits vorgeschlagen worden ist zu versuchen, die mikrobielle Population des Darmtraktes durch die Verabreichung und insbesondere die freiwillige Aufnahme von Bakterienzellen zu verändern, die für die Gesundheit als günstig angesehen werden (sogenannte Probiotika), insbesondere Milchsäurebakterien oder Bifidusbakterien.
Die Einführung einer erheblichen Population dieser Bakterien in den Organismus entweder über den Umweg einer besonderen Ernährung oder durch direkte Einnahme dieser mikrobiellen Zellen wurde insbesondere zu dem Zweck vorgeschlagen, die Entwicklung von pathogenen und fäulniserregenden Arten zu begrenzen: es ist nämlich bekannt, daß die im Kolon vorhandene endogene Flora in verschiedene Bakteriengruppen aufgeteilt ist, von denen einige unschädlich, ja sogar vorteilhaft sind, während andere, insbesondere Clostridiums und Fäulniserreger zur Produktion von toxischen Substanzen führen und die Gesundheit negativ beeinflussen.
Der der Erfindung zugrunde liegende Gedanke bestand darin, regelmäßig in den Organismus auf oralem Wege eine erhebliche Menge einer probiotischen mikrobiellen Flora einzuführen, die in der Lage ist, die regelmäßige Synthese von kurzkettigen Fettsäuren im Bereich des Kolons zu begünstigen.
Unter den mikrobiellen Arten, die zu diesem Zweck eingesetzt werden können, sind die Milchsäurebakterien nur wenig geeignet, da sie naturgemäß insbesondere und vor allem Milchsäure und ganz sekundär etwas Essigsäure, aber keine Propionsäure noch Buttersäure erzeugen.
Im Gegensatz dazu sind Bakterien eines anderen Typs, die Propionsäure-Bakterien, in der Lage, Propionsäure und Essigsäure im Überfluß zu erzeugen, also die beiden kurzkettigen Fettsäuren, die dazu aufgerufen sind, die Gewebesysteme zu versorgen, dies z.B. nach einem Prozentsatz von 2/3 Propionsäure zu 1/3 Essigsäure. Diese Bakterien finden sich seit Jahrhunderten in der menschlichen Nahrung, insbesondere in Kochkäsesorten; darüber hinaus bieten sie den Vorteil, besser als die Milchsäurebakterien dafür ausgerüstet zu sein, eine Aktivität im Kolon, wo totale anaerobe Verhältnisse vorliegen, zu entfalten, und im übrigen resistenter gegenüber den technologischen Belastungen als die Milchsäurebakterien und die Bifidusbakterien zu sein.
Zu bemerken ist, daß in der Literatur bereits vorgeschlagen wurde, Propionsäure-Bakterien absorbieren zu lassen, insbesondere um die Entwicklung von Bifidusbakterien im Darm zu stimulieren (Dokument WO-97/19689) oder auch um Stickstoffmonoxid im menschlichen oder tierischen Darmtrakt freizusetzen (Dokument WO-98/27991). Jedoch ist bis heute niemand auf den Gedanken gekommen, diese Bakterien für die Produktion von kurzkettigen Fettsäuren im Bereich des Kolons zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von Propionsäure-Bakterien, ausgewählt nach ihrer gering autolytischen Eigenschaft und ihrer Fähigkeit, gegenüber Gallensalzen resistent zu sein, für den Erhalt einer Zusammensetzung einer täglichen Nahrung oder einer diätetischen oder medikamentösen Zusammensetzung, die vom Menschen oder Tier absorbierbar ist, in einer solchen Ausarbeitung, daß die Bakterien zumindest teilweise gegenüber der Magensäure geschützt sind, unter Einschluß von zumindest 10⁶ Zellen/Gramm der Bakterien, mit der Fähigkeit, die Synthese von Propionsäure und/oder von Propionat und ggf. von Essigsäure und/oder Acetat im Bereich des Kolons durch anaerobe Bakterienfermentation in signifikanter Weise zu stimulieren und zu erhöhen.
Damit diese Bakterien die erwartete günstige Wirkung entfalten können, ist es unerläßlich, gering autolytische Stämme zu wählen, die in der Lage sind, ohne Schaden zu nehmen, das Kolon zu erreichen, sich dort möglicherweise zu entwickeln und ausreichende Mengen an Propionsäure zu produzieren. Es ist allgemein bekannt, daß die beiden hauptsächlichen Belastungen, denen die eingeführten Bakterien bei ihrem Durchgang im oberen Bereich des Verdauungstraktes ausgesetzt sind, einer seits mit dem Säuremilieu des Magens (pH-Wert 4 bis 1) und andererseits mit dem Vorhandensein von Gallensalzen im Dünndarm (in der Größenordnung von 15 mmol/l als Maximalwert im Bereich des Zwölffingerdarms) verknüpft sind.
Es konnte nun festgestellt werden, daß Bakterien, die der Magensäure ausgesetzt werden, angegriffen werden und als Folge davon nicht in der Lage sind, gegenüber den Gallensalzen Resistenz zu zeigen, dies selbst dann, wenn sie bis zum Ausgang des Magens lebensfähig bleiben.
Somit ist es nach der Erfindung unerläßlich, den Propionsäure-Bakterien eine Behandlung zuteil werden zu lassen, die es ihnen ermöglicht, nicht der Magenbelastung ausgesetzt zu werden, was als allgemeine Regel eine Einkapselung bedeutet, die absichtlich oder unabsichtlich z.B. im Falle einer Nahrung aus Käse erfolgen kann.
Diese Umstände wurden dank einer Untersuchung zu Tage gefördert, durch die der Einfluß des pH-Säurewertes und der Gallensalze aufeinanderfolgend oder einzeln auf die Lebensfähigkeit zweier Stämme von Milchpropionsäure-Bakterien untersucht wurde, die der Sammlung TL des LRTL (Laboratoire de Recherches de Technologie laitiére – INRA, Rennes) angehören, und zwar sind dies die Stämme TL 162 und TL 24, die zur Spezies P. freudenreichii subsp shermanii gehören.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind nachfolgend beschrieben.
Die Bakterien wurden bei 30°C auf YEL-Medium zwei Tage lang (Beginn der stationären Phase) kultiviert. Die optische Dichte bei 650 nm betrug 2,28 und 2,64 für TL 162 bzw. TL 24.
Säurebelastung
Die Kulturen wurden auf 1/10 in S-Medium (Trypton-Lactat) auf den pH-Wert 2,5 verdünnt (endgültiger pH-Wert 3,0). Nach einer Inkubation bei 37°C über 45 min wurden die Kulturen zentrifugiert und die Bakterien in dem gleichen YEL-Volumen wieder aufgenommen. Es wurden Zählungen vor und am Ende der Inkubation vorgenommen, und die Wiederaufnahme des Wachstums wurde durch Messungen der optischen Dichte über 5 Tage bei 37°C verfolgt.
Gallenbelastung
Die Ausgangskulturen wurden zentrifugiert und die Bakterien in einem zehnmal größeren YEL-Volumen mit 0,3 % Rindergalle (bis zu ~ 50 % Gallensalze) aufgenommen. Nach einer Inkubation bei 37°C über 90 min wurden die Kulturen zentrifugiert und die Bakterien in dem gleichen YEL-Volumen wieder aufgenommen. Es wurden Zählungen vor und nach dem Ende der Inkubation vorgenommen, und die Wiederaufnahme des Wachstums wurde durch Messungen der optischen Dichte über 5 Tage bei 37°C verfolgt.
Säure- und Gallenbelastung aufeinanderfolgend
Die Bakterien wurden einer Säuerbelastung, wie oben beschrieben, ausgesetzt, jedoch wurden die Zellen nach der Zentrifugierung in YEL mit 0,3 % Galle aufgenommen. Nach einer zweiten Inkubation bei 37°C über 90 min wurden die Kulturen zentrifugiert und die Bakterien wieder in dem gleichen YEL-Volumen aufgenommen. Es wurden Zählungen vor und am Ende der Inkubation vorgenommen, und die Aufnahme des Wachstums wurde durch Messungen der optischen Dichte über 5 Tage bei 37°C verfolgt.
Die erhaltenen Resultate sind einerseits in der nachstehenden Tabelle 1 wiedergegeben, die den Einfluß der Säure- und/oder Gallenbelastung auf die Lebensfähigkeit der Bakterien angibt, und andererseits in der 1, die eine die Aufnahme des Wachstums nach den verschiedenen Belastungen darstellende Schemazeichnung ist.
Tabelle 1
Es konnte somit festgestellt werden, daß

– die Acidität eine erhebliche Sterberate der Bakterien zur Folge hat (96,8 % bei TL 162 und 97,5 % bei TL 24), was eine sehr lange Verzögerung für die Wiederaufnahme des Wachstums erklärt (1).
– die Galle keine Sterberate der Bakterien zur Folge hat, woraus sich eine sehr schnelle Wiederaufnahme es Wachstums erklärt.
– wenn man die Bakterien der Galle, nach einer vorhergehenden Säurebelastung, aussetzt, führt dies zu einer quasi totalen Sterblichkeitsrate der Bakterien. Dieses, gänzlich unerwartete, Ergebnis zeigt somit an, daß Bakterien, die einer Säurebelastung ausgesetzt waren und die dennoch lebensfähig geblieben sind, ganz empfindlich gegenüber der Galle werden, während die gleichen Bakterien ohne voraufgegangene Säurebelastung vollkommen resistent gegenüber den Gallensalzen sind.

In Ansehung dieser Umstände sind Versuche zur Vorgewöhnung durchgeführt worden, mit dem Ziel, die Resistenz der Bakterien zu erhöhen. Es ist nämlich bekannt, daß eine Säure-Vorbelastung (pH-Wert 4,5 – 5) die Zellen wirksam gegen eine Säurebelastung (pH-Wert 2) schützt.
Es wurden somit drei Gewöhnungsversuche an TL 162 durchgeführt:

– Säurevorbelastung: voraufgehende Inkubation der Zellen bei 37°C über 30 min bei einem pH-Wert 5
– Gallenvorbelastung: Inkubation über 30 min in Gegenwart von 0,08 % Galle
– Säure- und Gallenvorbelastung: Inkubation während 30 min bei einem pH-Wert 5 und in Gegenwart von 0,08 % Galle.

Es wurde das gleiche Protokoll wie zuvor angewandt, und man erhielt die in der nachstehenden Tabelle 2 angegebenen Resultate:
Tabelle 2
Es konnte somit festgestellt werden, daß eine Säurevorgewöhnung die Zellen noch mehr schwächt, während eine Gallenvorgewöhnung ohne Wirkung ist.
Diese Ergebnisse erlauben es somit, den Beweis für die Notwendigkeit anzutreten, die Belastungen aufeinanderfolgend anzuwenden und nicht getrennt, wie es im größten Teil der Untersuchungen beschrieben wird, die auf diesem Gebiet angestellt wurden.
Es steht indessen zu vermuten, daß die Bedingungen in vivo für die Bakterien weniger drastisch sind (Tampon-Effekt der Nahrung im Magen, geringere bakterizide Wirkung der Gallensalze in Mizelleform mit den Phospholipiden).
Unter Berücksichtigung des Vorstehenden ist zur Erhöhung der Menge lebensfähiger Bakterien eine Verbesserung ihrer Resistenz gegenüber einem sauren pH-Wert nicht wirksam, da die Bakterien empfindlich für die Wirkung der Gallensalze bleiben.
Im Gegensatz dazu können sich bei einem Schutz der Bakterien vor Säurebelastung, insbesondere durch vorkonditionierte Verabreichung in magenresistenten Gelkapseln, in den Fäzes Bakterien finden, die natürlicherweise gegenüber der Galle resistent sind, und dies auf einem erhöhten Niveau der Lebensfähigkeit.
Im Hinblick auf diese Ergebnisse wurde eine ergänzende Untersuchung angestellt, um die Eignung von verschiedenen Propionsäure-Bakterienstämmen zur Produktion von erheblichen Mengen an Propionsäure nach einem In-Kontakt-Bringen mit Gallensalzen zu vergleichen.
In dieser Untersuchung wurden 33 Stämme von Milchpropionsäure-Bakterien, die der Sammlung TL des LRTL (INKA, Rennes) angehören, auf ihre Fähigkeit des Überlebens in Gegenwart von Galle und der nachfolgenden Produktion von Propionsäure verglichen:

– 20 Stämme, die zur Spezies P. freudenreichii subsp shermanii gehören,
– 6 Stämme, die zur Spezies P. freudenreichii subsp freudenreichii gehören,
– 7 Stämme, die zur Spezies P. acidipropionici gehören.

Das Arbeitsprotokoll war wie folgt:
Es wurden Kulturen im Anfang der stationären Phase (2 bis 3 Tage Kultur im YEL-Medium, inkubiert bei 30°C) auf 1/10 im YEL-Medium mit einem Gehalt von 0,6 Rindergalle (etwa 7 – 8 mmol/l Gallensalze) verdünnt. Diese Gallenkonzentration wurde gewählt, um die Stämme unter sich besser zu unterscheiden, und stellt Ge halte an Gallensalzen der gleichen Größenordung dar wie diejenigen, die im Zwölffingerdarm anzutreffen sind.
Die Verdünnungen wurden bei 37°C über 30 min inkubiert und dann zentrifugiert. Die Bakterien wurden wieder im YEL-Medium (Ausgangsvolumen) aufgenommen und zur Inkubation bei 37°C gebracht.
Nach 24 Stunden der Inkubation wurde die optische Dichte bei 650 nm gemessen, um die Wiederaufnahme des Wachstums festzustellen. Der Überstand wurde abgeerntet und dann zum Dosieren der Fettsäuren tiefgefroren.
Für bestimmte Stämme bestätigte sich die Erfahrung in der Weise, daß die Ergebnisse bekräftigt werden.
Die Werte der optischen Dichte bei 650 nm vor der Gallenbelastung und 24 Stunden nach dem Ende der Belastung sind in der nachstehenden Tabelle 3 wiedergegeben:
Tabelle 3
Es ist zu bemerken, daß bei bestimmten Stämmen die endgültige DO größer ist als die anfängliche DO, was sich durch das bei 37°C und nicht bei 30°C, wie anfangs, aufgenommene Wachstum erklären kann.
In Abhängigkeit von den erhaltenen Ergebnissen können drei Gruppen von Stämmen schematisch unterschieden werden:

– die Stämme, die sich durch eine schnelle Wiederaufnahme des Wachstums unterscheiden, was eine schwache Sterblichkeit der Zellen aufgrund von Galle anzeigt (unter ihnen TL 34, TL 160, TL 63, TL 33, TL 15, TL 3, TL 162),
– Stämme, die gegenüber der Galle sehr wenig resistent sind, indem sie die Aufnahme eines sehr schwachen Wachstums oder von null Wachstums zeigen (TL 148, TL 4, TL 64, TL 47),
– mittlere Stämme, die durch eine gemäßigte Sterberate aufgrund von Galle gekennzeichnet sind (TL 146, TL 147, TL 167, TL 168, TL 14, TL 17, TL 22, TL 24, TL 61, TL 40, TL 54).

Allein die Stämme, die ein Verhältnis [(DO bei 24 h/Ausgangs-DO) × 100] über 60 (willkürlich gewählter Schwellenwert) besitzen, wurden für die Messung des Lactats, des Acetats und des Propionats durch Hochflüssigkeitschromatographie in den tiefgefrorenen Überständen ausgewählt. Der Ausgangsgehalt des YEL-Mediums an Lactat betrug 11,4 g/l.
Die Konzentrationen an Lactat, Acetat und Propionat der gewonnenen Überstände nach 24 Stunden Inkubation sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tabelle 4
Die Tabelle zeigt, daß, wie vorhersehbar, die produzierte Menge an Propionat mit dem Grad der Verwendung des Lactats im Zusammenhang steht.
Allgemein kann gesagt werden, daß die der Spezies P. acidipropionici angehörigen Stämme weniger Propionsäure in 24 Stunden produzieren als die Stämme der Spezies P. freudenreichii.
Mit Blick auf die oben angegebenen Ergebnisse erweisen sich bestimmte Stämme als bessere Kandidaten hinsichtlich der Produktion von Propionat nach dem Einwirken der Galle. Es handelt sich dabei um Stämme, die zumindest 2 g/l Propionat unter den oben beschriebenen Bedingungen produzieren:
TL 134, TL 50, TL 3, TL 19, TL 33, TL 249,
und vorzugsweise mehr als 4 g/l Propionat produzieren:
TL 160, TL 144, TL 34, TL 63, TL 142.
Es wurde im übrigen eine Untersuchung an gesunden Freiwilligen mit dem Ziel durchgeführt, den günstigen Einfluß von gastroresistenten Gelkapseln zur Verbesserung des Überlebens im Darm bei einem Stamm von Propionsäure-Bakterien aus Käse und Einnahme in tiefgefrorener Form (TL 162) zu überprüfen.
Die Untersuchung wurde an insgesamt 7 Einzelpersonen durchgeführt, mit 3 Behandlungsperioden von 4 Wochen, getrennt durch 3 dazwischenliegende Wochen.
Die Behandlung 1 bestand darin, über 2 Wochen 5 × 10⁹ cfu/Tag an Bakterien einzunehmen, die in nicht gastroresistenten Gelkapseln konditioniert waren.
Die Behandlung 2 bestand darin, über 2 Wochen 5 × 10¹⁰ cfu/Tag an Bakterien einzunehmen, die in nicht gastroresistenten Gelkapseln konditioniert waren.
Die Behandlung 3 bestand darin, über 2 Wochen 5 × 10⁹ cfu/Tag an Bakterien einzunehmen, die in gastroresistenten Gelkapseln konditioniert waren.
Für jede Behandlung wurden 4 Fäzes-Proben genommen, um die Propionsäure-Bakterien mit Hilfe eines selektiven Mediums (Palpropiobac^®, Standa-Industrie, mit Zusatz von 4 mg/l Metronidazol) aufzufinden. Die Daten der Proben waren:

– S1: kurz vor der Einnahmeperiode,
– S2: eine Woche nach dem Beginn der Einnahme,
– S3: zwei Wochen nach dem Beginn der Einnahme,
– S4: eine Woche nach dem Ende der Einnahmeperiode,
– HP (für die Periode 3): 3 Wochen nach dem Ende der Einnahmeperiode.

Während des gesamten Versuchs konnten die Freiwilligen keinen Käse verzehren, der Propionsäure-Bakterien in erheblicher Menge enthielt (Emmentaler, Comté, Leerdammer, Schweizer Gruyére,...) mit Ausnahme von Schmelzkäse.
Die Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse hinsichtlich der Lebensfähigkeit der Propionsäure-Bakterien in den Fäzes an.
Bei den gängigen Gelkapseln zeigt sich die Dosis von 5 × 10⁹ cfu/Tag (Periode 1) als nicht ausreichend, um lebensfähige Propionsäure-Bakterien in erheblicher Menge bei allen Freiwilligen aufzufinden. Dagegen beherbergen bei der Dosis von 5 × 10¹⁰ cfu/Tag (Periode 2) sämtliche Freiwillige mehr als log 5 cfu/g lebensfähiger Propionsäure-Bakterien in den Feces seit der ersten Behandlungswoche. Jedoch sind die bei den Dosen beobachteten Maximalwerte der Lebensfähigkeit nicht verschieden (log ~ 7).
Die Verwendung gastroresistenter Gelkapseln (Periode 3) verbessert die Lebensfähigkeit der Propionsäure-Bakterien in den Fäzes, insbesondere bei den Freiwilligen, bei denen wenige bei der ersten Behandlung gefunden wurden (Frw. 1, 2 und 6). Praktisch sind, mit Bezug auf die Periode 2, die erhaltenen Werte der Lebensfähigkeit im Mittel äquivalent.
– Auf der Grundlage von 5 × 10⁹ cfu/Tag rechtfertigt sich die Verwendung gastroresistenter Gelkapseln somit für eine bestimmt Anzahl von Einzelpersonen (Frw. 1, 2, 6), während sie bei den anderen die Lebensfähigkeit nicht oder nur wenig verbessern (Frw. 3, 4 und 5).
– Sie erbringen Ergebnisse, die nahezu äquivalent mit den 5 × 10¹⁰ cfu enthaltenden gängigen Gelkapseln sind.
Die Konzentrationen wurden in den Fäzes durch Chromatographie in Gasphase gemessen. Die Mengen an Propionat in den Fäzes sind in der Tabelle 6 angegeben. Für die statistische Analyse wurden zwei Gruppen von Werten 2 : 2 verglichen. Die Werte entsprechend den Fäzesproben, wo die Propionsäure-Bakterien nicht festgestellt wurden (log < 4), für sämtliche Behandlungen und Perioden, und die Werte entsprechend den Fäzesproben, wo die Propionatsäure-Bakterien mit mehr als log 6 cfu/g ermittelt worden sind. Im ersten Fall beträgt die mittlere Menge an Propionat 5,06 ± 2,56 μmol/g (n = 25), und im zweiten Fall beträgt sie 7,19 ± 3,18 μmol/g (n = 30). Diese beiden Werte unterscheiden sich in signifikanter Weise zu p < 0,02 (Student-Test). Bei den anderen Konzentrationen gibt es keine signifikanten Unterschiede. Dieser Versuch zeigt somit, daß das Vorhandensein von erheblichen Mengen (log > 6 cfu/g) an Propionsäure-Bakterien im Kolon im Anschluß an die Einnahme von TL 162 in signifikanter Weise die Menge an Propionat in den Fäzes er höht. Jedoch erweist sich der Stamm TL 162 nicht als der beste Kandidat zur Optimierung der Produktion von Propionsäure im Kolon (vgl. Auswahlkriterien in vitro); es ist wahrscheinlich, daß die Ergebnisse mit einem nach den vorstehenden Kriterien selektionierten Stamm verbessert werden können.
Tabelle 6: Konzentration von Propionat in den frischen Fäzes (in μmol/g
grau hinterlegte Felder: sämtliche Werte entsprechend den Proben mit Propionsäurebakterien über log 6 cfu/g
Im Hinblick auf die obigen Ausführungen und nach einem bevorzugten Merkmal der Erfindung werden die verwendeten Propionsäure-Bakterien unter den Stämmen ausgewählt, die Propionsäure-Bakterien in physiologisch signifikanter Menge produzieren und insbesondere unter den Stämmen, die zumindest 2 g/l Propionsäure und/oder Propionate und, vorzugsweise, mehr als 4 g/l Propionsäure und/oder Propionate produzieren, nachdem sie bei 30°C im YEL-Medium unter Einschluß von etwa 11,4 g/l Lactat über 2 bis 3 Tage kultiviert, dann auf 1/10 in einem YEL-Medium mit einem Gehalt von 0,6 % Rindergalle verdünnt, bei 37°C über 90 min inkubiert, zentrifugiert, im YEL-Medium wieder aufgenommen und wieder zur Inkubation bei 37°C über 24 Stunden gebracht wurden.
Ein anderes Auswahlkriterium, dem nach der Erfindung Rechnung getragen werden kann, steht in Verbindung mit den Adhäsionseigenschaften der Stämme an den Kolonozyten: solche Stämme, die mit guten Adhäsionseigenschaften ausgestattet sind, bieten nämlich den Vorteil, daß sie für längere Zeit im Kolon verbleiben, was ihnen mehr Zeit läßt, die Propionsäure zu synthetisieren; darüber hinaus können die Stämme, die sich festsetzen, die Stelle pathogener Agenzien einnehmen.
Es ist zu bemerken, daß es zur Erzielung der nachgesuchten Wirkung nicht in Betracht gezogen werden kann, die Propionsäure selbst absorbieren zu lassen, dies angesichts der Tatsache, daß sie aufgrund der menschlichen metabolischen Kette nicht bis zum Kolon gelangen könnte, und daß darüber hinaus gezeigt wurde, daß sie in hoher Dosis für den Magen schädlich ist.
Unter den vorteilhaften Wirkungen, die den im Bereich des Kolons synthetisierten kurzkettigen Fettsäuren und insbesondere der Essigsäure und vor allem der Propionsäure zugeschrieben werden, ist ihre Rolle auf der Ebene der Assimilierung von wichtigen Mineralien und insbesondere von Calcium, Eisen, Zink oder auch Magnesium zu beachten; es konnte nämlich festgestellt werden, daß die Propionsäure und, in einem geringeren Ausmaß, die Essigsäure die Absorption dieser Mineralien im Kolon und die Nutzung des absorbierten Anteils durch den Organismus begünstigen kann.
Es handelt sich hierbei um einen besonders interessanten Effekt angesichts dessen, daß die Assimilierung von Mineralien mit funktionalen Wirkungen einhergeht, wie beispielsweise die Verbesserung der Annämie hinsichtlich Eisen oder die Knochenmineralisierung hinsichtlich Calcium.
Die experimentellen und klinischen Untersuchungen, die durchgeführt worden sind, liefern ein Bündel übereinstimmender Argumente zur Stützung eines günstigen Effekts der Propionsäure und der Propionate und, in einem geringeren Ausmaß, der Essigsäure und der Acetate auf den Metabolismus dieser Mineralien; dieser Effekt ist wahrscheinlich von größerer Bedeutung, wenn die Verdauungsbedingungen schlecht sind, was dazu führt, daß eine erhebliche Menge nicht absorbierter Minerale durch den Dünndarm in den Kolonbereich mitgeführt wird, und auch, wenn ein erhöhter Bedarf besteht.
Das Vorhandensein von Beziehungen zwischen den kurzkettigen Fettsäuren und dem Metabolismus von Mineralien wurde insbesondere durch Versuche nahegelegt, die lösliche Fasern verwendeten. Es konnte dabei festgestellt werden, daß die Polysaccharide oder Oligosaccharide, die von den Verdauungsenzymen nicht verdaut und die damit zu kurzkettigen Fettsäuren (insbesondere zu Propionaten) durch die Kolonflora fermentiert werden, die Absorption von Mineralien, wie Calcium, Eisen oder Zink erhöhen und daß diese Steigerung um so deutlicher ausfällt, wenn die Bedingungen pathologisch sind (Mangelerscheinungen, Gastrektomie ...).
Versuche mit Koloninfusion und als Gegensatz das Fehlen einer Wirkung bei Kolektomie-Personen ermöglichte es, die Lokalisierung des Wirkungsortes im Kolonbereich zu bestätigen.
Es wurde außerdem bestätigt, daß diese Wirkungen mit einem Rückgang des pH-Wertes und einer Synthese von kurzkettigen Fettsäuren einhergehen; dieses läßt die Intervention dieser Säuren auf dem Umweg einer Fermentation annehmen, dies um so mehr, als festgestellt wurde, daß die unlöslichen Fasern, die nicht fermentierbar sind, keine Wirkung haben. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der Blinddarm hypertroph ist und daß der Blutfluß im Kolon ansteigt, was einen trophischen Effekt bezeugt.
Die zu diesem Thema durchgeführten klinischen Versuche sind nicht sehr zahlreich, sie ermöglichen es jedoch zu bestätigen, daß die Wirkungen löslicher Fasern durch Kolonfermentation erreicht werden, und unmittelbar die Wirkung der kurzkettigen Fettsäuren auf die Absorption von Mineralien aufzuzeigen.
Zu diesen Untersuchungen kann die Veröffentlichung "Trinidad TP, Wolever TMS, Thompson LU, Effect of acetate and propionate on calcium absorption from the rectum and distal côlon of humans. Am J Clin Nutr 1996, 63/574–578" erwähnt werden, die über Versuche berichtet, bei denen das distale Kolon gesunder Personen direkt Infusionen mit Essigsäure, Propionsäure oder ihrer Verbindung in physiologischer Konzentration erhielt; es konnte so festgestellt werden, daß der Abgang des Calciums aus dem Kolonkanal durch die beiden kurzkettigen Fettsäuren erhöht wird, jedoch in signifikanter Weise weit mehr durch die Propionsäure; diese Untersuchung hat auch einen Dosiereffekt bei der Unterstützung eines nicht sättigungsfähigen Absorptionssystems gezeigt. Andere haben die Auffassung vertreten, daß die größere Lipophilie der Propionsäure im Vergleich zur Essigsäure ihre Absorption und die Freisetzung im Kolonozyt von Protonen begünstigen könnte, deren Übergang in den Verdauungskanal die Absorption des Calciums somit begünstigen würde.
In Ansehung der vorstehenden Ausführungen betrifft die Erfindung ferner die Verwendung von Propionsäure-Bakterien, ausgewählt nach ihrer gering autolytischen Eigenschaft und ihrer Fähigkeit zur Resistenz gegenüber Gallensalzen, zum Erhalt einer von Mensch oder Tier absorbierbaren Zusammensetzung einer täglichen Nahrung oder einer diätetischen oder medikamentösen Zusammensetzung, in einer solchen Ausarbeitung, daß die Bakterien zumindest teilweise gegenüber der Gastroazidität geschützt sind, unter Einschluß von zumindest 10⁶ Zellen/Gramm der Bakterien, mit der Fähigkeit, die Assimilierung der hauptsächlichen Mineralien, insbesondere von Calcium und/oder Eisen und/oder Zink und/oder Magnesium im Bereich des Kolons zu fördern.
Gemäß einer Abwandlung der Erfindung ist ferner vorgesehen, diese Verwendung zum Erhalt einer Zusammensetzung anzuwenden, die fungizide Eigenschaften im Bereich des Kolons besitzt und insbesondere geeignet ist, die Entwicklung von pathogenen Mykodermen des Typs Candida/Soor zur reduzieren.
Diese Verwendung eignet sich, indem sie Vorteil aus den ausgezeichneten fungiziden Eigenschaften der Propionsäure zieht, insbesondere für die Behandlung von Candidosen, die auf Antibiotika zurückzuführen sind.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die nach der Erfindung verwendete Zusammensetzung gegebenenfalls auch andere Bakterien enthalten kann, insbesondere Milchsäurebakterien und/oder Bifidusbakterien, die fähig sind, in Synergie mit den Propionsäure-Bakterien zu wirken, derart, daß die oben erwähnten Wirkungen in der Lieferung von Lactat als fermentierbares Substrat verstärkt werden.
Die gemäß der Erfindung verwendete Zusammensetzung kann von einer trockenen oder wasserhaltigen Zubereitung in Form einzelner Fraktionen von etwa 100 mg bis 1 g, vorzugsweise von 200 bis 500 mg, unter Einschluß von vorzugsweise zumindest 10⁸ Zellen gebildet sein; sie kann besonders vorteilhaft in Form von Gelkapseln oder gastroresistenten Kapseln dargeboten werden.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung kann die Zusammenfassung auch von einer Zubereitungsausarbeitung gebildet sein, bei der die Propionsäure-Bakterien einem fermentierungsfähigen Substrat, insbesondere Nahrungsmittelfasern, zugegeben oder damit verbunden sind oder auch flüssigen, pastösen oder festen Nahrungsmitteln zugegeben oder in diese eingearbeitet sind.
Bei einer solchen Zubereitung können die Propionsäure-Bakterien eine doppelte Rolle spielen, nämlich eine technologische im ersten Zeitabschnitt über die Fermentation der Nahrungsstoffe und eine funktionale im zweiten Zeitabschnitt, da sie, einmal aufgenommen, in der Lage sind, das Kolon zu erreichen und dort die oben erwähnte probiotische Rolle zu spielen, insbesondere auf der Ebene der Optimierung der Synthese von Propionsäure und der Optimierung der Assimilierung von Mineralien.

Claims

Verwendung von Propionsäure-Bakterien, die zu schwach autolytischen Stämmen gehören und ausgewählt sind nach ihrer Fähigkeit zur Produktion von zumindest 2 g/l Propionsäure und/oder Propionaten und vorzugsweise von mehr als 4 g/l Propionsäure und/oder Propionaten nach einer Kultivierung bei 30° C in einem YEL-Medium unter Einschluß von etwa 11,4 g/l Laktat über 2 bis 3 Tage, danach Verdünnung auf 1/10 in dem mit 0,6 % Rindergalle angereicherten YEL-Medium, Inkubation bei 37° C über 90 Minuten, Zentrifugierung, Wiederaufnahme im YEL-Medium und Wiederaufnahme der Inkubation bei 37° C über 24 Stunden, zum Erhalt einer von Mensch oder Tier absorbierbaren Zusammensetzung einer täglichen Nahrung oder einer diätetischen oder medikamentösen Zusammensetzung, in einer solchen Ausarbeitung, daß die Bakterien zumindest teilweise gegenüber der Gastroazidität geschützt sind, unter Einschluß von zumindest 10⁶ Zellen pro Gramm der Bakterien, mit der Fähigkeit, die Synthese von Propionsäure und/oder Propionaten und ggf. von Essigsäure und/oder Azetaten im Bereich des Kolons durch anaerobe Bakterienfermentation in signifikanter Weise zu stimulieren und zu erhöhen.
Verwendung nach Anspruch 1, zum Erhalt einer Zusammensetzung, die geeignet ist, die Assimilierung der wesentlichen Mineralien, insbesondere von Kalzium und/oder Eisen und/oder Zink und/oder Magnesium, im Bereich des Kolons zu fördern.
Verwendung nach Anspruch 1, zum Erhalt einer Zusammensetzung, die fungizide Eigenschaften im Bereich des Kolons besitzt und insbesondere geeignet ist, die Entwicklung von pathogenen Mykodermen des Typs Candida/Soor zu reduzieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Propionsäurebakterien zu mit Haftungseigenschaften an den Kolonozyten ausgestatteten Stämmen gehören.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung von einer trockenen oder wasserhaltigen Zubereitung in Form einzelner Fraktionen von etwa 100 mg bis 1 g, vorzugsweise von 200 bis 500 mg, unter Einschluß von vorzugsweise zumindest 10⁸ Zellen gebildet ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung die Form von gastroresistenten Gelkörpern oder Kapseln aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung von einer Zubereitungsausarbeitung gebildet ist, bei der die Propionsäurebakterien einem fermentierungsfähigem Substrat, insbesondere Nahrungsmittelfasern, hinzugefügt oder damit verbunden sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung von einer Zubereitungsausarbeitung gebildet ist, bei der die Propionsäurebakterien Nahrungsmitteln wie flüssigen, pastösen oder festen Nahrungsmitteln zugegeben oder in diese eingearbeitet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung Milchsäurebakterien und/oder Bifidusbakterien umfaßt.