CN104922158B

CN104922158B - 粪菌胶囊及其制备与应用

Info

Publication number: CN104922158B
Application number: CN201510304041.4A
Authority: CN
Inventors: 魏艳玲; 陈东风
Original assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2035-06-05
Also published as: CN104922158A

Abstract

本发明属于粪菌移植技术领域，尤其涉及一种粪菌胶囊及其制备与应用。所述粪菌胶囊的制备方法包括如下步骤：（1）粪菌液制备；（2）将步骤（1）所得粪菌液加入冻干保护剂后，冷冻干燥，得粪菌冻干粉；（3）将步骤（2）所得粪菌冻干粉装入胶囊中，得粪菌胶囊。采用所述粪菌胶囊使得菌群较为集中，可放于低温长久保存；便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式：如胃镜、肠镜、鼻空肠营养管等；对于虚弱的患者，增加了安全性。

Description

粪菌胶囊及其制备与应用

技术领域

本发明属于粪菌移植技术领域，尤其涉及一种粪菌胶囊及其制备与应用。

背景技术

粪菌移植(FMT)，也称为粪菌治疗或肠微生菌移植，是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的诊疗。目前，粪菌移植已被视为一种特殊的器官移植，用于治疗难辨梭状芽胞杆菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征、神经发育不良与神经退行性疾病、自身免疫性肠病、肠道食物过敏等。粪菌移植在中国应用至少有1700年的历史，中国传统医学一直有用人大小便给人治病的记载。公元300～400年间，东晋时期，葛洪《肘后备急方》(也称《肘后方》)即有记载，用人粪清治疗食物中毒、腹泻、发热并濒临死亡的患者。书中描述“饮粪汁一升，即活”，可见具有“起死回生”之奇效，但是该治疗方式却被中国的现代临床忽略了。现代医学史上，最早的粪菌移植报道于1958年，美国外科医生BenEiseman等报道了他们对患有严重伪膜性肠炎的4名患者实施粪便移植的结果。当时，伪膜性肠炎的死亡率为75％，抗生素相关性腹泻的主要原因被认为是金黄色葡萄球菌感染。Eiseman等对这4名患者采用抗生素、氢化可的松、益生菌等治疗，患者仍腹泻严重，并出现休克。无奈之下，医生、患者及其家属商议，决定用患者健康家属的大便制成粪水，对患者进行灌肠。结果，其中3名垂危的患者都在几天之内奇迹般的康复出院了，另1名患者在住院期间死于与肠道感染无关的其他疾病。

Bowden将此临床经验发表在《外科学》杂志。然而，在之后的20年里，几乎没引起人重视。直至1981年，Bowden等报道用经小肠置管输入粪液的方法，成功治愈16例伪膜性肠炎患者。现代粪菌移植技术主要是器械介入的方法，比如胃镜、胃管、肠镜、空肠管等，腹泻型IBS、溃疡性结肠炎等治疗需要多次移植，而每次粪便菌群都需要通过导管经过胃、十二指肠，注入十二指肠远端，过程复杂，患者有一定痛苦，应用受到限制。制备的粪菌样本在室温存放时间短，需要立即进行移植，加入无菌甘油后虽然可以置于-80℃冰冻，但是取用不便。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一目的在于提供一种粪菌胶囊及其制备与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供了一种粪菌胶囊的制备方法，包括如下步骤：

(1)粪菌液制备；

(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后，冷冻干燥，得粪菌冻干粉；

(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉装入胶囊中，得粪菌胶囊。

优选地，步骤(1)中，粪菌液的制备方法为：

1)初步搅拌：将供体粪便样本，加入无菌生理盐水进行初步均质处理，得到粪便浆体；

2)初步过滤：将步骤1)中所得粪便浆体过滤去除大颗粒物质；

3)将步骤2)所得样本称重并在匀浆器中进一步匀质处理；

4)将步骤3)所得样本逐级过滤或多次过滤；

5)离心、悬浮：将步骤4)所得样本离心，将所得沉淀再悬浮于无菌生理盐水中，得粪菌液。

优选地，步骤1)中，粪便样本采用2h内的新鲜粪便样本。

优选地，步骤1)中，100～150g粪便样本加入250ml无菌生理盐水进行初步均质加工。

更优选，120g粪便样本加入250ml无菌生理盐水进行初步均质加工。

优选地，步骤2)中，采用不锈钢滤网过滤。

优选地，步骤3)中，在氮气生物工程厨内进行称重和进一步匀质处理。

优选地，步骤4)中，逐级过滤是指依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的滤网。多次过滤是指经过直径0.25mm的滤网2～3次。步骤4)的作用是去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。

为了更好地保护粪菌中的益生菌，提高细菌冻干存活率，本发明对冻干保护剂进行了优化。

优选的，步骤(2)中，所述冻干保护剂为复合冻干保护剂，所述冻干保护剂各组分的质量体积浓度为：谷氨酸0.5～2.0％；脱脂乳6.0～8.0％；甘露醇2.0～3.0％；果糖8.0～10.0％；维生素C 0.2～0.4％。

质量体积浓度的单位为g/100ml。

更优选的，所述冻干保护剂各组分的质量体积浓度为：谷氨酸1.0％；脱脂乳7.0％；甘露醇2.5％；果糖9.0％；维生素C 0.3％。

所述冻干保护剂的溶剂为无菌生理盐水。

所述冻干保护剂无药理活性，可在冻干和保存时维持粪便菌群的稳定性。并非任意一种冻干保护剂对于粪便菌群都具有好的保护效果，而本发明的特殊冻干保护剂使得粪菌中的6种菌群“双歧杆菌”、“乳酸菌”、“拟杆菌”、“肠球菌”、“肠杆菌”、“小梭菌”的冻干存活率均超过90.00％。

为了进一步保护粪菌中的益生菌，本发明还对冻干方法进行了考察和优化。

优选的，步骤(2)中，所述冷冻干燥包括如下步骤：

1)预冻：通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；

2)真空干燥：以真空度8～12Pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。

上述冷冻干燥方法，比常规一步预冻后真空干燥，能够更好地保护粪菌中各种重要菌群的细胞结构。

优选的，步骤(3)中，所述胶囊采用肠溶胶囊。

更优选，DRcap耐酸型HPMC胶囊。所述DRcap耐酸型HPMC胶囊能够很好地保护粪菌中各种益生菌。

本发明的第二方面，提供了一种由前述方法制备获得的粪菌胶囊。

本发明的第三方面，提供了前述粪菌胶囊制备方法或粪菌胶囊在粪菌移植中的用途。

本发明的第四方面，提供了前述粪菌胶囊制备方法或粪菌胶囊在制备炎症性肠病(IBD)治疗药物中的用途。

优选的，所述炎症性肠病溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)。

本发明的有益效果为：

1、菌群较为集中，可放于低温长久保存；

2、便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式：如胃镜、肠镜、鼻空肠营养管等；

3、对于虚弱的患者，增加了安全性。

4、本发明特殊冻干保护剂的使用对于粪便菌群都具有好的保护效果。冷冻干燥方法，比常规一步预冻后真空干燥，能够更好地保护粪菌中各种重要菌群的细胞结构。二者的配合，有效得提高了粪菌菌群的冻干存活率。

附图说明

图1：胶囊耐酸曲线图。

图2：胶囊在胃肠部位的释放示意图。

图3：腹痛程度评分表。

图4：布里斯托大便分类法。

图5：对“粪菌胶囊”治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进行了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标IL-6于移植后第一天即出现了明显的下降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降趋势波动较大，IL-6变化趋势不明显。

图6：对“粪菌胶囊”治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进行了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标CRP于移植后第一天即出现了明显的下降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降趋势波动较大，CRP变化趋势不明显。

图7：对“粪菌胶囊”治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进行了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标ESR于移植后第一天即出现了明显的下降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降趋势波动较大，ESR变化趋势不明显。

图8：“标准化粪菌移植”前后细菌培养平板菌落代表图，供者细菌培养乳酸菌数量为189×10⁶CFU/g。

图9：“标准化粪菌移植”前后细菌培养平板菌落代表图，受者移植前稀释至10⁶培养数量为0。

图10：“标准化粪菌移植”前后细菌培养平板菌落代表图，受者移植后，稀释至10⁶，培养出的细菌数量为262×10⁶CFU/g，数量明显增加。

图11：FMT前后菌群PCA分析。

图12：FMT前后菌群聚类分析。

图13：FMT对IBD患者移植前后在门的水平菌群改变的影响，其中，横坐标中的A为供者，B为IBD患者移植前，C为IBD患者移植后2天，D为IBD患者移植后1月。

图14：FMT对IBD患者移植前后在纲的水平菌群改变的影响，其中，横坐标中的A为供者，B为IBD患者移植前，C为IBD患者移植后2天，D为IBD患者移植后1月。

图15：FMT对IBD患者移植前后在目的水平菌群改变的影响，其中，横坐标中的A为供者，B为IBD患者移植前，C为IBD患者移植后2天，D为IBD患者移植后1月。

图16：瘤胃菌科含量在供体、受体(移植前后三个时间点)之间的比较。

图17：受者移植前后大便形状改变。

图18：部分患者肠外表现的改变，左图为移植前，呈紫红色，可触及硬结；右图为移植后，明显变淡，结节消失。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

制备粪菌胶囊：

方法1：将约120g的供体新鲜粪便样本置于搅拌器中,加入250ml无菌0.9％NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤除去其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理。浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的分子筛过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以3000转/min的速率离心10min，并将沉淀再悬浮于0.9％NaCl溶液100ml中，分散重悬。通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；以真空度8～12pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。装胶囊，每颗胶囊含大便量10g(冻干后，约1g装于胶囊)。

方法2：将约120g的供体新鲜粪便样本置于搅拌器中,加入250ml无菌0.9％NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤除去其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理。浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的分子筛过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以3000转/min的速率离心10min，并将沉淀再悬浮于含10％甘油的0.9％NaCl溶液100ml中，分散重悬。通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；以真空度8～12pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。装胶囊，每颗胶囊含大便量10g(冻干后，约1g装于胶囊)。

方法3：将约120g的供体新鲜粪便样本置于搅拌器中,加入250ml无菌0.9％NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤除去其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理。浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的分子筛过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以3000转/min的速率离心10min，并将沉淀再悬浮于含谷氨酸1.0％；脱脂乳7.0％；甘露醇2.5％；果糖9.0％；维生素C 0.3％的0.9％NaCl溶液100ml中，分散重悬。通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；以真空度8～12pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。装胶囊，每颗胶囊含大便量10g(冻干后，约1g装于胶囊)。

方法4：将约120g的供体新鲜粪便样本置于搅拌器中,加入250ml无菌0.9％NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤除去其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理。浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的分子筛过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以3000转/min的速率离心10min，并将沉淀再悬浮于含谷氨酸0.6％；脱脂乳6.0％；甘露醇2.0％；果糖8.0％；维生素C 0.2％的0.9％NaCl溶液100ml中，分散重悬。通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；以真空度8～12pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。装胶囊，每颗胶囊含大便量10g(冻干后，约1g装于胶囊)。

方法5：将约120g的供体新鲜粪便样本置于搅拌器中,加入250ml无菌0.9％NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤除去其中的大颗粒物质；冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理。浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的分子筛过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以3000转/min的速率离心10min，并将沉淀再悬浮于含谷氨酸2.0％；脱脂乳8.0％；甘露醇3.0％；果糖10.0％；维生素C 0.4％的0.9％NaCl溶液100ml中，分散重悬。通过“两步法”从25℃降至-80℃：第1步以1～2℃/min的速率进行降温；第2步是以3～5℃/min的速率进行降温；总预冻时间为12～24h；以真空度8～12pa，温度-40～-60℃，真空干燥24～48h。装胶囊，每颗胶囊含大便量10g(冻干后，约1g装于胶囊)。

冷冻干燥存活率的确定：

冻干前活菌数检测：将待测样品梯度稀释，采用倾注平板计数法检测活菌数。

冻干后活菌数检测：向冻干粉中加入无菌0.9％NaCl溶液，补足至原体积，活菌检测方法同上。

测冻干前后的活菌数，按下列公式计算存活率：

存活率＝冻干后无菌0.9％NaCl溶液补足至前体积的活菌数/冻干前活菌数

由此可见，采用方法3～4制备的粪菌胶囊能够更好地保护粪菌中的各种有益菌。

本发明采用DRcap耐酸型HPMC胶囊来封装粪菌冻干粉。所述胶囊具有耐酸特性，其耐酸曲线图如图1所示。采用所述胶囊能够防止其在胃内崩解，有助于安全地将粪菌冻干粉运送至肠部位。所述胶囊在不同时间，在胃肠内崩解的情况如图2所示，在0min时，胶囊刚刚进入胃内；在胃内逗留50分钟后，开始准备释放内容物；在105分钟时，胶囊离开胃里面进入到小肠部位，开始释放内容物。本发明实施例中采用的是双层胶囊，其真正崩解的位置大概是在回肠末端，有效地避免了胃酸对粪菌冻干粉中各种有益菌群的破坏。

实施例2

将实施例1方法3～5制备的粪菌胶囊进行临床试验：

对于供者的要求：

1)FMT前取得粪便供体和受体的知情同意。

2)供者主要从夫妻、父母、子女和亲密朋友等与受体关系密切的个体中选择。这与受体意愿有关，同时,这部分人群与受体具有相似的微生态环境，理论上可能对FMT产生更为积极的效果。Gough等认为采用受体亲属或朋友的粪便较不相关供体的粪便疗效更好,并指出供体和受体间性别差异对疾病缓解的影响不大。

3)供者纳入标准：

①无任何已知的传染病；

②最近3个月内未使用抗菌药物以及其他导致肠道微生态紊乱的药物；

③无胃肠道肿瘤、息肉等消化系疾病；

④无免疫系统疾病史；

⑤未使用任何免疫抑制剂；

⑥无IBD、慢性便秘和IBS病史；

⑦无恶性肿瘤病史；

⑧最近6个月内未到地方流行性腹泻地区旅行；

⑨当前未进行任何抗肿瘤相关的药物和其他治疗；

⑩当前无消化系统症状，无其他相关危险因素，如静脉内药物滥用(吸毒)、高危性行为和犯罪史等。

4)供者的排除标准：

①糖尿病和代谢综合征等代谢性疾病；

②消化系统手术史；

③慢性疲劳综合征；

④自身免疫病；

⑤特异反应性疾病，如湿疹、哮喘和胃肠道嗜酸性细胞相关疾病等；

⑥神经精神性疾病。

5)供者血清学筛查项目：

①血常规；

②血生化；

③肝炎病毒A/B/C，人类免疫缺陷病毒,人类T淋巴细胞病毒,巨细胞病毒、EB病毒和梅毒等病毒学检测；

④苍白密螺旋体和幽门螺杆菌等致病微生物检测。

6)供者粪便样本需排除的感染：

各类可致病微生物

C.difficile毒素A/B

沙门菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、金黄色葡萄球菌属、耶尔森菌属、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、白色念珠菌、贾第虫属、轮状病毒属、大肠杆菌0157、环孢子虫、卵子、包囊和寄生虫等。

7)供者移植前一天的准备

①避免进食对患者可能造成过敏的食物；

②报告任何感染的症状和体征；

③移植前一晚口服渗透性缓泻剂。

2、对于移植胶囊内细菌的种类、数量、活性的进行了预培养，并定量：

通过前期细菌平板培养，明确得到1g粪便中，细菌的数量为10¹²CFU，故此，每位患者每次给予的大便重量固定为120g，其细菌的数量，约为1.2×10¹⁴CFU，活性正常。

3、细菌胶囊的制备、分离、转运、储存的标准化：

实施例1方法3～5。

4、移植的标准化方案：

①受者移植前3d停用抗菌类药物；

②受者无论接受何种移植途径,于1天前进行肠道清洁准备；

③给予抗运动功能药物胃复安，便于粪菌液的肠道保留；

④FMT前一晚和清晨需给予质子泵抑制剂，抑制胃酸的分泌。

⑤移植后2日内，密切观察患者腹痛、腹泻的情况，并观察患者的体温，如出现短暂的不良反应，如体温升高、腹泻次数短暂增加，对症处理。

5、标准化的胶囊复苏及给予过程

①胶囊共12颗，分两天给予，每天6颗；

②给予胶囊当天早上空腹，胶囊先置于-20℃预解冻2小时，用冰盒运输至床旁，争取患者于半小时内进食完。

③胶囊给予后半小时，鼓励患者进食，以便给予“肠道细菌”良好的生长环境，建议患者服用“安素”等营养液，效果更为理想。

6、临床效果的标准化评价：

患者的临床症状包括腹痛程度、大便性状改善、患者严重程度、内镜下粘膜愈合的程度、患者整体情况改善等均建立统一的评分标准，予以量化，血清学指标的改善，固定统一的时间取血，统一标准。

①腹痛程度评分表(图3)：

如图1所示，面部表情量表法，6个脸谱依次评分为0、2、4、6、8、10分。数字评分法：0为无痛；1-3为轻度疼痛；4-6为疼痛；7-10为剧烈疼痛。

②大便性状评分表(图4)：

如图4所示，布里斯托大便分类评分法，大便分为1-7型，分别评1-7分，乘以相应的大便次数。

③UC的严重程度评分表(表1)：

表1 Southerland活动指数表

注：总分<2分为症状缓解；3～5分为轻度活动；6～10分为中度活动；11～12分为重度活动。

④CD的严重程度评分表(表2)：

表2 Best克罗恩病活动指数

注：CDAI<150为缓解期。>150为活动期；150-219之间为轻度、220-450为中度、>450为重度。

⑤溃疡性结肠炎内镜下粘膜愈合程度评分表(表3)：

表3 Anchor溃疡性结肠炎内镜评分表

描述评分	0分	1分	2分	3分
					血管	正常	点状闭塞	片状闭塞	完全闭塞
出血	无	黏膜表面出血	管腔内轻度血液蓄积	管腔中度或重度血液蓄积
					糜烂和溃疡	无	糜烂	粘膜表面溃疡	粘膜深度溃疡

⑥克罗恩病内镜下粘膜愈合程度评分表SES-CD(表4)：

表4 简化的克罗恩内窥镜评分(SES-CD)

注：SES-CD总分为所有变量分值之和-1.4×累及的肠段数量

实施例3

前期20例患者的初步临床结果

1、入选患者基本情况：

入选患者30例，其中4例患者因不符合入选标准被排除，其中正式实施26例，有效患者18例，暂时未见明显效果8例，有效率：69.2％。

性别：男13例，女13例；年龄：19-53岁，平均35.5岁

病程：3年-10年，平均4.5年

既往用药史：均使用过美沙拉嗪口服，疗效不佳；部分患者使用过激素、免疫抑制剂；部分患者使用过英夫利西单抗治疗。

2、患者初步治疗效果：

1)临床症状的改善：

经实施例1“粪菌胶囊”按照实施例2的标准流程治疗后，临床疗效较好的患者，其腹痛程度明显减轻，大便次数明显减少，而存在肠外表现的患者，如有结节性红斑表现的患者，其结节性红斑明显消失，既往表现为发热的患者，其未在出现发热症状。而效果暂时不明确的患者，其腹痛程度及大便次数无明显改善，有肛瘘和血便的患者，其进一步改善亦不明确。

表5 有效患者临床症状得到明显改善(n＝18)

	Pre-FMT	Post-FMT	P
				腹痛程度(评分)	5±0.13	2±0.12#	<0.05
大便次数(评分)	6±0.15	2±0.19#	<0.05

表6 效果暂时不明确患者临床症状无明显改善(n＝8)

	Pre-FMT	Post-FMT	P
				腹痛程度(评分)	5±0.03	4±0.12	>0.05
大便次数(评分)	6±0.25	5±0.15	>0.05

2)血清学指标的变化情况(CRP、ESR、IL-6)

我们对“粪菌胶囊”治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进行了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标(包括CRP、IL-6、ESR)于移植后第一天即出现了明显的下降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降趋势波动较大，不明显(见图5、6、7)。

3)细菌培养结果：

我们对供者、受者移植前、移植后第2天的粪便标本进行了6种菌群的培养，包括“双歧杆菌”、“乳酸菌”、“拟杆菌”、“肠球菌”、“肠杆菌”、“小梭菌”等，研究发现，受者移植前，其益生菌(双歧杆菌、乳酸菌)的数量明显减少，甚至为“0”，而移植后，其益生菌数量明显增加，基本接近供者益生菌的数目，而效果暂时不明确的患者，其益生菌在移植前的数量下降程度不及效果明显好转的患者，移植后，其益生菌的数量无明显改善。表明，受者肠道菌群的改善，是“标准化粪菌移植”后IBD患者症状改善，血清中炎性指标下降的主要机制。(见表7、8)

表7双歧杆菌移植前后的数量改变(单位CFU/g)

	Pre-FMT(X10⁶)	Post-FMT(X10⁶)
			供者	253.12+19.91
有效受者	12.12+5.34	232.19+25.34#
			效果不明受者	165.27+15.49	178.13+23.03

表8乳酸菌移植前后的数量改变(单位CFU/g)

“标准化粪菌移植”前后细菌培养平板菌落代表图

如图8所示，供者细菌培养乳酸菌数量为189×10⁶；如图9所示，受者移植前稀释至10⁶培养数量为0；如图10所示，受者移植后，稀释至10⁶，培养出的细菌数量为262×10⁶，数量明显增加。

4)“粪菌胶囊”治疗前后患者16s rDNA菌群组成分析

通过对菌群组成的分析，A点表示供者菌群样品，B点表示患者FMT移植前菌群样品，C表示移植后3天患者菌群样品，D表示FMT移植后1月菌群样品。通过PCA(图11)和聚类分析(图12)，可以明确显示，经过移植后，C点菌群(移植后3天)逐渐趋近于A点(供者)，直到D点(移植后1月)进一步趋近并接近于A点(供者)的菌群分布。提示供者的粪便菌群在患者体内有效定植，是“粪菌移植”发挥作用的主要机制。

5)在细菌的门、纲、目、科、属上，分别对细菌16s rDNA分析结果：

我们对供者、受者移植前、移植后第2天、移植后1月的粪便标本进行了16s rDNA分析，研究发现，在门这一水平上，硬壁菌门(Firmicutes)移植前后改变最为显著(图13)；在纲这一水平上，梭菌纲(Clostridia)在移植前后改变最为显著(图14)；在目的水平上，梭菌目(Clostridiales)在移植前后改变最为明显(图15)；在科的水平上，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)在移植前后的改变最为明显(图16)；(图中A为供者，B为IBD患者移植前，C为IBD患者移植后2天，D为IBD患者移植后1月)。

6)大便性状改变：

如图17所示，移植前，炎症性肠病患者大便次数均较多，因此大便一般为稀便，且量少，移植后，在效果明确的患者，第2天大便逐渐成型，且粪质量明显增多，移植后第3天，大便进一步成型，接近正常大便形态，此后，至第5-6天，大便可逐渐成型至条状。

7)部分患者肠外表现的改变：

其中一例克罗恩病患者，移植前双下肢胫前有明显的结节性红斑，移植后2天，红斑变淡、结节消失。如图18所示，左图为移植前，呈紫红色，可触及硬结；右图为移植后，明显变淡，结节消失。

8)患者恢复良好出院。

综上所述，本发明的粪菌胶囊具有良好的治疗效果，具有很好的应用前景。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种制备粪菌胶囊的方法，包括如下步骤：

(1)粪菌液制备；

(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后，冷冻干燥，得粪菌冻干粉，所述冻干保护剂为复合冻干保护剂，所述冻干保护剂各组分的质量体积浓度为：谷氨酸0.5～2.0％；脱脂乳6.0～8.0％；甘露醇2.0～3.0％；果糖8.0～10.0％；维生素C 0.2～0.4％；

(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉装入胶囊中，得粪菌胶囊。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，粪菌液的制备方法为：

2)初步过滤：将步骤1)中所得粪便浆体过滤去除大颗粒物质；

3)将步骤2)所得样本称重并在匀浆器中进一步匀质处理；

4)将步骤3)所得样本逐级过滤或多次过滤；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，100～150g粪便样本加入250ml无菌生理盐水进行初步均质加工。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用不锈钢滤网过滤。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中，在氮气生物工程厨内进行称重和进一步匀质处理。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中，逐级过滤是指依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.4mm和0.1mm的滤网；多次过滤是指经过直径0.25mm的滤网2～3次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冷冻干燥包括如下步骤：

8.由权利要求1～7任一权利要求所述方法制备获得的粪菌胶囊。

9.根据权利要求1～7任一权利要求所述方法制备获得的粪菌胶囊在制备粪菌移植药物中的用途。

10.根据权利要求1～7任一权利要求所述方法制备获得的粪菌胶囊在制备炎症性肠病治疗药物中的用途。