CN116392511A - 鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制法和应用及外膜囊泡制品 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制法和应用及外膜囊泡制品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制法和应用及外膜囊泡制品。所述的乳杆菌为鼠李糖乳杆菌ATCC53103，其在食品工业中被广泛应用。本发明提供的鼠李糖乳杆菌ATCC53103的外膜囊泡LGG‑OMVs具有在体内和体外抑制结肠癌细胞MC38和SW620增殖的能力，能有效诱导结肠癌细胞的凋亡。对LGG‑OMVs进行体外消化和体内标记，发现其具有较强的耐高温能力，并且对外膜囊泡Ca2+修饰后提高了其酸稳定性，能够口服到达肠道部位并且加工稳定性较好。此外，口服LGG‑OMVs能够显著提升免疫检查点抑制剂PD‑1在小鼠体内的治疗效果，具有开发成为针对肿瘤患者的特医特膳食品的潜力。

Description

鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制法和应用及外膜囊泡制品
技术领域
本发明涉及微生物和生物医药领域，尤其涉及鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制法和应用及外膜囊泡制品。
背景技术
结肠癌是临床中常见的消化系统恶性肿瘤之一，其在所有癌症中发生率居于第三位，死亡率高居第二位。目前结肠癌治疗主要还是化疗，但存在多种并发症。因此，迫切地需要找到替代的抗癌药物来改善未来结肠癌的治疗。
益生菌尤其是乳酸杆菌在维护微生态平衡、多种疾病的预防和治疗中具有重要作用。益生菌大多为肠道天然菌株，能够适应肠道环境并发挥保健作用，在调节肠道菌群紊乱，提高免疫力等方面具有重要作用。益生菌在抗癌方面，主要发挥缓解肠道炎症、激活抗肿瘤免疫、调节肠道微生态以及缓解化疗放疗的腹泻等副作用。
鼠李糖乳杆菌是普遍应用于食品工业的益生菌菌株，具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点，能有效改善和调整人体胃肠道菌群群落，对人体健康非常有益。其生长过程中，会向外释放纳米级的囊泡物质，一般包含乳杆菌的少部分细胞质成分和细胞膜成分，而这种外膜囊泡在对于人体肠道菌群和免疫调节作用还尚不清楚。
革兰氏阳性菌产生的外膜囊泡相比革兰氏阴性菌产生的会少很多，可能与革兰氏阳性菌细胞膜含有较厚肽聚糖交联有关，释放压力较大，因此将革兰氏阳性菌细胞外膜囊泡量产，首先需要克服囊泡产生率低的问题，以便其生产和应用。此外，对细菌外膜囊泡的给药方式大多是参照研究细胞外泌体的注射给药的方式，而对于结肠癌等消化道癌症，口服更具有空间和安全优势，能够减少全身性的过敏或者免疫过激的情况，因此口服细胞外膜囊泡，并将其稳定的递送到特定肠道部位的是在细菌外膜囊泡应用中的需要解决的问题。
免疫检查点抑制剂治疗是近年来，有希望能够治疗癌症的免疫方法之一。相关药品已经上市用于临床。免疫检查点是一种可以抑制免疫细胞T细胞的过度激活的表面受体，而这一原本的保护机制能够被肿瘤细胞利用，从而产生免疫逃逸，造成T细胞的疲劳。尽管如此，对免疫检查点阻断(ICB)疗法的反应率仍然很低，并且一些人类癌症，例如大多数结直肠癌，具有抗药性。预计将需要新一代的组合疗法来改善对ICB疗法的反应并有效地治疗更大比例的癌症患者。
目前，已有报道摄入鼠李糖乳杆菌活菌能够被肠道树突状细胞DC所摄取，进而激活肠道抗肿瘤免疫，产生更多抗肿瘤的活性T细胞。然而，已有临床研究发现，长期大量摄取鼠李糖乳杆菌活菌制剂，能够显著提高临床病人的菌血症的发病率。此外，对于结肠癌患者来说，肠道内肿瘤已经破坏了肠道粘膜屏障，直接摄入活性制剂，可能会导致肠菌更容易转移到其他器官。因此，需要开发鼠李糖乳杆菌相关后生元，既能够避免活性增殖带来的潜在问题，又能够发挥激活抗肿瘤免疫的作用。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种显著提高产量的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法；本发明的另一目的是提供一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的应用；本发明的另一目的是提供一种含有上述鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的外膜囊泡制品。
技术方案：本发明的一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)取鼠李糖乳杆菌液接种培养，制成种子液；
(2)将培养后的种子液接种至新鲜的含有亚致死浓度青霉素G的MRS培养基中扩大培养；
(3)将步骤(2)培养的菌液低速离心收集上清液；
(4)将收集的上清液再次低速离心去除较大杂质；
(5)取步骤(4)得到的上清液并用滤膜过滤细菌；
(6)将步骤(5)过膜除菌得到的发酵液，再通过超滤离心管超滤和浓缩，以去除较小杂质；
(7)将超滤后的上清液分批移入超高速离心管中，超高速离心后弃上清，收集每次超高速离心后得到的沉淀；
(8)超高速离心上清液后，将收集到的含有所有沉淀的重悬并收集进行二次超高速离心，以去除残余培养基；
(9)将步骤(7)二次超高速离心的沉淀用PBS重悬，并通过Sepharose CL-2B的SEC柱纯化重悬的囊泡，收集1ml级分；
(10)收集步骤(9)所述的级分，得到的即为鼠李糖乳杆菌的外膜囊泡。
优选的，步骤(1)中，鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌ATCC53103。
优选的，步骤(1)和(2)中，鼠李糖乳杆菌液的培养温度为30～37℃，振荡培养，振荡的转速为150～200rpm。
优选的，步骤(3)、(4)中的低速离心的条件为8000～9000g、4℃离心25～35min；
优选的，所述的步骤(6)、(7)、(8)中的超离心的条件为150000～160000g、4℃离心1.5～2小时。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(2)中，青霉素G的浓度为0.2～0.3ug/ml，培养温度为30℃，转速为150～200rpm。
上述方案中可显著提高革兰氏阳性菌外膜囊泡产量，在前述扩大培养的培养基中添加亚致死量的青霉素G，是青霉素G的含量在培养基的浓度为0.2ug/ml，同时，将培养温度由37℃降低至30℃，刺激细菌外膜囊泡的产生。按照上述通过在培养基中添加适量青霉素G和降低培养温度，能够显著提高LGG-OMVs的产率至1.3倍。
优选的，步骤(2)中，扩大培养的稀释倍数为原种子液的10～15倍。
优选的，步骤(5)中，在过0.25滤膜前，可先过0.45滤膜，提高滤过效率，保证无菌体干扰。
优选的，步骤(9)中，装填层析柱规格为内径16～20mm，长度300～350mm，一次性装填，稳定后装填体积约为柱高的2/3～3/4。
优选的，步骤(9)中，收集级分过程时，恒流泵的流速控制在10-20rpm，不得超过30rpm。
另一方面，本发明提供一种外膜囊泡制品，所述制品含有鼠李糖乳杆菌外膜囊泡，所述鼠李糖乳杆菌外膜囊泡由上述的方法制备。
作为上述技术方案的进一步改进，所述外膜囊泡制品包括鼠李糖乳杆菌外膜囊泡和包覆在外膜囊泡外的外壳，外壳的组装方法为：将外膜囊泡溶液中加入1～1.5mM浓度的Ca2+，孵育一段时间，以在酸性环境下，形成沉淀外壳保护囊泡完整性。
上述方案中，通过在体外模拟消化发现，外膜囊泡制品中的外壳能够提高外膜囊泡的稳定性，具体表现在囊泡的粒径没有发生明显变化，同时对于标记后体内的分布结果表明，Ca2+处理后能够提高外膜囊泡在口服小鼠肠道的富集水平。
另一方面，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡在制备用于预防、治疗、辅助治疗和或/预后护理肿瘤疾病，和/或，用于肠胃调理的药物、保健品、食品、营养品、医疗装置、日化用品中的应用。
具体地，所述的辅助治疗效果包括但不限于辅助配合化疗、放疗及PD-1免疫检查点抑制剂治疗在内的免疫治疗。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于：消化系统肿瘤、血液系统肿瘤、颅脑肿瘤、呼吸系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、内分泌系统肿瘤、生殖系统肿瘤、循环系统肿瘤、骨骼肿瘤、皮肤肿瘤、软组织肿瘤。
优选地，所述的消化系统肿瘤包括但不限于：肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、口腔癌、咽癌。
进一步优选地，所述的肠癌包括但不限于：直肠癌、结肠癌、十二指肠癌、盲肠癌、阑尾癌。
又一方面，本发明提供了一种医药配置品。
具体地，所述的医药配置品中包括前述的微生物外膜囊泡LGG-OMVs。
优选地，所述的医药配置品为口服药物。
所述的口服药物剂型包括但不限于：胶囊剂、片剂、粉剂、冲剂、颗粒剂、乳剂、混悬
剂、丸剂、散剂。
又一方面，本发明提供了一种食品。
所述的食品中包括前述的微生物外膜囊泡LGG-OMVs。
所述的食品包括但不限于乳制品、饮料、休闲食品。
又一方面，本发明提供了一种日化用品。
所述的日化用品中包括前述的微生物外膜囊泡LGG-OMVs。
所述的日化用品包括但不限于清洁用品、保养用品。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明提供的鼠李糖乳杆菌ATCC53103制备的外膜囊泡LGG-OMVs具有耐酸耐高温特性，具有抑制MC38细胞，SW620细胞增殖的作用，有效地诱导结肠癌细胞凋亡，能够直接抑制癌细胞在皮下成瘤生长。此外，通过每天口服LGG-OMVs，能够调节肠道微生态，并且显著辅助提高PD-1免疫检查点抑制剂的治疗效果。
附图说明
图1为LGG-OMVs的透射电子显微镜(TEM)照片；
图2为LGG-OMVs的粒径分布图；
图3为添加青霉素G和降低培养温度对LGG-OMVs产量的优化图；
图4为在酸环境下Ca2+处理后LGG-OMVs的平均粒径图；
图5为Ca2+处理LGG-OMVs提高小鼠体内胃肠道稳定性的荧光图，(a)为口服Cy7标记的LGG-OMVs 12h后小鼠体内分布及离体分布情况，(b)为对离体分布进行量化分析；
图6为LGG-OMVs抑制SW620和MC38细胞的增殖，(a)为不同浓度LGG-OMVs对人源SW620结肠癌细胞增殖的抑制作用，(b)为不同浓度LGG-OMVs对鼠源MC38结肠癌细胞增殖的抑制作用；
图7为LGG-OMVs抑制MC39细胞的集落形成，(a)为0，100，200ug/ml的LGG-OMVs对MC38细胞集落形成的照片，(b)为集落形成数的计数图；
图8为LGG-OMVs直接抑制体内肿瘤生长，促进体内肿瘤细胞凋亡，(a)为肿瘤生长曲线，(b)为肿瘤离体照片，(c)为离体肿瘤质量，(d)为肿瘤组织Tunel染色图片，(e)为Tunel染色下棕色凋亡细胞数目；
图9为口服LGG-OMVs提高PD-1单克隆抗体的辅助治疗效果，(a)为肿瘤生长曲线，(b)为肿瘤质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种LGG-OMVs的制备方法
包括以下步骤：
(1)取一小勺约50mg的鼠李糖乳杆菌ATCC53103冻干粉(购自ATCC)放入高温灭菌后的MRS培养基中，将其放入37℃恒温振荡器中，200rpm下振荡培养12h；
(2)取50ul菌液涂布在MRS固体培养基上，将其放入37℃恒温培养箱中培养24h；
(3)接种环挑出少许菌体在新鲜的固体培养基上划线分离，再重新将其放入37℃恒温培养箱中培养24h；
(4)挑取单个菌落至新鲜的MRS液体培养基中，振荡数次，再将接种完毕的液体培养基放入37℃恒温振荡器中，200rpm下振荡培养12h；
(5)分别取培养后的菌液30ml接种至10个300mL MRS培养基中，37℃200rpm恒温振荡培养12h；
(6)将3000mL的鼠李糖乳杆菌ATCC53103菌液分别放入50mL离心管中，8000g 4℃离心25min，收集上清液；
(7)将收集的上清液再次8000g 4℃离心15min，以去除较大杂质，收集上清液；
(8)将收集的上清液分批加入100kDa超滤离心管超滤和浓缩，4000g 4℃离心25min，收集上管液体；
(9)两次低速离心和一次超滤离心后，注射器吸取上清液并依次用0.45μm、0.22μm滤膜过滤至无菌锥形瓶中，同时，取20μL过滤后的上清液涂于MRS琼脂平板中，放入37℃恒温培养箱中培养12h，通过观察MRS琼脂平板有无细菌生长以检测是否过滤掉细菌；
(10)将过滤后的上清液分批移入超速离心管中，150,000r/min，4℃离心1.5小时，弃上清，收集每次超速离心后得到的沉淀；
(11)超速离心所有上清液后，将收集到的含有所有沉淀的液体集中在一个超离管中进行最后的超离；
(12)弃上清，加入2mL PBS将沉淀从超速离心管中冲洗下来，再用PBS补齐至8mL，100,000r/min，4℃离心1.5h；
(13)弃去上清PBS，得到的沉淀即为鼠李糖乳杆菌ATCC53103的外膜囊泡，将得到的外膜囊泡用200μL PBS缓冲溶液重悬，分装后放入-80℃冰箱保存。
实施例2LGG-OMVs的鉴定
液体培养基培养鼠李糖乳杆菌ATCC53103，低速离心获取菌培养上清液，用滤膜过滤菌上清去除菌体，采用超速离心法从菌培养上清液中分离外膜囊泡。将提取的外膜囊泡重悬在10-20μL PBS中，并将其放置在300目铜网上，将铜网用2％的乙酸铀酰染色，在透射电镜下观察外膜囊泡的形态特征。透射电子显微镜下观察外膜囊泡的形态特征，见图1。
用1×PBS稀释外膜囊泡，使用ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪对样品进行上机检测，通过ZetaView 8软件跟踪单个外膜囊泡的布朗运动，结合Stockes-Einstein方程式计算出外膜囊泡的流体力学直径和浓度。通过纳米粒子示踪分析法来表征外膜囊泡粒子的直径尺寸分布，发现外膜囊泡粒子直径大约在180nm时该粒子的浓度达到峰值，这说明外膜囊泡粒子的直径大小主要集中在约180nm的范围内，并且与透射电子显微镜下观察的结果基本吻合，见图2。
实施例3一种提高LGG-OMVs产率的培养方法
称取0.1g的青霉素G，完全溶解于50ml的蒸馏水中，配制浓度为2mg/ml的青霉素G溶液。将上述的青霉素G溶液过0.22um的无菌滤膜。随后根据实施例1的步骤，在步骤(5)中的300ml新鲜MRS培养基中额外加入300ul的上述无菌青霉素G溶液，使得青霉素G在培养基中的终浓度为0.2ug/ml。同时，将恒温振荡仪培养温度降低至30℃，刺激细菌外膜囊泡的产生。
按照上述通过在培养基中添加适量青霉素G和降低培养温度，能够显著提高LGG-OMVs的产率至1.3倍，见图3。
实施例4外源添加Ca2+能够LGG-OMVs的酸稳定性
根据实施例1培养提取的OMVs在1mM CaCl2(Sigma-Aldrich)中孵育30分钟。将OMVs和CaCl2预处理半个小时的OMVs进行酸化(pH＝2)和煮沸(100℃,15分钟)处理，然后在4℃下进行150,000g的超离心1.5小时(Beckman Coulter:TLA-55转子)。得到的EV颗粒进行了等体积重悬后通过BCA蛋白测定和NTA分析，见图4。
选用C57小鼠(每组3只)研究口服给药OMVs的生物分布。用近红外荧光染料Cy7标记鼠李糖乳杆菌ATCC53103的OMVs,37℃孵育2h，然后在4℃150000×g离心1.5小时，以去除未结合的染料。EV颗粒进一步重悬在PBS中，并给动物单剂量灌胃的Cy7标记EV(7.5mg/kg)。在6、12、24和48小时使用IVIS Lumina XR-III对小鼠进行进一步成像。此外，从安乐死的动物中迅速切除器官，并进行体外成像，见图5。
实施例5LGG-OMVs能够抑制结肠癌细胞增殖
本实施例中使用的LGG-OMVs通过实施例1所述的方法进行制备。
(1)将对数期的贴壁细胞通过胰酶消化，使细胞脱落。待细胞大部分脱落时，加入两倍胰酶体积的含血清培养基终止消化。
(2)将残余细胞吹打下来后液体全部转移至离心管，1000r/min,离心3-5min，弃去离心管上清，用1ml含血清培养基重悬。
(3)取10ul细胞悬液加入到40ulPBS中，稀释5倍，通过计数板计数。根据计数结果对细胞悬液进行稀释。推荐值0.5-1×106个/ml。
(4)设置一个空白对照，5个不同给药浓度的实验组，每组设置3-5个复孔。在96孔板每孔中加100ul步骤(3)中稀释好的细胞悬液，振荡铺匀，放入37℃细胞培养箱中培养。
(5)接种12小时，细胞贴壁良好后，吸出各孔培养基。空白组加入不含外膜囊泡培养基，实验组加入含不同浓度外膜囊泡的培养基(10、20、50、100、200ug/ml)。放入细胞培养箱37℃培养12小时。
(6)药物处理相应时间后，再次吸出各孔培养基。此时，加入含CCK-8的培养基，CCK-8占细胞培养基体积的1/10。
(7)放入细胞培养箱37℃培养1-1.5小时，待颜色变为橙色就可以拿出来检测。注意，这一步应随时观察颜色变化情况，不宜时间过长。
(8)将96孔板取出，放入酶标仪检测，检测波长设为450nm。
结果显示，LGG-OMVs具有抑制MC38细胞和SW620细胞的增殖能力，见图6。
实施例6LGG-OMVs能够抑制结肠癌细胞集落形成
本实施例中使用的LGG-OMVs通过实施例1所述的方法进行制备。
(1)将对数期的贴壁细胞通过胰酶消化，使细胞脱落。待细胞大部分脱落时，加入两倍胰酶体积的含血清培养基终止消化。
(2)将残余细胞吹打下来后液体全部转移至离心管，1000r/min,离心3-5min，弃去离心管上清，用1ml含血清培养基重悬。
(3)取1/3的细胞总数分别传代到3个新的培养皿中，铺匀放入细胞培养箱37℃培养12h，随后取出，在3个培养皿中分别加入100ul的0、8、16mg/ml浓度的外膜囊泡的PBS溶液，继续培养24h。
(4)将3皿细胞消化吹打下来，终止消化后，分别取10ul细胞悬液加入到40ulPBS中，稀释5倍，通过计数板计数。根据计数结果对细胞悬液分别进行稀释，稀释到相同细胞浓度，推荐值2-2.5×103个/ml。
(5)设置空白对照和两个外膜囊泡浓度(100ug/ml、200ug/ml)的实验组，每组三个孔。在6孔板每孔中加100ul步骤(4)中稀释好的细胞悬液，相当于每孔接种200-250个细胞，振荡铺匀，放入37℃细胞培养箱中培养6-8天。
(5)当肉眼可见集落形成时,取出6孔板,弃除培养液,每孔加入2mL甲醇固定20min,弃除甲醇,每孔加入2mL 1％姬撒姆染液染色5min,然后清洗掉染料,拍照计数集落。
结果显示，LGG-OMVs具有抑制MC38的细胞集落形成的能力，见图7。
实施例7LGG-OMVs抑制体内肿瘤生长，促进体内肿瘤细胞凋亡
本实施例中使用的LGG-OMVs通过实施例1所述的方法进行制备。
(1)MC38细胞预处理：将对数期的贴壁细胞通过胰酶消化，使细胞脱落。待细胞大部分脱落时，加入两倍胰酶体积的含血清培养基终止消化。将残余细胞吹打下来后液体全部转移至离心管，1000r/min,离心3-5min，弃去离心管上清，用1ml含血清培养基重悬。取1：3稀释倍数的细胞分别传代到新的培养皿中，铺匀放入细胞培养箱37℃培养12h，随后取出，在空白组和处理组的培养皿中分别加入100ul的0、16mg/ml浓度的外膜囊泡的PBS溶液，共8ml培养液中，继续培养36h。将细胞分组消化吹打下来，终止消化后，分别取10ul细胞悬液加入到40ulPBS中，稀释5倍，通过计数板显微镜计数。
(2)分组与皮下注射：将所有小鼠随机分为两组，每组5只，并将200μL PBS包含：(a)MC38细胞(5×105个/0.2mL)；(b)经外膜囊泡(200μg/mL)预处理36h后的MC38细胞(5×105个/0.2mL)分别皮下注射到两组小鼠中。选择小鼠脱毛后的腋窝中后部进行皮下注射。注射前，将细胞悬液充分混匀，置于冰上。操作时，抓牢小鼠，常规消毒注射部位的皮肤，提起皮肤，针头在皮下进针约1cm，将悬液缓慢注入。此外，为了更好的区分每只小鼠，选择耳号标记法对小鼠进行编号标记。
(3)小鼠一般情况的观察以及定期移植瘤大小的测量：每天密切观察小鼠的状态，包括：毛色、饮食、排便、活动能力以及精神状况等方面。成瘤后，每隔三天用游标卡尺测量移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，按照公式：0.5×最长径(mm)×最短径2(mm2)计算小鼠移植瘤的体积。用每组小鼠移植瘤体积的平均值，绘制移植瘤生长曲线。
(4)小鼠移植瘤的剥离：成瘤31天后，乙醚麻醉小鼠，处死小鼠后，剥离小鼠移植瘤，将剥离后的小鼠移植瘤放置在超净工作台上进行拍照，游标卡尺测量移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，并用电子天平对移植瘤进行称重。
(5)肿瘤组织的固定包埋以及染色扫描：取少许肿瘤组织浸泡在4％的多聚甲醛中固定，随后进行包埋脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min；分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，PBS浸洗3min×3次。随后进行tunnel染色，包括以下步骤：通透：在样本上加1％的Triton-100，室温放置15min；ProteinaseK工作液：每样本90ul 1xPBS加10ul10xProteinaseK,即配即用，37℃反应15～20min；洗涤：PBS浸泡5分钟，清洗3次；Tunel反应：每个样本滴加100ulTdT酶反应液，避光湿润37℃反应1h；洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次；加酶标亲和素：滴加100ul Streptavadin-HRP，避光湿润37℃反应30min；洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次；DAB法显色：每个样本加2滴新鲜配制的DAB溶液；终止显色：显微镜下观察染色深浅，染好立即中止，用自来水轻柔冲洗15min，用蒸馏水终止显色反应；复染：将切片放入苏木素染液，染色10min，用蒸馏水冲洗干净；封片：放入盐酸甲醇溶液中，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；无水乙醇乙醇中浸泡5min。用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，晾干后在样本上加中性树胶，加盖玻片。观察：数字病理切片扫描仪扫片。
结果显示：经LGG-OMVs处理后的癌细胞在体内的生长显著被抑制，凋亡Tunel染色切片扫描结果表明，LGG-OMVs促进了体内移植瘤癌细胞的凋亡，见图8。
实施例8口服LGG-OMVs能够辅助提高免疫检查点抑制剂PD-1的治疗效果
本实施例中使用的LGG-OMVs通过实施例1所述的方法进行制备。
(1)MC38细胞预处理：将对数期的贴壁细胞通过胰酶消化，使细胞脱落。待细胞大部分脱落时，加入两倍胰酶体积的含血清培养基终止消化。将残余细胞吹打下来后液体全部转移至离心管，1000r/min,离心3-5min，弃去离心管上清，用1ml含血清培养基重悬，分别取10ul细胞悬液加入到40ulPBS中，稀释5倍，通过计数板显微镜计数。取足量的细胞，将细胞悬液离心后用PBS重悬，使其浓度为5×106个细胞/ml。
(2)分组与皮下注射：选择小鼠脱毛后的腋窝中后部进行皮下注射。注射前，将细胞悬液充分混匀，置于冰上。操作时，抓牢小鼠，常规消毒注射部位的皮肤，提起皮肤，针头在皮下进针约1cm，将悬液缓慢注入。此外，为了更好的区分每只小鼠，选择耳号标记法对小鼠进行编号标记。
(3)小鼠一般情况的观察、定期移植瘤大小的测量分组以及定期给药：每天密切观察小鼠的状态，包括：毛色、饮食、排便、活动能力以及精神状况等方面。成瘤后，每隔三天用游标卡尺测量移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，按照公式：0.5×最长径(mm)×最短径2(mm2)计算小鼠移植瘤的体积。待肿瘤体积约为100mm3，约为接瘤后的七天后，根据肿瘤体积分组，分成四组(空白组、OMVs给药组、PD-1抑制剂给药组以及OMVs辅助PD-1给药组)，保证分组后每组间的肿瘤体积无明显差异。随后，每天定期灌胃OMVs给药组和辅助给药组，每隔三天腹腔注射150ug/只的PD-1抑制剂单抗。随后，用每组小鼠移植瘤体积的平均值，绘制移植瘤生长曲线。
(4)小鼠移植瘤的剥离：成瘤28天后，乙醚麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠放置在超净工作台上处死小鼠后，剥离小鼠移植瘤，游标卡尺测量移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，并用电子天平对移植瘤进行称重。
结果显示：每日口服LGG-OMVs能够辅助提高免疫检查点抑制剂PD-1的治疗效果，小鼠肿瘤体积和肿瘤质量明显减小，见图9。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取鼠李糖乳杆菌液接种培养，制成种子液；
(2)将培养后的种子液接种至新鲜的含有亚致死浓度青霉素G的MRS培养基中扩大培养；
(3)将步骤(2)培养的菌液低速离心收集上清液；
(4)将收集的上清液再次低速离心去除较大杂质；
(5)取步骤(4)得到的上清液并用滤膜过滤细菌；
(6)将步骤(5)过膜除菌得到的发酵液，再通过超滤离心管超滤和浓缩，以去除较小杂质；
(7)将超滤后的上清液分批移入超高速离心管中，超高速离心后弃上清，收集每次超高速离心后得到的沉淀；
(8)超高速离心上清液后，将收集到的含有所有沉淀的重悬并收集进行二次超高速离心，以去除残余培养基；
(9)将步骤(7)二次超高速离心的沉淀用PBS重悬，并通过Sepharose CL-2B的SEC柱纯化重悬的囊泡，收集1ml级分；
(10)收集步骤(9)所述的级分，得到的即为鼠李糖乳杆菌的外膜囊泡。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌ATCC53103。
3.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，鼠李糖乳杆菌液的培养温度为30～37℃，振荡培养，振荡的转速为150～200rpm。
4.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)、(4)中的低速离心的条件为8000～9000g、4℃离心25～35min。
5.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)、(7)、(8)中的离心的条件为150000～160000g、4℃离心1.5～2小时。
6.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)的青霉素G的浓度为0.2～0.3ug/ml，培养温度为30℃，转速为150～200rpm。
7.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，收集级分过程时，恒流泵的流速控制在10-20rpm，不得超过30rpm。
8.一种外膜囊泡制品，其特征在于，所述制品含有鼠李糖乳杆菌外膜囊泡，所述鼠李糖乳杆菌外膜囊泡由根据权利要求1-7任一所述的方法制备。
9.根据权利要求8所述的外膜囊泡制品，其特征在于，所述外膜囊泡制品包括鼠李糖乳杆菌外膜囊泡和包覆在外膜囊泡外的外壳，外壳的组装方法为：将外膜囊泡溶液中加入1～1.5mM浓度的Ca2+，孵育一段时间，以在酸性环境下，形成沉淀外壳保护囊泡完整性。
10.一种鼠李糖乳杆菌外膜囊泡在制备用于预防、治疗、辅助治疗和或/预后护理肿瘤疾病，和/或，用于肠胃调理的药物、保健品、食品、营养品、医疗装置、日化用品中的应用。
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CN117965402A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 中国农业大学 乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用

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