CN112755054A - 凝结芽孢杆菌在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了凝结芽孢杆菌在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用，属于生物技术领域；该药物和/或食品中包含的凝结芽孢杆菌BC01的含量≥3.3×10⁴CFU/gd；本发明所述含凝结芽孢杆菌BC01的药物和/或食品能够治疗肠道组织水肿、肠粘膜屏障破坏等病变，改善肺部组织结构，有效控制IgE水平，降低脾脏细胞IL4的分泌，提高IL10和IFN‑γ的分泌，调节肠道微生态，提高肠道Alpha多样性指数，提高肠道乳杆菌属等益生菌水平，降低克雷伯氏菌等致病菌丰富度。

Description

凝结芽孢杆菌在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及凝结芽孢杆菌在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用。

背景技术

保护人类胃肠道免受致病菌定植的防御机制相当复杂并涉及到免疫学和非免疫学的领域。先天防御机制包括胃的低pH，胆汁盐，蠕动，黏蛋白层以及抗微生物化合物，例如溶菌酶。免疫学机制包括分布于整个小肠和结肠的特发性淋巴集结，基础性M细胞，又称为派伊尔淋巴集结。腔内抗原在这些位点上的提呈导致了对适当T和B细胞亚型的刺激，从而建立了细胞因子网络并将抗体分泌至胃肠道中去。此外，可通过上皮细胞将抗原提呈至上皮内淋巴细胞以及基础粘膜固有层免疫细胞。因此，宿主相当程度地依赖于胃肠道的免疫防御。由于胃肠道粘膜是宿主与外界环境相互作用的最大表面，发生于其上的具体控制机制必需能够适当地对平均寿命期间由胃肠道处理的上百吨食物进行免疫应答的调节。不仅如此，消化道定植有超过500种的细菌，在结肠中的数量为10¹¹-10¹²CFU/g。因此，这些控制机制必需能够从对宿主引起明显伤害的侵袭性病原体中区别出非致病性的附着细菌。此外，肠道是人体最大的免疫器官，人体超过70％免疫由肠道提供。事实上，通过与新摄入的潜在致病性微生物竞争，肠道菌群对宿主的防御大有裨益。

存在于人类胃肠道中的致病菌能够引起炎症，对固有微生物菌群的异常免疫应答可涉及到某些疾病状态，例如炎性肠病。与正常菌群相关的抗原通常会导致免疫耐受，而不能达到这样的耐受是粘膜发炎的主要机制。在患有炎性肠病(IBD)的患者中，其耐受被破坏的证据包括针对于所述肠道菌群的抗体水平升高。

益生菌是能够对宿主(机体)健康起积极作用的活微生物，现代医学研究证实，人体肠道菌群的平衡与过敏性疾病密切相关。免疫学认为，生命早期肠道菌群的形成可通过调节机体免疫功能而诱导免疫耐受产生，益生菌能改变终末器官的免疫应答从而预防和治疗过敏以及反复发作。越来越多的临床医学研究证明，通过补充肠道有益菌去调节菌群微生态免疫平衡，从而可以调节过敏体质，缓解过敏，降低过敏的发病率，具有预防和治疗过敏性疾病的潜能。但事实上，并非所有的益生菌都具有抗过敏的功效，益生菌广泛存在于我们的肠道、生殖器官，皮肤表面等各个角落，不同菌种和亚型的益生菌产生的功效是不同的，因此，亟需一种可通过调制细胞因子水平或通过抗拮以及排除来自胃肠道的促炎症微生物从而表现出具有缓解过敏性疾病的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供凝结芽孢杆菌在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种凝结芽孢杆菌BC01在制备用于预防和/或治疗过敏性疾病的药物和/或食品中的应用，所述凝结芽孢杆菌BC01命名为Bacillus coagulans-BC01，于2017年12月21日保藏于中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2017813。

进一步地，所述药物和/或食品中凝结芽孢杆菌BC01的含量≥3.3×10⁴CFU/gd。

进一步地，所述药物还包括生理上可接受的赋形剂。

进一步地，所述过敏性疾病包括由肠道组织水肿以及肠粘膜屏障被破坏引起的过敏性疾病。

进一步地，所述过敏性疾病包括由肠道菌群失衡引起的过敏性疾病。

进一步地，所述过敏性疾病包括由肺部组织发生病变而引起的过敏性疾病。

进一步地，所述过敏性疾病包括因过敏原引起的过敏性疾病。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过研究表明凝结芽孢杆菌BC01在治疗肠道组织水肿、肠粘膜屏障破坏等病变，改善肺部组织结构，有效控制IgE水平，降低脾脏细胞IL4的分泌，提高IL10和IFN-γ的分泌，调节肠道微生态，提高肠道Alpha多样性指数，提高肠道乳杆菌属等益生菌水平，降低克雷伯氏菌等致病菌丰富度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中不同处理组小鼠解剖图；

图2为实施例中不同处理组小鼠肺部组织病理切片；

图3为实施例中不同处理组小鼠结肠组织病理切片；

图4为实施例中不同时间血清IgE变化；

图5为实施例中无致敏剂和致敏剂刺激IL4；其中，A为无致敏剂刺激IL4(*致敏组VS处理组，#预防组VS治疗组)；B为致敏剂刺激IL4(*致敏组VS处理组，#低剂量VS高剂量)；

图6为实施例中无致敏剂和致敏剂刺激IL10；其中A为无致敏剂刺激IL10；B为致敏剂刺激IL10(*致敏组VS处理组)；

图7为实施例中无致敏剂和致敏剂刺激IFN；其中A为无致敏剂刺激IFN；B为致敏剂刺激IFN(*致敏组VS处理组，#低剂量预防组VS高剂量预防组，&低剂量治疗组VS高剂量治疗组)；

图8为实施例中用药前后组间肠道微生态Alpha多样性指数；

图9为实施例中不同处理组用药前后微生物群落物种Beta多样性分析距离Heatmap；

图10为实施例中用药前后微生物属水平的群落组成分析Heatmap图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

肠道菌群对于肠道免疫系统的发育和生理功能具有重要的作用。在肠道菌群失衡时，肠道免疫系统是发育不全的，且某些功能性参数也降低了，例如巨噬细胞吞噬能力和免疫球蛋白生成。消化道菌群在刺激性非伤害性免疫反应中的重要性也变得愈发明显。在西方世界中过敏发生及严重性的增加与卫生保健和公共卫生的改善以及宿主收到的感染刺激的数量和范围的降低有关。这种免疫刺激的缺乏可允许宿主与非致病性，但具有抗原性的因子反应，从而导致过敏或自身免疫。一系列非致病性免疫调节细菌的故意摄取可以为宿主提供必需和适当的教育性刺激从而提供免疫功能的适当发育和控制。

炎症是用来描述在承受物理伤害，感染的位点上液体，血浆蛋白和白细胞局部聚集，或正在发生免疫反应的术语。对炎症反应的控制可在多个水平中实施。控制因子包括细胞因子，激素(例如氢化可的松)，前列腺素，反应中间体和白细胞三烯。细胞因子是低分子量的具有生物活性的蛋白，其涉及免疫学和炎症反应的产生与控制，同时还可调控发育，组织修复和造血作用。其为白细胞和其他细胞类型之间提供了交流的渠道。大多数细胞因子都是多效性的并可表达多种生物学重叠的活性。控制炎症反应的是细胞因子级联反应和网络，而并非是特定细胞因子对特定细胞类型的作用。炎症反应的减弱导致了较低浓度的适当激活信号，而其他的炎症介导物则导致了炎症反应的停止。促炎症细胞因子被认为在许多炎症疾病，包括炎性肠病(IBD)中起到重要的作用。

本发明所述菌株在一系列炎症疾病的治疗中都具有潜在的应用，尤其是与其他抗炎症疗法，例如非类固醇抗感染药物(NSAID)或英利昔单抗组合使用时。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

各组实验数据以均数±标准差表示，整理后导入SPSS18.0统计软件进行数据分析。以方差分析检验各组均数间的差异性。动物实验中用Shapiro-Wilk检查数据分布，用Levene’s test进一步测试方差齐性，使用相对应的t-检验来评估每两个指定组之间的重要性。P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

实施例1凝结芽孢杆菌BC01在预防和/或治疗过敏性疾病中的应用

本发明所述凝结芽孢杆菌BC01(Bacillus coagulans-BC01)，于2017年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M2017813。

本发明通过腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏Balb/C小鼠，致敏前后用凝结芽孢杆菌BC01对小鼠进行灌胃，通过小鼠行为，毛发，表面器官，组织病变，细胞因子以及肠道微生态的变化来检验凝结芽孢杆菌BC01对过敏反应是否具有免疫及治疗作用。

实验材料

14日龄雌性Balb/C小鼠42只(扬州大学比较医学中心)、弗氏完全佐剂(Sigma)、卵清蛋白(Solarbio)、1mL无菌注射器、弯型8号小鼠灌胃针、PBS、清洁级维持鼠饲料及清洁级刨花垫料(南京市江宁区青龙山动物繁殖场)、凝结芽孢杆菌BC01粉末(2.5×10¹⁰cfu/g，善恩康生物科技(苏州)有限公司)、通用型组织固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司)；小鼠总IgE、IL4、IL10、IFN-gamma检测试剂盒(上海沪震生物科技有限公司)。

实验步骤：

1、准备工作：

(1)对饲养小鼠用鼠笼及水罐进行清洗消毒；

(2)小鼠送到后，将小鼠转移至动物房已准备好的饲养笼中正常饲养5日，观察其状态是否正常，同时让其适应饲养环境。

(3)将总共44只小鼠分为6组饲养，所有小鼠正常喂食，直到实验结束；具体分组为：

空白对照组(A组)10只，5只/笼分2笼；

致敏对照组(B组)10只，5只/笼分2笼；

高剂量预防组(C组)6只，1笼；

低剂量预防组(D组)6只，1笼；

高剂量治疗组(E组)6只，1笼；

低剂量治疗组(F组)6只，1笼；

(4)对小鼠进行称重，计算高剂量及低剂量组灌胃所需菌量(CFU/gd)；

(5)取4mg/mL OVA溶液4mL与4mL弗氏完全佐剂混合均匀即为致敏原，吸取1mL致敏原至注射器内；用2只1mL注射器吸取2mL PBS；

(6)用PBS将凝结芽孢杆菌BC01粉末溶解并分别稀释至2.5×10⁷cfu/mL(高浓度菌液，终浓度为8.3×10⁴cfu/gd)或5×10⁶cfu/mL(低浓度菌液，3.3×10⁴cfu/gd)，再将高浓度菌液或低浓度菌液吸取至1mL注射器内，将注射器针头替换为弯型8号小鼠灌胃针(小鼠体重增加，按照实际体重增加灌胃量)。

2、实验过程

Day1：A组腹腔注射PBS 0.1mL/只；B、E、F组腹腔注射致敏原0.1mL/只；C组用灌胃针灌喂高浓度菌液0.1mL/只、D组用灌胃针灌喂低浓度菌液0.1mL/只；

Day2：C、D组用Day1相同方式及用量进行灌胃；从A、B组中各随机抽取3只小鼠，用眼眶静脉丛采集血样，血样置于37℃1h后，6000rpm/min离心，收集上层血清，-20℃保存；

Day3-Day6：每日对C、D组进行灌胃，方法用量与Day1相同；

Day7：A组腹腔注射PBS 0.1mL/只；其余各组腹腔注射致敏原0.1mL/只；C组以相同方法用量灌胃高浓度菌液，D以相同方法用量灌胃低浓度菌液；

Day8：从所有组中每组各随机抽取3只小鼠，用Day2相同方式采血并获取及保存血清样品；

Day9-Day13：每日对C组进行灌胃高浓度菌液，D组进行灌胃低浓度菌液，方法用量与Day1相同；

Day14：A组腹腔注射PBS 0.1mL/只；其余各组腹腔注射致敏原0.1mL/只；C组以相同方法用量灌胃高浓度菌液，D以相同方法用量灌胃低浓度菌液；

Day15：先从所有组中每组各随机抽取3只小鼠，用Day2相同方式采血并获取及保存血清样品；随后C、D组停止灌胃，E、F组每日开始进行菌液灌胃，E组用灌胃针灌喂高浓度菌液0.1mL/只、F组用灌胃针灌喂低浓度菌液0.1mL/只；

Day16-Day20：E、F组每日灌胃菌液，方法用量与Day15相同；

Day21：A组腹腔注射PBS 0.1mL/只，B、C、D组腹腔注射致敏原0.1mL/只，E、F组灌胃菌液，方法用量与Day15相同；

Day22：先从所有组中每组随机选取3只小鼠按Day2相同方式进行采血，保存血清；随后E、F组灌胃菌液，方法用量与Day15相同；

Day23：A、B、C、D组所有小鼠用脊椎脱臼法处死，每组随机取1只小鼠剖检并收集肺部、结肠及脾脏，肺部及结肠浸泡于组织固定液中，脾脏用胰酶处理，分离得到脾脏细胞后测定其中IL-4、IFN-γ及IL-10的含量；E、F组继续灌胃菌液，方法用量与Day15相同；

Day23-28：E、F组每日灌胃菌液，方法用量与Day15相同；

Day29：E、F组用Day2相同方式采血并取得及保存血清样品；

Day30：E、F组用Day23相同方式致死并剖检，采集器官样品，按Day23相同方式进行处理；

收集处理前和21天处理后各组的老鼠粪便，通过16s rDNA测序分析处理前后以及各组间的差异分析肠道微生态群落变化。委托美吉生物基于二代测序平台，对16S rDNA功能基因等V3-V4特定区段PCR产物进行高通量测序，通过美吉云分析平台对测序数据分析探索用药前后各样本中微生物群落结构、进化关系以及微生物与理化指标相互作用等信息。

实验结果：

1.剖检结果

由小鼠解剖可得(图1)，空白组及致敏组对比，空白组各脏器均无异常，大肠及小肠部位无水肿、增厚等病变，粪便颗粒完整，致敏组大肠及小肠粘膜明显增厚、肠道水肿变粗，粪便颗粒不可见，各器官也有不同程度的水肿。预防组低剂量及高剂量剖检结果，肠道仍有一定程度病变，但是病变情况略好于致敏组，高剂量组大肠病变程度略低于低剂量组。治疗组低剂量及高剂量剖检结果，低剂量组肠道病变程度相较预防组进一步降低，高剂量组肠道已基本正常，无明显病变。

2.肺部组织病理切片

由肺部组织病理切片中可得(见图2)，空白组肺泡呈较规则圆形，大小相近，分布均匀；致敏组肺泡形态发生变化，无规则外形，且肺泡减少，出现病变。低剂量预防组也可见较低程度的病变，高剂量预防组、低剂量治疗组及高剂量治疗组肺部组织结构完好，无明显病变。

3.结肠组织病理切片

由结肠组织病理切片中可得(见图3)，对比空白组及致敏组结肠病理组织切片，可见致敏组结肠浆膜层及肌层明显增厚，肠绒毛萎缩，无法观察到明显绒毛结构等病理特征，在低剂量预防组及高剂量预防组中也存在较低程度的浆膜层增厚的现象，低剂量及高剂量治疗组中无明显病变。

4.血清中IgE

经OVA特异性IgE水平的测量，结果表明(见图4)，致敏对照组的小鼠总IgE水平明显提高，而预防高剂量组可以有效控制小鼠的IgE水平，治疗高剂量组可以在实验后期有效控制小鼠的总IgE水平，从而缓解小鼠的过敏反应。低剂量的预防与治疗两种方式均未能较好的控制小鼠的总IgE水平。

5.脾脏细胞IL-4、IFN-γ及IL-10含量

实验结束后致死各组别小鼠，分离脾脏，制备脾脏原代细胞。各组别脾脏原代细胞，经过致敏源刺激和无致敏源刺激后，测定培养上清中IL4、IL10、干扰素γ(IFN-gamma)的含量。结果表明，高剂量使用下的预防组和治疗组的脾脏细胞分泌的IL4水平较低(见图5)，维持较高的IL10水平(见图6)，同时IFN-gamma的分泌水平也明显增加(见图7)。

6.肠道微生态

干预前和21天干预后肠道微生态多样性统计学T检验，预防组和治疗组肠道Alpha多样性指数增高(见图8)，肠道微生态丰富度指数显著提高。为探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性，开展Beta多样性分析发现用药前后各处理组间显著聚类(见图9)。为在不同分类学水平上统计不同组的物种丰度，通过热图可视化方法直观研究群落组成，干预后预防组合治疗组的芽孢杆菌属丰度增加，凝结芽孢杆菌BC01在肠道内定植并显著提高有益生作用的芽孢杆菌属丰富度，降低与感染免疫相关的克雷伯氏菌属(Klebsiella)丰度(见图10)。为研究样本与物种关系，通过可视化圈图反映各处理组样本中优势物种分布比例，以及各优势物种在不同分组中分布比例，预防组和治疗组的乳杆菌属(Lactobacillus)属丰度增加见表1，表1为实施例中不同处理组用药前后乳杆菌属水平的组成物种OTU物种分类丰度表。

表1

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.凝结芽孢杆菌BC01在制备用于预防和/或治疗过敏性疾病的药物和/或食品中的应用，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌BC01命名为Bacillus coagulans-BC01，于2017年12月21日保藏于中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2017813。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物和/或食品中凝结芽孢杆菌BC01的含量≥3.3×10⁴CFU/gd。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括生理上可接受的赋形剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过敏性疾病包括由肠道组织水肿以及肠粘膜屏障被破坏引起的过敏性疾病。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过敏性疾病包括由肠道菌群失衡引起的过敏性疾病。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过敏性疾病包括由肺部组织发生病变而引起的过敏性疾病。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过敏性疾病包括因过敏原引起的过敏性疾病。

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