CN117384798A - 一种可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌及其应用,鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20231994。本发明还公开了鼠李糖乳酪杆菌M42及其发酵组合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢病的药物中的应用。该鼠李糖乳酪杆菌M42可高效抑制肠镰孢属等有害菌,靶向富集代谢反式脂肪酸,降低了肠道通透性和结肠组织病变;改善血糖稳态,减少肝细胞出现坏死和脂质空泡化,抑制高脂饮食小鼠的体重增加及体内脂肪积累,在制备预防和/或治疗糖脂代谢病的药物中,具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于益生菌技术领域及医药技术领域,尤其是涉及一种可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。
背景技术
糖脂代谢紊乱性疾病包括血糖异常、脂肪异常、非酒精性脂肪肝、超重等,其发病率居高不下,2023年8月发表于学术期刊《Diabetes Obesity and Metabolism》一篇题为“中国肥胖患病率及相关并发症:1580万成年人的横断面真实世界研究”报告,按照我国超重和肥胖的BMI(身体质量指数)分类标准,1580万成年受试者中超重人群占比34.8%,肥胖人群占比14.1%,整体人群中,最常见的肥胖相关并发症中,脂肪肝占比34.9%,糖尿病前期占比27.6%,血脂异常占比24.9%,高血压占比17.6%,因此,糖脂代谢紊乱性疾病严重威胁我国居民的健康,成为国家经济社会发展的重大公共卫生问题。
目前,用于减重的方法有间歇禁食、运动、减肥手术、药物治疗,禁食和运动方法很多人无法长期坚持,减肥药物副作用较大,比如司美格鲁肽药物能够有效降低体重,有研究显示一旦患者停用,体重反弹会在之前减重总量的三分之二左右,同时该药副作用包括恶心、呕吐、腹泻、便秘、腹痛,还有可能会诱发胰腺炎、肾损伤、糖尿病性的视网膜病变等严重副作用,因此,提供一种不良反应小,又能改善糖脂代谢的产品,是十分有必要的。
近年来,越来越多的研究表明糖脂代谢与肠道微生物密切相关,2023年日本理化研究所的Hiroshi Ohno团队在Cell Metabolism上研究表明的肠道中的肠镰孢属(Fusimonas intestini,FI)在人类和小鼠的肥胖症和高血糖症中高度定植,与肥胖、糖尿病正相关;肠镰孢属(Fusimonas intestini)通过高脂饮食促进其脂质生成基因的表达,而其产生的长链脂肪酸(如反式油酸)通过损害肠道上皮完整性促进代谢性内毒素血症,从而促进饮食诱导的肥胖症。另一方面,反式脂肪酸促进肥胖的力度是一般脂肪总体平均效应的7倍,而且也不易被人体消化,在体内代谢需要的时间长,容易在腹部积累,因此,反式脂肪酸直接和间接的通过肠道微生物增加糖尿病、肥胖等糖脂代谢性疾病的患病风险。
益生菌近年来被认为是一种有效的改善糖脂代谢的方法,如CN108157973B公开了一种有益糖脂代谢功能的益生菌组合物,该组合物包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、格式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等,该组合物具有调节糖脂代谢的功能,对血清总胆固醇和甘油三酯、胰岛β细胞功能和糖尿病改善有一定影响;CN114717147B公开了一种鼠李糖乳杆菌后生元,用于缓解脂肪肝与肥胖,该后生元缓解高脂饮食小鼠的体重增加,降低肝脏脂肪堆积、白色脂肪,但现有公开的微生物菌株及其代谢产物对改善肥胖及糖脂代谢紊乱的防治效果不佳,靶向性不强。
现有技术未见高效抑制肠镰孢属且靶向富集代谢反式脂肪酸的益生菌及其后生元在糖脂代谢病的防治与管理方面的报道,因此,开发高效对糖脂代谢病的预防有防治功效的新菌株及其组合物,用于制备一种安全、可高效防治糖脂代谢病的预防的微生态制剂、或药物,具有重要的意义和市场价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:克服现有技术的不足,提供鼠李糖乳酪杆菌M42及其代谢产物的新应用,具体为在防治糖脂代谢病的应用,尤其是通过抑制肠镰孢属有害菌并靶向富集代谢反式脂肪酸,鼠李糖乳酪杆菌M42与其代谢产物组合应用至糖脂代谢病的防治与管理,显著提高了减重效果。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:
一种可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌,所述鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20231994。
鼠李糖乳酪杆菌M42分离自云南大理酸汤水,将分离纯化的菌株进行16SrRNA鉴定,该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示,命名为鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)。将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对,与Genebank中的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)相似度大于99%,可鉴定该菌株为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus),基于16S rRNA基因序列比对结果以B.subtilis NCDO 1769(NR118972)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。
鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基上培养形成的菌落呈近圆形,菌落大小中等,乳白色,向上凸起,较湿润。革兰氏染色后呈阳性,杆状,其适宜的生长温度为30~40℃,生长pH为3.0-7.0。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是:
一种发酵组合物,通过使用权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌M42发酵生产制得。所述发酵组合物包括鼠李糖乳酪杆菌M42活菌、鼠李糖乳酪杆菌M42灭活菌体、代谢产物和鼠李糖乳酪杆菌M42后生元中的一种或多种。
优选,所述鼠李糖乳酪杆菌M42后生元为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基中发酵培养结束后,通过细胞裂解、灭活、离心、浓缩、喷雾干燥含有鼠李糖乳酪杆菌M42及其代谢产物的固体粉末,包括死细胞、菌体裂解物和/或发酵液。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是:
鼠李糖乳酪杆菌M42和/或上述发酵组合物在制备用于肠道调节的生物制剂或药物中的应用。
所述肠道调节至少包括以下一种:
a)抑制肠镰孢属、脱硫弧菌属或白色念珠菌中的一种或多种有害菌生长,降低其丰度;
b)促进乳杆菌属、双歧杆菌属或嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种有益菌生长,增加其丰度。
c)富集代谢反式脂肪酸,促进肠道屏障及结构的恢复。
鼠李糖乳酪杆菌M42作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用。
本发明进一步解决其技术问题所采用的另一技术方案是:
鼠李糖乳酪杆菌M42和/或上述发酵组合物在制备用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物中的应用。
所述糖脂代谢紊乱性疾病包括肥胖症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、脂肪肝和糖尿病。
所述组合物中鼠李糖乳酪杆菌M42活菌的用量为5*109~5*1010CFU/day,鼠李糖乳酪杆菌M42灭活菌体的用量为3~8*1010个/day,鼠李糖乳酪杆菌M42代谢产物为100~1000mg/day,鼠李糖乳酪杆菌M42后生元为5.0*109~1*1011个/day。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物,所述药物包含上述鼠李糖乳酪杆菌M42和/或上述发酵组合物。
所述药物通过如下至少一种功能实现对肥胖和糖脂代谢紊乱的调节作用:
a)靶向富集并代谢反式脂肪酸,减少肠道反式油酸的形成,降低了肠道通透性和结肠组织病变;
b)高效抑制肠镰孢属和/或白色念珠菌有害菌,并提高肠道有益菌丰度;
c)显著抑制高脂饮食小鼠的体重增加;
d)显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态;
e)显著抑制高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积,减小肝细胞出现坏死和脂质空泡化;
f)显著降低皮下脂肪、附睾脂肪、白色脂肪、棕色脂肪的积累。
所述药物包括上述组合物和药学上可接受的载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中,所述药学上可接受的载体包括但不限于:填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或润滑剂中的一种或多种。
优选,所述药物为口服药物。
在一种实施方式中,所述填充剂为海藻糖、壳聚糖、淀粉或糊精中的一种或多种;所述粘合剂为液状葡萄糖、淀粉糊或糖浆的一种或多种;所述润湿剂为甘油或乙醇中的一种或多种;所述崩解剂为交联聚维酮、羧甲基淀粉钠或交联羧甲基淀粉钠的一种或多种;所述润滑剂为二氧化硅硬脂酸镁或硬脂酸富马酸钠的一种或多种。
本发明可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌的有益效果:
本发明的鼠李糖乳酪杆菌M42,一方面通过高效抑制肠镰孢属、白色念珠菌等有害菌,提高乳杆菌、双歧杆菌、AKK等有益菌丰度;另一方面,鼠李糖乳酪杆菌M42通过靶向富集代谢反式脂肪酸,能够减少肠道产生反式油酸,降低了肠道通透性和结肠组织病变,进而调节肠道平衡并促进肠道机体修复;此外,鼠李糖乳酪杆菌M42显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态,减少体内反式脂肪酸的生成,减少肝细胞出现坏死和脂质空泡化细胞面积,并高效降低皮下脂肪和附睾脂肪重量,显著减少白色脂肪细胞和棕色脂肪,及显著缓解高脂饮食小鼠的体重增加,实现对小鼠及人体的糖脂代谢的调节,达到对糖脂代谢病的防治功效。因此,鼠李糖乳酪杆菌M42在制备预防和/或治疗糖脂代谢病的药物中,具有巨大的应用前景。
动物试验表明,本发明的鼠李糖乳酪杆菌M42及其后生元具有良好的安全性。
鼠李糖乳酪杆菌M42活菌及后生元在制备预防和/治疗糖脂代谢病疾病的药物中的应用,为鼠李糖乳酪杆菌M42提供了新的应用方向。
生物材料保藏
鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20231994,保藏地址为:湖北省武汉市武已区八一路299号。
附图说明
图1—为本发明鼠李糖乳酪杆菌M42的菌落图;
图2—为本发明鼠李糖乳酪杆菌M42革兰氏染色显微镜下形态图;
图3—为本发明鼠李糖乳酪杆菌M42系统发育树;
图4—为添加反式油酸对鼠李糖乳酪杆菌M42脂肪酸组成的影响分析图;
图5—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的体重变化图;
图6—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的葡萄糖耐量测试分析图;
图7—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的肝脏染色组织切片;
图8—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的皮下脂肪重量分析图;
图9—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的附睾脂肪重量分析图;
图10—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的白色脂肪切片分析图;
图11—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的棕色脂肪切片分析图;
图12—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的粪便中微生物不同种属丰度的对比图;
图13—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的粪便中反式油酸浓度分析图;
图14—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的肠道通透性和结肠病理切片图,其中,A:结肠病理切片图;B:肠道通透性(FITC)对比分析图。
附图5~14中,*代表p≤0.05,**代表p≤0.01,***代表p≤0.001,****代表p≤0.0001,;误差以Mean±SEM形式展现。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
以下为本发明实施例中所涉及的培养基:
MRS培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉粉5.0,酵母粉4.0,葡萄糖20.0,吐温80 1.5,K2HPO4·7H2O 2.0,无水乙酸钠5,柠檬酸三铵2.0,MgSO4·7H2O0.2,MnSO4·H2O 0.038,(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。
实施例1
鼠李糖乳酪杆菌M42的筛选及鉴定
鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20231994。
a)鼠李糖乳酪杆菌M42菌株的筛选
样品采集于云南大理酸汤水,将采集的样品称取1g,放入9mL无菌生理盐水中。充分震荡混匀后,10倍梯度稀释涂布于MRS固体培养基中,37℃培养48h。肉眼观察,挑取培养基中不同形态大小的单菌落,划线纯化4次以上。通过显微镜观察和溶钙法初步确定为乳酸菌,并将纯化的菌株45%甘油保存于-80℃冰箱备用。
b)菌株形态及显微镜观察
鼠李糖乳酪杆菌M42菌株菌落形态参见图1,菌落呈近圆形,菌落大小中等,乳白色,向上凸起,较湿润。革兰氏染色后呈阳性,杆状,显微镜下形态见图2。
c)菌株分子生物学鉴定
将纯化的鼠李糖乳酪杆菌M42菌株进行16S rRNA鉴定,该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示,命名为鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosusM42)。将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对,与Genebank中的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)相似度大于99%,可鉴定该菌株为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus),基于16S rRNA基因序列比对结果以B.subtilis NCDO1769(NR118972)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树,其系统发育树如图3所示。
d)菌株产酸性能测定
将鼠李糖乳酪杆菌M42菌株菌种按5%的接种量分别接种到MRS培养基中,37℃活化培养24小时,连续活化两次。将活化好的M42菌液按5%的接种量接种到MRS培养基液体培养基中,混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180)。将分装好的鼠李糖乳酪杆菌M42菌液放置在37℃恒温培养箱中静置培养,并取3支试管,每隔8小时,测定菌液总酸。
鼠李糖乳酪杆菌M42产酸结果见表1,培养时间8、16,24小时,产酸分别为0.89g/100ml,1.32g/100ml,1.58g/100ml,因此,鼠李糖乳酪杆菌M42具备产酸快的特点,可作为发酵剂用于发酵食品的制作。
表1鼠李糖乳酪杆菌M42产酸
实施例2
鼠李糖乳酪杆菌M42富集反式脂肪酸能力测定
a)菌株的活化及培养
在无菌的超净工作台里,将保存好的鼠李糖乳酪杆菌M42接种到装有10mL MRS液体培养基的试管中,置于37℃的恒温生化培养箱里培养24h。培养好的菌液浑浊,有白色沉淀。
b)培养基添加反式油酸(C18H34O2)样品的制备
反式油酸(Elaidic acid),是一种常见于氢化植物油内的反式脂肪酸,食品在高温或长时间烹调煎炸过程中,顺式脂肪酸会异构化为反式脂肪酸。将种子液分别按2%接种量接种于含有1g/L反式油酸的新鲜MRS液体培养基中,以不加反式油酸的新鲜MRS液体培养基作为对照,30℃下扩大培养32h,每隔8小时,取样,离心后用GC-MS测定测定不同培养时间的上清液中反式脂肪酸含量,并按照公式(1)计算富集率。同时,收集培养24h的菌体后通过细胞膜脂肪酸提取方法测定反式脂肪酸的成分及相对含量。
其中,式(1)中:M1为发酵0小时上清液中的反式油酸含量/g;M2为发酵不同时间点上清液中的反式油酸含量/g。
c)菌体细胞膜脂肪酸提取方法
取发酵液离心后的菌泥2g,加入2mL的甲醇:氯仿(2:1)溶液,室温下旋涡振荡2min后,4℃下静置24h后离心(12000rpm,10min,4℃)。收集上清液于试管中,并用甲醇:氯仿:水(4:2:1)溶液洗涤两次,收集上清液。将3份上清液混合,旋涡1min混匀。在上清液中加入2mL蒸馏水2mL氯仿溶液,旋涡2min,使混合物分层。收集底部的氯化层,并用氮吹仪在40℃下蒸发至干。将脂质残余物溶于1mL正己烷(色谱纯)中,并通过加入200μL甲醇氢氧化钾溶液将其转化为脂肪酸甲酯。加入10μL甲基橙溶液,混匀溶液变为橙色,加入盐酸直至溶液变为粉红色并使混合物沉降,收集有机层进行测定。
鼠李糖乳酪杆菌M42培养不同时间的菌体细胞膜脂肪酸测定试验结果如表2所示,鼠李糖乳酪杆菌M42培养8h时对反式油酸有17%的富集能力,随着培养时间的延长,富集能力得到增加,在24h富集能力为73%,后面随着时间延长,趋于稳定,说明,鼠李糖乳酪杆菌M42具有很好的反式脂肪酸富集能力。
表2鼠李糖乳酪杆菌M42反式油酸富集能力
发明人对未添加反式油酸和MRS添加反式油酸培养鼠李糖乳酪杆菌M42后的菌体脂肪酸的组成成分及相对含量的分析结果见图4,添加反式油酸后菌体细胞膜脂肪酸中均发现C14:0(十四烷酸)和C18:2(十八碳二烯酸)的消失(未检出),C18:1cis-9(油酸)、C18:1(trans-9)(反式油酸)、C18:1(trans-13以及C19:1的含量显著增加。
综上所述,培养基中添加反式油酸提高了细胞膜脂肪酸中正反油酸的含量,相应降低了上清中反式脂肪酸含量,从而对外源反式油酸等反式脂肪酸起到了富集的作用,由于鼠李糖乳酪杆菌M42可以通过肠道排除体外,因此,鼠李糖乳酪杆菌M42可以用于外源反式脂肪酸的富集、脱毒作用,进而起到靶向富集代谢反式脂肪酸的作用。
实施例3
鼠李糖乳酪杆菌M42对肠镰孢属(Fusimonasintestini)等有害菌的抑菌能力试验
对致病有害菌抑菌实验:在无菌平板中倾倒10mL的水琼脂培养基,待冷却凝固后放上牛津杯,将指示菌菌悬液肠镰孢属Fusimonas intestini G1、白色念珠菌ATCC 10231加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中,使指示菌浓度为106CFU/mL,混匀,将其倒在底层水琼脂上面,待其凝固后,用镊子取出牛津杯,即形成孔洞,向每个孔中加入200μL的待测样品MRS培养基发酵液,扩散30min,37℃厌氧培养48h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径,记录抑菌圈直径,最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。
表3鼠李糖乳酪杆菌M42发酵液的抑菌能力分析
鼠李糖乳酪杆菌M42对肠镰孢属(Fusimonas intestini)等有害菌的抑菌能力测试结果如表3所示,鼠李糖乳酪杆菌M42对肠镰孢属G1、白色念珠菌ATCC 10231抑菌圈都达到20mm以上,说明:鼠李糖乳酪杆菌M42对病原微生物有较强的抑菌能力,其中肠镰孢属被视为肥胖中肠道菌群的有害菌,即,鼠李糖乳酪杆菌M42可以高效改善肠道菌群,增加有益菌的丰度,促进肠道菌群的平衡和肠道蠕动,加快脂肪、糖等碳水化合物的分解,进而达到改善糖脂代谢的功效。
实施例4
鼠李糖乳酪杆菌M42对人体胃肠耐受性试验
a)鼠李糖乳酪杆菌M42对胃液和肠液的耐受性
配制模拟胃液:NaCl 2.0g/L,用HCl将pH值分别调至2.0、2.5、3.0和4.0,进行高压灭菌,胃蛋白酶3.2g/L,胃蛋白酶在实验时现加现用;
配制模拟肠液:磷酸二氢钾6.8g/L,用NaOH将pH值调至7.5,进行高压灭菌,胰蛋白酶10.0g/L,胰蛋白酶在实验时现加现用;
取甘油管保存的实施例2的鼠李糖乳酪杆菌M42菌种以10%的接种量接种至MRS培养基中37℃活化24h;将等量的鼠李糖乳酪杆菌M42菌液加入到体系50mL模拟胃液中,记录初始活菌,37℃恒温培养3h后测定活菌数。对检测的M42进行统计,并计算存活率,菌株存活率=试验组/对照组×100%。
当食物进入胃中时,胃酸即开始分泌。人体正常的胃分泌的胃酸浓度pH值约为2左右。胃在排空时pH值约在7.0 -7.2间,当食物进入胃中时,pH值迅速下降到2-3。饭后胃液稀释,pH上升至3.5左右。M42胃酸耐受性数据如表4所示,pH2.0时,M42存活率为42.31%;pH2.50时,M42存活率为68.45%;在pH3.0时,M42存活率为89.17%;在进食以后服用的M42菌株能够耐受胃液,且在肠道中,鼠李糖乳酪杆菌M42菌株能够耐受肠液。
表4鼠李糖乳酪杆菌M42胃酸耐受性
b)鼠李糖乳酪杆菌M42对胆盐的耐受性
将鼠李糖乳酪杆菌M42菌株按5%的接种量接种到MRS液体培养基中,37℃活化培养24小时,连续活化两次。将活化好的M42菌液按5%的接种量接种到MRS液体培养基中,于恒温培养箱中37℃静置培养15h。将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体,并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。
按10%的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L和0.0g/L(初始菌液)的MRS培养基中,以胆盐浓度为0.0g/L为对照组。然后于37℃恒温培养箱中孵育3h。将孵育后的菌液取出,立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水,拍打混匀后检测M42;对检测的活菌进行统计,并计算存活率,计算公式如下:
菌株存活率(%)=试验组/对照组×100%。
鼠李糖乳酪杆菌M42胆盐耐受性数据如表5所示:当胆盐浓度为1.0g/L和2.0g/L时,M42菌株的存活率分别为99.94%和97.32%,但当胆盐浓度达到3.0g/L时,M42菌株存活率仍达到96.49%。肠道内的胆盐浓度不超过3.0g/L,说明鼠李糖乳酪杆菌M42菌株能够耐受肠道内的胆盐。
表5鼠李糖乳酪杆菌M42胆盐耐受性
综上所述,本实施例的鼠李糖乳酪杆菌M42具有良好的胃酸和胆盐耐受性,可以通过胃肠道途径发挥功效。
实施例5
本实施例的鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉,为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基上,37℃恒温培养箱中静置培养24h,离心分离得到的发酵液,其中鼠李糖乳酪杆菌M42活菌数为5×1010CFU/g,将发酵液冷冻干燥或喷雾干燥成鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉。
鼠李糖乳酪杆菌M42对高脂饮食小鼠肥胖和糖脂代谢的影响分析
a)实验方案
1、动物来源:雄性SPF级C57BL/6小鼠,8周龄。
2、饲养条件和饲料:温度为23±2℃,相对湿度为50-55%,无病原体的房间里,控制12h昼夜循环,8:00点为控制时间,自由进食和饮水。
3、实验动物分组(表6),将39只小鼠(20.00g±2.00g)分为3组,分别为对照组(CON组),模型组(HFD组)、鼠李糖乳酪杆菌M42活菌组(M42组),每组13只小鼠。对照组采用维持饲料,HFD组、M42组饲料采用高脂饲料(Fat 60%),持续喂养12周。M42组采用灌胃方法,给小鼠每日灌胃的菌液中鼠李糖乳酪杆菌M42活菌数为1×109CFU(即,采用电子天平称取本实施例制备的鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉20mg),对照组和模型组小鼠每日灌胃同等量的麦芽糊精,各组灌胃持续12周。
表6实验动物分组
4、在第12周实验结束前,通过口服糖耐量试验(OGTT)对小鼠的血糖稳态进行评价,具体操作为:小鼠禁食12h后,按照2mg/g体重的剂量灌胃葡萄糖,分别在灌胃前(0min)、灌胃后15、30、60、90、120min尾静脉采集血液,并用血糖试纸测定血糖,并计算曲线下面积。
b)鼠李糖乳酪杆菌M42对高脂饮食小鼠体重增加量及血糖稳态的分析
实验进行每周对小鼠进行称重并记录,结果如图5所示,HFD组小鼠体重显著增长,造模成功,M42组添加鼠李糖乳酪杆菌M42干预后,高脂饮食小鼠体重明显下降;相对对照组,M42组体重增长量与模型组比较显著下降p<0.01,表明:鼠李糖乳酪杆菌M42可显著抑制了高脂饮食小鼠因高脂饮食诱发的体重增长。
图6示出了鼠李糖乳酪杆菌M42的AUC(曲线下面积)与HFD组相比极其显著降低(P<0.01),说明:M42组的高脂饮食小鼠的葡萄糖耐受能力增强,高脂饮食导致的葡萄糖代谢紊乱得到显著改善,鼠李糖乳酪杆菌M42具有改善高脂饮食小鼠血糖稳态、增加口服葡萄糖耐受性的作用。
c)鼠李糖乳酪杆菌M42对高脂饮食小鼠肝脏脂肪病变的影响
在第12周实验结束后处死小鼠,取小鼠肝脏组织进行H&E染色,在400倍显微镜下H&E染色观察各组肝组织切片,实验结果如图7所示。
CON组小鼠肝脏组织结构完整,着色均匀,脂肪蓄积较少,其肝细胞紧密且均一,呈现规则的形状;而HFD组小鼠肝脏结构明显受损,出现较多脂肪蓄积,出现明显的病理学变化,肝细胞出现坏死,且其周围呈现脂质空泡化。经鼠李糖乳酪杆菌M42干预后,鼠李糖乳酪杆菌M42组肝细胞出现坏死和脂质空泡化细胞面积极少,显著小于HFD组(P<0.0001),M42组的肝脏脂肪细胞面积甚至低于CON组,即,鼠李糖乳酪杆菌M42有效抑制了高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积甚至有利于肝脏脂肪的分解,还可以有效防止肝细胞坏死及脂质空泡化等病变现象。
d)鼠李糖乳酪杆菌M42对对高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪重量的影响
实验结束后处死小鼠,取小鼠皮下脂肪重量和附睾脂肪称量,实验结果分别如图8和9所示。
参见图8,HFD组皮下脂肪重量显著高于CON组(P<0.0001),M42组皮下脂肪重量显著低于HFD组(P<0.0001),且略高于CON组(p≤0.05);由图9可知:HFD组附睾脂肪重量显著高于CON组(P<0.0001),M42组附睾脂肪重量显著低于HFD组(P<0.0001),且略高于CON组(p≤0.05);因此,鼠李糖乳酪杆菌M42可以显著减少高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪的积累,降低高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪的重量。
e)鼠李糖乳酪杆菌M42对高脂饮食小鼠白色脂肪、棕色脂肪积累的影响
实验结束后处死小鼠,取小鼠白色脂肪(附睾和皮下)、棕色脂肪(背部)组织并进行H&E染色,并用软件进行统计,实验结果表明:参见图10,在400倍显微镜下H&E染色观察各白色脂肪组织切片,CON组小鼠白色脂肪细胞面积明显小于HFD组(P<0.0001),且HFD组中白色细胞的直径显著增大;M42组明显小于HFD组(P<0.0001),M42组小鼠的白色脂肪细胞面积及大小均接近对照组。
参见图11,在400倍显微镜下H&E染色观察各组棕色脂肪组织切片,CON组小鼠棕色脂肪细胞面积明显小于HFD组(P<0.0001),对比CON组和HFD组的棕色脂肪组织切片,高脂饮食增加了大脂肪细胞(直径>50μm)的比例,M42组棕色脂肪细胞面积明显小于HFD组(P<0.0001),对比CON组和M42组的棕色脂肪组织切片,鼠李糖乳酪杆菌M42显著改善了高脂饮食造成的白色脂肪组织脂质积累,减少脂质浸润与侵袭,逆转了棕色脂肪组织的非正常形态与功能。
综上所述,M42显著降低了高脂饮食小鼠白色脂肪、棕色脂肪的积累,逆转了白色脂肪组织、棕色脂肪组织的非正常形态与功能。
f)鼠李糖乳酪杆菌M42干预的高脂饮食小鼠的粪便微生物丰富度分析与反式油酸测定
小鼠粪便收集:小鼠最后一次灌胃饲料后2h,在超净工作台上促使小鼠产生排便反应,收集小鼠粪便,所有试剂及耗材提前灭菌以保证无菌。粪便收集到灭菌的1.5ml离心管中,每组三管重复,储存于-80℃备用。
小鼠肠道微生物检测实验流程:试剂盒提取小鼠粪便微生物组总DNA、对某个或某几个r RNA基因可变区或特定基因片段进行PCR扩增、凝胶回收试剂盒回收纯化扩增产物、将扩增回收产物进行荧光定量并送至生物测序公司分析不同分类水平物种丰富度分析。
小鼠粪便反式脂肪酸测定:收集粪便,利用GC-MS测定各组粪便中反式油酸的含量。
参照图12,实验结果表明:模型组与对照组相比,Lactobacillus(乳杆菌属)、Bifidobacteriaceae(双歧杆菌属)、Akkermansia muciniphila(嗜黏蛋白阿克曼菌)丰度下降(P<0.05),Desulfovibrio(脱硫弧菌属)、Fusimonas intestini(肠镰孢属)丰度显著增加(P<0.01)以及白色念珠菌丰度极其显著增加(P<0.001);鼠李糖乳酪杆菌M42干预后,相对与HFD组,M42组的Lactobacillus(乳杆菌属)、Bifidobacteriaceae(双歧杆菌属)、Akkermansia muciniphila(嗜黏蛋白阿克曼菌)丰度极显著增加(P<0.01),同时,Desulfovibrio(脱硫弧菌属)、Fusimonas intestini(肠镰孢属)、白色念珠菌丰度极显著降低(P<0.01),因此,鼠李糖乳酪杆菌M42通过降低Desulfovibrio(脱硫弧菌属)、Fusimonas intestini(肠镰孢属)、白色念珠菌等有害菌的丰度,促进乳杆菌属、双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌等有益菌的丰度调节肠道菌群,进而改善肥胖及糖脂代谢紊乱的现象。
不同组的小鼠粪便中反式油酸的测定结果表明(图13),模型组HFD组与对照CON组相比,HFD组的反式油酸含量增加极其显著(p=4.8*10-5),由于反式脂肪酸对人体健康有害,而鼠李糖乳酪杆菌M42干预后,M42组的小鼠粪便中反式油酸含量相对HFD组显著下降(P<0.01),且接近对照组的小鼠粪便中的反式油酸含量,说明:鼠李糖乳酪杆菌M42可靶向富集反式油酸等反式脂肪酸并排出至体外,进而高效抑制高脂饮食引起的反式脂肪酸在小鼠体内的积累,降低肠道通透性和结肠组织病变。
g)鼠李糖乳酪杆菌M42对小鼠肠道屏障和组织的影响
收集小鼠粪便,利用体内评估肠道屏障通透性水平利用口服荧光素FITC-dextran来测定。实验取血:口服FITC 4h后麻醉并固定小鼠,收集小鼠血清;使用多功能酶标仪在激发波长为493nm检测肠道通透性,选择吸收波长为518nm检测血清荧光强度;结肠组织使用4%的多聚甲醛溶液常温固定一天以上,将固定后的样本制作生理切片,并且使用H&E染色。切片制作完成后,在显微镜下观察不同组小鼠结肠的受损情况。
结果如图14所示,与对照组相比,模型组(HFD组)小鼠的肠道通透性显著增加(p<0.001),结合肠道中反式油酸的增加会导致肠道屏障被破坏,同时H&E染色结果表明高脂饮食组的小鼠结肠结构明显受损;鼠李糖乳酪杆菌M42干预后,小鼠肠道通透性降低(p<0.05),降低了反式油酸对肠道屏障的损坏,同时恢复了高脂饮食造成的结肠结构破坏。
综上所述,与CON组和HFD组相比,M42组的鼠李糖乳酪杆菌M42可显著抑制小鼠体重增长,并提高葡萄糖耐受能力、减少肝细胞出现坏死和脂质空泡化细胞面积、同时降低皮下脂肪和附睾脂肪重量,白色脂肪细胞和棕色脂肪也显著减少,同时,M42组的小鼠粪便中有害菌丰度降低,有益菌丰度升高,同时M42组的鼠李糖乳酪杆菌M42通过靶向富集油酸,使粪便中反式油酸减少,降低了肠道通透性和结肠组织病变,因此,鼠李糖乳酪杆菌M42可以用于制备预防或治疗肥胖及糖脂代谢紊乱疾病的药物,进而改善肥胖和糖脂代谢紊乱的症状。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉在制备用于调节肠道的生物菌剂中的应用,其用量0.5~0.8g/day。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉在制备用于预防或治疗糖脂代谢病的药物中的应用,其用量2~4g/day。
实施例6
本实施例的鼠李糖乳酪杆菌M42组合物,为鼠李糖乳酪杆菌M42后生元,所述鼠李糖乳酪杆菌M42后生元为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基上,37℃恒温培养箱中静置培养24h后,通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有鼠李糖乳酪杆菌M42及其代谢产物的固体粉末,其中鼠李糖乳酪杆菌M42菌体数为5×1010个/g。
本实施例的鼠李糖乳酪杆菌组合物在制备预防或治疗糖脂代谢病的药物中的应用,用量为5.0*109~1*1011个/day。
实施例7
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌,包括鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉,所述鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基中37℃发酵培养20h获得的发酵液经离心后冷冻干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉,含3*1010CFU/g活菌。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌在制备用于预防或治疗糖脂代谢病的药物中的应用,其用量为5*109~5*1010CFU/day。
本实施例的鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用,其用量为1*107CFU/Kg发酵食品。
本实施例的鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉在制备用于肠道调节的生物制剂或药物中的应用,其用量为1*109~2*109CFU/day。
实施例8
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌组合物,为重量比为1:1的鼠李糖乳酪杆菌M42后生元和鼠李糖乳酪杆菌M42灭活菌体的组合物,所述鼠李糖乳酪杆菌M42灭活菌体为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基发酵培养结束后得到的发酵液,发酵液离心得到的沉淀经过重悬、细胞裂解、高温灭活(121℃,30min)、离心、浓缩、喷雾干燥得到,其中鼠李糖乳酪杆菌M42菌体数为4.5×1010个/g;所述鼠李糖乳酪杆菌M42后生元为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基上,37℃恒温培养箱中静置培养24h后,通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有鼠李糖乳酪杆菌M42及其代谢产物的固体粉末,其中鼠李糖乳酪杆菌M42菌体数为7×1010个/g。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌组合物在制备用于预防或治疗糖脂代谢病的药物中的应用,其用量为100~1000mg/day。
实施例9
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌组合物,为按重量比为1:3的鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉和鼠李糖乳酪杆菌M42后生元的组合物,其中鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉同实施例5所述方法制备,活菌含量为5*109CFU/g,鼠李糖乳酪杆菌M42后生元如实施例6所述方法制备,其中,细胞数为5*1010个/g。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌组合物在制备用于调节肠道的药物中的应用,其用量0.5~1g/day。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌在制备用于预防或治疗糖脂代谢病的药物中的应用,其用量2~6g/day。
实施例10
本实施例的一种用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物,为按重量比为2:1的鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉和鼠李糖乳酪杆菌M42代谢产物,其中鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉同实施例4所述方法制备,活菌含量为3*1010CFU/g,所述鼠李糖乳酪杆菌M42代谢产物为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基中37℃发酵培养24h后,发酵液通过离心得到的离心上清液经高温灭活(121℃、30min)、离心、浓缩、喷雾干燥制备而成。
本实施例的用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物,用于预防或治疗肥胖、脂肪肝、高血糖等糖脂代谢病,推荐用量为3~5g/day。
实施例11
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌,包括鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉,所述鼠李糖乳酪杆菌M42活菌粉为鼠李糖乳酪杆菌M42在MRS培养基中37℃发酵培养20h获得的发酵液经离心后冷冻干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉,含5*1010CFU/g活菌。
本实施例的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌在制备用于肠道调节的生物制剂中的应用,其中生物制剂为粉剂,所述粉剂的制备方法如下:按重量份计,包括鼠李糖乳酪杆菌M42(5.0×1010CFU/g)20重量份、麦芽糊精20重量份、山梨糖醇11重量份、低聚半乳糖13重量份、玉米肽10重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽5重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E1重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后,按配比混合均匀,使用螺杆背封包装机装袋,制备成2g/袋具有肠道调节功效的固体粉剂。
本发明的可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌在制备糖脂代谢病的药物中的应用,可以根据糖脂代谢病初始症状的严重程度调整相应组合物的成分及用量,如实施例5中鼠李糖乳酪杆菌M42菌粉在制备用于肥胖症糖脂代谢病的药物中的应用,其用量还可以为2.0×1010CFU/day,实施例6中鼠李糖乳酪杆菌M42后生元作为组合物在制备预防或治疗糖脂代谢病中的应用,其用量还可以为4*1010个/day,以上技术特征的改变,本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施,故不再另作附图加以说明。
Claims (10)
1.一种可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌,其特征在于,所述鼠李糖乳酪杆菌M42(Lacticaseibacillus rhamnosus M42)于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20231994。
2.如权利要求1所述可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌,其特征在于,所述鼠李糖乳酪杆菌M42的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示,所述鼠李糖乳酪杆菌M42通过靶向富集代谢反式油酸,并抑制肠镰孢属和/或白色念珠菌有害菌,进而调节糖脂代谢和/或调节肠道菌群及肠道结构修复。
3.一种含鼠李糖乳酪杆菌的发酵组合物,其特征在于,所述发酵组合物通过使用权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌M42发酵生产制得。
4.如权利要求3所述的一种含鼠李糖乳酪杆菌的发酵组合物,其特征在于,所述发酵组合物包括如权利要求1所述可调节糖脂代谢的鼠李糖乳酪杆菌M42活菌、鼠李糖乳酪杆菌M42灭活菌体、代谢产物和鼠李糖乳酪杆菌M42后生元中的一种或多种。
5.如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌在制备用于肠道调节的生物制剂或药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述肠道调节至少包括以下一种:
a)抑制肠镰孢属、脱硫弧菌属或白色念珠菌中的一种或多种有害菌生长,降低其丰度;
b)促进乳杆菌属、双歧杆菌属或嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种有益菌生长,增加其丰度;
c)富集代谢反式脂肪酸,促进肠道屏障及结构的恢复。
7.如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌M42作为发酵剂在泡菜、酸菜发酵食品中的应用。
8.如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌和/或如权利要求3或4所述含鼠李糖乳酪杆菌的发酵组合物在制备用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物中的应用。
9.一种用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物,其特征在于,所述药物包含如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌M42和/或如权利要求3或4所述发酵组合物。
10.如权利要求9所述的用于预防和/或治疗糖脂代谢病的药物,其特征在于,所述药物包括如下至少一种作用:
a)靶向富集并代谢反式脂肪酸,减少肠道反式油酸的形成,降低了肠道通透性和结肠组织病变;
b)高效抑制肠镰孢属和/或白色念珠菌有害菌,并提高肠道有益菌丰度;
c)显著抑制高脂饮食小鼠的体重增加;
d)显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态;
e)显著抑制高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积,减小肝细胞出现坏死和脂质空泡化;
f)显著降低皮下脂肪、附睾脂肪、白色脂肪、棕色脂肪的积累。
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