CN114344338B - 脆弱拟杆菌和/或其两性离子荚膜多糖的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脆弱拟杆菌和/或脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖的新应用，特别涉及脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种在制备防治淋巴瘤的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC No.10685。本发明通过大量实验证明，保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌及其两性离子荚膜多糖，可通过降低淋巴瘤细胞存活水平、抑制淋巴瘤增殖，从而有效地防治淋巴瘤。

Description

脆弱拟杆菌和/或其两性离子荚膜多糖的新应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种脆弱拟杆菌和/或其两性离子荚膜多糖的新应用。
背景技术
淋巴癌是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，亦称恶性淋巴瘤，原发于淋巴结及或淋巴结外淋巴组织，是目前发病率最高的血液系统恶性肿瘤。其病理亚型众多，具有高度异质性，多起源于T、B淋巴细胞、NK细胞和组织细胞等，以B细胞来源者最多见。根据恶性淋巴瘤的细胞特征和组织结构，可分为霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤约占所有淋巴瘤的80％-90％，且其中70％起源于B细胞。
淋巴瘤和其他癌症不同，是免疫力下降后引起的，淋巴细胞很容易变异，引起恶变。随着对淋巴瘤研究的深入认识，人们一直致力于寻找适合的方法来治疗淋巴癌患者，以提高治疗效果，降低致死率及预防并发症。
传统的淋巴瘤治疗以手术切除、化疗、放疗、造血干细胞移植、免疫及靶向治疗等为主。其中，手术切除治疗多用于非常局限的部分体表淋巴瘤，以及恶性淋巴瘤并发胃肠道大出血和穿孔等特殊情况，使用较少；化疗多采用联合化疗，如霍奇金淋巴瘤常用ABVD方案(阿霉素，博来霉素，长春花碱和达卡巴嗪)，非霍奇金淋巴瘤常用CHOP方案(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和强的松)，还可以结合靶向治疗药物如CD20单抗等；放疗多用于淋巴瘤早期，以及化疗后的巩固治疗及移植时的辅助治疗；(自体/异体)造血干细胞移植治疗可以改善部分患者的疗效和预后，尤其是对于恶性程度比较高的或者复发难治的淋巴瘤，常常需要进行自体造血干细胞移植的巩固治疗；免疫及靶向治疗中主要使用CAR-T细胞免疫治疗药物(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)以及单克隆抗体、细胞周期依赖激酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)等。总而言之，淋巴瘤的基础和临床研究进展的非常快，从非特异性杀伤药物到免疫靶向治疗新药，经过了十分漫长的历程并取得了一定的成果。
但是，传统的治疗方法会产生不同程度的毒副作用，尤其是化疗后患者胃肠功能紊乱，肠道菌群失调，免疫力急剧下降导致感染性死亡。因此，寻求新的淋巴瘤治疗方案是迫切需要解决的技术问题。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种脆弱拟杆菌ZY-312和/或其两性离子荚膜多糖的新应用，主要是将脆弱拟杆菌ZY-312和/或其两性离子荚膜多糖用于制备防治淋巴瘤的药物，为淋巴瘤治疗提供新方案。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的一个目的是提供脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种在制备防治淋巴瘤的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCCNo.10685。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌选自脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，以及脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖包含荚膜多糖A。
在其中一些实施例中，所述夹膜多糖A的重均分子量为80kDa-90kDa。优选地，所述夹膜多糖A中，重均分子量分布于70kDa-100kDa的部分占总量的70wt％-80wt％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖中荚膜多糖A的含量超过95wt％。
在其中一些实施例中，所述淋巴瘤为T细胞淋巴瘤。
在其中一些实施例中，所述淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。
在其中一些实施例中，所述淋巴瘤为伯基特淋巴瘤。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取菌泥，加入菌泥质量3倍-10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0-4.5，50-120℃提取0.5h-3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌提取物。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述离心为11000g-13000g离心8min-12min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种。其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述超滤膜的切割分子量为3kDa-100kDa。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述离子交换柱优选为DEAE Sepharose FastFlow的16mm×200mm，层析时的流速15mL/min-25mL/min，pH5.0-9.0含0.2mol/L NaCl20mmol/L Tris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜的切割分子量为10kDa。
在其中一些实施例中，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、散剂、管饲制剂或者灌肠剂。
在其中一些实施例中，所述药物包括人药或兽药。
在其中一些实施例中，所述药物包含所述脆弱拟杆菌和所述脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种，以及药学上可以接受的辅料。
在其中一些实施例中，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂以及等渗或等张调节剂中的一种或者多种。
在其中一些实施例中，所述药物的给药方式包括口服给药、灌肠给药或者肠胃外给药。
在其中一些实施例中，所述药物的给药周期包括间歇性给药、周期性给药、持续性给药或者长期给药。
本发明的另一目的是提供一种用于预治淋巴瘤的药物，其中，所述药物包含脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC No.10685。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖含有荚膜多糖A。
在其中一些实施例中，所述荚膜多糖A的重均分子量为80kDa-90kDa。优选地，所述荚膜多糖A中，重均分子量分布于70kDa100kDa的部分占总量的70wt％-80wt％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3。
在其中一些实施例中，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明通过大量实验证明，保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌及其两性离子荚膜多糖，特别是荚膜多糖A，可通过降低淋巴瘤细胞存活水平、抑制淋巴瘤增殖，有效地防治淋巴癌。
附图说明
图1为本发明实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；
图2为本发明实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图3为本发明实施例2的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的1H谱；
图4为本发明实施例2的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的13C谱；
图5为本发明实施例2的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的COSY谱；
图6为本发明实施例2的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HSQC谱；
图7为本发明实施例2的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HMBC谱；
图8为本发明实施例2制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的结构单元的化学结构式；
图9为本发明实施例5中脆弱拟杆菌及其PSA对YAC-1细胞增殖的影响；
图10为本发明实施例6中裸鼠体重增长曲线；
图11为本发明实施例6中裸鼠弥漫大B细胞淋巴瘤生长曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自ATCC；所有细胞培养材料及胰酶购自Gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，B.fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型(NTBF)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。研究发现非产肠毒型脆弱拟杆菌(NTBF)具有重要的益生作用。脆弱拟杆菌与宿主的关系在很大程度上取决于其高度复杂和动态的荚膜结构，B.fragilis两性离子荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是首个公认的调节宿主免疫系统的发育，逆转无菌动物的形态、细胞和功能缺陷的共生因子。众多研究表明，非产肠毒型脆弱拟杆菌及其两性离子荚膜多糖对防治急慢性肠炎、调节宿主免疫系统的发育等具有较好疗效。
本发明采用的脆弱拟杆菌ZY-312不含BFT基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(Wang Y，Deng H，Li Z，Tan Y，Han Y，Wang X，Du Z，LiuY，Yang R，Bai Y，Bi Y，Zhi F.Safety Evaluation of a Novel Strain of Bacteroidesfragilis.Front Microbiol.2017Mar 17；8:435.)。根据专利ZL201510459408.X和科技文献Xu W，Su P，Zheng L，Fan H，Wang Y，Liu Y，Lin Y，Zhi F.In vivo Imaging of a NovelStrain of Bacteroides fragilis via Metabolic Labeling.Front Microbiol.2018Oct1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
脆弱拟杆菌ZY-312已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌ZY-312(Bacteroides fragilis ZY-312)，保藏编号CGMCC No.10685。脆弱拟杆菌ZY-312由申请人自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号ZL201510459408.X)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
目前，脆弱拟杆菌ZY-312在淋巴瘤防治中尚存在空白。
作为本发明的一个方面，本发明提供脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种在制备防治淋巴瘤的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCCNo.10685。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌选自脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一个示例中，所述两性离子荚膜多糖包含荚膜多糖A。
在其中一个示例中，所述夹膜多糖A的重均分子量为80kDa-90kDa。进一步地，所述荚膜多糖A中分子量分布于70kDa-100kDa的部分占所述荚膜多糖A总量的70wt％-80wt％，优选为大于95wt％。
在其中一个示例中，所述两性离子荚膜多糖的制备步骤包括：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取所述菌泥，加入菌泥质量3倍-10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0-4.5，50℃-120℃提取0.5h-3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到两性离子荚膜多糖。
在其中一个示例中，步骤(1)中，离心的条件包括：11000g-13000g，8min-12min。
在其中一个示例中，步骤(1)中，所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种。其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等。
在其中一个示例中，步骤(2)中，所述超滤膜的切割分子量可以为100KD、50KD、30KD、10KD、5KD、3KD或者任意两个分子量值之间的范围。
在其中一个示例中，步骤(3)中，所述离子交换柱优选为DEAE Sepharose FastFlow的16mm×200mm，层析时的流速15mL/min-25mL/min，pH5.0-9.0含0.2mol/L NaCl20mmol/L Tris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜为10KD。
在其中一个示例中，所述淋巴瘤为T细胞淋巴瘤。
在其中一个示例中，所述淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。
在其中一个示例中，所述淋巴瘤为伯基特淋巴瘤。
在其中一个示例中，所述药物包含所述脆弱拟杆菌和所述脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种，以及药学上可以接受的辅料。
可以理解的是，所述药物可以包含所述脆弱拟杆菌，也可以包含所述脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖，或者同时包含所述脆弱拟杆菌和所述脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖。进一步地，所述药物还可以包含其他的抗淋巴瘤活性成分，例如淋巴瘤化疗药物、其他抗淋巴瘤益生菌。所述淋巴瘤化疗药物例如阿霉素、PD-1抗体等，可以是一种，也可以是多种。所述其他抗淋巴瘤益生菌例如酵母菌属(Saccharomyces spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)及人肠道正常菌群的益生菌或微生物中的一种或多种，可以是一种，也可以是多种。
可以理解的是，所述辅料选自，包括但不限于以下所示辅料种类的一种或者几种：稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂。所述稀释剂可以选自，包括但不限于：淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐类。所述润湿剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇。所述黏合剂可以选自，包括但不限于：淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇。所述崩解剂可以选自，包括但不限于：淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂。所述润滑剂可以选自，包括但不限于：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇。所述色香味调节剂可以选自，包括但不限于：色素、香料、甜味剂、胶浆剂、矫臭剂。所述溶剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油、乙酸乙酯。所述增溶剂可以选自，包括但不限于：吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物。所述助溶剂可以选自，包括但不限于：有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油。所述乳化剂可以选自，包括但不限于：司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅、皂土。所述助悬剂可以选自，包括但不限于：甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇、触变胶。所述抗氧剂可以选自，包括但不限于：亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸、酯类。所述金属络合剂可以选自，包括但不限于：乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物。所述惰性气体可以选自，包括但不限于：氮气、二氧化碳。所述防腐剂可以选自，包括但不限于：尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油。所述局部止痛剂可以选自，包括但不限于：苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因、普鲁卡因。所述pH调节剂可以选自，包括但不限于：盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐。所述等渗或等张调节剂可以选自，包括但不限于：葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇。
可以理解的是，所述药物可以根据临床的需求，制备成合适的剂型，剂型可以选自，包括但不限于：丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂、口服液、管饲制剂或者灌肠剂。
可以理解的是，所述药物可以根据临床的需求，采用合适的给药途径进行给药，给药途径可以选自，包括但不限于：口服给药、灌肠给药或者肠胃外给药。
可以理解的是，所述药物可以根据临床的需求，采用合适的给药周期进行给药，给药的周期可以选自，包括但不限于：间歇性给药、周期性给药、持续性给药或者长期给药。
可以理解的是，所述药物可以是人药，也可以是兽药。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种用于预治淋巴瘤的药物，其中，所述药物包含脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC No.10685。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖含有荚膜多糖A。
在其中一些实施例中，所述荚膜多糖A的重均分子量为80kDa-90kDa。优选地，所述荚膜多糖A中，重均分子量分布于70kDa-100kDa的部分占总量的70wt％-80wt％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3。
在其中一些实施例中，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％。
实施例1：脆弱拟杆菌的发酵培养
将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行37℃，发酵培养8h，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。
取上述菌液，常规热灭活处理，得脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌液。
实施例2：脆弱拟杆菌荚膜多糖的制备
采用实施例1制备的菌泥进行实验。
(1)取50g菌泥，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/L盐酸溶液调节其pH至3.5，100℃提取1.5h，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经10kDa超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)转盐；DEAE SepharoseFast Flow离子交换柱层析(16mm×200mm)，流速20mL/min，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10kDa超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌提取物；
(4)称量30mg步骤(3)所述的脆弱拟杆菌提取物，溶于0.5mL D2O，加入1μl丙酮(1H，2.22；13C，30.89)定标。采用500MHz Bruker核磁共振波谱仪分析1H、13C、COSY、HSQC、HMBC谱(参见附图3、图4、图5、图6、图7)，确证步骤(3)收集的脆弱拟杆菌提取物为荚膜多糖A，结合脂质含量低于0.02％，蛋白残留低于1％，核酸残留低于0.05％。通过GPC(凝胶渗透色谱)分析，制得的荚膜多糖A重均分子量为80kDa-90kDa，Mw/Mn为1.0-1.2，化学结构参见附图8。
实施例3：脆弱拟杆菌及其PSA在体外抑制OCI-LY8细胞增殖的影响实验
本实施例通过实施例1和实施例2制备的脆弱拟杆菌ZY-312(低、中、高剂量)及ZY-312灭活菌(高剂量)和PSA对人弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)系OCI-LY8细胞进行孵育，分别在24h和48h采用MTT法检测细胞增殖活力。
1、OCI-LY8细胞的复苏和传代
从液氮罐中将冻存有OCI-LY8细胞的冻存管取出，迅速置于37℃水浴箱中并轻轻晃动使其融化。将融化后的细胞混合液移入到含有4ml混合培养基(80％IMDM+20％胎牛血清+1％青链霉素)的15ml离心管中，移液枪来回轻轻吸打后，于1200rpm/min，常温离心3min。弃上清后加入1ml混合培养基重悬细胞沉淀并将重悬液转移至含5ml混合培养基的培养瓶中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。次日观察细胞复苏后的生长状态并换液。
每天观察细胞生长状况，根据细胞密度及培养液情况决定是否传代及换液。由于OCI-LY8细胞为悬浮生长细胞，换液时需将培养瓶中培养液混匀吸出后置于15ml离心管中进行1200rmp，离心3min，然后小心倒掉上清液，加入新的培养基并混匀，接种到新的培养瓶中继续培养。若细胞数目多时需传代，则直接将混匀的细胞悬液分接种到两个新的培养瓶中继续培养。
2、脆弱拟杆菌及其PSA对OCI-LY8细胞增殖的影响
(1)将100μl的OCI-LY8细胞液(1×105Cells/ml)分别接种于96孔板中，分别加入20μl不同剂量的ZY-312菌液(1×106CFU/ml、1×108CFU/ml、1×1010CFU/ml，加入96孔板中的终浓度)、ZY-312灭活菌液(1×1010Cells/ml，加入96孔板中的终浓度)和PSA(300μg/ml，加入96孔板中的终浓度)，轻轻晃匀后于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养。
(2)MTT方法检测细胞增殖效率
使用MTT细胞增殖检测试剂盒(生工，货号：E606334；编号：E606334-0250)分别在24h、48h检测各组各复孔吸光度值，具体步骤如下：
a)根据说明书配制MTT溶液，每孔加入10μl MTT，37℃温度，5％CO2培养箱孵育4h；
b)小心吸取96孔板中的培养基，每孔中加入100μl Foemazan SolubilizationSolution，轻轻震荡，直至在光学显微镜下发现甲瓒全部溶解；
c)使用酶标仪在570nm处测定各孔吸光度值；
d)数据分析：通过细胞存活率考察各组细胞增殖活力，存活率越高，细胞活力越强。
细胞存活率具体计算公式如下：
其中，
As：表示实验孔，含有细胞和待测物质。
Asb：表示实验空白孔，不含细胞，含有待测物质。
Ac：表示对照孔，含有细胞，不含待测物质。
Acb：表示对照空白孔，不含细胞和待测物质。
3、实验结果
表1、OCI-LY8细胞活力(％)(均值±标准差，n＝6)
注：*表示与对照组比较，具有显著性差异(P<0.05)。
如表1所示，ZY-312活菌液(中、高剂量)、灭活菌液(高剂量)及其PSA实验组细胞存活率均显著低于对照组(P<0.05)，且存在一定的剂量关系。表明ZY-312活菌液、灭活菌液及其PSA对人弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)系OCI-LY8细胞增殖具有一定的抑制作用。
实施例4：脆弱拟杆菌及其PSA在体外抑制Cyc-Tag细胞增殖的影响实验
本实施例通过实施例1和实施例2制备的脆弱拟杆菌ZY-312(低、中、高剂量)及ZY-312灭活菌(高剂量)和PSA以及阿霉素(多柔比星)对小鼠T淋巴细胞瘤系Cyc-Tag(S49)细胞进行孵育，分别在24h和48h采用CCK-8法检测细胞增殖活力。
1、Cyc-Tag细胞的复苏和传代
从液氮罐中将冻存有Cyc-Tag细胞的冻存管取出，迅速置于37℃水浴箱中并轻轻晃动使其融化。将融化后的细胞混合液移入到含有4ml完全培养基(90％DMEM+10％胎牛血清+1％青链霉素)15ml离心管中，移液枪来回轻轻吸打后，于1200rpm/min，常温离心3min。弃上清后加入1ml完全培养基重悬细胞沉淀并将重悬液转移至含5ml完全培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。次日观察细胞复苏后的生长状态并换液。
细胞传代：如果细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养。
a)弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞2次。
b)加1ml消化液(0.25％Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化2分钟后，取出并迅速加入适量(4ml-8ml)完全培养基终止消化。
c)轻轻吹打，将贴壁的细胞吹落呈悬浮状态，细胞液全部转移至15ml离心管中，1200rmp，离心3min，然后小心倒掉上清液，加入完全培养基重悬混匀细胞沉淀，按1:(3-6)接种到新的培养瓶中继续培养。
2、脆弱拟杆菌及其PSA对Cyc-Tag细胞增殖的影响
(1)将100μl的Cyc-Tag细胞液(1×105Cells/ml)分别接种于96孔板中，分别加入20μl不同剂量的ZY-312菌液(1×106CFU/ml、1×108CFU/ml、1×1010CFU/ml，，加入96孔板中的终浓度)、ZY-312灭活菌液(1×1010Cells/ml，加入96孔板中的终浓度)和PSA(300μg/ml，加入96孔板中的终浓度)以及多柔比星(3μM)，轻轻晃匀后于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养。
(2)CCK-8法检测细胞增殖活力
使用CCK-8细胞增殖检测试剂盒(Dojindo，货号：CK04；批号：SD785)分别在24h、48h检测各组各复孔吸光度值，具体步骤如下：
a)按CCK-8与完全培养基1：10配制10％CCK-8溶液，每孔加入100μl，37℃温度，5％CO2培养箱孵育2h；
b)使用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度值；
c)数据分析：通过细胞存活率考察各组细胞增殖活力，存活率越高，细胞活力越强。细胞存活率具体计算公式如下：
As：表示实验孔，含有细胞和待测物质。
Asb：表示实验空白孔，不含细胞，含有待测物质。
Ac：表示对照孔，含有细胞，不含待测物质。
Acb：表示对照空白孔，不含细胞和待测物质。
3、实验结果
表2、Cyc-Tag细胞活力(％)(均值±标准差，n＝6)
组别 24h 48h
对照组 100.0±1.4 100.0±3.4
阳性组(多柔比星) 40.97±1.03*** 32.91±1.28***
ZY-312活菌液低剂量组 102.41±0.54 98.03±1.33
ZY-312活菌液中剂量组 87.1±1.4* 84.9±0.93*
ZY-312活菌液高剂量组 83.1±0.53* 78.9±3.1*
ZY-312灭活菌液高剂量组 70.72±2.09* 67.94±1.56*
PSA组 65.94±0.73* 62.58±1.69*
注：*表示与对照组比较，具有显著性差异(P<0.05)。
如表2所示，ZY-312活菌液(中、高剂量)、灭活菌液(高剂量)及其PSA实验组细胞存活率均显著低于对照组(P<0.05)，且存在一定的剂量关系。表明ZY-312活菌液、灭活菌液及其PSA对小鼠T淋巴细胞瘤系Cyc-Tag细胞增殖具有一定的抑制作用。
实施例5：脆弱拟杆菌及其PSA在体外抑制YAC-1细胞增殖的影响实验
本实施例通过实施例1和实施例2制备的脆弱拟杆菌ZY-312(低、中、高剂量)及ZY-312灭活菌(高剂量)和PSA以及阿霉素对小鼠淋巴瘤细胞YAC-1进行孵育，分别在24h和48h采用CCK-8法检测细胞增殖活力。
1、YAC-1细胞培养
同实施例3，YAC-1细胞为悬浮细胞，使用RPMl-l640完全培养基(90％RPMl-l640+10％胎牛血清+1％青链霉素)于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞长至约6×105～8×105个/ml(培养约48h)，此时细胞活性最好，可以用于实验。
2、脆弱拟杆菌及其PSA对YAC-1细胞增殖的影响
(1)将100μl的YAC-1细胞液(2×105Cells/ml)分别接种于96孔板中，分别加入20μl不同剂量的ZY-312菌液(1×106CFU/ml、1×108CFU/ml、1×1010CFU/ml，加入96孔板中的终浓度)、ZY-312灭活菌液(1×1010Cells/ml，加入96孔板中的终浓度)和PSA(300μg/ml，加入96孔板中的终浓度)以及阿霉素(3μM，加入96孔板中的终浓度)，轻轻晃匀后于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养。
(2)CCK-8法检测细胞增殖活力
同实施例4。
3、实验结果
如图9所示，图9中，与对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。根据图9可知，细胞存活率阳性组(阿霉素)极显著低于对照组(P<0.001)，ZY-312活菌液(中、高剂量)、灭活菌液(高剂量)及其PSA实验组均显著低于对照组(P<0.05)，且存在一定的剂量关系。表明ZY-312活菌液、灭活菌液及其PSA对小鼠淋巴瘤的增殖具有一定的抑制作用。
实施例6：脆弱拟杆菌及其PSA对裸鼠移植弥漫大B细胞淋巴瘤的药效试验
一、试验设计及流程
(1)OCI-LY8细胞培养与传代同实施例4。
(2)裸鼠预处理
将环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)用生理盐水配制成100mg/ml的母液(现配现用)，所有裸鼠(雌性，4周龄-6周龄)在SPF级环境适应性喂养一周后，按75mg/kg腹腔注射100mg/ml CTX，连续2天，停3天。经过上述预处理抑制裸鼠免疫力或使其免疫力达到最低状态。
(3)建立DLBCL淋巴瘤裸鼠肿瘤模型
在CTX给药后的第6天进行皮下荷瘤接种：无菌条件下收集对数生长期的OCI-LY8细胞，1200rmp/min，室温离心3min，用无血清培养基IMDM重悬细胞，进行细胞计数并调整细胞密度。碘伏消毒裸鼠皮肤，将细胞(2×107个/ml、0.2ml)皮下注射于裸鼠前肢近腋窝处。在注射后立刻用镊子夹闭针孔，避免漏液，之后再次碘伏消毒局部皮肤。隔日观察接种部位有无肿瘤形成及注射点有无红肿、破溃现象，并记录裸鼠体重及瘤块体积大小。
(4)实验分组及给药
待实性包块长出后(成瘤标准：肿瘤平均体积达到60mm3-80mm3)，将70只荷瘤鼠根据瘤体积随机分为：对照组，ZY-312活菌液低(1×106CFU/只)、中(1×108CFU/只)、高剂量组(1×1010CFU/只)，ZY-312灭活菌液高剂量组(1×1010Cells/只)和PSA组(3mg/kg)，每组10只。给药固定体积300μL/只，具体实验分组与给药方案如下表3所示。
表3、实验动物分组及给药方案
(5)肿瘤测量和实验指标
密切观察荷瘤鼠的一般情况，如活动、饮食，有无体重减轻及死亡等情况。每两天记录一次裸鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤长径(a)及与长径垂直的短径(b)，计算肿瘤体积：V＝0.5a×b2，并绘制肿瘤生长曲线。
二、试验结果
(1)体重
结果如图10所示，图10中，数据点代表组内平均体重，误差线代表标准误。根据图10可知，各组小鼠体重均呈缓慢上升态势，且PSA组、ZY-312活菌液高剂量、ZY-312灭活菌液高剂量组显著高于对照组，说明脆弱拟杆菌ZY-312及其PSA能够遏制淋巴瘤导致的体重下降，且效果明显。
(2)肿瘤生长曲线
结果如图11所示，图11中，数据点代表组内平均体积，误差线代表标准误。根据图11可知，与对照组比较，给药脆弱拟杆菌ZY-312及其PSA的各组小鼠肿瘤体积增长趋势均得到明显抑制，且起效剂量为1×108CFU/只，说明本发明提供的脆弱拟杆菌ZY-312及其PSA可有效遏制淋巴瘤的增殖。
实施例7：脆弱拟杆菌及其PSA对裸鼠移植伯基特淋巴瘤的药效试验
一、试验设计及流程
(1)Raji细胞培养与传代。
伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)细胞株Raji细胞完全培养液配制：90％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青链霉。细胞培养与传代同实施例3。
(2)裸鼠预处理
同实施例6。
(3)建立BL淋巴瘤裸鼠肿瘤模型
在CTX给药后的第6天进行皮下荷瘤接种：无菌条件下收集对数生长期的Raji细胞，1200rmp/min，室温离心3min，用无血清培养基RPMI-1640重悬细胞，进行细胞计数并调整细胞密度。碘伏消毒裸鼠皮肤，将细胞(2×107个/ml、0.2ml)皮下注射于每只小鼠的右后背处。在注射后立刻用镊子夹闭针孔，避免漏液，之后再次碘伏消毒局部皮肤。
(4)实验分组及给药
同实施例6。具体分组如表4：
表4、实验动物分组及给药方案
(6)肿瘤测量和实验指标
肿瘤药效指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每两天由同一实验人员用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即第0天)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV，TRTV与CRTV取同一天数据)。
二、试验结果
表5、ZY-312及其PSA对Raji模型的抑瘤药效评价(基于给药后第9天肿瘤体积计算得出)
注：a.平均值±SEM；b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算；**表示与对照组比较，P<0.01，***表示P<0.001。
表6、ZY-312及其PSA对Raji模型的抑瘤药效评价(基于给药后第14天肿瘤体积计算得出)
注：a.平均值±SEM；b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算；**表示与对照组比较，P<0.01，***表示P<0.001。
从表5和表6看出，与对照组比较，各实验组均具有抑制淋巴瘤增殖的作用(P<0.01)。其中，阳性组、ZY-312活菌液低、中、高剂量组、ZY-312灭活菌液高剂量组和PSA组肿瘤生长抑制率(TGI)在第9天时分别为97％、32％、61％、86％、81％、86％，第14天时分别为86％、30％、42％、43％、41％、43％，表明ZY-312活菌液、灭活菌液及其PSA在淋巴瘤中期抑瘤效果最好。
综上所述，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312及其两性离子荚膜多糖，尤其是荚膜多糖A(PSA)，在体外能够显著抑制淋巴瘤细胞Cyc-Tag、OCI-LY8和YAC-1的存活率，在体内可通过抑制弥漫大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤的肿瘤生长，改善淋巴瘤导致的体重下降，显著抑制小鼠体内淋巴移植瘤的增殖。不仅能够单独用于癌症治疗，还可以与手术、放疗、化疗等治疗手段联合应用，显著提高综合疗效，减轻放疗、化疗对机体的伤害，有效预防淋巴癌的发生发展及其复发转移，提高患者的生活质量。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种在制备防治淋巴瘤的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC No.10685；
所述两性离子荚膜多糖包含荚膜多糖A；
所述荚膜多糖A的重均分子量为80kDa-90kDa，重均分子量/数均分子量的比值为1.0-1.3；
所述荚膜多糖A中，结合脂质含量低于0.02％，蛋白残留低于1％，核酸残留低于0.05％；
所述淋巴瘤包括T细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌选自脆弱拟杆菌活菌体以及灭活的脆弱拟杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述脆弱拟杆菌和所述脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖中的一种或多种，以及药学上可以接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂以及等渗或等张调节剂中的一种或者多种。
5.根据权利要求1、2和4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂、口服液、管饲制剂或者灌肠剂。
6.根据权利要求1、2和4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括口服给药、灌肠给药或者肠胃外给药。
7.根据权利要求1、2和4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药周期包括间歇性给药、周期性给药、持续性给药或者长期给药。
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