DE60125529T2

DE60125529T2 - MIKROORGANISMEN FüR DIE BEHANDLUNG ODER VORBEUGUNG VON FETTLEIBIGKEIT UND DIABETES MELLITUS UND PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN, DIE DIESE ENTHALTEN

Info

Publication number: DE60125529T2
Application number: DE60125529T
Authority: DE
Inventors: Bioneer Corporation Han-Oh Cheongwon-Kun PARK; Bioneer Corporation Hea-Jung Cheongwon-Kun JOUNG; Bioneer Corporation Bong-Cheol Cheongwon-Kun KIM; Bioneer Corporation Hang-Rae Cheongwon-Kun KIM; Bioneer Corporation Young-Bae Cheongwon-Kun BANG
Original assignee: Bioneer Corp
Current assignee: Bioneer Corp
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-02-24
Also published as: JP2001321163A; DE60125529D1; EP1282687B1; US6808703B2; CN1380902A; US20050112112A1; CN1380902B; AU3617001A; EP1282687A1; JP4580542B2; ATE349511T1; WO2001088095A1; US20030180271A1; US20020037577A1; US20030180273A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen zur Behandlung oder Verhütung von Fettleibigkeit oder Diabetes mellitus, welche eine Menge an Monosaccharid oder Disaccharid, die in den menschlichen Körper aufgenommen werden können, durch Umwandeln von Monosacchariden, wie etwa Glukose, Fruktose, Galaktose etc., sowie Disacchariden in Polymermaterialien, die im Darm nicht aufgenommen werden können, reduzieren.
Stand der Technik
Wie bekannt ist, ist die Fettleibigkeit als eine chronische Erkrankung beschrieben worden, die durch eine Menge von Faktoren verursacht wird, deren Ursprünge noch nicht eindeutig aufgedeckt worden sind. Die Fettleibigkeit ist bekannt gewesen als ein auslösender Faktor von arteriellem Bluthochdruck, Diabetes mellitus, koronarer Herzerkrankung, Erkrankung der Gallenblase, Osteoarthritis, Schlafapnoe, Atemwegsstörung, Endometrium-, Prostata-, Brust- und Colonkrebs etc.
Nach dem NIH-Report (The Evidence Report: Clinical guideline on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults, 1999, NIH) sind 97 000 000 Amerikaner übergewichtig und fettleibig, und die Anzahl an Patienten mit einem Typ-2-Diabetes mellitus erreicht ungefähr 15 700 000 Personen. Darüber hinaus wird berichtet, dass ungefähr 200 000 Personen in jedem Jahr an Erkrankungen starben, die mit Fettleibigkeit im Zusammenhang stehen (Dan Ferber, Science, 283, S. 1424, 1999).
Diabetes mellitus ist eine der am weitesten verbreiteten chronischen Erkrankungen weltweit, die erhebliche Kosten für die Öffentlichkeit ebenso wie für die Patienten mit Diabetes mellitus und ihre Familie mit sich bringt.
Weiterhin gibt es verschiedene Typen von Diabetes mellitus, welche durch verschiedene ätiologische Faktoren verursacht werden und deren Pathogenese sich voneinander unterscheidet.
Beispielsweise ist ein echter Diabetes mellitus gekennzeichnet durch hohe Blutglukosespiegel und Glykosurie, und es handelt sich um eine Art Kohlenhydratstoffwechselstörung, die durch eine unzureichende Bildung von Insulin oder durch unzureichende Wirkungen desselben verursacht wird.
Ein nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (non-insulin-dependent Diabetes mellitus, NIDDM) ist eine Erkrankung von Erwachsenen, die eine Insulinresistenz in einem peripheren Zielgewebe trotz einer normalen Funktion und Wirkung von Insulin aufweisen.
Ein nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) tritt aufgrund von drei wichtigen Stoffwechselstörungen auf, wie etwa der Insulinresistenz, der funktionellen Störung der Insulinsekretion, die durch Nährstoffe stimuliert wird, und die Überproduktion von Glukose in der Leber. Ein Versagen, den NIDDM zu behandeln (Steuerung des Blutglukosespiegels), führt zum Tod aufgrund einer Atheroskleroseerkrankung und kann zusätzlich späte Komplikationen eines Diabetes verursachen, wie etwa Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie.
Ein Therapie mit Sulfonylharnstoff- und Biguanidinverbindungen, ebenso wie eine Therapie aus Diät und körperlicher Bewegung sind in die NIDDM-Therapie eingeschlossen, um den Blutglukosespiegel zu steuern. Kürzlich konnten therapeutische Verbindungen, wie etwa Metformin oder Acarbose eingesetzt werden, um den NIDDM zu behandeln. Allerdings kann eine Hyperglykämie bei einigen der Diabetes mellitus-Patienten durch eine Therapie durch Diät und/oder Bewegung oder trotz einer Chemotherapie mit derartigen Verbindungen nicht gesteuert werden. Im Fall dieser Patienten sollte exogenes Insulin verabreicht werden.
Eine Verabreichung von Insulin ist eine sehr teure und für die Patienten schmerzhafte Methode. Weiterhin kann dies verschiedene nachteilige Zustände und verschiedene Komplikationen bei den Patienten verursachen. Beispielsweise kann eine Insulinantwort (Hypoglykämie) durch ein Fehlberechnen der Insulindosierung, Bedingungen ohne eine Mahlzeit und durch unregelmäßige Bewegung verursacht werden, und sie kann auch ohne besonderen Grund verursacht werden. Zusätzlich kann eine lokale Allergie oder eine Allergie des ganzen Körpers oder eine immunologische Resistenz gegenüber Insulin bei einer Insulininjektion auftreten.
Es gibt verschiedene Wege, um eine Fettleibigkeit und einen Diabetes mellitus zu verhüten oder zu behandeln, wie etwa eine Therapie aus Diät und Bewegung, eine chirurgische Opera tion oder eine Chemotherapie. Eine Therapie aus Diät und Bewegung ist eine Methode, bei der eine Diät mit niedriger Kalorienzahl und wenig Fett durchgeführt wird und bei der Bewegung durch Aerobic stattfindet, es wird jedoch allgemein erkannt, dass diese Methode bei einem Großteil der Öffentlichkeit nicht erfolgreich ist, da sie regelmäßig durchgeführt werden muss.
Eine Operation, um Körperfett physisch zu entfernen, hat sofortige Wirkung, sie weist allerdings einige Einschränkungen auf wegen des Risikos, das mit der Durchführung einer chirurgischen Operation verbunden ist, einer nicht dauerhaften Beständigkeit der Wirkung und aufgrund der sehr hohen Kosten.
Eine Pharmakotherapie mit Arzneimitteln, welche den Blutglukosespiegel senken, die Aufnahme von Glukose hemmen, die Wirkung von Insulin stärken oder eine Zügelung des Appetits auslösen können, ist eine Methode, die auf diesem Gebiet gegenwärtig am aktivsten entwickelt wird. Die Arzneimittel, die bis heute zur Behandlung und Verhütung von Fettleibigkeit und Diabetes mellitus entwickelt wurden, machen Gebrauch von verschiedenen physiologischen Mechanismen.
Einige Arzneistoffe, welche die Wirkung von Insulin verstärken, wie etwa Sulfonylharnstoff, Metformin, Pioglitazon oder Thiazolidindionderivate etc., sind entwickelt worden. Sulfonylharnstoff hat die Wirkung einer Stimulation der Insulinsekretion aus Beta-Zellen in das Pankreas, kann jedoch eine Nebenwirkung verursachen, die als Hypoglykämie bezeichnet wird, bei der der Blutglukosespiegel unter den normalen Wert absinkt.
Metformin wird hauptsächlich bei Patienten mit einem insulinunabhängigen Diabetes mellitus verwendet, die durch eine Therapie aus Diät oder Bewegung die Gesundheit nicht wiedererlangen würden. Dieses Arzneimittel hemmt die Glukoneogenese in der Leber und verstärkt die Glukosespeicherung im Muskel und im Fettgewebe. Allerdings ist bekannt gewesen, dass dieses Arzneimittel als Nebenwirkung Übelkeit, Erbrechen und Diarrhöe hervorruft.
Pioglitazon, entwickelt durch die japanische Takeda, verstärkt die Wirkung von Insulin durch Steigern der Empfänglichkeit einer Zelle für Insulin (Kobayashi M. et al., Diabetes, 41(4), S. 476-483, 1992).
Ein Beta-3-Adrenorezeptorinhibitor (BRL-35135), der als ein Arzneimittel bekannt ist, welches den Abbau von Körperfett stimuliert, baut Körperfett ab und wandelt es in Hitze um, indem es spezifisch an der Fettzelle wirkt, und senkt gleichzeitig den Blutglukosespiegel.
Der Inhibitor einer Pankreaslipase (Orlistat, hergestellt durch die schweizer Roche), der als ein Arzneimittel bekannt ist, welches die Aufnahme von Fett hemmt, reduziert die Aufnahme von Fett durch Hemmen der Funktion der Pankreaslipase, allerdings hemmt er auch die Aufnahme von fettlöslichem Vitamin und er kann Brustkrebs verursachen.
Im Allgemeinen vermindern die Arzneimittel, welche den Appetit hemmen, den Appetit, indem sie am Catecholamin im Gehirn wirken. Allerdings sind Nebenwirkungen von Dexfenfluramin und Fenfluramin eine Neurotoxizität und eine Erkrankung der Herzklappen. Auch Sibutramin hat als Nebenwirkungen ein Zunehmen der Herzschlagfrequenz und des Blutdrucks.
Ein α-Glukosidaseinhibitor (Acarbose, hergestellt durch die deutsche Bayer) ist als Arzneimittel zur Hemmung der Glukoseaufnahme bekannt. Acarbose ist ein Pseudo-Monosaccharid, welches die Wirkung von verschiedenen α-Glukosidasen, die in Mikrovilli des Gastrointestinaltrakts vorhanden sind, kompetitiv hemmt. Allerdings können diese, wenn eine große Menge davon eingenommen wurde, eine Diarrhöe auslösen (W. Puls et al., Front. Norm. Res. 2, 235, 1998).
Ein Amylaseinhibitor ist entwickelt worden, um ein Ungleichgewicht des Stoffwechsels zu verhüten, das auf eine übermäßige Nährstoffaufnahme zurückzuführen ist, indem die Wirkung von Amylase, Kohlenhydrate in Oligosaccharide zu überführen, gehemmt wird (Sanches-Monge R. et al. Eur. J. Biochem., 183, 37-40, 1989).
Das Aufnehmen von Ballaststoffen ist die einfachste Methode, um eine hemmende Wirkung auf die Fettleibigkeit zu erreichen, indem die Menge an Glukose und/oder Fett, die im Darm aufgenommen wird, mittels einer Diät mit einer Menge an Pflanzenfasen verringert wird. Allerdings sind mit dieser Methode einige Probleme verbunden insofern, als Ausstattung und Personal in erheblichem Umfang zur Herstellung von Ballaststoffen erforderlich sind, und die Produktivität davon ist sehr gering.
Polymermaterialien, wie etwa Isomaltotriose, Dextran und Pullulan, hemmen den Anstieg des Blutglukosespiegels, der auf die Aufnahme von Glukose zurückzuführen ist. Allerdings haben derartige Materialien ebenfalls schwere Nebenwirkungen. Beispielsweise kann Dextran durch Verlängerung der Blutgerinnugszeit eine ausgedehnte Blutung auslösen.
Unter den verschiedenen Arzneimitteln werden Ballaststoffe erkannt als das nützlichste Arzneimittel zur Verhütung oder Behandlung von Fettleibigkeit, da sie das menschliche Stoffwechselgleichgewicht nicht beschädigen und da sie eine natürliche Substanz sind.
Ballaststoffe aus Mikroorganismen werden durch Mikroorganismen produziert, wie etwa Gluconobacter sp., Agrobacterium sp., Acetobacter xylium, A. hansenii, A. pasteurianus, A. aceti, Rhizobium sp., Alcaligenes sp., Sarcina sp., Streptococcus thermophilus, Lactococcus cremoris, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sake, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp., Lactobacillus helveticusglucose var. jugurti, Leuconostoc dextranicum, Bulgaricus sp., Campestris sp., Sphingomonas sp.
Ballaststoffe, die durch diese Mikroorganismen hergestellt werden, werden als Stabilisator, Verdickungsmittel, Emulgator, hygroskopisches Mittel von verschiedenen Nahrungsmitteln und als Rohmaterialien von Kosmetika und Pharmazeutika verwendet. Zellulose aus Mikroorganismen, Xanthan, Acetan, etc., Guargummi, Johannisbrotkernmehr, Carrageenan, Alginat, aus Meeresalgen erhaltener Agar, werden zu Verkaufszwecken verwertet.
Der Stamm Lactobacillus sp. ist der Hauptbestandteil der normalen Bakterienflora im Darm des menschlichen Körpers. Seine wichtige Rolle beim Erhalten eines gesunden Verdauungsorgans und bei den Bedingungen der Vagina sind seit langen bekannt gewesen [Bible, D. J., ASM News, 54:661-665, 1988; Reid G. and A.W. Bruce, In H Lappin-Scott (de.), Bacterial biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, England, S. 274-281, 1995; Reid G., A.W. Bruce, J.A. McGroarty, K.J. Cheng und J.W. Costerton, Clin. Microbiol. Rev., 3:335-344, 1990]. Im Allgemeinen bewohnt der Stamm Lactobacillus das Verdauungsorgan (L. acidophilus, L. intestinalis, L. johnsonii, L. reuteri et al.), die Mucosa der Vagina (L. vaginalis, L. gasseri), Nahrungsmittel (Wein-L. hilgardii), Lactobacillus-Getränke (L. kefir, L. kefiranofaciens), Käse (L. casei), Essig (L. acetotolerans), die Mundhöhle (L. oris), Hefe (L. sake, L. ho mohiochi), Fruchtsaft (L. kunkeei, L. mali, L. suebicus), fermentierte Würste oder Fisch (L. farciminis, L. alimentarious) etc.
Viele Leute nehmen Gesundheitsnahrungsergänzungsmittel, welche den Stamm Lactobacillus sp. enthalten, um einen gesunden Darm zu erhalten oder um einer Infektion des Urogenitaltrakts vorzubeugen. Kürzlich sind die verschiedenen probiotischen Wirkungen von Lactobacillus, wie etwa die Steuerung der Immunität, die Steuerung des Cholesterinspiegels im Blut, die Verhütung von Krebs, die Behandlung von Rheumatismus, die Linderung einer Überempfindlichkeit gegenüber Lactose oder die Wirkung bei atopischer Dermatitis, zusätzlich zu der Verhütung von Diarrhöe, Obstipation und einer Infektion des Urogenitaltrakts, offenbart worden und das Interesse daran beginnt zu wachsen.
Gemäß der U.S Public Health Service Guideline werden alle der 262 Arten von Lactobacillus, die bei der ATCC hinterlegt sind, als „Bio-safety Level 1" klassifiziert, was dafür steht, dass es kein potentielles Risiko für die Verursachung einer Erkrankung bei Menschen und Tieren gibt, das bis jetzt bekannt wäre. Unter ungefähr 60 Stämmen von Lactobacillus gibt es keinen, der für den menschlichen Körper giftig wäre.
Kürzlich hat die Forschung an extrazellulären Ballaststoffen, die durch Lactobacillus hergestellt werden, deutliche Fortschritte gemacht. Es ist berichtet worden, dass ein Verfahren zum Herstellen von Ballaststoffen in diesen Stämmen sehr kompliziert ist, da eine Menge von Genen an diesem Verfahren beteiligt ist und da die Menge der auf diese Weise hergestellten Ballaststoffe sehr gering ist (Int. J. Food Microbiol., Mar 3 40:1-2, 87-92, 1998; Current Opinion in Microbiology, 2:598-603, 1999; Appl. Environ. Microbiol., Feb 64:2, 659-64, 1998; FEMS Microbiol. Rev. Apr 23:2 153-77, 1999; FEMS Microbiol. Rev. Sep 7:1-2, 113-30, 1990).
Auch sind verschiedene Untersuchungen zur Synthese von Zellulose durch Acetobacter sp., der als ein Mikroorganismus, der Ballaststoffe herstellt, gut bekannt ist, unternommen worden (Aloni Y., Cohen R., Benziman M., Delmer D, J Biological Chemistry 171:6649-6655, 1989; Ascher M., J. Bacteriology 33:249-252, 1937; Benziman M., Burger-Rachamimv H., J., Bacteriology 84:625-630, 1962; Brown AM. Journal of Polymer Science 59:155-169, 1962; Brown AM, Gascoigne JA, Nature 187:1010-1012, 1960; Calvin JR, Planta DP, Benziman M., Padan E, PANS USA 79:5282-5286, 1982; Dehmer DP. Brown RM Jr., Cooper JB, LIn FC, Science 230:82-825, 1985).
Acetobacter ist strikt aerob, weist jedoch Eigenschaften zum Überleben und Leben unter Bedingungen von sehr wenig Sauerstoff auf sowie die Eigenschaft, flottierend zu sein, um nach Sauerstoff zu suchen, indem Zelluloseballaststoffe aus sich selbst unter dieser Bedingung von sehr wenig Sauerstoff synthetisiert werden. Gemäß der Forschung im Hinblick auf die Menge und Rate, Glukose in Zelluloseballaststoffe durch Acetobacter umzuwandeln (Brown et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 73 (12), 4565-4569), setzt Acetobacter Glukose zu Zellulose mit einer Geschwindigkeit von 400 amol/Zelle/h um. Diese Rate entspricht einer Rate, bei der ungefähr 200 g Glukose in Zellulose durch 4 × 10¹⁵ Zellen pro Stunde umgesetzt werden können.
Es ist selten berichtet worden, dass es einen Acetobacter gibt, der Saccharose verstoffwechseln kann. Es gibt jedoch einen Acetobacter, der Saccharose zu Glukose umsetzen kann, in der Natur (PNAS 9: S. 14-18). Zur Zeit hat die FDA der Vereinigten Staaten Acetobacter xylinum zum Synthetisieren von Essigsäure und Sorbose zugelassen und das Bakterium als einen allgemein sicheren Mikroorganismus klassifiziert (GRAS: Generally Recognized As Safe).
Die WO 99/49877 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche Mikroorganismen umfasst, die Milchsäure herstellen, von denen gesagt wird, dass sie die Cholesterin- und Triglyzerinspiegel als eine nützliche Behandlung bei Patienten senken, die ein Risiko für, unter anderem, Diabetes aufweisen.
Die EP 0 194 794 A2 betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Mikroorganismen umfassen, die auch Milchsäure produzierende Bakterien sind, von denen gesagt wird, dass sie die nachteiligen Wirkungen eines α-Glukosidaseinhibitors, wie etwa Diarrhöe und Abdominlaldistension, verhüten, und deshalb zum Behandeln von Fettleibigkeit und Diabetes nützlich sind.
Wie oben erwähnt, hat es bis jetzt verschiedene Forschungen und Fortschritte gegeben, um die Arzneistoffe zur Behandlung oder Verhütung von Fettleibigkeit und Diabetes mellitus zu entwickeln, die Ergebnisse daraus waren jedoch unbefriedigend. Die verschiedenen oben erwähnten chemischen Substanzen sind zur medikamentösen Behandlung von Fettleibigkeit und Diabetes mellitus entwickelt worden, weisen jedoch verschiedene Nebenwirkungen auf.
Diese Arzneistoffe bauen Körperfett gemeinsam mit wertvollen Proteinen gewaltsam ab. Folglich gibt es nicht einen einzigen Arzneistoff zur Behandlung oder Unterdrückung von Fettleibigkeit und Diabetes mellitus von Beginn an.
Offenbarung der Erfindung
Deshalb besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Mikroorganismen verfügbar zu machen, die im Darm leben können und Oligosaccharid, das durch die Verdauungsenzyme hergestellt wird, zu nicht verdaubarem Polysaccharid umsetzen können, und dadurch die Menge an Oligosaccharid, das im Darm aufgenommen werden kann, deutlich reduzieren können.
Die andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung verfügbar zu machen, welche die genannten Mikroorganismen in einer pharmazeutisch wirksamen Menge enthält, die Fettleibigkeit oder Diabetes mellitus behandeln oder verhüten würde, indem an der Quelle die Menge an Oligosaccharid, die durch den Darm des menschlichen Körpers aufgenommen werden kann, reduziert wird.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in Form einer Tablette oder Kapsel mit einer pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, welche Hilfsstoffe, pharmazeutisch zulässige Vehikel und Träger, die abhängig von dem Verabreichungsweg ausgewählt werden, umfasst. Die pharmazeutische Formulierung der vorliegenden Erfindung kann weiterhin ergänzende aktive Bestandteile enthalten.
Laktose, Dextrose, Sukrose, Sorbitol, Mannitol, Stärke, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginsäuresalz, Treguhkenselatex, Gelatine, Calciumsilikat, feinkristalline Zellulose, Polyvinylpyrrolidon, Zellulose, Wasser, Sirup, Methylzellulose, Methylhydroxybenzoat und Propylhydroxybenzoat, Talcum, Magnesiumstearat oder Mineralöl können als Träger, Hilfsstoffe oder Verdünnungsmittel in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich kann die pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Gleitmittel, Feuchthaltemittel, Emulgatoren, Suspensionsstabilisatoren, Konservierungsstoffe, Süßstoffe und Geschmacksstoffe umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vor liegenden Erfindung kann als eine enterisch beschichtete Formulierung durch verschiedene Verfahren, die der Öffentlichkeit bereits bekannt sind, hergestellt werden, damit die aktiven Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung, d.h. Mikroorganismen, den Magen passieren können, ohne durch Magensaft beschädigt zu werden.
Weiterhin kann der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung in der Form einer Kapsel, die durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt wurde, verabreicht werden. Beispielsweise werden Standardvehikel und lyophilisierte Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung zusammengemischt und zu Pellets verarbeitet, und dann werden die Pellets in Hartgelatinekapseln gefüllt. Zusätzlich wird der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch zulässige Vehikel, beispielsweise wässriges Gummi, Zellulose, Silikat oder Öl gemischt, um eine Suspension oder Dispersion herzustellen, und dann wird diese Suspension oder Dispersion in eine Weichgelatinekapsel gefüllt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann zu einer enterisch beschichteten Tablette zur oralen Verabreichung verarbeitet werden. Der Begriff „die enterische Beschichtung" dieser Anmeldung schließt alle herkömmlichen pharmazeutisch zulässigen Beschichtungen ein, die durch Magensaft nicht abgebaut werden können, die allerdings im Dünndarm ausreichend zersetzt werden können, um die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung rasch freizusetzen.
Die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung wird für mehr als zwei Stunden in dem synthetischen Magensaft, wie etwa HCl-Lösung bei pH 1 bei der Temperatur von 36°C bis 38°C, aufbewahrt, und sie wird innerhalb von 0,5 Stunden in dem synthetischen Darmsaft, wie etwa KH₂PO₄-Pufferlösung bei pH 6,8, zersetzt.
Die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung wird auf jede Tablette mit der Menge von ungefähr 16 bis 30 mg, vorzugsweise 16 bis 25 mg, stärker bevorzugt 16 bis 20 mg geschichtet. Die Dicke der Beschichtung der vorliegenden Erfindung beträgt 5 bis 100 μm, vorzugsweise 20 bis 80 μm. Die Bestandteile der enterischen Beschichtung werden in geeigneter Weise ausgewählt aus üblichen Polymermaterialien, die der Öffentlichkeit gut bekannt gewesen sind. Die Polymermaterialien, die zum enterischen Beschichten der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden in den folgenden Artikeln aufgezählt und beschrieben [The Theory and Practices of Industrial Pharmacy, 3. Aufl., 1986, S. 365-373 von L. Lachman, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, S. 355-359 von H. Sucker, Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, 4. Aufl. Band 7, S. 739, 742, 766 und 778, Springer Verlag, 1971), und Remington's Pharmaceutical Sciences, 13. .Aufl., S. 1689 und 1691 (Mack Publ., Co., 1970)]. Beispielsweise können Zelluloseesterderivat, Zelluloseether und ein Copolymer aus Acryl und Methylacrylat oder Maleinsäure oder Phtalsäurederivat in der enterischen Beschichtung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die bevorzugten enterischen Beschichtungen der vorliegenden Erfindung werden aus Polymeren von Zelluloseacetatphthalat oder Trimellitat und Methacrylat-Copolymer hergestellt (beispielsweise Copolymer aus mehr als 40% Methacrylsäure und Methacrylsäure, die Hydroxypropylmethylzellulosephthalat oder Derivate von Estern davon enthält).
Endragit L 100-55, hergestellt durch die deutsche Röhm GmbH, kann als ein Rohmaterial für die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Zelluloseacetatphthalat, das in der enterischen Beschichtung der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, weist eine Viskosität von ungefähr 45 bis 90 cP, Acetylgehalte von 17 bis 26% und Phthalatgehalte von 30 bis 40 % auf. Das in der enterischen Beschichtung verwendete Zelluloseacetattrimellitat weist eine Viskosität von ungefähr 15 bis 21 cP, Acetylgehalte von 17 bis 26% und Trimellitylgehalte von 25 bis 35% auf. Das Zelluloseacetat Trimellitat, das durch die Eastman Kodak Company hergestellt wird, kann als ein Material für die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Hydroxypropylmethylzellulosephthalat, das in der enterischen Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, weist ein Molekulargewicht von im Allgemeinen 20 000 bis 130 000 Da, vorzugsweise 80 000 bis 100 000 Da auf, und weist Hydroxypropoxygehalte von 5 bis 10%, Methoxygehalte von 18 bis 24% und Phthalylgehalte von 21 bis 35 % auf. Zelluloseacetatphthalat, das durch die Eastman Kodak Company hergestellt wird, kann als ein Material für die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Hydroxypropylmethylzellulosephthalat, das in der enterischen Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist HP50, das durch die japanische Shin-Etsu Chemical Co. Ltd. hergestellt wird. Das HP50 weist Hydroxypropoxygehalte von 6 bis 10%, Methoxygehalte von 20 bis 24 %, Propylgehalte von 21 bis 27% auf, und das Molekulargewicht beträgt 84 000 Da. Ein anderes Material zum enterischen Beschichten, das durch die Shin-Etsu Chemical Co. Ltd. hergestellt wird, ist HP55. HP55 kann auch als Material der enterischen Beschichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das HP55 weist Hydroxypropoxygehalte von 5 bis 9%, Methoxygehalte von 18 bis 22%, Phthalatgehalte von 27 bis 35% auf, und das Molekulargewicht beträgt 78 000 Da.
Die enterische Beschichtung der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, das in einem Aufsprühen der enterischen Beschichtungslösung auf den Kern besteht, hergestellt. Die in dem Verfahren des enterischen Beschichtens verwendeten Lösungsmittel sind Alkohol wie etwa Ethanol, Keton wie etwa Aceton, halogenierter Kohlenwasserstoff wie etwa Dichlormethan, oder es kann die Mischung daraus verwendet werden. Weichmacher, wie etwa Di-n-Butylphthalat und Triacetin werden der enterischen Beschichtungslösung im Verhältnis von einem Teil Beschichtungsmaterial zu ungefähr 0,05 oder ungefähr 0,3 Teilen Weichmacher zugesetzt.
Das Sprühverfahren wird vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt, und die Menge an aufgesprühten Materialien kann in Abhängigkeit von der Bedingung des Beschichtungsverfahrens gesteuert werden. Der Sprühdruck kann auf verschiedene Weise reguliert werden, und im Allgemeinen kann ein wünschenswertes Ergebnis unter dem Druck von im Mittel 1 bis 1,5 bar erhalten werden.
Die „pharmazeutisch wirksame Dosierung" dieser Beschreibung bedeutet die geringste Menge des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, welche die Menge an Oligosaccharid, das in den Körper in den Därmen von Säugetieren aufgenommen wird, reduzieren kann. Die Menge an Mikroorganismen, die einem Körper mit der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, kann in Abhängigkeit von dem Verabreichungsverfahren und dem Individuum, an das die Verabreichung erfolgt, angepasst werden.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann einmal oder mehrmals am Tag an das Individuum verabreicht werden. Die Einheit einer Verabreichungsmenge bedeutet, dass sie physisch getrennt ist und folglich als Verabreichungseinheit für den Menschen und alle anderen Säugetiere geeignet ist. Und jede Einheit enthält einen pharmazeutisch zulässigen Träger und die Menge des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, die bei der Therapie wirksam ist.
In der oralen Verabreichungseinheit für einen erwachsenen Patienten sind die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einer Menge von 0,1 g oder mehr enthalten, und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beträgt 0,1 bis 10 g bei jeder Verabreichung, vorzugsweise 0,5 bis 5 g. Die pharmazeutisch wirksame Dosierung von Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung beträgt 0,1 g pro 1 Tag.
Allerdings ist die Verabreichungsmenge veränderbar, was von dem Gewicht und der Schwere der Fettleibigkeit des Patienten, den enthaltenen ergänzenden aktiven Bestandteilen und den darin verwendeten Mikroorganismen abhängt. Zusätzlich ist es möglich, die tägliche Verabreichungsmenge aufzuteilen und, falls nötig, kontinuierlich zu verabreichen. Deshalb schränkt der Bereich der genannten Verabreichungsmenge den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
Die „Zusammensetzung" der vorliegenden Erfindung bezieht sich nicht nur auf medizinische Produkte, sondern auch auf solche, die als funktionelle Nahrungsmittel und Gesundheitsergänzungsnahrungsmittel dienen.
Falls die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung periodisch eingenommen wird, bilden Mikroorganismen im Darm Kolonien und unterbrechen die Aufnahme von Oligosaccharid im Körper vollständig. Auch schaffen nicht verdaubare Fasern, die durch Mikroorganismen produziert werden, eine gesunde Bedingung für andere nützliche Mikroorganismen im Darm und stimulieren die Darmaktivität. Folglich wirkt die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, um Fettleibigkeit und Diabetes mellitus zu behandeln und zu verhüten.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die oben beschriebenen Aufgaben und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden deutlicher werden, indem eine bevorzugte Ausführung davon unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen genau beschrieben wird, von denen:
1 der Graph ist, der die Aufnahmerate von Glukose durch eine Reihe von Mikroorganismen veranschaulicht.
2 der Graph ist, der die Änderung des Blutglukosespiegels nach Aufnehmen der drei verschiedenen Mikroorganismen veranschaulicht.
3 der Graph ist, der die Änderung der Energiestoffwechseleffizienz von fettleibigen Mäusen, welche die drei verschiedenen Mikroorganismen aufgenommen haben, veranschaulicht.
4 das phylogenetische Analysediagramm von Lactobacillus BC-Y009 auf der Grundlage der 16S rRNA-Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung ist.
Bester Weg zum Ausführen der Erfindung („Best Mode")
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben werden.
Der Mikroorganismus, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Verhüten und Behandeln von Fettleibigkeit und Diabetes mellitus verwendet werden kann, sollte die Voraussetzungen erfüllen, 1) in der Lage zu sein, in den Darmschichten zur proliferieren, 2) in der Lage zu sein, Oligosaccharid schnell aufzunehmen und in nicht verdaubare oder schwer verdaubare Materialien mit hohem Molekulargewicht (hochmolekulare Materialien) wie etwa faserige Materialien umzusetzen, 3) unschädlich für den menschlichen Körper und für Tiere zu sein.
Der Mikroorganismus der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist Lactobacillus BC-Y009.
Um den neuen Mikroorganismus, der die Voraussetzungen erfüllt und der als ein aktives Prinzip der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, zu isolieren und zu erhalten, haben die Erfinder der vorliegende Erfindung Folgendes erforscht.
Mit Proben von Mikroorganismen, die aus Glukoseindustrieabwasser und anderen Orten gewonnen wurden, wurden MRS- und BHS-Agarmedien, die Cycloheximid enthielten, beimpft und dann kultiviert. Die im Agarmedium gebildeten Kolonien wurden dann auf MRS- und BHS-Flüssigmedium überimpft und ohne Schütteln inkubiert. Mikroorganismen, die eine Matrix oder eine Membranform auf den obersten Schichten des Mediums bildeten, wurden ausgewählt. Die gebildeten Membranen wurden abgetrennt und darauf untersucht, ob die abgetrennten Membranen durch die Verdauungsenzyme des Darms abgebaut werden. Die Ergebnisse bestimmten, ob unverdauliche (oder schwer verdauliche) hochmolekulare Verbindungen hergestellt wurden oder nicht. Unter den Mikroorganismen wird BC-Y009 aufgrund seiner hohen Produktivität in Bezug auf extrazelluläres Polysaccharid (Ballaststoffe) ausgewählt.
Nach Beurteilen der Morphologie von BC-Y009 und Vergleichen mit partiellen DNA-Sequenzen der 16S rRNA wurde bestätigt, dass jede einen hohen prozentualen Anteil an Sequenzhomologie beim Vergleich mit Lactobacillus und Acetobacter aufwies. Auf der Grundlage des Phänotyps und der 16S rRNA/DNA-Sequenzanalyse wurde festgestellt, dass es sich bei BC-Y009 um einen neuen Mikroorganismus handelt, der zur Gattung Lactobacillus gehört.
Lactobacillus BC-Y009 der vorliegenden Erfindung wurde einer Maus verabreicht, bei der eine Fettleibigkeit und ein Diabetes mellitus ausgelöst worden war. Der Blutglukosespiegel einer Versuchsmaus war nach der Verabreichung um ungefähr 70% erniedrigt.
Diese Ergebnisse bestätigten, dass Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung eine Wirkung beim Senken des Blutglukosespiegels aufweisen, und sie folglich zum Behandeln und Verhüten von Diabetes mellitus wirksam sind.
Wenn BC-Y009 an eine Maus, bei der ein Diabetes mellitus und eine Fettleibigkeit induziert worden waren, verabreicht wurde, stieg die Rate der Futteraufnahme im Vergleich zu einer Kontrollmaus um 17 bis 24% an. Die Gewichtszunahme war jedoch im Vergleich zur verbrauchten Futtermenge vermindert. Das Ergebnis zeigt folglich, dass die Zusammensetzung mit dem Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung es ermöglicht, dass Menschen Nahrung aufnehmen, ohne sich um Fettleibigkeit oder Diabetes mellitus sorgen zu müssen.
Wenn diese Mikroorganismen aufgenommen werden, ist auch die Blutlipidmenge geringer als in der Kontrollgruppe, so dass die Information gewonnen wurde, dass die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung das Auftreten von Diabetes mellitus, Fettleibigkeit und Kreislauferkrankungen (beispielsweise Atherosklerose, Myokardinfarkt) steuern können.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt werden. Die Beispiele werden nur zur Veranschaulichung der Erfindung gegeben und beabsichtigen nicht, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1: Auswahl eines Mikroorganismus, der extrazelluläres Polysaccharid aus Proben herstellt
Um Mikroorganismen zu isolieren, die Ballaststoffe herstellen, wurden Proben aus Glukoseindustrieabwasser oder von anderen Orten gewonnen. 10 g der auf diese Weise gewonnenen Mischung wurden aufgebrochen und in 90 ml physiologische Salzlösung (0,85% NaCl) suspendiert. Die genannten suspendierten Proben wurden 10^–2, 10^–4 und 10^–6 in physiologischer Salzlösung verdünnt. Diese verdünnten Proben wurden dann auf MRS-Agarmedium, das 1 mg Cycloheximid pro 100 ml Medium (1% Pepton, 1% Rinderextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 2% Glukose, 0,1% Tween-80, 0,2% Zitronensäureammonium, 0,5% Natriumacetat, 0,01% MgSO₄, 0,005% Mn SO₄, 0,2% Natriumphosphat, pH 6,5) enthielt, und auf BSH-Agarmedium (2% Glukose, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,27% Na₂PO₄, 0,115% Zitronensäure, pH 5,0) (Hestirin und Schramm, J. Gen. Microbiol. 11:123, 1954) ausgestrichen und bei 30°C 72 Stunden kultiviert. Ungefähr 2000 Kolonien wurden ausgewählt, und es wurden damit 5 ml MRS-Flüssigmedium und BSH-Flüssigmedium bei 30°C beimpft, und es wurde 72 Stunden ohne Schütteln kultiviert. Der Mikroorganismus, der eine Membranform auf der oberen Schicht des Flüssigmediums bildet und der Mikroorganismus, der kapselförmiges extrazelluläres Polysaccharid bildet und dessen Medium durchsichtig war, wurden ausgewählt. Mit diesen Mikroorganismen wurden wieder 5 ml MRS-Flüssigmedium um BSH-Flüssigmedium beimpft, und es wurde bei 30°C gerührt, und es wurde die Absorption bei 600 nm durch ein Spektrofotometer gemessen. Die Mikroorganismen wurden mit BSH-Flüssigmedium verdünnt, bis dessen Absorption 0,2 erreichte. Mit 10 ml von auf diese Weise verdünnten Mikroorganismen wurden 100 ml BSH-Flüssigmedium bei 30°C beimpft, und es wurde 72 Stunden ohne Schütteln kultiviert.
Um die auf diese Weise hexgestellte Menge an extrazellulärem Polysaccharid (Ballaststoffen) zu messen, wurde jedes Medium bei 6000 Upm bei 4°C zentrifugiert, um die Präzipitation von Mikroorganismen zu erreichen. Die Zellmembranen wurden durch alkalische Lyse in 0,1 N NaOH-Lösung aufgebrochen und bei 80°C 30 Minuten stehen gelassen und bei 6000 Upm bei 4°C zentrifugiert, wobei das oben beschriebene Verfahren mehrfach vollständig wiederholt wurde. Extrazelluläres Polysaccharid, verwickelt wie weiße Fäden, wurde isoliert und lyophilisiert, um die Menge davon zu messen. Mikroorganismen mit einer hohen Produktivität an extrazellulärem Polysaccharid wurden ausgewählt und die extrazellulären Produktivitäten wurden miteinander verglichen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Vergleich der Produktivität von extrazellulärem Polysaccharid
Beispiel 2: Morphologische Bestimmung und die Kennzeichen der ausgewählten BC-Y009 und BC-Y058
Die Mikroorganismen, die eine hohe Polysaccharidproduktivität zeigen und aus dem Beispiel 1 ausgewählt wurden, waren BC-Y009, BC-Y002, BC-Y015, BC-Y026, BC-Y058, BC-Y112, BC-Y130, BC-Y201. Nach Feststellen der partiellen DNA-Sequenzen waren BC-Y009, BC-Y002, BC-Y015 und BC-Y026 Mikroorganismen der Gattung Lactobacillus, und BC-Y058, BC-Y112, BC-Y130 und BC-Y201 waren Mikroorganismen der Gattung Acetobacter.
Von diesen Bakterien wurden mit BC-Y009 und BC-Y058, die eine hohe Polysaccharidproduktivität zeigten, MRS- und BSH-Flüssigmedien bei 30°C beimpft, und es wurde 72 Stunden in Suspension kultiviert. Die kultivierten Medien wurden bei 6000 Upm bei 4°C zentrifugiert, um die Mikroorganismen zu erhalten, und die Nukleinsäuren davon wurden unter Verwendung der CTAB/NaCl-Methode isoliert. Unter Verwendung von 16S rRNA-Konsensusprimern wurde die 16S rRNA mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert und die auf diese Weise erhaltene Sequenz wurde bestimmt. Eine BLAST-Analyse (NCBI, USA) der auf diese Weise erhaltenen Sequenz wurde durchgeführt und ihr Ergebnis zeigte einen hohen Prozentsatz einer Homologie mit den Sequenzen von Lactobacillus hilgardii, Acetobacter xylinum, Gluconobacter sp., einer Reihe anderer Lactobacillus sp. und Acetobacter sp. (Tabelle 2 und 3).
Tabelle 2: Vergleich der 16S rRNA-Nukleotidsequenz von Lactobacillus sp. BC-Y009
Unter 1400 Basenpaaren, die zum Vergleich aufgenommen wurden, gibt der obere rechte Bereich der Tabelle die Anzahl an Basenpaaren an, welche einen Unterschied zeigen, der untere linke Bereich der Tabelle gibt die Homologie in % an.
Tabelle 3: Vergleich der 16S rRNA-Nukleotidsequenz von Acetobacter sp. BC-Y058
Unter 1320 Basenpaaren, die zum Vergleich aufgenommen wurden, gibt der obere rechte Bereich der Tabelle die Anzahl an Basenpaaren an, welche einen Unterschied zeigen, der untere linke Bereich der Tabelle gibt die Homologie in % an.
BC-Y009 ist ein gram-positives Bakterium und weist eine Größe von 0,5 bis 3,0 μm auf. Es handelt sich um ein unbewegliches Bakterium mit der Form kurzer Stäbchen. Es bildet keine Sporen und ist fakultativ anaerob. Die Wachstumstemperatur beträgt zwischen 20°C und 37°C, und der pH-Wert beträgt 2,0 bis 8,0, und der optimale pH-Wert beträgt 4,0 bis 7,0. Die Ergebnisse der Experimente zeigten, dass dieser Mikroorganismus in Milch kondensiert war und in Bezug auf die Katalase negativ (unreaktiv) war und in komplexem Medium eine weißgefärbte Kolonie bildete. Das Bakterium war in MRS-Flüssigmedium und BSH-Flüssigmedium in Form von weißgefärbten Kapseln präzipitiert. Die Trübung des Flüssigmediums war deutlich, und der Mikroorganismus produzierte extrazelluläres Polysaccharid in klarem Medium, und falls das Flüssigmedium geschüttelt wurde, wurde das extrazelluläre Polysaccharid (Ballaststoffe) in kleine Teile zerbrochen.
BC-Y058 ist ein gram-negatives Bakterium, ein stäbchenförmiges Bakterium und weist eine Größe von 0,6 bis 0,8 μm auf und kommt einzeln oder paarweise vor. Es ist ebenfalls unbeweglich und bildet keine Sporen. Die Wachstumsrate ist gering, weshalb eine Inkubationszeit von 5 bis 7 Tagen erforderlich ist, und gebildete Kolonien sind klein und fest. In Flüssigmedium wird eine klare Haut gebildet. Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure können als Substrate verwendet werden, und es wurde eine positive Katalaseantwort gezeigt. Dieser Mikroorganismus produziert Säure unter Verwendung von Glukose, und in Hoier-Medium kann er nicht wachsen.
Nach Berücksichtigung des Ergebnisses der Analyse des Phänotyps und der 16S rRNA/DNA-Sequenz wurde BC-Y009 als Lactobacillus sp. BC-Y009 und BC-Y058 als Acetobacter sp. BC-Y058 bezeichnet. Sie wurden bei der KCTC (Korean Collection for Type Cultures) am 30. Mai 2000 hinterlegt, und es wurden die Hinterlegungsnummern KCTC-0774 BP bzw. KCTC-0773 BP zugeteilt.
Beispiel 3: Ausmaß des Abbaus von extrazellulärem Polysaccharid (Ballaststoffe) durch Verdauungsenzyme des Darms
Um zu bestimmen, ob Ballaststoffe, die durch die genannten Mikroorganismen produziert werden, durch Verdauungsenzym des Darms abgebaut werden oder nicht, wurden 1 g Schweinepankreatin, das eine Aktivität von 3 x U.S. Pharmacopeia (hergestellt durch Sigma) zeigte, und Amylase, Lipase, Protease und Nuklease umfasst, in Pufferlösung (pH 7,4) mit 1 g getrockneter Ballaststoffe suspendiert. Diese Suspension wurde 7 Tage bei 40°C inkubiert, und die Suspension wurde einmal täglich geerntet, und die Glukose darin wurde unter Verwendung von DNS (3,5-Dinitrosalicylsäure) quantitativ bestimmt. Das Ergebnis davon zeigte, dass Ballaststoffe niemals vollständig abgebaut wurden.
Damit wurde bestätigt, dass die Ballaststoffe, die durch die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung produziert wurden, sich im Darm nicht zersetzen.
Beispiel 4: Glukoseaufnahmerate von Bakterien
Es wurden die Glukoseaufnahmeraten von Lactobacillus acidophilus (KCTC 3140), L. hilgardii (KCTC 3500), bekannt als Probiotica, und der genannten Lactobacillus BC-Y009, Acetobacter BC-Y002, Acetobacter BC-Y058 sowie von E. coli unter Bedingungen des Darms gemessen. Die Ergebnisse werden in 1 und Tabelle 4 dargestellt.
Wie in 1 und Tabelle 4 veranschaulicht, sind die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung den anderen Milchsäurebakterien in Bezug auf die Glukoseaufnahmerate überlegen.
Tabelle 4: Durch die Bakterien verringerte Glukosekonzentration in O.D.-Einheit pro Zeiteinheit.
Beispiel 5: Konzentration und Überlebensrate von Mikroorganismen im Darm nach Verabreichung von Mikroorganismen
C57BL/6J Lep^ob ob/ob-Mäuse mit einer genetisch ausgelösten Fettleibigkeit und einem Diabetes mellitus (im Folgenden als „OB-Maus" bezeichnet), wurden 18 Stunden hungern gelassen und mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung (die Anzahl an Mikroorganismen in der Zusammensetzung betrug 1,0 × 10¹³ CFU/g), die 1 % Lactobacillus BC-Y009, Acetobacter BC-Y058 (Gew.-%, Trockengewicht) enthielt, 7 Tage lang gefüttert, und dann wurde die Konzentration an Bakterien im Duodenum, Jejunum und Dickdarm dieser Mäuse analysiert. Zusätzlich wurde die Konzentration an Bakterien im Duodenum, Jejunum und Dickdarm der Kontroll-OB-Maus, die mit Futter gefüttert worden ist, das die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung nicht enthielt, analysiert.
Um die Menge an Lactobacillus zu messen, wurde das Duodenum, das Jejunum und der Dickdarm der Maus, die mit Lactobacillus-Futter gefüttert worden ist, sowie der Kontroll-Mäuse entnommen. Die Oberflächen der Organe wurden mit physiologischer Salzlösung gespült und die Inhalte wurden in physiologischer Salzlösung suspendiert. Dann wurde MRS-Agarmedium beimpft und bei 37°C inkubiert. 3 Tage später wurde die Menge an Bakterien durch Flockenzählung und Subtrahieren der Menge an Lactobacillus in der Kontrollgruppe gemessen, um die Änderung der Menge an Bakterien zu bestimmen (Tabelle 5).
Um die Anwesenheit von Acetobacter zu bestätigen, wurden der Maus alle Organe entnommen, dann wurden die Oberflächen der Organe mit physiologischer Salzlösung gespült. Die Inhalte wurden in physiologischer Salzlösung suspendiert, dann wurde BSH-Flüssigmedium damit beimpft und bei 37°C 3 Tage lang inkubiert. Durch Überprüfen der Haut, die auf der obersten Schicht des Flüssigmediums erschien, wurde die Anwesenheit von fasernproduzierendem Acetobacter bestätigt (Tabelle 6).
Nach den in Tabelle 5 und Tabelle 6 gezeigten Ergebnissen waren die beiden genannten Arten von Mikroorganismen beide in der Lage, im Darm zu proliferieren.
Tabelle 5: Menge an Lactobacillus sp. im Duodenum, Jejunum und Dickdarm der Maus
Tabelle 6: Menge an Acetobacter sp. im Duodenum, Jejunum und Dickdarm der Maus
Beispiel 6: Änderung des Blutglukosespiegels nach Füttern mit BC-Y009 und BC-Y058
100 g Mäusefutter, bezogen von SAMYANG Co., und 400 g koreanischer Reis wurden gemischt, um die Zusammensetzung herzustellen, deren Kohlenhydratgehalt 60% betrug, dann wurden 5 g getrockneter Lactobacillus BC-Y009 oder Acetobacter BC-Y058 zugesetzt, um eine lyophilisierte Tablette herzustellen. Die Tablette wurde an die Maus mit Wasser verfüttert.
Alle in diesem Beispiel verwendeten Mäuse waren Weibchen und OB-Mäuse. Die mit Acetobacter gefütterte Gruppe (OB-058), die mit Lactobacillus gefütterte Gruppe (OB-009) und die Kontrollgruppe (OB-con, deren Futter keinen Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung enthielt), wurden getrennt gezüchtet. Die Zuchtbedingung war derart, dass Licht in 12-Stundenintervallen gespendet wurde (9.00 bis 21.00 Uhr beleuchtet, 21.00 bis 9.00 Uhr unbeleuchtet) und eine Temperatur von 20 bis 24°C und eine Feuchtigkeit von 40 bis 60% aufrechterhalten wurde.
Weiterhin wurde die enterische Beschichtungslösung auf getrockneten Lactobacillus BC-Y009 oder Acetobacter BC-Y058 gesprüht, um die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen, welche enterisch beschichtete Mikroorganismen umfasste. Das Gewicht des Materials der enterischen Beschichtung, welches die Zusammensetzung enthielt, beträgt ungefähr 16 bis 30 mg oder weniger pro 1 Tablette. Die Materialien für die enterische Beschichtung wurden ausgewählt aus üblichen hochmolekularen Materialien, wie etwa Zelluloseacetatphthalat, Trimellitat, Copolymer aus Methacrylsäure (Methacrylsäure 40% oder mehr, insbesondere Methacrylsäure einschließlich Hydroxypropylmethylzellulosephthalat und seine Esterderivate) oder Mischungen davon.
Das in dem Beispiel verwendete Methylacrylat war Endragit L 100-55, hergestellt durch die Röhm GmbH (Deutschland), Zelluloseacetatphthalat mit einer Viskosität von ungefähr 45 bis 90 cP, einem Acetylgehalt von 17 bis 26% und einem Phthalatgehalt von 30 bis 40%, oder Zelluloseacetattrimellitat, hergestellt durch die Eastman Codak Company (mit einer Viskosität von ungefähr 15 bis 20 cP, einem Acetylgehalt von 17 bis 26% und einem Trimellitylgehalt von 25 bis 35%).
Die enterische Beschichtung wurde durch das herkömmliche Beschichtungsverfahren vorgenommen, wobei die enterische Beschichtungslösung auf den Kern aufgesprüht wurde. Als Lösungsmittel wurde eine Mischung aus Ethanol und Aceton verwendet, und der Weichmacher wurde zu der Beschichtungslösung in einem Verhältnis von 1 zu ungefähr 0,005 oder 0,3 zugesetzt.
Die enterische Beschichtungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die durch das genannte Verfahren hergestellt wurde, wurde der Maus mit Wasser frei zur Verfügung gestellt. Es wurde der Blutglukosespiegel der Maus, welche die enterische Beschichtungszusammensetzung aufgenommen hatte, gemessen.
Vor dem Messen des Blutglukosespiegels der Mäuse jeder Gruppe wurde jede Maus 18 Stunden hungern gelassen. Nach dem Hungern wurde eine ausreichende Menge an Futter zur Verfügung gestellt und nach einem Zeitraum von 60 Minuten wurde vom retroorbitalen (retrobulbären) Plexus venosus unter Verwendung von Kapillarröhrchen, die frei von Gerinnungshemmern waren, Serum gewonnen.
Der Blutglukosespiegel wurde mit Hilfe der Absorption bei 505 nm unter Verwendung des Trinder-Kits (Kat.-Nr. 315-500, Sigma, USA), welcher die Enzymfarbmethode anwendet, gemessen. Der statistische Fehler der Ergebnisse wurde angegeben durch den Mittelwert ± Standardabweichung pro experimentelle Gruppe, und die statistischen Signifikanz des mittleren Unterschieds in jeder Gruppe wurde durch ANOVA getestet (P < 0,02).
Die Werte für den Blutglukosespiegel werden in 2 veranschaulicht. Wie in 2 veranschaulicht, beträgt der Blutglukosespiegel für die OB-con-Gruppe ungefähr 500 mg/dl, während der OB-058-Blutglukosespielgel niedrig ist. Zusätzlich sind die Blutglukosespiegel von jeder Maus aufgrund der Verabreichung von Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009 auf ungefähr jeweils 70% und 53% erniedrigt (Tabelle 7).
Tabelle 7: Änderung des Blutglukosespiegels nach Verabreichung von Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009
Beispiel 7: Änderung des Gewichts und der Diätmenge aufgrund des Aufnehmens von BC-Y058 und BC-Y009 und Änderung der Stoffwechseleffizienz
Die Mäuse wurden der OB-058-Gruppe, der OB-009-Gruppe und der OB-con-Gruppe zugeordnet, und Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009 wurden jeder der Gruppen verabreicht, und es wurde das Gewicht von jeder Maus im Abstand von einer Woche gemessen. Zusammen mit dem Messen von Gewichtsänderungen wurde das Gewicht des Futters, das durch eine Maus verbraucht wurde, ebenfalls gemessen, wodurch Änderungen der Stoffwechseleffizienz von jeder der Gruppen untersucht wurden.
Der Unterschied der Gewichtsänderung war bei jeder Gruppe, deren genetische Eigenschaften verschieden waren, offensichtlich, während der Unterschied der Gewichtsänderung in der Gruppe, deren genetische Eigenschaften dieselben waren, vernachlässigbar war. Wie in Tabelle 8 angegeben, betrug die Gewichtsänderung von OB-Mäusen in dem Zeitraum von 7 Wochen unabhängig von der Verabreichung von Acetobacter BC-Y058 oder Lactobacillus BC-Y009 ungefähr 47% Gewichtszunahme. Im Gegensatz dazu allerdings, wie in Tabelle 9 und Tabelle 10 angegeben, nahm der prozentuelle Futterverbrauch abhängig von der Verabreichung des Mikroorganismus um 17 bis 24% in der Gruppe der OB-Mäuse zu.
Das heißt, im Fall eines Verbrauchens von Futter, das die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung umfasst, war die Gewichtszunahme dieselbe wie die beim Verbrauchen von Futter, das die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung nicht enthält. Diese Ergebnisse zeigen, dass Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009 den Anstieg des Blutglukosespiegels nach einer Mahlzeit unterdrücken und deshalb zum Ausgleich sehr viel mehr Futter aufgenommen werden kann. Aufgrund der Überführung von Glukose zu Ballaststoffen durch die Mikroorganismen BC-Y058 und BC-Y009 ist die Stoffwechseleffizienz verändert gewesen.
Nach der unter dargestellten Formel hängt die Änderung der Energieeffizienz vom Futterverbrauch ab, was in Tabelle 10 berechnet und dargestellt wird. Stoffwechselenergieeffizienz = (Gewichtszunahme (g)/Futtermenge (g)) × 1000
Wie in Tabelle 10 dargestellt, betrug in dem Fall, dass einer OB-Maus Mikroorganismen verabreicht wurden, die Stoffwechselenergieeffizienz im Vergleich zu der der Kontrollgruppe, der die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung nicht verabreicht wurden, 75 bis 85% (3).
Tabelle 8: Änderung des Gewichts der Mäuse (g)
Tabelle 9: Änderung der Menge an verbrauchtem Futter in Abhängigkeit von der Verabreichung von Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009 (g)
Tabelle 10: Stoffwechselenergieeffizienz
Beispiel 8: Änderungen des Lipidspiegels, wenn BC-Y058 und BC-Y009 verabreicht wurden
Nach Verabreichung der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung wurde die Änderung des Blutlipids, insbesondere die Änderung von Cholesterin, analysiert, und es wurde untersucht, ob die Mikroorganismen die Kreislauferkrankungen wie Atherosklerose und Myokardinfarkt neben Diabetes mellitus und Fettleibigkeit beeinflussten.
Die Lipidanalyse wurde mittels der Enzymfarbmethode wie in Beispiel 6 unter Verwendung von TG-Glycezyme-V (Young-Yeoun Chemical Co., Japan), HDL-zyme-V (Young-Yeoun Chemical Co., Japan), Cholestezyme-V (Young-Yeoun Chemical Co., Japan), LDL Cholesterin (Kat.-Nr. 61532, BioMerieux, Frankreich) durchgeführt, um die Absorption bei 505 bis 570 nm mit einer Standardlösung zu messen, und auf diese Weise wurde die Menge an Lipid im Blut berechnet.
Wie in Tabelle 11 dargestellt, zeigte die Lipidkonzentration vor der Verabreichung von Futter keine Unterschiede bei den fettleibigen Mäusen. Allerdings war die Änderung der Lipidkonzentration, nachdem Acetobacter BC-Y058 und Lactobacillus BC-Y009 verabreicht worden waren, nach 7 Wochen offensichtlich, wie in Tabelle 12 angegeben.
Im Fall von fettleibigen Mäusen, welche den Mikroorganismus aufgenommen haben, veränderte sich der Lipidspiegel nicht im Vergleich zu den Werten früherer Schritte in dem vorliegenden Experiment, und im Fall der Kontrollmaus, der die Mikroorganismen nicht verabreicht worden waren, war der Lipidgesamtgehalt im Blut allerdings erhöht. Tabelle 11: Lipidmenge im Blut vor Verabreichung von Futter (mg/dl)

n = 4
TG: Triglyzeride
HDL: "High-Density"-Lipoprotein-Cholesterin
LDL: "Low-Density"-Lipoprotein-Cholesterin

n = 4, *p < 0,05
TG: Triglyzeride
HDL: "High-Density"-Lipoprotein-Cholesterin
LDL: "Low-Density"-Lipoprotein-Cholesterin

Gewerbliche Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung
Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können im Darm leben und Monosaccharide und Disaccharide zu hochmolekularem Material, das im Darm nicht aufgenommen und kaum verdaut werden kann, umsetzen, wodurch die Menge and Monosaccharid, das aufzunehmen ist, reduziert wird, und sie induzieren, dass die bei der Stoffwechselaktivität erforderliche Energie aus im Körper gespeicherten Lipiden und Proteinen zur Verfügung gestellt wird, wodurch eine Fettleibigkeit und ein Diabetes mellitus wirksam unterdrückt wird. Zusätzlich produzieren die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung Ballaststoffe im Darm, und es werden schädliche Materialien gemeinsam mit diesen Ballaststoffen ausgeschieden, um eine Appendizitis oder Dickdarmkrebs zu verhüten und um die Aufnahme von Cholesterin zu unterdrücken und um den Darm zu reinigen.

Claims

Lactobacillus BC-Y009 mit der Hinterlegungsnummer KCTC-0774BP.
Verwendung von Lactobacillus BC-Y009 mit der Hinterlegungsnummer KCTC-0774BP zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Verhinderung von Fettleibigkeit.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit enterischen Beschichtungsmaterialien beschichtet ist.
Verwendung von Lactobacillus BC-Y009 mit der Hinterlegungsnummer KCTC-0774BP zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Verhinderung von Diabetes mellitus.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit enterischen Beschichtungsmaterialien beschichtet ist.