CN108085270B - 一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法 - Google Patents

一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法，本发明利用锂基高岭土将粪菌液中的铁、钛、铋离子交换到锂基高岭土层间；吸附了铁、钛、铋离子的锂基高岭土和碳酸锂经过滤除去，从而达到去除粪菌液中铁、钛、铋离子的目的。本发明可通过特异性吸附去除人粪便中的铁、钛、铋离子，使铁、钛、铋离子超标的粪便捐献者所捐献的粪便经处理后能达标。

Description

一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法
技术领域
本发明属于人粪菌移植、发酵、检测技术领域，涉及一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法。
背景技术
“粪菌移植”(Fecal microbiota transplantation，FMT)是指将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。粪菌移植作为重建肠道菌群的有效手段，已用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘、代谢病、肠道免疫缺陷、肠道过敏等多种菌群相关性疾病的治疗和探索性研究，并被认为是近年的突破性医学进展。
粪菌给入途径分为上消化道、中消化道、下消化道三种途径。上消化道途径主要指口服粪菌胶囊；中消化道途径包括通过鼻肠管、胃镜钳道孔、经皮内镜胃造瘘空肠管；下消化道途径包括结肠镜、灌肠、结肠造瘘口、以及经内镜肠道植管术(transendoscopicenteral tubing，TET)等。医生应针对患者的不同情况和各种途径的特点选择其最合适的输入途径。
粪菌移植的状态可分为新鲜、冻存和发酵三种形式。由于粪菌移植的安全性成为临床决策的首要考虑因素，因此，为了分离一份优质的不含病菌的粪菌群，对捐粪者的要求很高，至少近3-6个月内没有发生腹泻、没有使用过抗生素，而且必须没有传染病和胃肠道疾病，另外，还有包括年龄、生理、病理、心理、诚信、时间、环境等方面的限制条件。
由于合格的粪便捐献者提供的粪菌完全不能满足临床需求，所以，对于某些离子超标的粪菌，通过技术处理，使其符合粪菌移植的要求，具有非常重要的现实意义。
随着人类生活环境的变化，人粪便中铁、钛、铋离子的超标已越来越常见，当粪便提供者的粪便中铁、钛、铋离子超标时，将不符合粪菌移植的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备不含铁钛铋离子粪菌液的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种制备不含铁、钛、铋离子粪菌液的方法，
1)将粪便样品中加入无菌NaCl溶液，再加入锂基高岭土，搅拌均匀后获得粪便浆体；
2)将粪便浆体初滤，取滤液，在二氧化碳气体、氮气、氦气、氖气或氩气的保护下，每隔0.8～1.2h以1800～2200rpm搅拌3～6min，4～7h后获得粪菌浆体；
3)将粪菌浆体过滤取滤液，得粗粪菌液；将粗粪菌液离心，取沉淀，重悬得无色无味的不含铁、钛、铋离子的粪菌液。
进一步的，所述锂基高岭土的制备方法为：将高岭土矿物中加入水、偏磷酸锂，加热至70～80℃，加入Na2CO3；搅拌2.5～3.5h，静置20～30h后用去离子水离心洗涤，回收固体物，干燥后得到锂基高岭土。
进一步的，所述高岭土矿物、偏磷酸锂、Na2CO3、水的用量比为80～120g：8～12g：18～22g：1L。
进一步的，所述干燥的温度为100～110℃，时间为45～55h。
进一步的，所得锂基高岭土的阳离子交换容量为70～90mmol/100g。
进一步的，步骤1)中，粪便样品、NaCl溶液和锂基高岭土的用量比为1g∶3～7mL：2～3g。
进一步的，所述NaCl溶液的浓度为0.85％～0.95％w/v。
进一步的，步骤1)中，所述搅拌的速度为1800～2200rpm，时间为2～4min。
进一步的，步骤2)中，所述初滤的具体操作为：将粪便浆体经孔径为4.5～5.5mm的滤网过滤去除大颗粒物质。
进一步的，步骤3)中，所述粪菌浆体过滤的具体操作为：依次经孔径为1.5～2.5mm、0.8～1.2mm、0.4～0.6mm和0.2～0.3mm的滤网过滤。
进一步的，步骤3)中，离心的转速为5500～6500rpm，时间为12～18min。
进一步的，步骤3)中，重悬所用的液体为无菌0.85％～0.95％w/v NaCl溶液。
本发明的有益效果是：
目前暂未见到去除人粪便中铁、钛、铋离子的方法报道，本发明可通过特异性吸附去除人粪便中的铁、钛、铋离子，使铁、钛、铋离子超标的粪便捐献者所捐献的粪便经处理后能达标。
具体实施方式
一种制备不含铁、钛、铋离子粪菌液的方法，
1)将粪便样品中加入无菌NaCl溶液，再加入锂基高岭土，搅拌均匀后获得粪便浆体；
2)将粪便浆体初滤，取滤液，在二氧化碳气体、氮气、氦气、氖气或氩气的保护下，每隔0.8～1.2h以1800～2200rpm搅拌3～6min，4～7h后获得粪菌浆体；
3)将粪菌浆体过滤取滤液，得粗粪菌液；将粗粪菌液离心，取沉淀，重悬得无色无味的不含铁、钛、铋离子的粪菌液。
优选的，所述锂基高岭土的制备方法为：将高岭土矿物中加入水、偏磷酸锂，加热至70～80℃，加入Na2CO3；搅拌2.5～3.5h，静置20～30h后用去离子水离心洗涤，回收固体物，干燥后得到锂基高岭土。
优选的，所述高岭土矿物、偏磷酸锂、Na2CO3、水的用量比为80～120g：8～12g：18～22g：1L。
优选的，所述干燥的温度为100～110℃，时间为45～55h。
优选的，所得锂基高岭土的阳离子交换容量为70～90mmol/100g。
优选的，步骤1)中，粪便样品、NaCl溶液和锂基高岭土的用量比为1g∶3～7mL：2～3g。
优选的，所述NaCl溶液的浓度为0.85％～0.95％w/v。
优选的，步骤1)中，所述搅拌的速度为1800～2200rpm，时间为2～4min。
优选的，步骤2)中，所述初滤的具体操作为：将粪便浆体经孔径为4.5～5.5mm的滤网过滤去除大颗粒物质。
优选的，步骤3)中，所述粪菌浆体过滤的具体操作为：依次经孔径为1.5～2.5mm、0.8～1.2mm、0.4～0.6mm和0.2～0.3mm的滤网过滤。
优选的，步骤3)中，离心的转速为5500～6500rpm，时间为12～18min。
优选的，步骤3)中，重悬所用的液体为无菌0.85％～0.95％w/v NaCl溶液。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
其中，铁、钛、铋离子在粪菌液中的浓度通过电感耦合等离子光谱仪(ICP，Optima2000DV，美国)测试(测试方法参考文献Xiang Cai,Guang-Jian Dai,Shao-Zao Tan,YuOuyang,You-Sheng Ouyang,Qing-Shan Shi.Synergistic antibacterial zinc ions andcerium ions loaded α-zirconium phosphate.Materials Letters.2012,67(1):199-201.)。
实施例1一种利用锂基高岭土去除人粪便中铁、钛、铋离子制备粪菌液的方法
(1)锂基高岭土的制备：将100g高岭土矿物(市售产品，粒径为0.5～2.0mm)加入到1L水中，加入10g偏磷酸锂，加热至75℃，加入20g Na2CO3；电磁60rpm搅拌3h，静置24h后用去离子水离心洗涤4次，除去底部不溶物，回收固体物；105℃下干燥48h后得到锂基高岭土；所得的锂基高岭土的阳离子交换容量(CEC)为80mmol/100g。
(2)取150±0.1g锂基高岭土(粒径为0.5～2.0mm)，加入100mL无菌0.9％NaCl溶液，500r/min搅拌5min，0.25mm的不锈钢滤网过滤掉水分后，得到锂基高岭土浆状物，备用。
(3)将50±1g供体新鲜粪便置于搅拌器中，加入250mL无菌0.9％NaCl溶液，再加入上步备好的锂基高岭土浆状物(粒径为0.5～2.0mm)，2000r/min均质3min，获得粪便浆体；
(4)将粪便浆体经5.0mm的不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质，获得初滤后的粪便浆体；
(5)初滤后的粪便浆体冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；
(6)将初滤后的粪便浆体转入氮气生物工程厨内，通入二氧化碳气体，并在匀浆器中每隔1h以2000r/min搅拌5min，6h后获得粪菌浆体；
(7)粪菌浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除吸附了铁、钛、铋离子的锂基高岭土、碳酸锂、未吸收的食物残渣和小颗粒物质，获得粗粪菌液；
(8)将粗粪菌液以6000r/min的速率离心15min，并将粪菌沉淀再悬浮于250mL的0.9％NaCl溶液中，得近无色无味的粪菌液250mL。
测定所得粪菌液中铁、钛、铋离子总含量为零(仪器检不出，铁、钛、铋离子总含量＜4ppb)，钠离子含量为155mmol/L。
空白对照组：操作步骤同本实施例上述步骤(1)～步骤(8)，只是不加入粪便和锂基高岭土，得近无色无味的液体250mL，测定液体中铁、钛、铋离子总含量为零(仪器检不出，铁、钛、铋离子总含量＜4ppb)，钠离子含量为零(见表1)。
对比组1(有粪便无高岭土)：操作步骤同本实施例上述步骤(1)～步骤(8)，只是不加入锂基高岭土，得近无色无味的液体250mL，测定液体中铁、钛、铋离子含量分别为16.8mmol/L、4.3mmol/L、3.1mmol/L，铁、钛、铋离子总含量为24.2mmol/L，钠离子含量为156.8mmol/L。
对比组2(有粪便有高岭土)：操作步骤同本实施例上述步骤(1)～步骤(8)，只是加入高岭土不加锂基高岭土，得近无色无味的液体250mL，测定液体中铁、钛、铋离子含量分别为13.3mmol/L、4.0mmol/L、2.8mmol/L，铁、钛、铋离子总含量为20.1mmol/L，钠离子含量为156.8mmol/L(见表1)。
表1不同处理组中离子含量的检测结果
Figure BDA0001485153930000051
注：ammol/L，毫摩尔/升；
bN/A:仪器检不出，含量＜4ppb(ppb:μg/L(微克/升)。
从表1中可以看出，经过锂基高岭土处理后的铁、钛、铋离子超标的供体新鲜粪便不再含有铁、钛、铋离子，使铁、钛、铋离子超标的粪便捐献者所捐献的粪便经处理后能达标，且钠离子的含量基本保持不变。
实施例2一种利用锂基高岭土去除人粪便中铁、钛、铋离子制备粪菌液的方法
(1)锂基高岭土的制备：将120g高岭土矿物(市售产品，粒径为0.5～2.0mm)加入到1L水中，加入8g偏磷酸锂，加热至80℃，加入22g Na2CO3；电磁60rpm搅拌3.5h，静置20h后用去离子水离心洗涤4次，除去底部不溶物，回收固体物；100℃下干燥45h后得到锂基高岭土；所得的锂基高岭土的阳离子交换容量(CEC)为70mmol/100g。
(2)将50±1g供体新鲜粪便置于搅拌器中，加入150mL无菌0.95％NaCl溶液，再加100g锂基高岭土(粒径为0.5～2.0mm)，2200r/min均质4min，获得粪便浆体；
(3)将粪便浆体经5.0mm的不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质，获得初滤后的粪便浆体；
(4)初滤后的粪便浆体冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；
(5)将初滤后的粪便浆体转入氮气生物工程厨内，通入氮气气体，并在匀浆器中每隔1.2h以2000r/min搅拌5min，4h后获得粪菌浆体；
(6)粪菌浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除吸附了铁、钛、铋离子的锂基高岭土、碳酸锂、未吸收的食物残渣和小颗粒物质，获得粗粪菌液；
(7)将粗粪菌液以6500r/min的速率离心18min，并将粪菌沉淀再悬浮于250mL的0.9％NaCl溶液中，得近无色无味不含铁、钛、铋离子的粪菌液250mL。
实施例3一种利用锂基高岭土去除人粪便中铁、钛、铋离子制备粪菌液的方法
(1)锂基高岭土的制备：将80g高岭土矿物(市售产品，粒径为0.5～2.0mm)加入到1L水中，加入12g偏磷酸锂，加热至70℃，加入18g Na2CO3；电磁60rpm搅拌2.5h，静置30h后用去离子水离心洗涤4次，除去底部不溶物，回收固体物；110℃下干燥55h后得到锂基高岭土；所得的锂基高岭土的阳离子交换容量(CEC)为90mmol/100g。
(2)将50±1g供体新鲜粪便置于搅拌器中，加入350mL无菌0.85％NaCl溶液，再加75g锂基高岭土(粒径为0.5～2.0mm)，2200r/min均质4min，获得粪便浆体；
(3)将粪便浆体经5.0mm的不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质，获得初滤后的粪便浆体；
(4)初滤后的粪便浆体冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；
(5)将初滤后的粪便浆体转入氮气生物工程厨内，通入氮气气体，并在匀浆器中每隔1.2h以2000r/min搅拌5min，4h后获得粪菌浆体；
(6)粪菌浆体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除吸附了铁、钛、铋离子的锂基高岭土、碳酸锂、未吸收的食物残渣和小颗粒物质，获得粗粪菌液；
(7)将粗粪菌液以6500r/min的速率离心12min，并将粪菌沉淀再悬浮于250mL的0.9％NaCl溶液中，得近无色无味不含铁、钛、铋离子的粪菌液250mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种制备不含铁、钛、铋离子粪菌液的方法，其特征在于：
1)将粪便样品中加入无菌NaCl溶液，再加入锂基高岭土，搅拌均匀后获得粪便浆体；
2)将粪便浆体初滤，取滤液，在二氧化碳气体、氮气、氦气、氖气或氩气的保护下，每隔0.8～1.2h以1800～2200rpm搅拌3～6min，4～7h后获得粪菌浆体；
3)将粪菌浆体过滤取滤液，得粗粪菌液；将粗粪菌液离心，取沉淀，重悬得无色无味的不含铁、钛、铋离子的粪菌液；
其中，所述锂基高岭土的制备方法为：将高岭土矿物中加入水、偏磷酸锂，加热至70～80℃，加入Na2CO3；搅拌2.5～3.5h，静置20～30h后用去离子水离心洗涤，回收固体物，干燥后得到锂基高岭土。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高岭土矿物、偏磷酸锂、Na2CO3、水的用量比为80～120g：8～12g：18～22g：1L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所得锂基高岭土的阳离子交换容量为70～90mmol/100g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，粪便样品、NaCl溶液和锂基高岭土的用量比为1g∶3～7mL：2～3g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为0.85％～0.95％w/v。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述搅拌的速度为1800～2200rpm，时间为2～4min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述初滤的具体操作为：将粪便浆体经孔径为4.5～5.5mm的滤网过滤去除大颗粒物质。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述粪菌浆体过滤的具体操作为：依次经孔径为1.5～2.5mm、0.8～1.2mm、0.4～0.6mm和0.2～0.3mm的滤网过滤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，离心的转速为5500～6500rpm，时间为12～18min。
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