CN115804795A - 一种枯草芽孢杆菌菌剂及其在制备糖尿病预防产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌剂及其在制备糖尿病预防产品中的应用。本发明从小鼠粪便中筛选到一株枯草芽孢杆菌Cohn 1872，该菌株能够以透明质酸作为碳源进行发酵。本发明针对上述菌株活性的研究表明，该菌株具有调节肠道菌群，提高机体免疫功能的效果；另外，上述菌株与透明质酸联用对糖尿病症状改善具有提升效果，有望作为一种糖尿病防治活性成分应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌剂、药物组合物及其在制备肠道调节益生菌制剂、糖尿病预防产品中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
糖尿病是一种以持续高血糖为特征的疾病。根据世界卫生组织的研究,到2030年，糖尿病可能成为世界人口死亡的主要原因之一。2型糖尿病是由于胰岛素抵抗引起的，常见于中老年人群体，2型糖尿病患者常伴有血脂异常、高血压、动脉粥样硬化等疾病。糖尿病伤口比正常皮肤伤口愈合缓慢，导致了糖尿病并发症糖尿病足等，如果治疗不当可能引起截肢等严重后果。
糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是一种广泛存在于细胞外基质和细胞表面聚糖层中的带负电荷的线性多糖，包括硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素和透明质酸等。透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由GlcNAc和GlcA二糖重复单位通过β1,4-和β1,3-糖苷键构成的酸性黏多糖，HA以游离的形式存在于动物组织细胞间质、某些细菌的荚膜和病毒蛋白中。HA是皮肤和其他结缔组织的重要成分，在伤口愈合过程中起着重要作用。HA具有生物相容性、可降解性、抑菌性、抗氧化性和抗炎性等特点，对于伤口的愈合有着积极作用。现有研究表明，STZ诱导的2型小鼠模型中，小鼠皮肤中HA含量明显低于对照组，小鼠机体中HS的差异表达可能是导致糖尿病患者伤口难以愈合的原因之一。
糖尿病的患者肠道内的菌群通常处于一种失调的状态，这种状态容易导致糖尿病患者的代谢状态难以逆转，容易导致糖尿病患者变胖、血脂容易高，加重症状。采用益生菌对糖尿病治疗具有一定帮助，益生菌可以调节肠道内的菌群、分解膳食纤维，减少对碳水化合物的吸收及提高胰岛素的敏感性，有利于血糖的调理。但目前益生菌对糖尿病的治疗效果尚不显著，单一益生菌的效果往往是特定的，难以实现整体的提升效果。
发明内容
本发明以饲喂透明质酸糖尿病小鼠模型粪便为样品，从中筛选到了一株能够以透明质酸为单一碳源的活性菌株，该菌株的形态学特征如下：
菌体特征：菌体呈椭圆或柱状，芽孢位于菌体中央，单个细胞尺寸约为(0.7～0.8)μm×(2～3)μm；
菌落特征：菌落生长速度较快，不透明，颜色呈米白色或微黄色，表面干燥粗糙。
经鉴定，其细菌形态满足芽孢杆菌特征，并且具有SEQ ID NO:1所示的16S rRNA序列。经基因组测序比对与已知枯草芽孢杆菌的同一性可达98％，通过与EzBioCloud数据库中菌株序列进行比对，确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872。
根据本发明研究验证，该枯草芽孢杆菌Cohn 1872能够以透明质酸为碳源，满足自身生长增殖需要的同时将透明质酸分解为脂肪酸类物质。并且上述菌株具有可食用性，其生成的长链、短链脂肪酸等代谢物能够改善肠道菌群组成，减轻糖尿病相关症状。将该菌与透明质酸组合服用，可以实现快速增殖，并产生多种生物活性成分，可能对糖尿病症状的缓解起到一定的促进作用。
基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：
上述菌株分离自饲喂透明质酸糖尿病小鼠的粪便，在上述菌株培养条件的探索中，本发明发现，上述菌株可利用透明质酸作为碳源满足自身增长和增殖需求的菌株。进一步的，本发明研究还证实了上述菌株具有较高的安全性，对动物机体没有明显的危害性，是一种可以通过口服摄入的益生菌，该菌株进入机体后可以通过调节肠道菌群实现对机体免疫功能的促进作用，首先可作为一种肠道益生菌应用于日常免疫调节。
另外，由于上述菌株将透明质酸作为碳源并代谢生成脂肪酸。现有研究表明，糖尿病患者机体中表现出明显的透明质酸沉积，本发明尝试将上述菌株应用于糖尿病模型小鼠中，研究表明，上述菌株与透明质酸联合能够改善糖尿病症状，启示了上述菌株、菌剂与透明质酸的联用有望作为糖尿病治疗的活性成分，应用于糖尿病预防产品的开发。
本发明第一方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cohn 1872和/或所述菌株的培养物。
上述第一方面所述菌剂为包含所述菌株的生物或化学制剂；优选的所述菌剂中包括枯草芽孢杆菌及药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872和/或第一方面所述菌剂，还包括活性剂量的透明质酸。
优选的，所述药物组合物应用于糖尿病的预防、治疗或症状缓解，在上述应用的药物组合物中，所述菌株、菌剂及透明质酸均作为活性成分发挥作用，其中，菌株、菌剂及透明质酸的剂量为根据本领域常规研究方式可以推知的技术要素。
优选的，所述药物组合物为口服制剂，进一步的，为口服液体制剂或口服固体制剂；其中，所述液体制剂为包括但不限于溶液剂、微囊制剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；所述口服固体制剂为包括但不限于粉剂、片剂、滴剂、胶囊剂。
本发明第三方面，提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872和/或第一方面所述菌剂在制备肠道调节益生菌制剂中的应用。
优选的，所述益生菌制剂中，还含有其他具有肠道调节功能的菌株，包括但不限于干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧乳杆菌、德氏乳杆菌或保加利亚乳杆菌。
本发明第四方面，提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872、第一方面所述菌剂和/或第二方面所述药物组合物在糖尿病预防产品中的应用。
优选的，所述糖尿病预防产品为包括但不限于药物、保健品或特殊医用食品。
本发明第五方面，提供一种用于糖尿病的药物制剂，所述药物制剂中，包括活性剂量的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872、第一方面所述菌剂和/或第二方面所述药物组合物。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为枯草芽孢杆菌Cohn 1872的显微镜图；
图2为枯草芽孢杆菌Cohn 1872的平板单菌落图；
图3为培养基A的培养结果；
图4为培养基B的培养结果；
图5为小鼠肠道菌群门水平结构组成；
图6为小鼠肠道菌群属水平结构组成；
图7为灌胃后小鼠体重指数；
图8为灌胃后小鼠空腹血糖指数；
图9为灌胃后小鼠胰岛素水平；
图10为灌胃后小鼠肝脏指数。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、菌株对透明质酸的分解作用
①.使用高脂高糖饲料喂养小白鼠四周，之后小鼠禁食12小时，连续三天腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，禁食不禁水12小时后，使用血糖仪测定空腹血糖含量，当血糖含量＞11mmol/L,即为糖尿病小鼠建模成功。
②.对糖尿病小鼠进行透明质酸灌胃处理，持续28天。
③.在第28天，更换小鼠的垫料并收集单只小鼠排出的4小时之内的粪便，用无菌镊子装入灭菌的离心管中。
④.将小鼠粪便置于无菌的三角瓶中，用灭菌水将粪便样品稀释至10-6，取10-4、10-5、10-6各0.1mL涂布MRS培养基平板，各浓度涂布两个平板，分别为好氧培养和厌氧培养，在37℃的条件下培养48h。
⑤.在好氧培养的平板中发现菌落，编号为2-GJ，进行划线分离，见图2。
⑥.镜检，使用光学显微镜对该菌株的形态进行观察，见图1。确认无杂菌后，挑选单菌落划入斜面培养基，在4℃条件下冰箱保存。
⑦.将菌株2-GJ的16S rRNA基因在GenBank(NCBI)的16S ribosomal RNAsequences(Bacteria and Archaea)数据库进行BLAST对比。结合形态特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株2-GJ鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn1872。
⑧.基于MRS培养基，配制两个培养基
培养基A的成分为.透明质酸8g/L、蛋白胨10g/L、K2HPO4·7H20 2.0g/L、Na2HPO4·12H20 2.0g/L、柠檬酸三胺2.0g/L、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O0.05g/L。
培养基B的成分为蛋白胨10g/L、K2HPO4·7H20 2.0g/L、Na2HPO4·12H202.0g/L、柠檬酸三胺2.0g/L、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 0.05g/L，121℃，灭菌20min。
⑨.取长势较好的菌株接入培养基，37℃，100r/min,摇床好氧培养18h。接入培养基A和B，结果发现在培养基A中菌体生长，在培养基B中菌体不生长，见图3和图4。说明这一种特基拉芽孢杆菌能够分解利用透明质酸。
⑩.进一步地对以透明质酸为碳源的枯草芽孢杆菌发酵液中脂肪酸进行定性，结果见表1。枯草芽孢杆菌能利用透明质酸同时生成多种脂肪酸，其中包括月桂酸等长链脂肪酸，短链脂肪酸丙酸。长链脂肪酸可以作为能量来源，酶和膜蛋白的激活剂及抑制剂(如g蛋白偶联受体)等参与能量代谢和糖脂代谢，他们可能介导胰岛β细胞的功能障碍、胰岛素敏感性以及在特定条件下胰岛细胞的生长凋亡；丙酸可以参与调节糖代谢平衡，促进全身脂肪酸氧化，增加能量消耗，提高胰高血糖素样肽以降低能量摄入，从而又可参与脂质代谢，降低体脂水平。说明该株枯草芽孢杆菌联合透明质酸具有降糖及缓解糖尿病潜力。
表1
二、菌株改善肠道菌群结构
①.使用高脂高糖饲料喂养小白鼠四周，之后小鼠禁食12小时，连续三天腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，禁食不禁水12小时后，使用血糖仪测定空腹血糖含量，当血糖含量＞11mmol/L,即为糖尿病小鼠建模成功。
②.对糖尿病小鼠进行枯草芽孢杆菌联合透明质酸灌胃处理，透明质酸灌胃剂量为50mg/kg，枯草芽孢杆菌的灌胃剂量为1×108CFU/mL,10mL/kg，持续4周，分组情况为正常组(NC)，模型组(MC)，枯草芽孢杆菌-透明质酸(BS-HA)。
③.试验结束后，轻轻按压小鼠腹部采集粪便，液氮速冻后置于-80℃储存。
④.使用高通量测序分析糖尿病小鼠肠道菌群变化。
⑤.试验结束后小鼠肠道菌群结构组成见图5和图6。枯草芽孢杆菌联合透明质酸灌胃处理使得小鼠肠道菌群结构组成发生变化，在门水平上，BS-HA处理拟杆菌丰度增加，厚壁菌门丰度降低，拟杆菌与厚壁菌门的比值逐渐趋向于正常组；在属水平上，没有发现芽孢杆菌属的定植，但使得乳酸杆菌属趋于正常，富集了拟杆菌属，使得颤螺菌，瘤胃球菌和双歧杆菌等菌属丰度增加。说明枯草芽孢杆菌联合透明质酸改变了糖尿病小鼠的肠道菌群结构组成，使得与糖尿病缓解相关的菌属丰度增加。
三、菌株对糖尿病的缓解作用
①.建模成功后，每周固定时间测定糖尿病小鼠的体重和空腹血糖值，在试验结束后一天采集小鼠血液，3000rpm离心10min获得血清，采用Elisa酶联免疫法测定小鼠血清胰岛素水平；小鼠处死后，收集肝脏称重并计算肝脏的脏器指数。
②.小鼠体重、空腹血糖、胰岛素水平和肝脏器指数见图7、图8、图9和图10。经过分析，枯草芽孢杆菌联合透明质酸灌胃处理具有以下功效：避免了糖尿病小鼠体重发生显著降低；空腹血糖值明显低于模型对照组；促进胰岛素分泌；保护肝脏，防止肝脏病变。说明枯草芽孢杆菌联合透明质酸对糖尿病的病情起到了缓解作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn1872和/或所述菌株的培养物。
2.如权利要求1所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中包括枯草芽孢杆菌及药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cohn 1872和/或权利要求1或2所述菌剂，还包括活性剂量的透明质酸。
4.如权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂。
5.如权利要求4所述药物组合物，其特征在于，为口服液体制剂或口服固体制剂；其中，所述口服液体制剂为包括但不限于溶液剂、微囊制剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；所述口服固体制剂为包括但不限于粉剂、片剂、滴剂、胶囊剂。
6.权利要求枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872和/或权利要求1或2所述菌剂在制备肠道调节益生菌制剂中的应用。
7.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872、权利要求1或2所述菌剂在制备肠道调节益生菌制剂中的应用，其特征在于，所述益生菌制剂中，还含有其他具有肠道调节功能的菌株，包括但不限于干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧乳杆菌、德氏乳杆菌或保加利亚乳杆菌。
8.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872、权利要求1或2所述菌剂和/或权利要求3或4所述药物组合物在糖尿病预防产品中的应用。
9.如权利要求8所述枯草芽孢杆菌、菌剂、药物组合物在糖尿病预防产品中的应用，其特征在于，所述糖尿病预防产品为包括但不限于药物、保健品或特殊医用食品。
10.一种用于糖尿病的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中，包括活性剂量的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cohn 1872、权利要求1或2所述菌剂和/或权利要求3或4所述药物组合物。
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