CN114480218B - 一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用，属于微生物菌种领域，本发明公开一种凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，其已于2021年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23766，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌通过促进小鼠小肠推进作用，增加粪便含水量，展现出良好的润肠通便功效。同时凝结芽孢杆菌对胃肠动力相关生物标志物的调节作用，可达到对便秘小鼠肠道功能调节，以及对肠道炎症的缓解作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种领域，特别是涉及一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用。
背景技术
便秘是消化系统常见症状之一，对人的身体健康有着很大的影响和损害。一方面便秘会导致人体内毒素积累，降低五脏功能，甚至可能导致其他疾病的发生，另一方面毒素的长期积累会使机体内分泌系统功能异常，激素代谢失调，导致肝脏的负担加重。因此，如何有效的控制便秘及其引发的各种疾病和内分泌系统功能异常具有重要意义。
便秘的发生大多都是因为不健康的生活方式(如不良的饮食、排便习惯和缺乏锻炼)、心理因素，以及一些消化系统疾病所引起的。临床上常采用泻药和促动力剂(5-HT调节剂、胃动素激动剂和氯通道激活剂等)来治疗便秘，虽然可以有效改善便秘，但是都不适合长期使用，长期药物治疗常常会引起诸多副作用，如对药物产生依赖性、腹痛、腹泻、恶心、呕吐和头痛等，从而严重影响患者的生活质量。
临床研究表明：便秘患者肠道内存在严重的菌群失调，通过给予益生菌对其局部的微生态环境进行调节，可以达到治疗便秘的目的，是目前该领域研究的新思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌是一种潜在的益生菌菌种，具有改善便秘的能力。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，其已于2021年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23766，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还提供一种如上所述的凝结芽孢杆菌在制备预防和/或治疗便秘产品中的应用。
进一步地，所述便秘是指由盐酸洛哌丁胺引起的便秘。
本发明还提供一种如上所述的凝结芽孢杆菌在制备改善盐酸洛哌丁胺引起的体重上涨产品中的应用。
本发明还提供一种具有改善便秘功效的产品，以上述的凝结芽孢杆菌或其次级代谢产物为主要活性成分。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了凝结芽孢杆菌对于缓解药物诱导的功能性便秘症状的作用，并对其作用机理进行了初步探讨。通过盐酸洛哌丁胺诱导小鼠功能性便秘模型，通过小鼠体重变化、粪便含水率、小肠推进率和病理学组织切片直观地分析乳酸菌对便秘的改善效果。然后通过血清指标、小肠组织中的mRNA和蛋白表达水平进一步评价乳酸菌预防便秘的效果。本发明的实验结果不仅可以为开发凝结芽孢杆菌作为保健食品和药品提供实验和理论依据，同时为益生菌具有润肠通便的功效提供理论支持。
通过本发明的实验，凝结芽孢杆菌缓解与恢复小鼠便秘症状的效果被证实。凝结芽孢杆菌通过促进小鼠小肠推进作用，增加粪便含水量，展现出良好的润肠通便功效。同时凝结芽孢杆菌对胃肠动力相关生物标志物的调节作用，可达到对便秘小鼠肠道功能调节，以及对肠道炎症的缓解。该研究表明，凝结芽孢杆菌是一种有效的候选益生菌，能够减轻便秘的不利影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验期间小鼠体重变化，其中，NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组；
图2为实验期间小鼠粪便失水率变化，其中，NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组；
图3为小肠解剖图，其中，NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组；
图4为小肠病理切片(H&E)，其中，NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1凝结芽孢杆菌的分离和鉴定
培养基：MRS液体及固体培养基(青岛海博)、MC液体及固体培养基(百思)、BHI液体及固体培养基(青岛海博)。
取10g盐豆子加入三角瓶中，摇床30min后，吸取1mL，至9mL稀释液中得到10-1稀释液，依次梯度稀释6次，而后依次涂布接种到MRS/MC/BHI琼脂培养基，后置于37℃厌氧倒置培养72h。培养后的平板取出，观察固体培养基上的菌落形态，包括形状、颜色、大小、表面、边缘、隆起度、透明度等，挑选不同菌落形态的单菌进行分区划线，37℃培养48h。对细菌落进行镜检，拍照记录。用无菌牙签挑取已纯化好的菌落接于液体试管中，置于37℃条件下厌氧培养48h。将培养48h后的液体取1.6mL分装至甘油管中，标注混合均匀后置于-80℃下进行保藏。细菌用细菌基因组提取试剂盒提取基因组，通过27F/1492R引物扩增16s rRNA并送生工生物工程有限公司测序，测序后到NCBI数据库比对鉴定为凝结芽孢杆菌。
16s rRNA的基因序列如下SEQ ID No.1所示：
tgcggaccttttaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagatcgggataacgccgggaaaccggggctaataccggatagttttttcctccgcatggaggaaaaaggaaagacggcttcggctgtcacttacagatgggcccgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggccttcgggtcgtaaaactctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcggcgccttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcttcttaagtctgatgtgaaatcttgcggctcaaccgcaagcggtcattggaaactgggaggcttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgc。
实施例2凝结芽孢杆菌BC69的应用
1.材料与方法
1.1实验动物
6周龄SPF级健康雄性昆明小鼠40只，体重(25±5)g，购自重庆医科大学。饲养期间各组小鼠自由饮水，饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在22～25℃。
1.2实验方法
1.2.1药物制备
盐酸洛哌丁胺悬液(1mg/mL)的配制：盐酸洛哌丁胺(2mg/胶囊)，取50粒胶囊，将胶囊中的药物粉末取出混匀，加无菌水至100mL，临用前配制。
活性炭混悬液：称取阿拉伯树胶50g，加水400mL，煮沸至溶液透明。称取活性碳25g，加至上述溶液中煮沸3次。待溶液凉后，加水定容至500mL，获得活性炭混悬液(50g/L)，于冰箱4℃保存。
1.2.2造模方法
40只小鼠适应性培养一周后，随机分为5组，每组8只，分别为正常组(NC)、模型组(GM)、BC69低剂量组(BC-L)、BC69高剂量组(BC-H)和比沙可啶药物治疗组(Bis)。实验期间，NC和GM每天灌胃生理盐水0.25mL；从第1天至第4天，除NC小鼠外，其余所有小鼠每天需要另外灌胃盐酸洛哌丁胺混悬液(1mg/mL)0.25mL，每天两次(上午9点，下午2点)诱导小鼠功能性便秘模型。第4天灌胃完成之后，所有组小鼠禁食不禁水16h。从第5天至第11天，BC-L、BC-H组每天灌胃凝结芽孢杆菌BC悬液0.25mL，浓度分别为1.0×108CFU/mL和4.0×109CFU/mL；Bis每天按照100mg/kg灌胃比沙可啶水溶液，第11天灌胃完成之后，所有组小鼠禁食不禁水16h。
动物模型在功能性便秘机制研究中扮演重要的角色，不同的研究目的对于造模动物的选择、造模方法都各不相同。因此，建立与人便秘有共同的病理生理变化的动物实验模型对于探索便秘的发病机制、新的治疗途径都有着重要意义。药物造模是功能性便秘造模的主要方式，盐酸洛哌丁胺是常用的药物之一。盐酸洛哌丁胺是一种外周性阿片受体激动剂，机制是抑制肠道水分泌和结肠蠕动，延迟粪便疏散时间和肠腔运输，通过减少动物的粪便颗粒数量，重量和含水量而出现便秘症状。本实验采用盐酸洛哌丁胺造成小鼠功能性便秘模型，在使用盐酸洛哌丁胺造模后，小鼠5h内排便粒数，粪便含水量与空白对照组相比明显减少，说明造模成功。
1.2.3肠道推进率检测
造模完成后，小鼠禁食过夜以排空肠内容物。至第2天上午开始进行小鼠肠道推进率检测。具体方法为：每只小鼠经口灌0.25mL活性炭混悬液，20min后脱颈椎处死。迅速打开小鼠腹腔，取出自幽门至肛门的全肠道，无张力拉直后测量肠道全长L1；然后再测量活性炭在肠道内的行进长度L2，计算小鼠肠道推进率D＝L2/L1×100％。
1.2.4粪便含水量检测
实验期间，每日上午给药后，更换新笼盒，至下午给药之前，收集小鼠两次给药间期的粪便，并称重、记录粪便湿重W1，以比较组间排便量差异；然后将各组小鼠的粪便放入鼓风机内进行高温烘干、脱水。再次进行称重，记录干重W2；计算小鼠的粪便含水率R＝(W1-W2)/W1×100％。
1.2.5样本采集与保存
血清：通过眼眶取血收集全血，全血在4℃冰箱静置2h左右，于3000r/min，4℃条件下冷冻离心10min，然后收集上层血清。将所得血清适量分装后放于-80℃冰箱保存备用。
小肠：小鼠处死之后，解剖小鼠取上自幽门、下至回盲部的小肠部分。小心清理出小肠中的剩余粪便，剪取0.5cm左右的小肠固定于组织固定液中，作为组织切片的样本，剩余小肠经液氮冷冻之后保存于-80℃冰箱，作为后续实验样本。
1.2.6H&E染色
小肠于组织溶液中固定24h，采用H&E染色(Hematoxylin and eosin staining，苏木精-伊红染色)，然后通过正置显微镜观察便秘小鼠小肠组织的病理学形态。
1.2.7血清中各胃肠激素水平的测定
按ELISA试剂盒说明测定血清中内皮素(ET)、胃泌素(Gas)、胃动素(MTL)、P物质(SP)、生长抑素(SS)和血管活性肠肽(VIP)的含量。
1.2.8RT-qPCR测定小肠组织中相关基因的mRNA表达
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测COX-2，c-kit，NFκB，iNOS，eNOS，nNOS和SCF的mRNA表达。根据RNA提取试剂盒和cDNA反转录试剂盒的说明，提取总RNA并进行cDNA反转录。微量分光光度计用于在260/280nm下鉴定RNA的纯度。肌动蛋白(actin)作为标准化内参进行RT-qPCR分析。使用2-△△Ct方法计算最终的RT-qPCR产物表达。
1.2.9数据分析
来自不同组的数据以均值±标准差(SD)表示。t测试用于确定两组之间的显著差异。为了比较两组以上，ANOVA(差异分析)与Dunnett的后临时分析测试进行了，并且使用GraphPad 7.0进行分析。
2.实验结果
2.1凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠体重的影响
为评价便秘小鼠整个实验过程中的体重变化，称量各组小鼠的体重并做好记录，结果如图1所示。造模期间(第1天至第4天)，各组小鼠体重均呈现上涨趋势，由于诱导小鼠便秘，与NC相比，诱导组小鼠体重上涨更为明显。治疗开始后，从第6日起，各组小鼠体重重新上涨，其中GM小鼠的体重涨幅明显，而灌胃凝结芽孢杆菌BC69的小鼠体重在实验后期出现下降趋势，但是分析表明各组小鼠的体重之间不存在显著差异(p>0.05)。如此说明盐酸洛哌丁胺诱导小鼠便秘会在一定程度上引起小鼠体重的上涨，而灌胃凝结芽孢杆菌BC69可较好地缓解便秘小鼠的体重上涨。
2.2凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠粪便失水率的影响
粪便含水率是评价便秘模型造模成功与否的重要指标，便秘患者肠道蠕动功能的减弱，粪便干结，致使粪便含水率的降低。如图2所示，造模期间(第1天至第4天)，除正常组小鼠外，其余所有组小鼠的粪便含水率均出现不同程度的下降，至造模最后一天，模型组小鼠的粪便含水量显著低于正常组小鼠的粪便含水率(p<0.05)，表明建模成功。从第5天开始干预治疗后，灌胃凝结芽孢杆菌BC69的小鼠的粪便含水率与GM小鼠的粪便含水率相比有所提高，且BC-H小鼠的粪便含水率接近于NC和Bis小鼠的粪便含水率，表明凝结芽孢杆菌BC69可通过增加小鼠粪便含水率来缓解便秘症状。
2.3凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠小肠推进率的影响
由图3可知，GM小鼠小肠较其余各组有缩短的现象，但差异并不明显，其余各组小鼠的小肠长度之间不存在显著差异(p>0.05)，说明便秘会对小肠长度产生一定影响，但影响结果并不显著。由表1可知，GM小鼠的小肠推进率为53.7％，显著低于NC(p<0.05)。而给予便秘小鼠凝结芽孢杆菌BC69灌胃后，其小肠推进率与GM小鼠的小肠推进率相比得到显著提高(p<0.05)，其中BC-H的剂量效果更为显著。结果说明凝结芽孢杆菌BC69可以促进小肠蠕动，加快活性炭在小肠中的推动速度，从而对便秘起到一定的改善作用。
表1小肠推进率
注：NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组
2.4凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠小肠组织形态学的影响
当小肠绒毛受到损伤后，肠道蠕动功能也会受到不同程度的影响，而肠道蠕动减慢是引起便秘的因素之一，所以小肠绒毛的完整性对评价便秘同样具有重要意义。由图4可知，NC小鼠的小肠绒毛排列整齐均一，不存在断裂或皱缩现象，杯状细胞丰富；GM小鼠小肠绒毛出现严重断裂和皱缩，刷状缘杂乱无序，而且杯状细胞不完整。虽然BC-L和BC-H的小肠绒毛也有一定程度的皱缩和断裂，但是小肠绒毛明显比GM小鼠的小肠绒毛更为完整，而且BC-H小鼠的小肠绒毛完整性更为明显。
2.5凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠血清中相关胃肠激素的影响
胃肠激素可通过不同的信号对消化系统的吸收、运动、分泌和免疫等产生重要的调节作用，与便秘的发生也密切相关。结果如表2所示，GM血清中P物质(Substance P，SP)的含量较NC显著降低(p＜0.05)，内皮素(endothelin，ET)、胃泌素(Gastrin，Gas)、胃动素(Motilin，MTL)、生长抑素(Smotostatin，SS)、和血管活性肠肽(vasoactive intestinalpeptide，VIP)的含量上调。与GM相比，BC-L和BC-H小鼠的SP水平得到了显著提高(p<0.05)，而且随着凝结芽孢杆菌BC69灌胃浓度的升高，SP的浓度升高更明显。此外，ET-1，Gas，MTL，SS，VIP的含量下调，同样表现出随着凝结芽孢杆菌BC灌胃浓度的升高，降低效果越明显。治疗组血清检测结果说明给便秘小鼠灌胃凝结芽孢杆菌BC69可通过调节胃肠激素的分泌，从而加快胃肠道运输，达到缓解便秘的作用。
表2血清指标
注：NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组；ET-1，内皮素-1；Gas：胃泌素；MTL，胃动素；SS，生长抑素；VIP，血管活性肠肽
2.6凝结芽孢杆菌BC69对便秘小鼠小肠组织中相关mRNA表达水平的影响
通过RT-qPCR分析便秘小鼠小肠组织中COX-2，c-kit，NFκB，iNOS，eNOS，nNOS和SCF的mRNA表达。结果如表3所示，GM小鼠小肠组织中COX-2，NFκB，SCF的表达上调，c-kit，iNOS，eNOS，nNOS的表达下调。与GM相比，治疗组凝结芽孢杆菌BC处理后的小肠组织中COX-2，NFκB，SCF的表达小调，c-kit，iNOS，eNOS，nNOS的表达上调。且表达效果随着菌液浓度的升高约显著。mRNA表达结果说明给便秘小鼠灌胃凝结芽孢杆菌BC69可对小鼠小肠组织的基因表达产生影响。
表3mRNA表达水平
注：NC，正常组；GM，便秘模型组；Bis，比沙可啶药物对照组；BC-H，BC高剂量组；BC-L，BC低剂量组
3.结论
便秘与肠道微生物群失调有关，肠道菌群丰度减少可能是肠道运动改变的潜在原因或结果。本发明研究凝结芽孢杆菌BC69对便秘模型小鼠的便秘改善作用和润肠通便作用。在使用不同剂量的凝结芽孢杆菌BC69菌液灌胃小鼠后，小鼠的便秘功能得到明显改善，其中数量级为4.0×109CFU/mL的BC69菌液效果最为显著。高剂量的凝结芽孢杆菌BC69菌液可以显著促进小鼠小肠推进作用，同时增加其5h排黑便粒数和质量，展现出良好的润肠通便功效。
胃肠道中肠神经网络分泌的肠神经参数作为神经调节剂和神经递质，促进肠道蠕动和内容物的运输。胃肠激素是一组小分子活性多肽，产生于胃肠道内分泌细胞和神经细胞，某些胃肠激素同时存在于中枢神经系统，所以又称其为脑肠肽或神经递质。胃肠激素与靶细胞上的受体结合后，可通过不同的信号对消化系统的吸收、运动、分泌和免疫等具有重要的调节作用，同时与便秘的发生也密切相关。本发明中凝结芽孢杆菌BC69治疗显着提高血清SP水平，抑制血清ET-1、SS、VIP水平，效果呈现浓度依赖。高剂量的凝结芽孢杆菌BC69菌液对小鼠血清中胃肠激素调节效果更为明显。
除了直接调节这些神经递质外，凝结芽孢杆菌BC69还影响便秘小鼠小肠中的mRNA表达。Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)在肠道蠕动过程中扮演着重要角色，一些研究表明慢性便秘患者结肠中的ICC数量会出现下降，并有认为ICC数量下降是由c-Kit表达下调引起的。c-Kit受体(CD117)又称干细胞因子受体，是一种具有酪氨酸激酶活性跨膜蛋白，是ICC的特异性标记物之一。SCF是c-Kit的天然配体，SCF/c-Kit信号通路对ICC的增殖、分化及表型维持起着至关重要的作用。本发明的结果表明，模型小鼠中c-Kit的mRNA水平较低，凝结芽孢杆菌BC69处理后SCF/c-Kit的比值较便秘小鼠显著升高。此外，凝结芽孢杆菌BC69处理后的小鼠结肠组织中炎症因子COX-2，NFκB，iNOS，eNOS，nNOS等的表达降低。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 善恩康生物科技（苏州）有限公司
<120> 一种改善便秘的凝结芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (1)
1.一种凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）在制备预防和/或治疗便秘产品中的应用，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌已于2021年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23766，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述便秘是指由盐酸洛哌丁胺引起的便秘。
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