JP4445204B2 - 肥満および糖尿病の予防・治療用微生物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は腸内生存性の優れた、腸内で多糖類を高効率で産生する肥満および糖尿病予防・治療用微生物に係り、より詳しくは腸内に流入するブドウ糖、ショ糖、または果糖などを体内に吸収されない高分子物質に転換し、低糖類の腸内吸収を競争的に阻害することにより、肥満症または糖尿病の予防や治療を可能にする新規な微生物、これらの薬学的な有効量を含む組成物、およびこれらを有効成分として含む食品組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
肥満は未だにその原因が明確に究明されていない種々の要因により複合的に発生する慢性的な疾患として知られている。肥満は高血圧症、糖尿病、心血管疾患、胆石症、骨関節炎、睡眠時無呼吸症(Sleep apnea)、呼吸障害、子宮内膜症、前立腺がん、乳がん、または大腸がんなどを引き起こす原因とされている。
【0003】
1999年米国の国立保健院(NIH)の報告書(The Evidence Report:Clinical guidelines on the identification,evaluation,and treatment of overweight and obesity in adults,1999,NIH)によると、米国人の約9,700万人が肥満状態であり、肥満にかかる疾患中の一つであるII型糖尿病(TypeII diabetes mellitus)の患者はおよそ1,570万人にも達するという。また、肥満にかかる疾患により毎年全世界において約20万人が死亡すると知られている(Dan Ferber,Science,283,pp 1423−1424,1999)。
【0004】
糖尿病は患者やその家族を含め、社会的にも個人的・財政的な費用の要される全世界的に蔓延した慢性疾患の一つであって、それぞれ別個の病因や発病機序を有する相異な糖尿病の類型が存在する。例えば、腎性糖尿病は、過血糖症および糖尿を特徴とし、インスリンの不適切な産生や利用で引き起こされる炭水化物代謝の障害によるものである。
【0005】
インスリン非依存性糖尿病(NIDDM、II型糖尿病)は、インスリンが適切に産生されて利用されるが、末梢組織においてインスリンを介するグルコース代謝その他の代謝に障害のある、主に成人で観られる糖尿病である。
【0006】
NIDDMは、3つの主要な代謝的異常、例えば、インスリンを介するグルコース処理に対する抵抗と、栄養物により刺激されるインスリン分泌能の損傷と、肝臓でのグルコースの過多産生とによる。NIDDMの治療、すなわち、血糖値の調節に失敗すると、心血管疾患による死亡や網膜症、腎臓病、および末梢神経病を始めとする他の糖尿病の合併症が引き起こされるおそれがある。
【0007】
NIDDMの治療法は、NIDDM患者の血糖値を調節する方法として、食餌療法および運動に加え、スルホニル尿素(Sulfonylurea)系薬物やビグアナイド系薬物などを使用し得る。また、最近、メトホルミン(metformin)やアカルボース化合物などもNIDDMの治療に用いられている。しかしながら、ある患者においては食餌療法と運動および/または前記治療化合物によっても過血糖症を適切にコントロールできないため、外因性インスリンの投与が要求される場合もある。
【0008】
注射によるインスリンの投与は高価であり、患者に対して苦痛を与える他、なお様々な障害や合併症が引き起こされることもある。例えば、インスリン反応(低血糖症)は、インスリン投与量の間違い、欠食、不規則的な運動、または特別な原因がなくても引き起こされ得る。また、局所的および/または全身的アレルギー反応およびインスリンに対する免疫学的な抵抗性が発生し得る。
【0009】
肥満および糖尿の予防・治療方法は、食餌・運動療法、手術療法および薬物療法に大別される。食餌・運動療法は、低カロリー・低脂肪の摂取と酸素消費の肉体活動による治療方法であるが、これは忍耐強く反復的、持続的に行わなければならないので大衆的な効果を得るには難しいとされている。
【0010】
手術療法は、外科的手術を介して体脂肪を物理的に取り除く方法であって、短期間でその効果が得られる長所はあるが、手術が要されること、効果の持続性がないこと、費用の問題などで、その活用が制限されている。
【0011】
したがって、血糖値の減少、糖吸収の阻害、インスリン作用の強化および食欲の減退をもたらす薬物により肥満または肥満型糖尿病を治療・予防しようとする薬物療法が活発に研究されており、現在まで開発された肥満および肥満型糖尿病の予防および治療用の薬物は様々な生理学的なメカニズムを利用している。
【0012】
そこで、従来に開発された様々な薬物群の中で、人体の代謝バランスに損傷を与えず、天然物質であるということで、食餌繊維が最も有用な肥満予防および治療製剤として認められている。
【0013】
従来の微生物食餌繊維は、グルコノバクター属(Gluconobactersp.)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium sp.)、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)、アセトバクター・ハンセニー(A.hansenii)、アセトバクター・パスタリアナス(A.pasteurianus)、アセトバクター・アセティー(A.aceti)、リゾビウム属(Rhizobium)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、サルチナ属(Sarcina)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、ラクトコッカス・クレモリス(Lactococcus cremoris)、ラクトバシラス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバシラス・ブルガリカス(L.bulgaricus)、ラクトバシラス・サケ(L.sake)、ラクトバシラス・ロイテリ(L.reuteri)、ラクトバシラス・ラクティス(L.lactis)、ラクトバシラス・デルブルッキー亜種(L.delbrueckii subsp.)、ラクトバシラス・ヘルベティカスグルコース変種(L.helveticusglucose var.jugurti)、ロイコノストック・デキサトラニカム(Leuconostoc dextranicum)、ブルガリカス属(Bulgaricus)、カンペストリス属(Campestris)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)などの微生物が利用されている。
【0014】
これらの微生物の産生する食餌繊維は各種の食品の安定剤、増粘剤、乳化剤、吸湿剤などや、医薬品、化粧品の原料として用いられている。現在、微生物セルロース、キサン(xanthan)、アセタンなどと、海藻類から精製した食餌繊維のグアールガム(Guar gum)、ローカストビーンガム(Locust bean gum)、カラギーナン(Carrageenan)、アルギン酸塩(alginate)、寒天(agar)などが既に商品化されている。
【0015】
上記の微生物の中で、ラクトバシラス属の菌株は人体の腸内で生息している正常微生物群集(normal microbial flora)の主要構成物であって、健康な消化器官と膣内環境の保持に重要なものとして以前から知られている(Bibel,D.J.,ASM News,54:661−665,1988:Reid,G.and A.W.Bruce,In H.Lappin−Scott(ed.),Bacterial biofilms.Cambridge University Press,Cambridge,England,p.274−281,1995;Reid G.,A.W.Bruce,J.A.McGroarty,K.J.Cheng,and J.W.Costerton,Clin.Microbiol.Rev.,3:335−344,1990)。一般に、ラクトバシラス菌株の生息地は、動物の消化器官(L.acidophilus,L.intestinalis,L.johnsonii,L.reuteriなど)、膣内粘膜(L.vaginalis,L.gasseri)、食品(wine−L.hilgardii)、乳酸菌飲料(L.kefir,L.Kefiranofaciens;cheese−L,casei)、お酢(L.acetotolerans)、口腔(L.oris)、こうじ(L.sake,L.homohiochi)、果汁(L.kumkeei,L.mali,L.suebicus)、発酵したソーセージまたは魚類(L.farciminis,L.alimentarius)などである。
【0016】
実際、多くの人々が健康な腸を維持し、尿路膣内感染(urogenitaltract infection)を防ぐために、ラクトバシラス属の菌株を含有した健康補助剤を用いている。最近は、下痢および便秘の予防や尿路感染の予防その他ラクトバシラスの様々な生理活性機能(probiotic activity)、例えば、免疫力の調節、血中コレステロール値の調節、リウマチの治療、がんの予防、乳糖に対する敏感性の緩和、アトピー性皮膚炎に対する効果などに対する重要性と関心が高まっている。
【0017】
米国の公衆健康ガイドライン(U.S.Public Health Service guidelines)によると、現在米国の菌株寄託機関(ATCC)に寄託された262種のラクトバシラス菌株の全ては、人体や動物に疾患を引き起こす潜在的な危険性がないと認められる‘安定レベル(Bio−safety Level)1’として分類されている。
【0018】
最近、ラクトバシラスの合成する細胞外の食餌繊維に対する研究が活発に行われている。これらの菌株が細胞外の食餌繊維を作る機序には多くの遺伝子がかかわっているため極めて複雑であり、合成される食餌繊維の量も極めて少ないと報告されている(Int.J.Food Microbiol.,Mar.340:1−2,87−92,1998;Current Opinion in Biotechnology,10:498−504,1999;Current Opinion in Microbiology,2:598−603,1999;Appl.Environ.Microbiol.,Feb.64:2,659−664,1998;FEMS Microbiol.Rev.,Apr.23:2153−77,1999;FEMS Microbiol.Rev.,Sep.7:1−2,113−30,1990.を参照)。
【0019】
上記のように、現在まで肥満および糖尿病の治療に関しての様々な研究と努力が行われ、様々な化合物が肥満および糖尿病治療剤として開発されているが、依然として副作用があって、体内に蓄積された体脂肪、タンパク質などを強制的に排出してしまうので、肥満および糖尿病を根本的に抑制・治療する画期的な治療剤は未だにないというのが現状である。
【0020】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、腸内で生長しながら消化酵素により分解された低糖類の炭水化物を吸収し体内に吸収されない高分子物質に転換させることにより、腸から体内に吸収される低糖類の量を大幅に減らすことのできる微生物を提供することである。
【0021】
本発明の他の目的は、薬学的な有効量を含有の前記微生物が体内に吸収される低糖類の量を根本的に減すことにより、肥満および糖尿病を予防・治療できる医薬組成物を提供することである。
【0022】
本発明の更に他の目的は、前記微生物を有効成分として含有する食品組成物を提供することである。
【0023】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、腸内で生長しながら消化酵素により分解された低糖類の炭水化物を吸収し体内に吸収されない高分子物質に転換させることにより、腸から体内に吸収される低糖類の量を大幅に減らすことのできる微生物を提供することで達成される。
【0024】
本発明の微生物は腸内で生長可能な、人体に無害な、低糖類を腸管に吸収されない高分子物質に転換させるものであって、ラクトバシラス・ロイテリ(L.reuteri)PRD202が好ましい。
【0025】
本発明の他の目的は、薬学的な有効量を含有の前記微生物が体内に吸収される低糖類の量を根本的に減少させることにより、肥満および糖尿病を予防・治療できる医薬組成物を提供することで達成される。
【0026】
本発明の各微生物は通常、投与経路に応じて選択される薬学的担体および賦形剤、または補助の有効成分などとの混合により得られる錠剤またはカプセルのような単位形態で投与される。本発明の組成物に適合な担体、賦形剤および希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱油などが挙げられる。
【0027】
本発明の微生物組成物は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤または香味剤を更に含んでも良い。本発明の組成物は当業界において公知された方法を用い、胃腸通過の後、小腸に到達し活性成分の微生物が速やかに腸内に放出されるような腸溶性の被覆製剤として製造されても良い。
【0028】
また、本発明の微生物組成物は通常のカプセル化方法を用い、カプセル形態の組成物として製造され得る。例えば、標準担体を用いて凍結乾燥させた本発明の微生物を含有するペレットを製造した後、それを硬質のゼラチンカプセル内に充填しても良く、または本発明の微生物と任意の適宜な製薬学的な担体(例えば、水性ガム、セルロース、ケイ酸塩、またはオイル)とを用いて懸濁液や分散液を製造した後、かかる分散液や懸濁液を軟質のゼラチンカプセル内に充填しても良い。
【0029】
本発明の製剤は特に、経口用の単位剤型であって、腸溶被覆された腸溶性製剤として提供され得る。本明細書の“腸溶性被覆”は胃酸によっては分解されず被覆が維持されるが、小腸では十分に分解されてその活性成分が小腸内に放出され得るようにする製薬学上において許容可能なあらゆる公知の被覆を含む。
【0030】
本発明の“腸溶性被覆”はpH1のHCl溶液のような人工胃液を36ないし38℃で接触させるとき、2時間以上にその形が維持され、好ましくは、以降はpH6.8のKH2PO4緩衝溶液のような人工腸液で30分以内に分解される被覆を称する。
【0031】
本発明の腸溶性被覆は1つのコアに約16ないし30mg、好ましくは16ないし20(または25)mgの量で被覆される。本発明の腸溶性被覆の厚さが5ないし100μm、好ましくは20ないし80μmの場合が腸溶性被覆として満足した結果を示した。腸溶性被覆の材料は公知の高分子物質の中から適宜に選択される。これらの高分子物質は、文献〔L.Lachmanら、The Theory and Practice of Industrial Pharmacy,3版、1986,pp.365−373,H.Suckerら,Pharmazeutische Technologie,Thieme,1991,pp.355−359,Hagers Handbuch der pharmazeutiscnen Praxis,4版,vol.7,pp.739−742および766−778,(Springer Verlag,1971),およびRemingtons Pharmaceutical Sciences,13版,pp.1689−1691(mack Publ.,Co.,1970)〕に挙げられており、セルロースエステル誘導体、セルロースエーテル、アクリル樹脂のアクリル酸メチル共重合体およびマレイン酸およびフタル酸誘導体の共重合体がこれらに含まれても良い。
【0032】
本発明の好ましい腸溶性被覆はセルロースアセテートフタルレートおよびトリメリテート、そしてメタクリル酸共重合体(例えば、メチルアクリル酸40%以上、および、特にヒドロキシプロピルメチルセルロースフタルレートを含むメチルアクリル酸およびそれらのエステルから誘導された共重合体)から製造される。ローム・ゲエンベハ社(Rohm GmbH,ドイツ)により市販中の製品、エンドリジット・エル(Endragit L 100−55)が本発明の腸溶性被覆の材料として使用され得る。
【0033】
本発明の腸溶被覆用セルロースアセテートフタレートは、約45ないし90cPの粘度と、17ないし26%のアセチル含量および30ないし40%のフタレート含量を有し、セルロースアセテートトリメリテートは、約15ないし20cSの粘度と、17ないし26%のアセチル含量、25ないし35%のトリメリチル含量を有する。イーストマン・コダック社(Eastman Kodak Company)市販の製品、セルロースアセテートトリメリテートが、本発明の腸溶性被覆材料として使用され得る。
【0034】
本発明の腸溶被覆材料として用いられるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートは、130,000ドルトン(Dalton)の分子量を有し、5ないし10%のヒドロキシプロピル含量、18ないし24%のメトキシ含量および21ないし35%のフタリル含量を有する。イーストマン・コダック社市販のセルロースアセテートフタレートが、本発明の腸溶性被覆の材料として使用され得る。
【0035】
本発明の腸溶性被覆として用いられるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートは、シンエツ・ケミカル社(Shin−Etsu Chemical Co.Ltd.,日本)市販のHP50であり、これは6ないし10%のヒドロキシプロピル含量、20ないし24%のメトキシ含量、21ないし27%のフタリル含量と84,000ドルトンの分子量を有する製品である。また、シン−エツケミカル社がHP55として市販中の、ヒドロキシプロピル含量が5ないし9%、メトキシ含量が18ないし22%、フタリル含量が27ないし35%、分子量が78,000ドルトンである製品が、本発明の腸溶性被覆材料として使用され得る。
【0036】
本発明の腸溶性被覆は、腸溶被覆溶液をコアに噴霧する通常の腸溶被覆法を用いて製造できる。腸溶被覆工程に用いられる適宜な溶媒としては、エタノールのようなアルコール、アセトンのようなケトン、CH2Cl2のようなハロゲン化炭化水素の溶媒であり、これらの溶媒の混合溶媒が使用されても良い。フタル酸ジ−n−ブチルまたはトリアセチンのような軟化材を1:約0.05ないし0.3(コーティング材料対軟化材)の割合で被覆溶液に加える。噴霧過程を連続的に行うことが好ましく、被覆の条件を考慮して噴霧量を調節することが可能である。噴霧圧は多様に調節でき、一般に約1ないし1.5barの噴霧圧で満足できるような結果が得られる。
【0037】
本明細書の“薬学的な有効量”は、哺乳動物の腸内から体内に吸収される低糖類の量を減らすことのできる本発明の微生物の最小量を意味し、本発明の組成物により体内に投与される微生物の量は投与経路、投与対象を考慮して調整される。
【0038】
本発明の組成物は対象の固体に毎日一回以上投与され得る。単位投与量は、被験者および他の哺乳動物のための単位投与に適合な物理的に分離された単位を意味し、各単位は適当な製薬的な担体を含み、治療効果を示す本発明の微生物の所定量を含有する。
【0039】
成人患者への経口投与用の投与単位は、本発明の微生物0.1g以上を含有することが好ましく、本発明の組成物の経口投与量は、一回に0.1ないし10g、好ましくは、0.5ないし5gである。本発明の微生物の薬学的な有効量は、0.1g/日である。
【0040】
しかし、投与量は、患者の体重、肥満症状の深刻度、および用いられる微生物と補助の有効成分によって可変的である。また、一日総投与量を数回に分割し、必要に応じて連続的に投与することができる。したがって、前記投与量の範囲はいかなる方式においても本発明の範囲を制限しない。
【0041】
また、本発明の他の目的は、前記微生物を有効成分として含有する食品組成物を提供することにより達成される。
【0042】
本明細書の“組成物”は必ず医薬品として許可されるものだけを意味するものではなく、通常の食品、機能性食品または健康補助食品までも含む概念である。
【0043】
本発明の組成物を周期的に服用する場合、腸内で本発明の各微生物が菌の群を成しながら、人体による糖類の吸収を競争的に妨げると共に、それらの糖類を利用し微生物の産生した非消化性多糖類が腸内有用菌の生息条件を良くし、腸管運動を刺激することにより、結果的には本発明の組成物が肥満および糖尿病を予防・治療できるようにする。
【0044】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0045】
本発明の肥満および糖尿病の予防および治療用微生物は、▲1▼腸内で増殖が可能であり、▲2▼低糖類を速やかに吸収して繊維状物質のような非消化性または難消化性の高分子化合物に転換させ、▲3▼人体または家畜に害のないという条件を満たす。したがって、前記の3つの条件を満たす公知の微生物を各種の寄託機関から受け、本発明の組成物に使用でき、なお新規の微生物を新たに分離して使用しても良い。
【0046】
本発明者らは、本発明の組成物に使用できる新規の微生物を下記のような方法で製造した。
【0047】
多糖類を産生するものとして公知された各種の微生物を寄託機関より受け、それらの多糖類の産生能、糖消費の速度、胃酸および胆汁酸に対する耐性実験を通じて突然変異の母菌株を選び、それを化学物質を用いて突然変異させ、多糖類を多量産生するPRD202を選別した。選別されたPRD202を確認した結果、それはラクトバシラス・ロイテリであることを確認し、ラクトバシラス・ロイテリPRD202と命名し、KCTCに寄託した(寄託番号:KCTC10301BP)。
【0048】
こうして選別された本発明のラクトバシラス・ロイテリPRD202の菌株により産生される多糖類が、腸内消化酵素により分解されるか否かを確認した結果、分解されないことより、ラクトバシラス・ロイテリPRD202により産生された多糖類は、腸内消化酵素により分解されず体内に吸収されないまま排出されることが分かった。また、本発明の微生物のβ−グルクロニダーゼ(β−glucuronidase)の力価を測定した結果、本発明の微生物はβ−グルクロニダーゼを全く産生しないことより、β−グルクロニダーゼによる有害性はないことが分かった。
【0049】
本発明のラクトバシラス・ロイテリPRD202をラットに投与した結果、対照群に比べて体重は約6.5%減少し、飼料摂取量は約9.3%減少した。なお代謝効率を計算した結果、本発明のラクトバシラス・ロイテリPRD202は対照群に比べて約5.6%の差を示していた。したがって、本発明の微生物は体重調節に効果を示すことが分かる。
【0050】
本発明の微生物を摂取する場合の、血中コレステロールの変化を調べた結果、本発明のラクトバシラス・ロイテリPRD202は、生理食塩水投与群に比べて有意に減少した。したがって、本発明の微生物および微生物組成物は肥満、糖尿病および循環器性疾患(動脈硬化、心筋梗塞など)に効果を示すことが分かる。
【0051】
また、本発明の微生物の投与により正常血糖値より低くなる、いわゆる低血糖症は現われないことを確認した。
【0052】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例を用いてより詳しく説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するだけであって、本発明の権利範囲を制限しようとするものではない。
【0053】
〔実施例1:ラクトバシラス・ロイテリATCC23272の低糖類消費の速度および多糖類産生能の測定〕
ラクトバシラス・ロイテリATCC23272菌株の糖消費の速度を測定するために、−80℃の超低温の冷凍庫に保管中のラクトバシラス菌を10mlのキャップチューブに接種し、37℃で24時間培養器で活性化させた後、活性化された菌株を100mlのMRS培地(2%ブドウ糖、1%牛肉抽出物、1%ペプトン、0.5%酵母抽出物、0.1%Tween−80、0.2%クエン酸アンモニウム、0.5%酢酸ナトリウム、0.01%MgSO4、0.005%MnSO4、0.05%L−cysteine−HCl)に接種し、3時間毎に試料を採り、成長速度、収率および糖消費速度を測定した結果、ラクトバシラスATCC23272菌株は、成長速度0.071O.D/hr、収率0.082Ys/xおよびグルコース消費速度1.21g/L/hrを示した。
【0054】
ラクトバシラス・ロイテリATCC23272の多糖類産生能を調べるために、MRS培地で24時間培養した前記菌株0.5mLをチューブに入れ、13,000gで20分間遠心分離を行い、上清液を採り、同量の40%トリクロロアセテートを加えて強く攪拌した。その後、再び13,000gで20分間遠心分離し、得られた上清液に2培の冷却したエタノール(4℃)を加えて混合し、それを再び6,000gで10分間遠心分離して上清液を捨てた後、最初の体積と同量の蒸留水を加え多糖類を懸濁させ、フェノール・硫酸法で多糖類の量を測定し多糖類産生量を測定した。
【0055】
ラクトバシラス・ロイテリATCC23272の胃腸および十二指腸通過能を調べるために、pH1.5の塩酸で人工胃液を製造し、菌を106の濃度で接種し、2時間後に、生存率〔初期の接種菌数(cfu/ml)/培養後の生存菌数(cfu/ml)〕を測定した結果、類似胃液(pH1.5)で2時間培養した後の生存率は25.5%、胆汁で9時間培養した後の生存率は667%、EPS産生量は670mg/Lであった。
【0056】
〔実施例2:多糖類を多量に産生する本発明の変異菌株の収得〕
食餌繊維を多量に産生する変異菌株を得るために、まず菌を変形MRS培地で37℃で6時間培養した後、遠心分離で沈殿させてから得たラクトバシラス・ロイテリATCC23272を生理食塩水(PBS.pH7.0)緩衝液で洗浄した後、NTG(N−methyl−N−mitro−N−nitrogoguanidine)を最終濃度が200μg/mlになるように加えた後、37℃で30分間培養し、菌株99.9%を死滅させた。
【0057】
こうして得られた突然変異群を高濃度の果糖の含有されたMRS(5%果糖、1%牛肉抽出物、1%ペプトン、0.5%酵母抽出物、0.1%Tween−80、0.2%クエン酸アンモニウム、0.5%酢酸ナトリウム、0.01%MgSO4、0.01%MnSO4、0.05%L−cysteine−HCl)培地に塗末し、37℃で48時間培養した。
【0058】
培養液をそれぞれのチューブに0.5mLずつ入れ、13,000gで20分間遠心分離を行い、上清液を採り、同量の40%トリクロロアセテートを加えて攪拌した。その後、再び13,000gで20分間遠心分離を行い、得られた上清液に2培の冷却したエタノール(4℃)を加え混合した。それを再び6,000gで10分間遠心分離してからその上清液を気をつけながら捨てた後、最初の体積と同量の蒸留水を入れ多糖類を懸濁させてからフェノール−硫酸法で多糖類の量を測定し、多糖類効率〔EPS(mg/L)/O.D(650nm)〕を測定した。
【0059】
こうして得られた多糖類効率の高い菌株を同じ方法で再び突然変異させ、多糖類産生効率の高い菌株を収得した。
【0060】
第1世代変異菌株より元来の菌株に比べて多糖類の産生量の増加した菌株を収得し、同じ方法で再び突然変異させ、第2世代変異菌株を収得した。この結果、高いEPS(exopolysccharide)産生効率を示すラクトバシラス・ロイテリPRD202(以下、PRD202という)を収得し、PRD202は表1に示すように、ラクトバシラス・ロイテリATCC23272に比べて約7培の多糖類産生能を示した。
【0061】
【表1】
【0062】
〔実施例3:PRD202の菌株の特性および同定〕
多糖類産生量の多いPRD202微生物と母菌株との遺伝的違いを把握するために、菌株をそれぞれMRS液体培地に接種し、37℃で12時間静置し培養した。培養液を4℃、6,000gで遠心分離し微生物を得てから、それよりCTAB/NaCl法を用いて核酸を抽出した。核酸抽出物を16S rRNAコンセンサスプライマー(16S rRNA consensus primer)を用いて16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した結果、本発明の微生物はラクトバシラス・ロイテリATCC23272変異菌株であることが分かった。
【0063】
本発明の微生物は母菌株に比べてその成長速度が遅く、静置培養の際、菌株が沈殿することが少なく、ATI 50 CH Kit(Bio Merieux社)を用いた糖利用性を比べた結果、母菌株は、α−methyl−D−glucosideを炭素源にして微弱な成長を示した反面、本発明のラクトバシラス・ロイテリPRD202はそれを利用することができなかった。
【0064】
以上の通り、表現型と16S rRNA遺伝子との塩基配列分析に基づき、本発明の微生物をラクトバシラス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)PRD202と命名し、2002年7月12日、国際寄託機関の遺伝子銀行附設のKCTCに寄託した(寄託番号:KCTC10301BP)。
【0065】
〔実施例4:多糖類の腸内消化酵素による分解性〕
前記の本発明の微生物PRD202により腸内で産生される多糖類が腸内消化酵素により分解されるか否かを確認するために、精製された多糖類をホスフェート緩衝液に溶かした後、ラットの小腸より分離した消化酵素を濃度別に添加し、120分間反応させ、これを酵素比色法を用いたトリンダー・キット(Cat.315−500 Sigma,USA)で測定した。
【0066】
測定の結果、表2に示すようにPRD202により産生された多糖類は、腸内の消化酵素で分解されなかった。したがって、本発明のPRD202により産生された多糖類は、腸内消化酵素により分解されず、体内に吸収されないまま体外に排出されることが分かった。
【0067】
【表2】
【0068】
〔実施例5:ラクトバシラス・ロイテリPRD202からβ−グルクロニダーゼの発現の可否〕
腸内微生物により産生されるβ−グルクロニダーゼは、ベンゾピレンのような発がん性の芳香族化合物などの分解を遅らせ、ヒトの体内より産生される毒素が肝臓で分解されるのを防ぎ、いわゆる解毒作用を遅らせるなどの悪影響を及ぼす。
【0069】
したがって、腸内から本発明の微生物によりβ−グルクロニダーゼが産生されるか否かを確認するために、PNPG(para−nitrophenyl−beta−D−glucuronide)(Cat.N−1627,Sigma,USA)の加水分解による吸光度測定法を利用した。
【0070】
まず、PRD202を300mlのMRS培地で37℃で24時間培養した後、培養液を遠心分離して菌を回収し、それを生理食塩水(PBS)で洗浄した。その後、GUS緩衝液〔100mM Sodium phosphate−2.5mM EDTA(pH6.0)〕10mlに再懸濁させ、粉砕し,細胞壁などのかすを取り除き、得られた細胞抽出物50〜400μlを12.5mMのPNPGの含有されたGUS緩衝液500μlに加え、37℃水浴槽の中で5、15、30分間反応させた。次いで、1M Na2CO3で反応を止め、波長405nm(OD405)で吸光度を測定した。β−グルクロニダーゼの力価(1 unit)は標準試料(Cat.No.G−8162,Sigma.USA)を用いて測定し、その比較値は表3の通りである。
【0071】
ラクトバシラス・ロイテリPRD202のβ−グルクロニダーゼの力価を測定した結果、本発明の微生物はβ−グルクロニダーゼを全く産生せず、かかる結果より、β−グルクロニダーゼによる有害性の問題はないことが分かった。
【0072】
【表3】
【0073】
〔実施例6:ラクトバシラス・ロイテリPRD202の摂取時の体重、食餌量の変化、およびそれに伴う代謝効率の変化〕
測定に用いた動物は、SDラット(Sprague Dawley rat)(5週齢、雄)であり、一群を9匹ずつにして、生理食塩水(PBS)投与群、ラクトバシラス・ロイテリATCC23272投与群、PRD202投与群に分類して実験した。群に応じてラクトバシラス・ロイテリATCC23272とPRD202とを1日2回投与し、1回投与時の菌体量は、3×1011cfuの濃度で経口投与した。ラットの体重および飼料摂取量は2日毎に測定し、9匹の平均値を示した。
【0074】
30日間投与した結果、表4および図1に示すように、SDラットの体重の変化が12日以降から徐々に現われ、最終日の30日目の測定値は対照群のPBS群に比べ、体重が約6.5%減少した。
【0075】
【表4】
【0076】
また、飼料摂取量の変化を比較すると、表5および図2に示すように、PBS投与群に比べ、約9.3%減少した。この結果を用いて飼料の代謝効率を計算した結果、PBS投与群とPRD202投与群との間の差が約5.6%生じ、PRD202の代謝効率がより高かった(図3を参照)。
【0077】
【表5】
【0078】
以上の結果より、本発明の微生物は、低糖類を吸収しそれを多糖類に転換させることにより、肥満の治療および予防に大きな効果を示し、体内に産生される多糖類による飽満感により飲食物の摂取を減らす効果があることが分かった。
【0079】
〔実施例7:ラクトバシラス・ロイテリPRD202の摂取時の血中コレステロールの変化〕
本発明によるPRD202を摂取する場合、糖尿病や肥満などの疾患だけでなく、循環器性疾患(動脈硬化、心筋梗塞など)の抑制効果があるか否かを確認するために、血中コレステロールの変化を分析した。
【0080】
脂肪質の分析のために、実験中のラットの血液をしっぽ採血法を用いて1週間毎に採って使用した。脂肪質の分析は酵素比色法を用い、Cholestezyme−V(シンヤン化学)などを用い、505〜570nmで、標準溶液と共に吸光度を測定することにより、血清に存在するコレステロールの量を計算した。
【0081】
表6および図4に示すように、血中の総コレステロール値は、PRD202の場合、投与後28日目において生理食塩水投与群に比べて有意に減少し(P<0.005)、また投与前に比べても有意に減少した(P<0.005)。したがって、本発明の微生物は、循環器性の疾患(動脈硬化、心筋梗塞など)の減少にもその効果を示すと予測できる。
【0082】
【表6】
【0083】
〔実施例8:ラクトバシラス・ロイテリPRD202の摂取時の血糖値の変化〕
本発明の微生物を摂取するとき、微生物による糖の吸収に伴う低血糖症などの問題点を調べるために、ラットの血糖値を測定した。
【0084】
血糖の測定のために1週間毎にラットから血液を採ってから、血清を分離した。血糖値は酵素比色法を利用したトリンダー・キット(Cat.325−500,Sigma,USA)を利用して波長505nmで吸光度を測定した。標準溶液を基準にしてそれぞれの血清に対する血糖値を計算した。こうして得られた実験結果を、各実験群に対し、平均±標準偏差で表わした。血糖値の測定結果を図5に示した。
【0085】
図5に示すように、正常のラットの血糖値とほぼ同じレベルの血糖値を示した。したがって、本発明の微生物の投与により正常血糖値より低くなる、いわゆる低血糖症のおそれはないことが分かった(表7参照)。
【0086】
【表7】
【0087】
以上のように、本発明の構成および好ましい実施例を本明細書に記載したが、本発明の権利範囲は記載された実施例に制限されるものと解析されてはいけず、当業者であれば、本発明の権利範囲内で本明細書に記載の内容を変形し実施できると判断される。
【0088】
【発明の効果】
本発明の微生物は、優れた腸内生存性と、高効率の多糖類産生能を有しており、腸内で生存しつつ、低糖類の炭素化合物を高分子の多糖類に転換させ体内に吸収される炭素化合物の量を減らすことにより、肥満および糖尿病の治療および予防効果を有する。なお、β−グルクロニダーゼによる有害性もなく、体重調節や、整腸作用、そしてコレステロール吸収の抑制などの効果を現わす。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明による微生物を摂取したラットの体重の変化を示す図表である。
【図2】本発明による微生物を摂取したラットの体重増加の変化を示す図表である。
【図3】本発明による微生物を摂取したラットの代謝効率の変化を示す図表である。
【図4】本発明による微生物を摂取したラットの血中コレステロールの変化を示す図表である。
【図5】本発明による微生物を摂取したラットの血糖値の変化を示す図表である。
Claims (7)
- 多糖類物質を産生するラクトバシラス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri;KCTC−10301BP)。
- 多糖類物質を産生する薬学的な有効量のラクトバシラス・ロイテリ(KCTC−10301BP)と担体とでなる肥満症予防・治療用製剤。
- 前記肥満症予防・治療用製剤を腸溶性の被覆物質で覆ったことを特徴とする請求項2に記載の肥満症予防・治療用製剤。
- 多糖類物質を産生するラクトバシラス・ロイテリ(KCTC−10301BP)を有効成分として含む食品組成物。
- 前記食品組成物が体重減少効果を有するものであることを特徴とする請求項4に記載の食品組成物。
- 多糖類物質を産生する薬学的な有効量のラクトバシラス・ロイテリ(KCTC−10301BP)と担体とでなる糖尿病予防・治療用製剤。
- 前記糖尿病予防・治療用製剤を腸溶性被膜物質で覆ったことを特徴とする請求項6に記載の糖尿病予防・治療用製剤。
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