CN111004733B - 一种具有缓解便秘功能的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有缓解便秘功能的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂，属于微生物技术领域。本发明所提供的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂包括下列重量份的原料：凝结芽孢杆菌0.01‑0.1份，低聚果糖4‑6份，低聚半乳糖4‑6份，菊粉10‑13份，其中凝结芽孢杆菌的芽孢含量不低于10¹⁰cfu/g。本发明还公开了该凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的制备方法及其在缓解便秘中的应用。

Description

一种具有缓解便秘功能的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂

技术领域

本发明涉及一种具有缓解便秘功能的复合微生态制剂，属于微生物技术领域。

背景技术

便秘是一种常见的消化道疾病，随着现代人们饮食结构和社会生活的改变，便秘在人群中的发病率呈上升趋势，各年龄段的人群都可能遭受便秘的困扰。便秘患者具有排便次数减少、粪便坚硬干燥难排出、排便不尽感、腹部不适等症状。便秘对患者的生活质量和身体健康都有很大的危害。部分便秘患者会出现食欲下降、焦虑、失眠等精神和心理障碍，便秘可能导致痔疮、肛裂等器质性病变，长期便秘可能引发大肠肿瘤、结肠黑变等严重的疾病，患有高血压等心血管疾病的便秘人群在用力排便时可能引发生命意外。

目前对便秘的治疗方法包括传统的手术治疗、药物治疗、行为干预以及新型的微生态制剂治疗等。外科手术治疗是其他治疗方法失败后的最终选择，仅严重顽固性便秘等极少数便秘人群需手术治疗，存在术后复发率高及远期治疗效果不明确等问题。改变饮食习惯、加强身体锻炼、培养良好的排便习惯等行为干预存在起效慢、难以坚持等局限性。药物治疗是目前最主要的治疗方法，但对身体有一定的毒副作用。

鉴于传统治疗方法存在多种问题，探寻一种新的有效治疗便秘的方法显得尤为重要。新型的微生态制剂治疗是指通过口服足够数量的活菌制剂或益生菌的促生长物质，改善便秘引起的肠道微生物失调，改善后的菌群代谢产生的短链脂肪酸可降低肠道pH而抑制病原菌增殖，还可直接刺激肠壁促进肠道蠕动，从而缓解便秘。

目前，一些专利涉及到具有缓解便秘功能的微生态制剂及其制备方法，例如专利CN107050062A公开了一种嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸菌组合物及其制备方法，该组合物具有能显著治疗便秘且无任何毒副作用的优点；专利CN107412274A提供了一种含有干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌的益生菌药物及其通便用途，该专利制剂能显著改善便秘患者的症状。

凝结芽孢杆菌是一种新型益生菌，与传统的双歧杆菌、乳杆菌相比具有产芽孢特性，芽孢具有高抗逆性，在口服后能顺利通过胃酸和消化酶的双重关口进入肠道，从而发挥其生理功能。低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉是安全无毒性的益生元，在结肠中提供双歧杆菌等有益微生物发酵的底物，促进肠道有益菌的增殖，调节便秘引起的肠道微生态失衡，并通过改善的菌群生成短链脂肪酸等代谢物刺激肠壁蠕动，提高肠内渗透压，促进水分吸收，从而缓解便秘。同时低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉能通过吸收水分，增大粪便体积和质量，增加粪便润滑度，及机械性刺激肠壁等发挥通便功能。

但是目前涉及到凝结芽孢杆菌缓解便秘的专利申请文件不多，因此提供一种具有缓解便秘功能的复合微生态制剂，对于缓解或治疗便秘有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种凝结芽孢杆菌复合微生态制剂，按重量份数计，含以下原料：凝结芽孢杆菌0.01-0.1份，低聚果糖4-6份，低聚半乳糖4-6份，菊粉10-13份，所述凝结芽孢杆菌，分类命名为Bacillus coagulans，已于2019年01月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。

在本发明的一种实施方式中，凝结芽孢杆菌的含量不低于10¹⁰cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，以脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖为保护剂。

本发明的第二个目的是提供上述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)活化凝结芽孢杆菌菌种；

(2)将活化的上述菌种接种至产孢培养基中培养后，水浴加热，离心取沉淀，洗涤沉淀后收集芽孢体，或者将收集得到的上述芽孢体用保护剂重悬，干燥后得到凝结芽孢杆菌芽孢粉；

(3)将凝结芽孢杆菌芽孢10⁸-10⁹cfu，低聚果糖4-6份，低聚半乳糖4-6份，菊粉10-13份混和均匀，得到凝结芽孢杆菌复合微生态制剂。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)是将凝结芽孢杆菌以1％-10％的接种量接种至MRS培养基中，在35-40℃下，培养16-22h，得到活化的凝结芽孢杆菌菌种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的培养条件是将活化的上述菌种以1-4％的接种量接种至产孢培养基中，在35-42℃下，180-250r/min培养45-50h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的水浴加热条件为80-85℃下水浴加热10-15min，离心条件为5500-6000g离心10-15min。

在本发明的一种实施方式中，所述干燥包括冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明的第三个目的是提供上述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂在制药领域内的应用。

本发明的第四个目的是提供上述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂在制备医疗保健品领域内的应用。

本发明有益效果和优点如下：

(1)本发明提供的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂，经小鼠体内实验证明，与便秘治疗药物酚酞片能起到相似作用，具有显著缓解便秘的效果。

(2)本发明提供的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂属食品级，对人体安全，无毒副作用。

(3)本发明提供的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对热的耐受能力高，适合热水送服或添加于需较高温度加工的食品中，具有非常广阔的应用前景。

生物材料保藏

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NJ23，分类命名为Bacillus coagulans，已于2019年01月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。

附图说明

图1为第0、7、14天各组小鼠3h排便颗粒数，同一天柱形图上的字母不同表示组间差异显著(p<0.05)。

图2为第0、7、14天各组小鼠3h排便重量，同一天柱形图上的字母不同表示组间差异显著(p<0.05)。

图3为第0、7、14天各组小鼠粪便含水量，同一天柱形图上的字母不同表示组间差异显著(p<0.05)。

图4为各组小鼠小肠推进率，柱形图上的字母不同表示组间差异显著(p<0.05)。

图5为各组小鼠排首粒黑便的时间，柱形图上的字母不同表示组间差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

(一)培养基

MRS培养基的配方为：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵，调pH至6.8。

产孢培养基的配方为：在1L蒸馏水中加入0.7g酵母膏、1g蛋白胨、1g葡萄糖、0.2g硫酸铵、0.2g七水硫酸镁、1g磷酸氢二钾。

(二)检测指标及方法

1.小鼠粪便粒数、重量和水分含量的测定

第0、7、14天，灌胃结束后小鼠立即单只单笼待3h，收集粪便，计颗粒数，称重，冻干后记录干重。粪便水分含量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100％。

2.小鼠肠道运动能力的测定

第13天，小鼠禁食过夜，空白组小鼠灌胃无菌生理盐水，其余各组灌胃盐酸洛哌丁胺(10mg/kg b.w)，1h后，所有小鼠灌胃含相应受试制剂的墨汁，灌胃体积均为0.2mL。随后动物立即转移到干净、空的笼子，随意摄入食物和水。记录从灌胃墨汁到第一颗黑色粪便排出的时间。

第14天，小鼠禁食过夜，灌胃方法同第13天，30min后，小鼠腹腔注射氯胺酮(100mg/kg b.w)麻醉，取血后脱颈椎处死，开腹，小心地取出从幽门到盲肠的整个小肠，测量墨汁行进的距离和小肠全长。小肠推进率(％)＝墨汁行进距离/小肠全长×100％。

3.小鼠血清胃肠调节肽的测定

将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，参照相应ELISA试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算血清中P物质(SP)、内皮素(ET-1)、生长抑素(SS)、胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)和血管活性肠肽(VIP)的浓度。

4.小鼠肠道短链脂肪酸的测定

使用气质联用仪测量小鼠粪便中的短链脂肪酸的含量。

实施例1一种固体凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的制备

(1)菌种活化

将凝结芽孢杆菌以2mL/100mL的接种量接种至MRS培养基中，在37℃下，培养18h，得到活化的凝结芽孢杆菌菌种。

(2)制备芽孢粉

将活化的上述菌种以2mL/100mL的接种量接种至产孢培养基中，在37℃下，250r/min摇瓶培养48h后，在85℃下水浴加热13min后，6000g离心10min取沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次后收集芽孢体，将收集得到的上述芽孢体用保护剂重悬，喷雾干燥或冷冻干燥得到凝结芽孢杆菌芽孢粉，所述的保护剂可以为脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖等。

(3)制备益生元组合物

将重量份数的：低聚果糖5g，低聚半乳糖5g，菊粉12g混和均匀。

(4)制备凝结芽孢杆菌复合微生态制剂

凝结芽孢杆菌芽孢粉0.01g(10¹⁰cfu/g)与益生元组合物1.32g混和均匀，得到凝结芽孢杆菌复合微生态制剂。

实施例2一种口服液形式凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的制备

(1)菌种活化

将凝结芽孢杆菌以2mL/100mL的接种量接种至MRS培养基中，在37℃下，培养18h，得到活化的凝结芽孢杆菌菌种。

(2)制备芽孢体

将活化的上述菌种以2mL/100mL的接种量接种至产孢培养基中，在37℃下，250r/min摇瓶培养48h后，在85℃下水浴加热13min后，6000g离心10min取沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次后收集芽孢体。

(3)制备益生元组合物

将重量份数的：低聚果糖4g，低聚半乳糖5g，菊粉13g混和均匀；

(4)制备凝结芽孢杆菌复合微生态制剂

将凝结芽孢杆菌芽孢体10⁸cfu，益生元组合物22g溶于50mL无菌水，得到凝结芽孢杆菌复合微生态制剂。

实施例3凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的应用

1.动物实验设计

取7周龄雄性SPF级BALB/c小鼠40只，随机分成空白组、造模组、酚酞组、复合Ⅰ组和复合Ⅱ组，每组8只。适应7天后，空白组每天灌胃无菌生理盐水，其余四组小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺(10mg/kg b.w)，造成小鼠便秘，1h后空白组和造模组灌胃无菌生理盐水，酚酞组灌胃酚酞溶液(7mg/mL)，复合组灌胃凝结芽孢杆菌复合微生态制剂生理盐水悬液(复合Ⅰ组0.44g/mL，复合Ⅱ组0.044g/mL)，灌胃体积均为0.2mL，连续14天。其中凝结芽孢杆菌复合微生态制剂按实施例1提供的方法制备。具体地，复合Ⅰ组微生态制剂配方为：凝结芽孢杆菌5×10⁸cfu/mL，低聚果糖0.1g/mL，低聚半乳糖0.1g/mL，菊粉0.24g/mL；复合Ⅱ组微生态制剂配方为：凝结芽孢杆菌5×10⁷cfu/mL，低聚果糖0.01g/mL，低聚半乳糖0.01g/mL，菊粉0.024g/mL。

2.结果

2.1本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠粪便粒数、重量和水分含量的影响

结果如附图1(表1)、图2(表2)、图3(表3)所示，复合Ⅰ组微生态制剂能显著增加便秘小鼠的排便颗粒数、粪便重量和粪便含水量(p<0.05)，随服用时间延长，效果呈增强趋势，而常用的通便药物酚酞片随服用时间增长，效果减弱，机体表现出抗药性，复合Ⅱ组微生态制剂对便秘小鼠排便颗粒数、粪便重量和粪便含水量无改善作用。结果证实本发明所选配方的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂能显著缓解便秘，效果优于阳性药物对照酚酞片。

表1第0、7、14天各组小鼠3h排便颗粒数

表2第0、7、14天各组小鼠3h排便重量

	空白组	造模组	酚酞组	复合Ⅰ组	复合Ⅱ组
						0d	0.26±0.01<sup>a</sup>	0.25±0.04<sup>a</sup>	0.24±0.01<sup>a</sup>	0.25±0<sup>a</sup>	0.25±0<sup>a</sup>
7d	0.27±0.03<sup>c</sup>	0.03±0.02<sup>a</sup>	0.1±0.01<sup>b</sup>	0.04±0.02<sup>a</sup>	0.05±0.01<sup>a</sup>
						14d	0.3±0.01<sup>d</sup>	0±0.01<sup>a</sup>	0.03±0.01<sup>b</sup>	0.06±0.02<sup>c</sup>	0±0.01<sup>a</sup>

表3第0、7、14天各组小鼠粪便含水量

	空白组	造模组	酚酞组	复合Ⅰ组	复合Ⅱ组
						0d	55.1±3.47<sup>a</sup>	59.48±5.69<sup>a</sup>	59±5.56<sup>a</sup>	58.68±6.21<sup>a</sup>	58.27±3.68<sup>a</sup>
7d	58.59±3.57<sup>a</sup>	57.34±6.22<sup>a</sup>	60.45±4.92<sup>a</sup>	62.23±3.08<sup>a</sup>	55.61±2.08<sup>a</sup>
						14d	57.86±6.21<sup>a</sup>	52.17±6.34<sup>a</sup>	57.37±2.86<sup>a</sup>	64.87±4.96<sup>b</sup>	50.73±3.2<sup>a</sup>

注：同行肩标的不同字母a-d表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。

2.2本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠肠道运动能力的影响

小肠和整个肠道的运动能力检测结果如附图4(表4)和附图5(表5)所示，复合Ⅰ组微生态制剂能显著增加便秘小鼠的小肠推进率，缩短小鼠排首粒黑便的时间(p<0.05)，对小肠运动能力的恢复效果明显好于常用的通便药物酚酞片，对整个肠道运动能力的恢复作用与酚酞药物相当，复合Ⅱ组微生态制剂对便秘小鼠肠道运动能力无促进作用。证明本发明所选配方的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂能促进肠道蠕动，有效缓解便秘。

表4各组小鼠的小肠推进率

注：肩标的不同字母a-d表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。

表5各组小鼠的排首粒黑便的时间

注：肩标的不同字母a-c表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。

2.3本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠血清胃肠调节肽的影响

结果如表6所示，复合Ⅰ组微生态制剂能显著增加便秘小鼠的兴奋性神经递质Gas、MTL、SP的水平(p<0.05)，并显著降低便秘小鼠的抑制性神经递质VIP、ET-1、SS的水平(p<0.05)，其作用与常用药物酚酞片效果相当或优于酚酞片，复合Ⅱ组微生态制剂对便秘小鼠血清胃肠肽的分泌无明显影响。结果证明本发明所选配方的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂能明显抵抗便秘引起的小鼠胃肠调节肽水平的失调，从而有效缓解便秘。

表6本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠胃肠调节肽水平的影响

	空白组	模型组	酚酞组	复合Ⅰ组	复合Ⅱ组
						Gas	38.9±1.5<sup>c</sup>	23.1±1.6<sup>a</sup>	34.1±1.1<sup>b</sup>	37.3±2<sup>c</sup>	24.2±0.3<sup>a</sup>
MTL	152.8±1.3<sup>bc</sup>	126.7±4.5<sup>a</sup>	146.1±6<sup>b</sup>	157.7±3.9<sup>c</sup>	126.9±1.5<sup>a</sup>
						SP	139.4±4.3<sup>b</sup>	29.2±5.2<sup>a</sup>	139.4±4.3<sup>b</sup>	135.8±3<sup>b</sup>	29.5±3<sup>a</sup>
VIP	29±0.9<sup>a</sup>	45.6±2.3<sup>c</sup>	32.7±1.7<sup>b</sup>	33.7±2.6<sup>b</sup>	43.3±1.1<sup>c</sup>
						ET-1	56.7±2.1<sup>a</sup>	79.6±1.9<sup>b</sup>	60.7±1.7<sup>a</sup>	60.6±3.4<sup>a</sup>	78.6±0.9<sup>b</sup>
SS	41.5±2.1<sup>a</sup>	68.2±2.5<sup>b</sup>	64.6±2.3<sup>b</sup>	42±5.6<sup>a</sup>	66.4±1.2<sup>b</sup>

注：同行肩标的不同字母a-c表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。

2.4本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠短链脂肪酸含量的影响

短链脂肪酸是肠道微生物的最终代谢产物，能通过降低肠道pH值抑制致病菌的生长，促进有益菌的增殖，从而改善肠道微环境，并通过改善的菌群生成乳酸等代谢物刺激肠壁蠕动，提高肠内渗透压，促进水分吸收，从而缓解便秘。如表7所示，本发明所选配方(如复合Ⅰ组)的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂能显著增加便秘小鼠中乙酸、丙酸、异丁酸和正丁酸等短链脂肪酸的含量(p<0.05)，使其恢复到正常水平，证明本发明所选配方的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂能通过增加肠道中短链脂肪酸的产生，达到缓解便秘的效果。

表7本发明的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂对小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响

注：同行肩标的不同字母a-d表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。

对比例

按照复合Ⅰ组微生态制剂的制备方法，制备对照组。

配方为：两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632(公开于专利CN106834187A中)5×10⁸cfu/mL，低聚果糖0.1g/mL，低聚半乳糖0.1g/mL，菊粉0.24g/mL。对照组的小肠推进率为65.46±2.31％，排首粒黑便时间为138.54±4.13min。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种凝结芽孢杆菌复合微生态制剂，其特征在于，包含以下原料：凝结芽孢杆菌5×10⁸ cfu/mL，低聚果糖0.1 g/mL，低聚半乳糖0.1 g/mL，菊粉0.24 g/mL，所述凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），已于2019年01月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。

2.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂，其特征在于，以脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖为保护剂。

3.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）活化凝结芽孢杆菌菌种；

（2）将活化后的上述菌种接种至产孢培养基中培养后，水浴加热，离心取沉淀，洗涤沉淀后收集芽孢体，或者将收集得到的上述芽孢体用保护剂重悬，干燥后得到凝结芽孢杆菌芽孢粉；

（3）将凝结芽孢杆菌芽孢、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉混和均匀，得到凝结芽孢杆菌5×10⁸ cfu/mL，低聚果糖0.1 g/mL，低聚半乳糖0.1 g/mL，菊粉0.24 g/mL的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）是将凝结芽孢杆菌以1%-10%的接种量接种至MRS培养基中，在35-40℃下，培养16-22 h，得到活化的凝结芽孢杆菌菌种。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）的培养条件是将活化的上述菌种以1-4%的接种量接种至产孢培养基中，在35-42℃下，180-250r/min培养45-50 h。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）的水浴加热条件为80-85℃下水浴加热10-15min，离心条件为5500-6000g离心10-15min。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述干燥包括冷冻干燥或喷雾干燥。

8.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂在制药领域内的应用。

9.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌复合微生态制剂在制备医疗保健品领域内的应用。

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