CN116172997B - 苯基乳酸在抑制幽门螺杆菌感染中的应用 - Google Patents
苯基乳酸在抑制幽门螺杆菌感染中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,本发明公开了苯基乳酸在制备抑制幽门螺杆菌感染药物中的应用,苯基乳酸抑制抗生素耐药性幽门螺杆菌感染,特别是苯基乳酸能抑制对甲硝唑不敏感的幽门螺杆菌的生长。
Description
技术领域
本发明涉及苯基乳酸在抑制幽门螺杆菌感染引发胃黏膜炎症和改善胃部微生态中的应用,属于微生物技术领域。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种可以在人胃黏膜上皮细胞定植的革兰氏阴性菌,感染后将够引起胃炎、消化性溃疡等疾病,也是诱发胃癌的潜在因素,被国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物。
随着H.pylori感染率的逐渐升高,二次感染的机率也逐年上升。目前最标准也是最常用的治疗H.pylori感染的方法是克拉霉素和阿莫西林联合使用质子泵抑制剂(PPI)的“三联”疗法(Triple Therapy)。近年来数据统计显示,部分的H.pylori对克拉霉素和甲硝唑的耐药率高达是94.1%和67.6%,标准三联疗法对H.pylori的根除率已小于80%,另外由于抗生素的广泛使用患者常常会出现严重的不良反应(如腹痛、恶心、腹泻等)。因此,寻找一种安全、无副作用的方案来缓解H.pylori感染显得尤为重要。
苯基乳酸(Phenyl lactic acid,PLA)是一类由乳酸菌代谢产生的新型天然小分子有机酸,因其稳定性、安全性和良好的溶解性等优点,在食品领域、医药领域、化妆品行业广受亲睐。但苯基乳酸对H pylori是否有抑制作用尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供苯基乳酸(Phenyl lactic acid,PLA)用于抑制抗生素耐药性幽门螺杆菌感染。
为解决上述技术问题,本发明提供苯基乳酸在制备抑制幽门螺杆菌感染药物中的应用。
作为本发明应用的改进:苯基乳酸抑制抗生素耐药性幽门螺杆菌感染。
作为本发明应用的进一步改进:苯基乳酸能抑制对甲硝唑不敏感(对甲硝唑有耐性性)的幽门螺杆菌的生长。
作为本发明应用的进一步改进,苯基乳酸具有如下至少任一的性能:
苯基乳酸能抑制H.pylori生长;
苯基乳酸缓解H.pylori感染引发胃黏膜炎症;
苯基乳酸抑制H.pylori尿素酶活性;
苯基乳酸对于H.pylori的菌体具有破坏性。
H.pylori例如为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori ZJC03)。
目前现有技术对苯基乳酸对H pylori的体外抑制作用,以及对H pylori感染引起的胃部炎症和胃部菌群调节作用还未见报道。
而本发明证明苯基乳酸对H.pylori具有显著抑制特性;苯基乳酸对H.pylori的最小抑菌浓度(MIC)范围为2.5mg/mL;苯基乳酸抑制H.pylori尿素酶活性;苯基乳酸对于H.pylori的菌体具有破坏性。
本发明的应用包括苯基乳酸修复H.pylori感染导致的胃黏膜损伤、减轻H.pylori感染导致的胃黏膜炎症和改善胃部菌群失调。所述胃黏膜损伤由胃粘膜H&E病理染色观察及组织损伤评价;所述胃黏膜炎症的病理程度与炎症因子的表达量相关,包括炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10。
本发明中苯基乳酸对胃微生态的影响包括降低因H.pylori感染引起变形菌门(Proteobacteria)的增加、降低Helicobacter的比例、显著性提高胃中乳酸菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和普氏菌(Prevotella)的含量。
苯基乳酸的使用方式为口服,建议用量约为2.5~3.5mg/人·天。
与现有技术相比,本发明具有如下优势:
1.本发明在体外实验证明了苯基乳酸对H.pylori的生长有抑制作用,且根据实验推测出苯基乳酸的抑菌作用是通过破坏细菌的壁膜,抑制H.pylori脲酶的活性。
2.在小鼠实验中,苯基乳酸可缓解因H.pylori感染所致的胃黏膜损伤,并下调促炎因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达量,上调抑炎因子IL-10的表达量。
3.基乳酸的治疗作用提高了小鼠胃粘膜中益生菌的丰度,降低了致病菌的丰度,对治疗H.pylori感染后对胃微生态菌群的恢复具有良好的效果。
综上所述,本发明通过体外和体内试验研究明确了苯基乳酸抑制H.pylori感染引起胃炎的新用途,具有应用于药物开饭的潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是苯基乳酸亚抑菌浓度对H.pylori生长曲线的影响示意图。
图2是不同浓度的苯基乳酸对H.pylori脲酶活性抑制率示意图。
图3是苯基乳酸处理H.pylori前后的扫描电镜示意图:
图3中:
A为未经处理的H.pylori扫描电镜示意图(×15000);
B为未经处理的H.pylori扫描电镜示意图(×30000);
C为经MIC浓度的苯基乳酸处理后的H.pylori扫描电镜示意图(×15000);
D为经MIC浓度的苯基乳酸处理后的H.pylori扫描电镜示意图(×30000)。
图4是苯基乳酸处理H.pylori前后的透射电镜示意图;
图4中:
A为未经处理的H.pylori透射电镜示意图(×15000);
B为未经处理的H.pylori透射电镜示意图(×30000);
C为经MIC浓度的苯基乳酸处理后的H.pylori透射电镜示意图(×15000);
D为经MIC浓度的苯基乳酸处理后的H.pylori透射电镜示意图(×30000)。
图5是苯基乳酸处理H.pylori前后的负染色透射电镜示意图;
图5中:
A为未经处理的H.pylori负染色透射电镜示意图(×20000);
B为未经处理的H.pylori负染色透射电镜示意图(×20000);
C为经MIC苯基乳酸处理后的H.pylori负染色透射电镜示意图(×20000);
D为经MIC苯基乳酸处理后的H.pylori负染色透射电镜示意图(×20000)。
图6是动物实验小鼠处理时间示意图。
图7为各组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
图7中:
A为未经处理的正常对照组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
B为未经处理的正常对照组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
C为H.pylori感染组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
D为H.pylori感染组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
E为苯基乳酸治疗组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
F为苯基乳酸治疗组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
G为抗生素治疗组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图;
H为抗生素治疗组小鼠胃黏膜组织HE病理染色示意图。
图8为小鼠胃黏膜组织RT-qPCR检测示意图;
图8中:
A为小鼠胃黏膜组织IL-1β的RT-qPCR检测示意图;
B为小鼠胃黏膜组织IFN-γ的RT-qPCR检测示意图;
C为小鼠胃黏膜组织IL-6的RT-qPCR检测示意图;
D为小鼠胃黏膜组织IL-10的RT-qPCR检测示意图。
图9为小鼠胃部菌群“门”水平上和“属”水平上的分布情况分析示意图;
图9中:
A为小鼠胃部菌群“门”水平上的分布情况分析示意图;
B为小鼠胃部菌群“属”水平上的分布情况分析示意图。
图10为小鼠胃部菌群Beta多样性分析示意图。
图11为各组小鼠胃部菌群物种显著性差异分析聚类树图和LDA分值分析示意图;
图11中:
A为各组小鼠胃部菌群物种显著性差异分析聚类树图示意图;
B为胃部菌群物种显著性差异分析LDA分值分析示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中涉及的常规的培养基和试剂如下:
哥伦比亚血琼脂基础(CBA)培养基:称取5.2g哥伦比亚培养基(青岛海博生物技术有限公司)于100mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,冷却至44℃~55℃后,添加7mL无菌绵羊血(上海源叶生物科技有限公司)和1mL幽门螺杆菌添加剂(青岛海博生物技术有限公司),待其凝固之后,备用。
改良布氏肉汤培养基(Brucella Broth培养基):称取28.6g布氏肉汤培养基(青岛海博生物技术有限公司),加热溶解于1L超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
尿素酶培养基:0.1g酵母粉,9.1g磷酸二氢钾,9.5g磷酸氢二钠,20.0g尿素,0.01g酚红,调PH为6.5,超纯水定容至1L容量瓶中。
三联疗法抗生素的配制:按照说明书将抗生素换算成小鼠使用的剂量进行配制。取2.1g克拉霉素、82.5mg奥美拉唑、12.5g阿莫西林溶于1L超纯水中,充分混匀后,置于4℃环境下保存,备用。
下述实施例中涉及的幽门螺杆菌菌体的制备方法如下:
将冻存的H.pylori ZJC03室温解冻后在配置好的CBA培养基上涂布接种,随后放入培养盒(内置含有微需氧产气包,三菱瓦斯化学株式会社)中,37℃培养48h~72h进行复苏,经两代活化之后,将菌体用改良Brucella Broth培养基轻轻冲下制成108CFU/mL菌悬液。
H.pylori为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori ZJC03),其保藏信息具体如下:保藏名称:幽门螺杆菌ZJC03 Helicobacter pylori ZJC03,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学,保藏编号:CCTCC NO:M 20211218,保藏时间2021年09月26日。此菌株在专利CN112080444A《用于防治幽门螺杆菌引发的胃炎的乳酸菌及其应用》中也有告知。
实施例1:H.pylori ZJC03药敏实验
通过E-text测试纸检测H.pylori ZJC03敏感性。结果显示临床菌株H.pyloriZJC03对克拉霉素、阿莫西林和四环素的敏感性分别为0.8μg/mL、0.016μg/mL和0.023μg/mL,对甲硝唑不敏感。
表1、H.pylori ZJC03对抗生素的敏感性
实施例2:纸片扩散法抑菌实验
不同浓度苯基乳酸的制备:将苯基乳酸二倍稀释至40mg/mL,20mg/mL,10mg/mL,5mg/mL,2.5mg/mL,1.25mg/mL。稀释所用溶剂为超纯水。
药敏纸片的制备:滤纸打成直径为6mm的圆形纸片,高压灭菌15min烘干。将每张圆形滤纸片完全浸泡在含有不同浓度的苯基乳酸溶液中,以超纯水作为空白对照,得到含量不同浓度的药敏纸片。
涂布与培养:将108CFU/mL的H.pylori菌液100μL均匀涂于CBA培养基上,干燥后,用镊子将不同浓度苯基乳酸的药敏纸片贴于平板上,每个浓度纸片共重复3次。随后将平板放置于培养盒(内置含有微需氧产气包)中37℃静置培养72h,测量抑制圈(mm)的大小,记录测量结果。
通过测定抑菌圈直径大小来评价苯基乳酸对菌株H.pylori ZJC03的抑菌效果,其中40mg/mL的苯基乳酸浓度组对H.pylori具有较强的抑菌作用,抑菌圈直径>15mm;5mg/mL浓度组和2.5mg/mL浓度组抑菌圈直径>6mm;1.25mg/mL浓度组和溶媒对照组均无抑菌圈。
表2、不同浓度的苯基乳酸对H.pylori生长的影响
注:滤纸片直径大小为6mm。
实施例3:最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用琼脂稀释法:将灭菌后的哥伦比亚血琼脂培养基与不同浓度梯度的苯基乳酸溶液混匀(使苯基乳酸的终浓度分别为40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL,1.25mg/mL),涂布100μL 108CFU·mL-1的H.pylori菌悬液,置于37℃微需氧环境中培养48h,观察H.pylori生长情况,以培养基中完全没有菌生长的苯基乳酸最低浓度为MIC值。
测定结果显示,当培养基中苯基乳酸浓度高于2.5mg/mL时,CBA培养基表面光滑,无H.pylori菌体出现,当培养基中苯基乳酸浓度低于2.5mg/mL时,肉眼可见的观察到CBA培养基上有H.pylori菌体出现。
实施例4:亚抑菌浓度苯基乳酸对H.pylori生长曲线的影响
根据对抑菌能力的测定,进行苯基乳酸对生长曲线的影响的分析。将过夜培养的H.pylori菌悬液接入已灭菌的改良Brucella Broth培养基中。调整浓度,使其细菌的初始接种量为1×108CFU/mL。添加终浓度为1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC浓度的苯基乳酸,对照组(control)不加药品。混合液置于37℃,微需氧环境中培养120h,每隔12h测定其OD560的值,观察并记录在亚抑菌浓度下生长曲线的变化情况。
实验结果如图1所示,随着H.pylori生长时间的增长,H.pylori在不同亚抑菌浓度的苯基乳酸作用下的细菌吸光度均有不同程度的增加。随着时间的增长,吸光度值均随着苯基乳酸浓度的增大而降低,即细菌数量越来越少。且与对照组相比,不同亚抑菌浓度的苯基乳酸作用后H.pylori的生长均受到不同程度的抑制。在不同时间内,吸光度值均随加药浓度的增大而降低,即细菌数量减少。当在12h和24h时,这种差别并不明显,当时间达到48h、72h、96h以及120h时,苯基乳酸浓度在1/2MIC和MIC时,苯基乳酸表现出强烈的杀菌效果,H.pylori的生长受到明显的抑制。当浓度降到1/4MIC时,苯基乳酸表现出一定的杀菌效果,1/8MIC时基本不抑制H.pylori的生长。
实施例5:苯基乳酸抑制H.pylori脲酶活性的测定
采用苯酚红法测定苯基乳酸抑制H.pylori的脲酶活性,将H.pylori进行活化和培养,Brucella Broth培养基清洗2次,调节H.pylori的浓度为1×108CFU/mL。共将50μLH.pylori培养液和50μL的1/4MIC,1/2MIC,MIC,2MIC浓度的苯基乳酸依次加入到96孔微量滴定板中。然后,将100μL混合物加入100μL尿素酶培养基混合均匀后,共培养48h观察其颜色变化,并用分光光度计测定在560nm处的吸光度,空白组是仅用尿素酶培养基测定的结果;对照组是用超纯水代替苯基乳酸溶液测定的结果。抑制率的计算公式如下:
其中,Au为H.pylori ZJC03的脲酶活性。
研究表明当H.pylori进入胃粘膜层受到酸冲击(pH<3)后能否存活取决于H.pylori蛋白脲酶的活性,该酶可将人体内的尿素转化成氨气和碳酸氢盐,中和胃酸,从而促进H.pylori的生长定植。此外,H.pylori产生的脲酶还会参与氮代谢过程,影响宿主细胞的生长过程,包括细胞裂解。本发明的研究表明苯基乳酸可以通过抑制H.pylori脲酶活性来抑制H.pylori的生长。如图2所示,在不同浓度的苯基乳酸处理下,其脲酶活性随浓度的增加而降低。苯基乳酸与H.pylori共培养48h后,浓度为MIC苯基乳酸的抑制率为43.01%±2.11%,2MIC浓度的苯基乳酸的抑制率为80.13%±1.18%,0.25MIC和0.5MIC的苯基乳酸对脲酶活性没有显著的抑制作用。可以分析到,MIC是苯基乳酸抑制H.pylori脲酶活性的临界浓度。
实施例6:超微结构的影响
(1)扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)观察
将活化后的菌株H.pylori ZJC03用涂布棒轻轻刮取至5mL Brucella Broth培养基中,调OD600=0.5±0.05。将配置好的苯基乳酸溶液加入到H.pylori ZJC03菌液中,使其终浓度为MIC,以未经处理的临床菌株H.pylori ZJC03作为对照,静置培养4h。经过常规的固定、漂洗、双固定、脱水、干燥、粘样、镀膜后观察样品。
实验结果如图3的A、B所示为H.pylori未经苯基乳酸处理的菌体细胞形态结构的SEM图。H.pylori未经苯基乳酸处理时,H.pylori菌体细胞形态完好,颜色清亮,细胞之间形态结构清晰完整,菌体与菌体之间界限分明,均呈略带弯曲的杆状或短弧状。如图3的C、D所示,当用MIC浓度的苯基乳酸处理后,H.pylori菌体细胞表面出现褶皱状的凸起,表面粗糙,菌体形态有的发生严重扭曲变形,部分杆状细胞变为球形,内部物质流出,大部分菌体细胞出现崩解现象,且中心区域不完整或消失,甚至表现为凝絮状或呈豆腐渣状。这些结果表明,苯基乳酸能够破坏细菌的被膜系统,导致细菌细胞形态改变、胞质外流,最终死亡。
(2)透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察
H.pylori的准备和苯基乳酸的加样如上述SEM的方法操作。
随后经过常规的琼脂包埋、漂洗、固定、清洗、脱水、渗透、再包埋、切片、染色后在透射电镜Hitachi H-7650中观察样品。
图4的A、B为H.pylori未经苯基乳酸处理时的细胞内部结构。H.pylori菌体细胞壁和细胞膜结构完整,电子云密度均匀,核区层次分明,菌体大部分呈弯曲螺杆状,少部分呈球状。如图4的C、D所示,H.pylori当用MIC浓度的苯基乳酸处理后,菌体形态出现明显的变化,H.pylori形态大部分呈球状、杆状或U型状,菌体表面凹凸不平,细胞壁与细胞膜分离,可见细胞壁和细胞膜多处出现变薄、凹陷等现象、细胞质分布不均匀或浓缩聚集成团状,胞质电子密度降低,胞内中心类核区缺失严重,周围有内容物流出,部分细胞已经破碎、裂解且不能成形。结合图3、图4的SEM和TEM中结果,说明苯基乳酸可通过影响H.pylori细胞形态和结构,使细胞膜表面及其内部发生一定程度的破损,以达到抑制H.pylori的作用。
(3)透射电镜负染色
将H.pylori活化,在干净的玻片上滴几滴浓度为MIC的无菌苯基乳酸液体,用牙签将哥伦比亚血琼脂上的H.pylori轻轻刮下一点,蘸到玻片的苯基乳酸液体中,使其在苯基乳酸液体中游离5~10min,随后将其小心滴于带有Formal膜的铜网上;静置,用滤纸吸取余液,再静置2min。吸取0.1~0.2mL染液滴加于带有菌体的铜网上,静置2min左右,用滤纸吸去多余染液。自然干燥5min后用日立透射电子显微镜Hitachi H-7650观察经苯基乳酸处理前后H.pylori的负染色结果。
经过悬滴法负染色技术制备的H.pylori样品,在透射电子显微镜下视野经观察形态如图5的A、B所示,经过悬滴法负染色技术制备的H.pylori样品,在透射电子显微镜下视野清晰、菌体的边缘清晰可见,无成团和聚集现象。观察发现,H.pylori外形呈单极、带有4~7条带鞘的鞭毛、末端钝圆、能游动,长2.5~4.0μm,宽0.5~1.0μm,菌体整体上呈现螺旋弯曲杆状。而经MIC浓度的苯基乳酸处理后的H.pylori,如图5的C、D所示,菌体鞭毛脱落,由于自身保护机制蜷缩在一起,并且菌体破裂,内容物从菌体两侧流出,图片上能够清晰看到因菌体破裂而形成的空泡,有些细菌成破碎状。结果说明苯基乳酸对H.pylori的抑菌作用很可能是使菌体鞭毛脱落,破坏细胞壁膜使内容物流出,从而使菌体死亡。
实施例7:动物实验分组
小鼠适应培养一周后,随机分为4组:ZC、ZH、ZP、ZA。各组处理如下:
ZC组(15只):每只小鼠隔天灌胃一次改良布氏肉汤培养基400μL,持续2周,随后每天灌胃超纯水400μL,持续4周。
ZH组(15只):每只小鼠隔天灌胃一次H.pylori ZJC03菌悬液400μL,持续2周,随后每天灌胃超纯水400μL,持续4周。
ZP组(45只):每只小鼠隔天灌胃一次H.pylori ZJC03菌悬液400μL,持续2周,随后每天灌胃苯基乳酸400μL(浓度分为0.16mg/mL、0.32mg/mL、0.8mg/mL,每个浓度15只小鼠),持续4周。
ZA组(15只):每只小鼠隔天灌胃一次H.pylori ZJC03菌悬液400μL,持续2周,随后灌胃联合抗生素10天(每天每只的用量为400μL),10天后每只小鼠继续灌胃超纯水400μL,持续18天。
上述H.pylori ZJC03菌悬液的含菌量为108CFU/mL。
造模结束后各组小鼠均行颈椎脱位处死。胃粘膜样本用PBS清洗,并进行无菌采集。胃内容物在液氮中冷冻,随后放置于-80℃时保存,用于实施例8-10的检测。
上述动物实验治疗组处理时间点如图6所示。
实施例8:胃组织的组织病理学观察
室温下将胃粘膜固定在4%多聚甲醛(PFA)缓冲溶液中固定24h。经过处理后,胃组织用EG 1160石蜡机进行包埋,石蜡块放置于RM 2235轮转式切片机中进行切片(5μm),用苏木精和伊红染色(H&E),染色切片在光学显微镜下观察并拍照(NIKON Eclipse Ci,日本);成像系统为:NIKON digital sight DS-FI2,摄片倍数:400×、200×。
组织病理染色观察是诊断胃炎的有效手段,不同分组小鼠胃粘膜染色结果如图7所示。ZC组(图7的A、B)染色结果可以看出胃组织粘膜层结构清晰,上皮完整,粘膜层腺体排列紧密,未见明显其他病变。ZH(图7的C、D)组可见少量坏死脱落的上皮细胞,多见胃腺细胞坏死,核固缩,间质多见少量淋巴细胞浸润;少见黏膜下层轻度水肿,伴少量淋巴细胞点状浸润;多见大量胃腺扩张,并偶见黏膜下层少量出血。ZP(图7的E、F)组为灌胃0.8mg/mL的苯基乳酸对H.pylori感染的小鼠进行治疗,染色结果可以看出组织结构基本正常,粘膜下层可见少量脱落的上皮细胞和轻度水肿伴少量淋巴细胞浸润,未见其他明显的病变。ZA(图7的G、H)组为用混合抗生素治疗H.pylori感染的小鼠,粘膜下层可见少量脱落的上皮细胞,未见明显其他病变。
ZP与ZA相比,得知:当苯基乳酸的浓度达到0.8mg/mL时,炎性细胞基本消失,仅出现轻度水肿伴少量淋巴细胞浸润和少见上皮细胞脱落现象,其治疗效果接近混合抗生素的治疗效果。
实施例9:实时荧光定量PCR链式反应(RT-qPCR)
采用RT-qPCR方法对胃组织中的IFN-γ、IL-6、IL-1β和IL-10进行定量分析。按照RNA提取试剂盒说明书,从小鼠胃组织样本中分离总RNA(100-500ng/μL),随后使用试剂盒将RNA反转录为cDNA。以GAPDH作为内参,对各个基因水平进行标准化。RTqPCR检测按照以下热循环程序进行:预变性95℃,10min,95℃ 15s,60℃ 30s循环40次,熔解曲线60℃到95℃,每15s升温0.3℃并采集一次荧光信号,并采用2-ΔΔCt法计算。
不同治疗组小鼠胃粘膜炎症因子的变化情况如图8所示。和ZC对照组相比,ZH组中促炎因子IL-1β(A)、IFN-γ(B)、IL-6(C)均出现显著性升高,抑炎因子IL-10(D)下降。表明灌胃H.pylori能够显著增加致炎因子和减少抑炎因子。通过灌胃苯基乳酸对H.pylori感染的小鼠进行治疗ZP组,与ZH造模组相比较,IFN-γ、IL-6、IL-1β均出现的明显的下降,IL-10的相对表达量也有所上升,但无统计学差异(P>0.05)。这些结果表明灌胃苯基乳酸对H.pylori感染引起的炎症反应有一定的治疗作用。
ZP与ZA相比,得知:苯基乳酸与混合抗生素的治疗均可以显著降低促炎因子IFN-γ、IL-6、IL-1β的基因表达水平,且苯基乳酸的治疗效果与混合抗生素的治疗效果无显著差异。
实施例10:基于16S rRNA基因测序技术的微生物群分析。
选择CTAB法从胃粘膜中提取DNA样本,并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量,同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量.利用通用引物(341F和805R)扩增细菌细菌16SrRNA的V3-V4的高变区。使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250bp进行双端测序,DNA提取和测序在联川生物公司完成。
(1)用苯基乳酸缓解H.pylori感染后胃微生物群的结构。
通过联川测序平台进行16S rRNA基因测序,实验结果如图9的A所示,其中正常小鼠胃微生态菌群中最丰富的门以Firmicutes(48.20%)、Bacteroidetes(27.79%)、Proteobacteria(13.59%)和Cyanobacteria(4.64%)为主。同时,在H.pylori阳性类群中,Firmicutes(47.75%)、Proteobacteria(35.49%)、Bacteroidetes(13.85%)和Cyanobacteria(0.34%)。而治疗组ZP和ZA组与ZH组相比较Proteobacteria比例明显下降,但ZA组Bacteroidetes与Firmicutes之比明显下降,ZP组Bacteroidetes与Firmicutes之比上升与正常组相似。在属水平上,如图9B所示,ZC组和ZP组的微生物群主要以乳酸菌为主,相对丰度分别为25.63和22.39%,ZH组以Helicobacter(20.55%)为主,ZA组虽Helicobacter明显下降,但胃组织中有益菌乳杆菌的含量也明显下降。以上结果表明经H.pylori感染用苯基乳酸治疗后,有害菌群的相对丰度明显降低,提高乳杆菌含量。
ZP与ZA相比,得知:苯基乳酸和混合抗生素均可显著抑制胃部Helicobacter,但同时苯基乳酸的治疗可以显著促进肠道乳杆菌的生长,而混合抗生素无此效果。
(2)治疗组小鼠胃粘膜中菌群的Alpha和Beta多样性分析
Alpha多样性指标用于表征样品内的微生物群落多样性。如表3所示造模组和治疗组比对照组的小鼠胃黏膜菌群群落丰富度和多样性均发生了一定变化。由此可知,经苯基乳酸的治疗可以改善因H.pylori感染造成胃黏膜中微生物物种丰富度的降低。在平均Simpson指数和shannon指数分析中,ZC组指数高于ZH组和其他治疗组,其次是苯基乳酸高浓度治疗组,这说明经过苯基乳酸的治疗可以提高因H.pylori感染造成胃黏膜中微生物菌群多样性的降低。
表3、治疗组和对照组α多样性参数的比较
注:ZA为抗生素治疗组,ZC为对照组,ZH为造模组,ZP为0.8mg/mL苯基乳酸治疗组
β多样性常用于不同生态系统间多样性的比较。通常使用Weighted UniFrac PcoA的方法展示各处理组样品间的差异大小,如图10所示,PC1的贡献率为34.99%,PC2的贡献率为23.79%,二者之和大于50%,说明样本间差异性并非由外界干扰引起,而是样品本身引起的,检测结果有意义。通过比较图中各样品点的远近观察个体或者群间的差异,坐标图上距离越近的样品,相似性越大,差异性越小。ZC组、ZP组和ZA组除个别样品存在偏差,基本上比较相似,主要分布在靠近中央的区域,而H.pylori感染组ZH组则相隔较远。由此可以看出ZC组和苯基乳酸高浓度治疗组与ZH组差异比较大,这也从侧面说明对小鼠灌胃苯基乳酸进行治疗处理一定程度上可以改善H.pylori对胃微生物菌群的改变。
ZP与ZA相比,得知:苯基乳酸和混合抗生素的治疗对小鼠胃部菌群的多样性均无显著影响。
(3)治疗组小鼠胃粘膜中物种显著性差异分析
经过苯基乳酸治疗4周后,使用LEfSe方法(LDA>3)线性判别了ZC、ZH、ZP、ZA组四组菌群相对丰度和细菌属的显著性差异。如图11(A、B)所示,ZH组中Proteobacteria为优势菌门,Helicobacteraceae、Vibrionaceae、Pasteurellaceae、Acetobacteraceae、Paenibacillaceae为显著增加的优势科,“属”水平上的Helicobacter、Vibrio、Rodentibacter、Cupriavidus、Paenibacillaceae、Coriobacteriaceae UCG 002显著增加,其中与正常组相比感染后小鼠胃中幽门螺杆菌属的平均相对丰度增加了17.29%;ZP组胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“属”水平上的Prevotella,Lactobacillus,Faecalibaculum,Olsenella,Aerococcus等,且与ZH相比,幽门螺杆菌相对丰度下降了9.46%,另外ZP组中增加最明显的为“目”水平上的Lactobacillales,已知大多数Lactobacillus物种从人类和动物的胃肠道中分离出来。由以上可知,苯基乳酸通过治疗作用,提高了小鼠胃粘膜中Lactobacillus、Prevotella、Faecalibaculum、Olsenella等益生菌的丰度而降低了Vibrio、Helicobacter等致病菌的丰度。
ZP与ZA相比,得知:苯基乳酸的治疗更有益于胃部有益菌群Lactobacillus、Prevotella、Faecalibaculum、Olsenella等的生长。
综上,本发明在体外抑菌实验的基础上,选择SPF级小鼠建立H.pylori胃炎感染模型,并用灌胃苯基乳酸治疗此胃炎模型的方法,来探究苯基乳酸对H.pylori感染小鼠模型的胃微生态影响。得到以下结果:
1、证明苯基乳酸对H.pylori具有较强的体外抑菌活性从抑菌圈、MIC、生长曲线、超微结构和脲酶活性五个方面进行测定。实验结果显示MIC为2.5mg/mL,MIC浓度的苯基乳酸完全抑制H.pylori的生长,随着苯基乳酸浓度的降低抑制效果也逐渐减弱、MIC浓度的苯基乳酸对H.pylori脲酶的抑制率高达43.01%±2.11%,通过SEM和TEM观察经MIC浓度的苯基乳酸处理过的H.pylori ZJC03的菌体形态,发现菌体变形,细胞壁膜发生严重破损,甚至胞内中心类核区缺失。
2、选用C57BL/6J小鼠建立H.pylori感染小鼠模型。通过H&E染色和RT-qPCR等方法,检测胃粘膜中炎症细胞浸润情况以及炎症因子变化水平来探究苯基乳酸对小鼠胃炎症状是否具有改善作用。结果表明,经过苯基乳酸的治疗可降低小鼠胃黏膜中炎症细胞的浸润情况,显著下调促炎性细胞因子的表达量。说明苯基乳酸可通过调节宿主免疫应答、降低氧化损伤来改善H.pylori感染引起的胃炎症状。
3、苯基乳酸对H.pylori诱发的胃菌群紊乱有调节作用。苯基乳酸通过治疗作用,显著性提高了小鼠胃粘膜中Lactobacillus、Prevotella、Faecalibaculum等有益菌的丰度而降低了Vibrio、Helicobacter等致病菌的丰度,对比抗生素治疗组,苯基乳酸治疗组小鼠胃黏膜中有益菌群的提升也更加显著。苯基乳酸可以改善因H.pylori感染而造成机体胃微生态菌群紊乱现象,调节胃微生态平衡。
本发明在发明过程中,还进行过如下的对比实验:将乳酸(具有广谱抑菌性)替代苯基乳酸,按照实施例2所述方法进行检测,所得结果为:10mg/mL乳酸无法抑制H.pyloriZJC03(对甲硝唑不敏感)的生长,无可见抑菌圈;而本发明所得结果为10mg/mL苯基乳酸可显著抑制该H pylori的生长,抑菌圈直径为9.98±0.97mm。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.苯基乳酸在制备抑制幽门螺杆菌感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:苯基乳酸能抑制对甲硝唑不敏感的幽门螺杆菌的生长。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于苯基乳酸具有如下至少任一的性能:
苯基乳酸能抑制H.pylori生长;
苯基乳酸缓解H.pylori感染引发胃黏膜炎症;
苯基乳酸抑制H.pylori尿素酶活性;
苯基乳酸对于H.pylori的菌体具有破坏性。
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3-苯基乳酸的研究进展;李德茂等;药物生物技术;第11卷(第5期);参见第345页右栏,第346页左栏 * |
复方丹参在消化系统疾病中的临床应用;刘洪等;世界华人消化杂志;第7卷(第6期);参见第537页左栏 * |
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