JP2005040123A

JP2005040123A - ラクトバシラス・ファーメンタム、それと担体からなる肥満症または糖尿病の予防・治療用製剤、食品組成物

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Publication number: JP2005040123A
Application number: JP2003338120A
Authority: JP
Inventors: Han Oh Park; 翰 ▲吾▼ 朴; Su-Han Song; 守漢宋; Sun Kyung Kang; 善京姜; Jae Ho Kim; 載浩金; Young-Hyun Park; 龍賢朴
Original assignee: BAIONIA KK
Current assignee: BAIONIA KK
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2023-09-29
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Abstract

【課題】腸内生存性の優れた、腸内で多糖類を高効率で生成する、肥満症、または糖尿病を予防または治療できる微生物を提供すること。
【解決手段】腸内に流入されるブドウ糖、ショ糖、または果糖などを体内に吸収されない高分子物質に転換して低糖類の腸からの吸収を競争的に阻害する役割を果たす新規な微生物と、該微生物の薬学的有効量を含有する組成物および食品組成物を提供することにより、肥満症や糖尿病などを予防または治療することができる。
【選択図】図２

Description

本発明は、腸内生存性が優秀であると共に、腸内で多糖類を高効率で生成して肥満症や糖尿病を予防または治療することのできる微生物に係り、より詳しくは腸内に流入するブドウ糖、ショ糖、または果糖などを体内に吸収されない高分子物質に転換して低糖類の腸内吸収を競争的に阻害することにより、肥満症または糖尿病の予防や治療を可能にした新規な微生物、これらの薬学的有効量を含む組成物（製剤）、およびこれらを有効成分として含む食品組成物に関する。

肥満は、未だに明確に究明されていない種々の要因によって複合的に発生する慢性的な疾患として知られている。肥満は高血圧症、糖尿病、心血管疾患、胆石症、骨関節炎、睡眠時無呼吸症（Ｓｌｅｅｐａｐｎｅａ）、呼吸障害、子宮内膜症、前立腺がん、乳がん、または大腸がんなどを引き起こす原因とされている。

１９９９年米国の国立保健院（ＮＩＨ）の報告書（ＴｈｅＥｖｉｄｅｎｃｅＲｅｐｏｒｔ：Ｃｌｉｎｉｃａｌｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｏｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｏｂｅｓｉｔｙｉｎａｄｕｌｔｓ，１９９９，ＮＩＨ）によると、米国人の約９,７００万人が肥満状態であり、肥満と関連した疾患の一つであるII型糖尿病（ＴｙｐｅII ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）の患者はおよそ１,５７０万人にも達するという。また、肥満と関連した疾患により毎年全世界において約２０万人が死亡するという（ＤａｎＦｅｒｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，ｐｐ１４２３−１４２４，１９９９）。

糖尿病は、患者およびその家族を含め、社会的にも個人的・財政的な費用が要求される全世界的に蔓延した慢性疾患の一つであって、それぞれ別個の病因や発病機序を有する異なる類型の糖尿病が存在する。例えば、腎性糖尿病は、過血糖症および糖尿を特徴とし、インスリンの不適切な生成や利用で引き起こされる炭水化物代謝の障害によるものである。

インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、II型糖尿病）は、インスリンが適切に生成されて利用されているが、末梢組織においてインスリンを介するグルコース代謝、およびその他の代謝に障害のある、主に成人で観られる糖尿病である。

ＮＩＤＤＭは、３つの主要な代謝的異常、例えば、インスリンを介するグルコース処理に対する抵抗と、栄養物により刺激されるインスリン分泌能の損傷と、肝臓でのグルコースの過多生成とによる。ＮＩＤＤＭの治療、すなわち、血糖値の調節に失敗すると、心血管疾患による死亡や網膜症、腎臓病、および末梢神経病を始めとする様々な糖尿病合併症が引き起こされるおそれがある。

ＮＩＤＤＭの治療法には、ＮＩＤＤＭ患者の血糖値を調節する方法として、食餌療法および運動療法に加え、経口的血糖降下剤であるスルホニル尿素（Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）系薬物やビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系薬物などを使用しても良い。また、最近はメトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）やアカルボース化合物などもＮＩＤＤＭの治療に用いられている。しかし、ある患者においては食餌療法と運動療法および／または前記治療薬物によっても過血糖症を適切にコントロールできない場合もあるため、外因性インスリンの投与が要求されることもある。

注射によるインスリンの投与は高価であり、患者には苦痛を与える他、様々な障害や合併症を引き起すこともある。例えば、インスリン反応（低血糖症）は、インスリン投与量の間違い、欠食、不規則的な運動、または特別な原因がないときでも引き起こされることがある。また、局所的および／または全身的アレルギー反応やインスリンに対する免疫学的な抵抗性が発生することもある。

肥満症や糖尿病の予防・治療法は、食餌・運動療法と、手術療法と、薬物療法とに大別される。食餌・運動療法は、低カロリー・低脂肪の摂取と酸素消費の肉体活動を通じた治療方法であるが、これは忍耐強く反復的、持続的に行わなければならないので大衆的な効果を得るには難しいとされている。

手術療法は、外科的手術を介して体脂肪を物理的に取り除く方法であって、短期間でその効果が得られるという長所を有するが、手術過程が必要であること、効果の持続性がないこと、費用の問題などで、その活用が制限されている。

したがって、血糖値の減少、糖吸収の阻害、インスリン作用の強化または食欲減退をもたらす薬物によって、肥満や肥満型糖尿病を治療・予防しようとする薬物療法が盛んに研究されており、現在まで開発されている肥満や肥満型糖尿病の予防・治療用の薬物は、様々な生理学的メカニズムを利用している。

したがって、現在開発された様々な薬物のうち、人体の代謝バランスに損傷を与えないものであって、天然物質であるという長所を有する食餌繊維が最も有用な肥満の予防・治療製剤として認められている。

従来の微生物食餌繊維を生成する微生物としては、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ）、アセトバクター・ハンセニー（Ａ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）、アセトバクター・パスタリアナス（Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・アセティー（Ａ．ａｃｅｔｉ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、サルチナ属（Ｓａｒｃｉｎａ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバシラス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・サケ（Ｌ．ｓａｋｅ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌ．Ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバシラス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・デルブルッキー亜種（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．）、ラクトバシラス・ヘルベティカスグルコース変種（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓｇｌｕｃｏｓｅｖａｒ．ｊｕｇｕｒｔｉ）、ロイコノストック・デキサトラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）、ブルガリカス属（Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、カンペストリス属（Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）などが挙げられる。

これらの微生物により生成される食餌繊維は、各種食品の安定剤、増粘剤、乳化剤、吸湿剤などと、医薬品、化粧品の原料として用いられているが、現在では、微生物セルロース、キサン（ｘａｎｔｈａｎ）、アセタンなどと、海藻類から精製した食餌繊維であるグアールガム（Ｇｕａｒｇｕｍ）、ローカストビーンガム（Ｌｏｃｕｓｔｂｅａｎｇｕｍ）、カラギーナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、寒天（ａｇａｒ）などが既に商品化されている。

上記した微生物のうち、ラクトバシラス属の菌株は人体の腸内で生息している正常微生物群集（ｎｏｒｍａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｌｏｒａ）の主構成物であって、健康な消化器官と膣内環境の保持に非常に重要なものとして以前から知られている（非特許文献１）。一般に、ラクトバシラス菌株の生息地は、動物の消化器官（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ，Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ，Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉなど）、膣内粘膜（Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ，Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、食品（ｗｉｎｅ−Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、乳酸菌飲料（Ｌ．ｋｅｆｉｒ，Ｌ．Ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ；ｃｈｅｅｓｅ−Ｌ，ｃａｓｅｉ）、お酢（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、口腔（Ｌ．ｏｒｉｓ）、こうじ（Ｌ．ｓａｋｅ，Ｌ．ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉ）、果汁（Ｌ．ｋｕｍｋｅｅｉ，Ｌ．ｍａｌｉ，Ｌ．ｓｕｅｂｉｃｕｓ）、醗酵したソーセージまたは魚類（Ｌ．ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ，Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）などである。

実際、多くの人々が健康な腸を維持するために、また尿路膣内感染（ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を防ぐために、ラクトバシラス属の菌株を含有している健康補助剤を使用している。最近は、下痢および便秘の予防、または尿路感染の予防その他ラクトバシラスの様々な生理活性機能（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）、例えば、免疫力の調節、血中コレステロール値の調節、リウマチの治療、がんの予防、乳糖に対する敏感性の緩和、アトピー性皮膚炎に対する効果などに対する重要性および関心が高まっている。

米国の公衆健康ガイドライン（Ｕ．Ｓ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）によると、現在米国の菌株寄託機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている２６２種のラクトバシラス菌株の全ては、人体や動物に疾患を引き起こす潜在的な危険性がないと認められる「安定レベル（Ｂｉｏ−ｓａｆｅｔｙＬｅｖｅｌ）１」として分類されている。

最近、ラクトバシラスの合成する細胞外の食餌繊維に対する研究が盛んに行われている。これらの菌株が細胞外の食餌繊維を作る機序には多くの遺伝子がかかわっているため極めて複雑であり、合成される食餌繊維の量も極めて少ないと知られている（非特許文献２）。

上記のように、現在まで肥満症または糖尿病の治療に関して様々な研究と努力が行われ、様々な化合物が肥満症または糖尿病治療剤として開発されているが、依然として副作用があって、体内に蓄積された体脂肪、タンパク質などを強制的に排出してしまうので、肥満症または糖尿病を根本的に抑制または治療する画期的な治療剤は未だにないというのが現状である。
Ｂｉｂｅｌ，Ｄ．Ｊ．，ＡＳＭＮｅｗｓ，５４：６６１−６６５，１９８８：Ｒｅｉｄ，Ｇ．ａｎｄＡ．Ｗ．Ｂｒｕｃｅ，ＩｎＨ．Ｌａｐｐｉｎ−Ｓｃｏｔｔ（ｅｄ．），Ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍｓ．ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐ．２７４−２８１，１９９５；ＲｅｉｄＧ．，Ａ．Ｗ．Ｂｒｕｃｅ，Ｊ．Ａ．ＭｃＧｒｏａｒｔｙ，Ｋ．Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，ａｎｄＪ．Ｗ．Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３：３３５−３４４，１９９０Ｉｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｍａｒ．３４０：１−２，８７−９２，１９９８；ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４９８−５０４，１９９９；ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：５９８−６０３，１９９９；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ．６４：２，６５９−６６４，１９９８；ＦＥＭＳ

本発明の目的は、腸内で生長しながら消化酵素により分解された低糖類の炭水化物を吸収し、体内に吸収されない高分子物質に転換させることにより、腸から体内に吸収される低糖類の量を大幅に減らすことのできる微生物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記微生物の薬学的有効量を含有し、体内に吸収される低糖類の量を根本的に減すことにより、肥満または糖尿病を予防または治療するための医薬組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記微生物を有効成分として含有する食品組成物を提供することである。

本発明は、腸内生存性が優秀であると共に、腸内で多糖類を高効率で生成して肥満症や糖尿病を予防または治療することのできる微生物に係り、より詳しくは腸内に流入するブドウ糖、ショ糖、または果糖などを体内に吸収されない高分子物質に転換して低糖類の腸内吸収を競争的に阻害することにより、肥満症または糖尿病の予防や治療を可能にした新規な微生物、これらの薬学的有効量を含む組成物、およびこれらを有効成分として含む食品組成物に関する。

前記本発明の微生物は、腸内で生長が可能であり、人体に無害で低糖類を腸管に吸収されない高分子物質に転換するものであって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＮＭ３１６であることが好ましい。

本発明の各微生物は通常、投与経路に応じて選択される薬学的担体や賦形剤、または補助の有効成分などとの混合でなる錠剤またはカプセルのような単位形態で投与される。本発明の組成物に適合な担体、賦形剤および希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、または鉱油などが挙げられる。

本発明の微生物組成物は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤または香味剤を更に含んでも良い。本発明の組成物は当業界において公知の方法を用いて、胃腸通過後に小腸に到達したときに活性成分の微生物が速やかに腸内に放出されるように腸溶性の被覆製剤として製造されても良い。

また、本発明の微生物組成物は通常のカプセル化方法を用いてカプセル形態の組成物として製造されても良い。例えば、標準担体を用いて凍結乾燥させた本発明の微生物の含有されたペレットを製造した後、それを硬質のゼラチンカプセル内に充填しても良く、または本発明の微生物と任意の適宜な製薬学的な担体（例えば、水性ガム、セルロース、ケイ酸塩、またはオイル）とを用いて懸濁液や分散液を製造した後、かかる分散液や懸濁液を軟質のゼラチンカプセル内に充填しても良い。

本発明の製剤は特に、経口用の単位剤型であって、腸溶被覆された腸溶性製剤として提供されても良い。本明細書の“腸溶性被覆”は胃酸では分解されず被覆が維持されるが、小腸では十分に分解されてその活性成分が小腸内に放出され得るようにする製薬学上において許容可能なあらゆる公知の被覆を含む。

本発明の“腸溶性被覆”は、ｐＨ１のＨＣｌ溶液のような人工胃液を３６〜３８℃で接触させるとき、２時間以上その形態が維持され、好ましくは、その後はｐＨ６.８のＫＨ₂ＰＯ₄緩衝溶液のような人工腸液において３０分以内に分解される被覆を称する。

本発明の腸溶性被覆は、１つのコアに約１６〜３０ｍｇ、好ましくは１６〜２０ｍｇまたは２５ｍｇ以下の量で被覆される。本発明の腸溶性被覆の厚さが５〜１００μｍ、好ましくは２０〜８０μｍである場合が腸溶性被覆として満足した結果を示した。腸溶性被覆の材料は公知の高分子物質の中から適宜に選択される。これらの高分子物質は、文献〔Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら、ＴｈｅＴｈｅｏｒｙａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ,３版、１９８６，ｐｐ．３６５−３７３，Ｈ．Ｓｕｃｋｅｒら，ＰｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｔｈｉｅｍｅ，１９９１，ｐｐ．３５５−３５９，ＨａｇｅｒｓＨａｎｄｂｕｃｈｄｅｒｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｎｅｎＰｒａｘｉｓ，４版,ｖｏｌ．７,ｐｐ．７３９−７４２および７６６−７７８，（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，１９７１），およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１３版，ｐｐ．１６８９−１６９１（ｍａｃｋＰｕｂｌ．，Ｃｏ．，１９７０）〕に挙げられており、セルロースエステル誘導体、セルロースエーテル、アクリル樹脂のアクリル酸メチル共重合体、並びにマレイン酸およびフタル酸誘導体の共重合体がこれらに含まれても良い。

本発明の好ましい腸溶性被覆は、セルロースアセテートフタルレートおよびトリメリテート、そしてメタクリル酸共重合体、例えば、メチルアクリル酸４０％以上、および、特にヒドロキシプロピルメチルセルロースフタルレートを含むメチルアクリル酸およびそのエステルから誘導された共重合体から製造される。ローム・ゲエンベハ社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ，ドイツ）により市販中の製品、エンドリジット・エル（ＥｎｄｒａｇｉｔＬ１００−５５）を本発明の腸溶性被覆の材料として使用し得る。

本発明の腸溶被覆用セルロースアセテートフタレートは、約４５〜９０ｃＰの粘度と、１７〜２６％のアセチル含量、および３０〜４０％のフタレート含量を有し、セルロースアセテートトリメリテートは、約１５〜２０ｃＳの粘度と、１７〜２６％のアセチル含量、２５〜３５％のトリメリチル含量を有する。イーストマン・コダック社（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏｍｐａｎｙ）市販の製品、セルロースアセテートトリメリテートを、本発明の腸溶性被覆材料として使用し得る。

本発明の腸溶被覆材料として用いられるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートは、１３０,０００ドルトン（Ｄａｌｔｏｎ）の分子量を有し、５〜１０％のヒドロキシプロピル含量、１８〜２４％のメトキシ含量および２１〜３５％のフタリル含量を有する。イーストマン・コダック社市販のセルロースアセテートフタレートを、本発明の腸溶性被覆の材料として使用し得る。

本発明の腸溶性被覆として用いられるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートは、シンエツ・ケミカル社（Ｓｈｉｎ−ＥｔｓｕＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｌｔｄ．，日本）市販のＨＰ５０であり、これは６〜１０％のヒドロキシプロピル含量、２０〜２４％のメトキシ含量、２１〜２７％のフタリル含量と８４,０００ドルトンの分子量を有する製品である。また、シン−エツケミカル社がＨＰ５５として市販中の、ヒドロキシプロピル含量が５〜９％、メトキシ含量が１８〜２２％、フタリル含量が２７〜３５％、分子量が７８,０００ドルトンである製品を、本発明の腸溶性被覆材料として使用し得る。

本発明の腸溶性被覆は、腸溶被覆溶液をコアに噴霧する通常の腸溶被覆法を用いて製造できる。腸溶被覆工程に用いられる適宜な溶媒としては、エタノールなどのアルコール、アセトンなどのケトン、ＣＨ₂Ｃｌ₂のようなハロゲン化炭化水素の溶媒であり、これらの溶媒の混合溶媒を用いても良い。フタル酸ジ−ｎ−ブチルまたはトリアセチンのような軟化材を１：約０.０５〜０.３（コーティング材料対軟化材）の割合で被覆溶液に加える。噴霧過程を連続的に行うことが好ましく、被覆の条件を考慮して噴霧量を調節することが可能である。噴霧圧は多様に調節でき、一般に約１〜１.５ｂａｒの噴霧圧で満足できるような結果が得られる。

本明細書の“薬学的な有効量”は、哺乳動物の腸内から体内に吸収される低糖類の量を減らすことのできる本発明の微生物の最小量を意味し、本発明の組成物により体内に投与される微生物の量は投与経路および投与対象を考慮して調整される。

本発明の組成物は対象の固体に毎日一回以上投与され得る。単位投与量は、被験者および他の哺乳動物のための単位投与に適合な物理的に分離された単位を意味し、各単位は適当な製薬的な担体を含み、治療効果を示す本発明の微生物の所定量を含有する。

成人患者への経口投与用の投与単位は、本発明の微生物０.１ｇ以上を含有することが好ましく、本発明の組成物の経口投与量は、一回に０.１〜１０ｇ、好ましくは、０.５〜５ｇである。本発明の微生物の薬学的な有効量は、０.１ｇ／日である。

しかし、投与量は、患者の体重、肥満症状の深刻度、および用いられる微生物と補助の有効成分によって可変的である。また、一日総投与量を数回に分割し、必要に応じて連続的に投与することができる。したがって、前記投与量の範囲はいかなる方式であっても本発明の範囲を制限することはない。

本明細書の“組成物”は必ず医薬品として許可されるものだけを意味するものではなく、醗酵乳、ジェリー、プディングなどの通常の食品、機能性食品または健康補助食品までも含む概念である。

本発明の組成物を周期的に服用する場合、腸内で本発明の各微生物が菌の群を成しながら、人体による糖類の吸収を競争的に妨げると共に、それらの糖類を利用して微生物が産生した非消化性多糖類が腸内有用菌の生息条件を良くし、腸管運動を刺激することにより、結果的には本発明の組成物が肥満症または糖尿病を予防・治療することができるようにする。

以下、本発明をより詳しく説明する
本発明の肥満症または糖尿病の予防および治療用微生物は、（１）腸内での増殖が可能であり、（２）低糖類を速やかに吸収して繊維状物質のような非消化性または難消化性の高分子化合物に転換させ、（３）人体または家畜に害のないという条件を満たす。したがって、前記の３つの条件を満たす公知の微生物を各種の寄託機関から受け、本発明の組成物に使用することができると共に、新規の微生物を新たに分離して使用しても良い。

本発明では、多糖類を生成する乳酸菌を糞便から分離し、それらの多糖類の生成能、糖消費速度、胃酸および胆汁酸に対する耐性実験を通じて突然変異の母菌株を選び出し、それを化学物質を用いて突然変異させて多糖類を多量生成するＮＭ３１６菌株を選別した。選別されたＮＭ３１６菌株を調べた結果、それはラクトバシラス・ファーメンタムであることを確認し、‘ラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６’（以下、‘ラクトバシラスＮＭ３１６’と呼ぶ。）と命名し、これを寄託した（ＫＣＴＣ−１０４５８ＢＰ）。

このように選別された本発明のラクトバシラスＮＭ３１６菌株により生成される多糖類が、腸内消化酵素により分解されるか否かを確認した結果、ラクトバシラスＮＭ３１６菌株により生成された多糖類は、腸内消化酵素により分解されず最終的には体内に吸収されないまま排出されることが分かった。

本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６菌株を生菌形態および乳酸菌醗酵乳形態でラットに投与した結果、少量の多糖類を生成する対照群に比べ、体重変化の面において、生菌形態の投与群では約１６.１％の体重増加抑制効果を、乳酸菌醗酵乳形態の投与群では約６.３％の体重増加抑制効果を示していた。そして、飼料摂取量においては、生菌形態の投与群では概ね１０.７％減った量を、乳酸菌醗酵乳形態の投与群では概ね４.６％増えた量を摂取することと確認された。

上記のそれぞれの結果に基づき、飼料摂取量を体重増加量で割ることで得られた値で表現した代謝効率の側面で計算した結果、対照群に比べ本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６菌株においては、生菌形態の投与群の場合は、一日おきの周期で測定した結果、概ね６.４％、また乳酸菌醗酵乳形態の投与群の場合では１２日を周期にして測定した結果、概ね２８.５％増加した代謝効率を示していた。したがって、本発明の微生物を摂取する場合、摂取する飼料の量が増えると、対照群に比べ、体重増加の抑制効果があることを確認できた。

また、本発明の微生物を摂取した場合における血中コレステロールの変化を調べた結果、本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６菌株は、生理食塩水投与群に比べ有意に減少した。したがって、本発明の微生物および該微生物が有効成分として含む食品組成物は、肥満症、糖尿病および循環器性疾患（動脈硬化、心筋梗塞など）に効果を示すことが分かる。

本発明の微生物は、優れた腸内生存性と、高効率の多糖類産生能を有しており、腸内で生存しながら、ブトウ糖、ショ糖、果糖なとの低糖類の化合物を高分子量の多糖類に転換させて体内に吸収される炭水化物の量を減らすことにより、肥満症または糖尿病を治療・予防できる効果を有する。なお、本発明による微生物は、体重調節、整腸作用、コレステロール吸収抑制などの効果を有する。

以下、本発明を実施例を用いてより詳しく説明するが、下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の権利範囲を制限しようとするものではない。
実施例１：多糖類を多量に産生する菌株の獲得
本発明の組成物に用いられる新規な微生物を下記のような方法で分離および改善した。先ず、粘質物を多量に産生する乳酸菌を見出すために、糞便飼料を、韓国清州市に生まれた、６ヶ月間母乳のみ授乳している健康な乳児から得た。該糞便を生理食塩水で１０倍希釈し、２％のものをｐＨ１.５のＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で５時間培養した。これをＭＲＳ培地および乳酸菌選択培地（ＬＢＳａｇａｒ）に塗末してから、３７℃で４８時間培養し、各平板から５〜３０個のコロニーを得た。次いで、つまよう枝を用いてそれぞれのコロニーの粘性を調べ、粘りを示すコロニーを粘性物質産生菌株として選抜した。選抜された菌株はＭＲＳａｇａｒ培地に２回以上塗末して純粋分離した。それぞれのコロニーはラクトバシラスのみを選択的に選別できるプライマーを用いたＰＣＲ法により、ラクトバシラスのみを選別分離した。

上記のようにして分離したそれぞれの菌株をＭＲＳ培地において３７℃で６時間培養してから遠心分離し、生理食塩水（ＰＢＳ．ｐＨ７.０）緩衝液で２回洗浄した後、同量の生理食塩水に懸濁させてＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｇｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を最終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で３０〜１２０分間培養した。遠心分離して得られた菌株は生理食塩水で２回洗浄した後、再びＭＲＳ液体培地で３回繰り返して培養し、高濃度の果糖の含有されたＭＲＳ培地〔５％果糖、１％牛肉抽出物、１％ペプトン、０.５％酵母抽出物、０.１％Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、０.２％クエン酸アンモニウム、０.５％酢酸ナトリウム、０.０１％ＭｇＳＯ₄、０.０１％ＭｎＳＯ₄、０.０５％Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ〕に塗末し、３７℃で４８時間培養した。

平板に形成したコロニーをつまよう枝を用いてそれぞれの粘性を調べ、粘性の増加したコロニーを選抜した後、それを再び、ＭＲＳ液体培地に接種して培養した。２４時間培養された菌株培養液の多糖類産生収率を計算するために、それぞれのチューブに０.５ｍＬずつ入れ、１３,０００（ｇ）で２０分間遠心分離してから上清液を採り、同量の４０％トリクロロアセテートを加えて攪拌した後、再び１３,０００（ｇ）で２０分間遠心分離して得られた上清液に２培の冷却したエタノール（４℃）を加えて混合した。それを再び６,０００（ｇ）で１０分間遠心分離してからその上清液を気をつけながら捨てた後、最初体積と同量の蒸留水を入れて多糖類を懸濁させてからフェノール−硫酸法で多糖類の量を測定し、多糖類効率〔ＥＰＳ（ｍｇ／Ｌ）／Ｏ.Ｄ（６５０ｎｍ）〕を測定し、一つの菌株を得た。

ラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６菌株は表１に示すように、対照の微生物であるラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２に比べ、５倍以上の多糖類産生能を示していることが分かる。

実施例２：ラクトバシラスＮＭ３１６菌株（ＫＣＴＣ１０４５８ＢＰ）の特性および同定
多糖類産生量の向上されたラクトバシラスＮＭ３１６の系統を把握するために、それぞれの菌株をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で１２時間静置して培養した。培養液を４℃、６,０００（ｇ）で遠心分離して微生物を得た後、それよりＣＴＡＢ／ＮａＣｌ法を用いて核酸を抽出した。核酸抽出物を１６ＳｒＲＮＡコンセンサスプライマー（１６ＳｒＲＮＡｃｏｎｓｅｎｓｕｓｐｒｉｍｅｒ）を用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した結果、本発明の微生物はラクトバシラス・ファーメンタムであることが確認された。

尚、ＡＰＩ５０ＣＨＫｉｔ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＣｏ.）を用いた糖利用性を比べた結果、Ｌ−アラビノース、リボース、ガラクトース、グルコース、マルトース、メリビオス、果糖に対する糖利用性は高いレベルを示したが、その他、Ｄ−ラフィノース、グルコネートにおいては低い成長率を示していた。

上記したように、表現型と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との塩基配列分析を通じ、本発明の微生物を‘ラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６菌株’として命名し、これを微生物寄託における国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、ＫＣＴＣ（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ）に寄託した（ＫＣＴＣ１０４５８ＢＰ）。

実施例３：多糖類の腸内消化酵素による分解性
本発明のラクトバシラスＮＭ３１６菌株による、腸内から産生される多糖類の腸内消化酵素による分解度を調べるために、精製された多糖類をリン酸緩衝液に溶かした後、ラットの小腸より分離した消化酵素を濃度別に添加し、１２０分間反応させてからその結果を酵素比色法を用いたトリンダー・キット（Ｃａｔ．３１５−５００Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で測定した。

表２に示すように、ラクトバシラスＮＭ３１６菌株により産生された多糖類は、腸内消化酵素によって分解されないことが分かった。したがって、本発明のラクトバシラスＮＭ３１６菌株により産生された多糖類は、体内に吸収されないまま体外に排出されることが分かった。

実施例４：ラクトバシラスＮＭ３１６菌株のプロバイオティックス効果の確認
ラクトバシラスＮＭ３１６菌株のプロバイオティックス効果を確認するために、先ず、大腸菌（Ｅ,Ｃｏｌｉ）を１６時間ＬＢ培地で培養し、１×１０⁵〜１×１０⁶の濃度に希釈した。これを滅菌した綿棒に濡らして均一に塗末した後、ラクトバシラスＮＭ３１６培養上清液を２０倍に希釈し、滅菌した８ｍｍディスクペーパー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，日本）に４０μＬの醗酵液を吸収させて塗末した寒天平板培地の上に置いた。

次いで、３７℃で４８時間培養した後、その生育抑制能を比較するためにディスク周辺に形成する透明地域の大きさを調べた。醗酵液による大腸菌生長抑制環を確認した結果、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２およびラクトバシラスＮＭ３１６のいずれにおいても透明環の形成を確認することができた。したがって、ラクトバシラスＮＭ３１６菌株は、有害菌の生長を抑制する乳酸菌固有のプロバイオティックス効果を有することを確認できた。

実施例５：ラクトバシラスＮＭ３１６摂取時の体重、食餌量の変化、およびそれに伴う代謝効率の変化
本発明で用いられた動物は、ＳＤラット（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔ）（５週齢、雄）で、生理食塩水（ＰＢＳ）投与群、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２投与群、ラクトバシラスＮＭ３１６菌株投与群からなるグループに大別し、各群当たりを１１匹のラットに構成して実験に臨んだ。上記各実験群に対して、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２およびラクトバシラスＮＭ３１６菌株は１日２回投与し、１回投与時の総菌体量は、３×１０¹¹ｃｆｕの濃度にし、経口投与方式を採択した。図４のａは、本発明による微生物を生菌の形態で摂取したラットの飼料摂取量の変化様子を示したものである。ここでは、ラットの体重および飼料摂取量を隔日周期にて測定し、９匹の平均値を示していた。

図２および表３に示すように、本実験によって４０日間投与した結果、ＳＤラットの体重変化が、投与開示日から１２日経過した時点から徐々に現われ、最終日の４０日目における測定値は対照群のＰＢＳ群に比べ、約１０.３％減少した結果が得られた。

また、長期投与時において、ＳＤラットの飼料摂取量の変化を伴う飼料効率の変化を調べたが、図５のａに示すように、本発明による微生物を生菌の形態で摂取したラットの代謝効率の変化は結果的に、ラクトバシラスＮＭ３１６投与群の総飼料摂取量が、他群に比べ概ね１０.７％程度低いことを確認することができ、投与期間中の総体重変化量も同様に約１６.１程度低くなることが確認された。しかし、飼料の効率面では、生理食塩水（ＰＢＳ）投与群に比べ、約６.４％高くなっていた。

結果として、ラクトバシラスＮＭ３１６投与群は、生理食塩水投与群より多い量の飼料を摂取するとしても、体重増加の抑制効果がより優れていることが分かる。
実施例６：ラクトバシラスＮＭ３１６菌株の乳酸菌醗酵乳の摂取時における体重、食餌量の変化、およびそれに伴う代謝効率の変化
本発明で用いられた動物は、ＳＤラット（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔ）（５週齢、雄）で、生理食塩水（ＰＢＳ）投与群、一般のスターター菌株のみを用いた乳酸菌醗酵乳（Ｓ）投与群、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２菌株を添加して製造した乳酸菌醗酵乳投与群、およびラクトバシラスＮＭ３１６菌株を添加して製造した乳酸菌醗酵乳投与群として分類し、各群当たりを１１匹のラットに構成して実験に臨んだ。ここで、生理食塩水を除いた乳酸菌醗酵乳投与群に対しては、スターター菌株であるストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバシラス・ブルガリカスとを５：２の割合で混合した菌体７×１０⁶を接種して基本スターター醗酵乳を製造し、これを基本スターター乳酸菌醗酵乳とし、該醗酵乳の生菌数は全体として１×１０⁸程度となるようにした。このようにして製造した乳酸菌醗酵乳に、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２およびラクトバシラスＮＭ３１６菌株に対しては別途培養して乳酸菌醗酵乳に添加して投与し、このとき、ラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２およびラクトバシラスＮＭ３１６菌株の投与された総菌体量は、４×１０¹⁰ｃｆｕであり、こうして製造した乳酸菌醗酵乳は１日２回経口投与する方式を採択した。図４のｂに示すように、ラットの体重および飼料摂取量は４日毎に測定して１０匹に対する平均値を示した。

上記で製造した醗酵乳を６０日間投与した結果、図３および図４に示すように、ＳＤラットの体重変化が４４日経過して時点から徐々に現われ、最終日の６０日目における測定値は、対照群であるヨーグルト投与群に比べ、体重が約２.６％程度減少した結果を示した。長期投与時のＳＤラットの飼料摂取量の変化においては、スターターヨーグルト投与群に比べ、ラクトバシラスＮＭ３１６投与群が約４.６％程度多い量の飼料を摂取すると判明され、投与期間中の体重変化量においても、４.３％程度抑制されると判明された。上記結果に基づき、図５のｂに示すように、飼料効率を計算したとき、ヨーグルト投与群に比べ約５.２％高い数値を示していた。

実施例７：ラクトバシラスＮＭ３１６菌株の摂取時におけるコレステロールの変化
本発明によるラクトバシラスＮＭ３１６菌株を摂取した場合、糖尿病や肥満症などの疾患だけでなく、循環器性疾患（動脈硬化、心筋梗塞など）の発病率に対する抑制効果があるか否かを確認するために、血中コレステロール値の変化を分析した。

脂肪質の分析のために、実験に使用していたラットの血液を実験終了の際に、しっぽ採血法を利用して採血してから分析に用いた。脂肪質の分析は、酵素比色法を用いており、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｚｙｍｅ−Ｖ（シンヤン化学、韓国）などを用い、５０５〜５７０ｎｍにおいて標準溶液と共に吸光度を測定することにより、血清内のコレステロール含量を計算した。

図６および表５に示すように、ラクトバシラスＮＭ３１６菌株の血中総コレステロール値は、生理食塩水投与群に比べ、投与開示日から４０日経過した時点から減少し始め、かえって投与前より減少していた。したがって、本発明の微生物は循環器性疾患（動脈硬化、心筋梗塞など）の発病率を減少させる効果を有すると予測できる。

前述したように、本発明の構成および好ましい実施例を本明細書に記載したが、本発明の権利範囲は、上記で記載された実施例に制限されるものと解析されてはならず、当業者であれば、本発明の権利範囲内で本明細書に記載の内容を変形して実施できると判断される。

本発明による微生物によるプロバイオティックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）効果を検証する図面である。ここで、Ａはラクトバシラス・ロイテリＡＴＣＣ２３２７２を、Ｎはラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６を示すものである。本発明による微生物を生菌の形態で摂取したラットの体重変化の様子を示す図表である。ここで、ａは初期体重ｇを、ｂは４０日間投与した後の体重ｇを、ｃは４０日間投与した後の体重増加量ｇを示すものである。本発明による微生物を乳酸菌醗酵乳の形態で摂取したラットの体重変化の様子を示す図表である。ここで、ａは初期体重ｇを、ｂは６０日間投与した後の体重ｇを、ｃは６０日間投与した後の体重増加量ｇを示すものである。本発明による微生物を摂取したラットの飼料摂取量の変化を示す図表である。ここで、ａは本発明の微生物の生菌形態の投与群を、ｂは乳酸菌醗酵乳（ヨーグルト）形態の投与群に対する結果である。本発明による微生物を摂取したラットの代謝効率の変化を示す図表である。ここで、ａは本発明の微生物の生菌形態の投与群を、ｂは乳酸菌醗酵乳（ヨーグルト）形態の投与群に対する結果である。本発明による微生物を摂取したラットの血中コレステロール濃度変化の様子を示す図表である。

Claims

多糖類物質を生成するラクトバシラス・ファーメンタム（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍＮＭ３１６（ＫＣＴＣ−１０４５８ＢＰ）。
多糖類物質を生成する薬学的有効量のラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６（ＫＣＴＣ−１０４５８ＢＰ）および担体でなる肥満症予防・治療用製剤。
前記肥満症予防・治療用製剤を腸溶性の被覆物質で覆ったことを特徴とする請求項２に記載の肥満症予防・治療用製剤。
多糖類物質を生成するラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６（ＫＣＴＣ−１０４５８ＢＰ）を有効成分として含む食品組成物。
前記食品組成物が、ジェリー、プディング、粉末、カプセル、または醗酵乳であることを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
多糖類物質を生成する薬学的有効量のラクトバシラス・ファーメンタムＮＭ３１６（ＫＣＴＣ−１０４５８ＢＰ）および担体でなる糖尿病予防・治療用製剤。
前記糖尿病予防・治療用製剤を腸溶性被覆物質で覆ったことを特徴とする請求項５に記載の肥満症予防・治療用製剤。