CN107823536B - 一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法 - Google Patents

一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料药制备得到的：草乌3～6份，诃子5～10份，藏木香4～8份，安息香4～8份，翼首草6～12份，兔耳草5～10份，草果4～8份，红景天4～6份，轮叶棘豆6～12份；并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明公开了一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法，是根据藏药理论及应用法则和传统用药经验，结合现代免疫药理和临床兽医学等技术方法，对藏药进行组方筛选，其组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经体外、体内药效试验研究，效果显著，在临床上具有广阔的推广应用价值。

Description

一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组 合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物组合物技术领域，具体涉及一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法。
背景技术
西藏作为全国五大牧区之一，其主导产业是牦牛，牦牛是以我国青藏高原为中心产区，主要分布在喜马拉雅山脉和青藏高原的特有地方家畜品种，生活在海拔3000m～5000m的高寒缺氧地区，不仅是生产和生活资料提供者，还是牧区直接劳动力。在牧区内，常零星散发或地方流行巴氏杆菌病，该病又称出血性败血症，简称“牛出败”，是由多杀性巴氏杆菌引起的一类多种动物共患的一种急性热性败血性的国家二级传染病，也是一种人畜共患传病，该病原是条件致病菌，一般常存在于健康牛的上呼吸道和消化道粘膜上，正常情况下不引起发病，当机体抵抗力降低时，如在天气骤变、长途运输、营养缺乏等不良应激因素作用下，病菌即可侵入体内大量繁殖，除内源性感染而发病外，也可经呼吸道、消化道以及损伤的皮肤和粘膜感染。该病的流行呈明显的季节性，发病牦牛大多表现急性经过,未经确诊治疗便已死亡,死亡率较高，不仅带来巨大的经济损失，还对草场和水源造成二次污染。
近年来，由于抗生素的滥用，临床分离到的牛源巴氏杆菌耐药菌株不断增多，临床抗感染治疗效果也越来越差，有研究表明中药或天然植物提取物可发挥对病原菌的直接杀灭作用而不产生耐药性或提高其对抗生素的敏感性，故抗菌中药已逐渐成为研究热点。通过体外抑菌试验可以初步判断藏药组合物抑菌作用的大小，进一步通过体外抑菌试验可以筛选获得有效的中药组方，为畜牧养殖业的健康发展起到积极的保障作用。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料药制备得到的：草乌3～6份，诃子5～10份，藏木香4～8份，安息香4～8份，翼首草6～12份，兔耳草5～10份，草果4～8份，红景天4～6份，轮叶棘豆6～12份。
进一步的，上述的一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物，是由按照重量份计的以下原料药制备得到的：草乌4.5份，诃子7.5份，藏木香6份，安息香6份，翼首草9份，兔耳草7.5份，草果6份，红景天5份，轮叶棘豆9份。
本发明的第二个目的是提供了上述一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)按照权利要求1所述的重量配比，分别准确称取草乌、诃子、藏木香、安息香、翼首草、兔耳草、草果和红景天，放置于20L-30L的圆筒锅中，加水量为每100g药材加水10-12L，浸泡2.5-3h；
2)将加入原料药的圆筒锅放置于加热器上，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W,使其慢慢煮沸120min，用双层纱布进行过滤，得到第一次煎煮过滤的滤液，保存备用；
3)将第一次煎煮过滤的滤渣，再按每100g药材加水12-15L加入纯净水，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W,使其慢慢煮沸120min，将准确称量的配比量的轮叶棘豆加入，继续煮沸30min，用纱布进行过滤，得到第二次煎煮过滤的滤液，保存备用；
4)合并第一次煎煮过滤的滤液和第二次煎煮过滤的滤液，2200W条件下加热25～30分钟至沸腾，然后降低加热器功率到1200-1600W，煮沸210-240min，挥发多余水分后得到药物组合物浓缩液至2000～4000ml，冷却后密封保存于4℃冰箱备用；
5)将药物组合物浓缩液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。
本发明的有益效果为：本发明公开了一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物及其制备方法，是根据藏药理论及应用法则和传统用药经验，结合现代免疫药理和临床兽医学等技术方法，对藏药进行组方筛选，其组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经体外、体内药效试验研究，效果显著，在临床上具有广阔的推广应用价值。
具体实施方式
实施例1：
一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物的制备方法
1材料与方法：
1.1材料：
药材：
草乌，诃子，藏木香，安息香，翼首草，兔耳草，草果，红景天，轮叶棘豆。
仪器：
ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-2，国画电器有限公司)、电磁炉、GOODLOOK-1000型薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070，上海鸿都电子科技有限公司)、数控超声波清洗器(KH7200DB,昆山禾创超声仪器有限公司)、实验室专用超纯水机、TDZ4-WS台式低速离心机、锥形瓶、漏斗、量筒、烧杯等。
2.方法：
2.1粉碎药材：
取草乌，诃子，藏木香，安息香，翼首草，兔耳草，草果，红景天，轮叶棘豆9味药材各200g-300g左右，粉碎成粉末，分开装袋，保存。
2.2药材煎煮：
(1)藏药组合物的制备方法：
分别准确称取草乌30～60g，诃子50～100g，藏木香40～80g，安息香40～80g，翼首草60～120g，兔耳草50～100g，草果40～80g，红景天40～60g，放置于20L-30L的圆筒锅中，加水量为每100g药材加水10-12L，浸泡2.5-3h；
(2)将加入原料药的圆筒锅放置于加热器上，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W,使其慢慢煮沸120min，用双层纱布进行过滤，得到第一次煎煮过滤的滤液，保存备用；
(3)将第一次煎煮过滤的滤渣，再按每100g药材加水12-15L加入纯净水，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W,使其慢慢煮沸120min，将准确称量的轮叶棘豆加入，继续煮沸30min用纱布进行过滤，得到第二次煎煮过滤的滤液，保存备用；
(4)合并第一次煎煮过滤的滤液和第二次煎煮过滤的滤液，2200W条件下加热25～30分钟至沸腾，然后降低加热器功率到1200-1600W，煮沸210-240min，挥发多余水分后得到药物组合物浓缩液至2000～4000ml，冷却后密封保存于4℃冰箱备用。
(5)将浓缩药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。
药物组合物配比分组如表1所示。
表1
药物名称 组1配比量 组2配比量 组3配比量
草乌 30g 60g 45g
诃子 50g 100g 75g
藏木香 40g 80g 60g
安息香 40g 80g 60g
翼首草 60g 120g 90g
兔耳草 50g 100g 75g
草果 40g 80g 60g
红景天 40g 60g 50g
轮叶棘豆 60g 120g 90g
实施例2：
藏药组合物体外抑菌试验：
1材料与方法
1.1藏药组合物与菌种
藏药组合物由草乌，诃子，藏木香，安息香，翼首草，兔耳草，草果，红景天，轮叶棘豆组成，以上药材均购买于西藏亚郎藏药材销售有限公司。
菌种：多杀性巴氏杆菌(编号CVCC 1659)，购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；MH琼脂培养基(Mueller-Hinton Agar，MHA)，MH肉汤培养基(Mueller-Hinton borth，MHB)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；LS4509增菌培养基，批号ZBAP-170716D，购自于广州市迪景微生物科技有限公司。
1.2实验动物
昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，连续饲喂7d，自由采食饮水，注意观察。
1.3仪器和试剂
HFsafe-1500生物安全柜，购自于上海力申科学仪器有限公司；高压灭菌锅(LDZS-50KBS)，购自于上海申安医疗器械厂；TDZ4-WS低速离心机，购自于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；；HNYC-202T恒温培养振荡器，购自于天津欧诺仪器股份有限公司；VITEK2COMPACT仪器，购自于生物梅里埃公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自于上海鸿都电子科技有限公司沃特浦制水机，购自于四川沃特尔水处理有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，购自于昆山市超声仪器有限公司；CO2培养箱，购自于TABAI ESPEC CORD，Japan；革兰氏阴性细菌鉴定卡，产品批号2410112103，购自于梅里埃诊断产品(上海)有限公司；注射用硫酸链霉素，产品批号170103，购自于合肥强力动物药品有限责任公司；注射用青霉素钠，产品批号16050905-1，购自于哈药集团。
1.4细菌的鉴定
将细菌配制为0.50-0.63麦氏浓度的菌悬液，按照革兰氏阴性细菌鉴定卡的操作说明利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK 2 COMPACT)进行细菌鉴定。
1.5藏药组合物梯度浓度的配制
将配制的药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。取8支10mL灭菌过的离心管，分别标号1-1、1-2～1-8，在超净台中每支管中分别加入3mL的无菌超纯水，在1-1管中加入3mL无菌的方剂1，混匀后吸出3mL于1-2管中，这是2倍稀释，再从1-2中吸出3mL于1-3管中，依次至1-8，则2-1～2-8倍的药浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91g/L，做好标记，封口膜封上，于4℃冰箱保存备用。
1.6菌悬液的计数和制备
取8支灭菌离心管，每个里面准确加入2.7mL灭菌过的PBS，将离心管依次标记为10-1～10-8，精密吸取0.3mL的菌悬液至10-1离心管中，此为10倍稀释，反复吹打使菌液混匀，从离心管中吸取0.3ml至10-2管中，混匀，依次稀释到10-8离心管，将每个离心管的菌液吸取100μL于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个浓度设置2个平行，37℃恒温培养箱中培养18h，对菌落数在10～100之间的平皿进行计数，求平均值，单位为CFU/mL。菌落均匀平铺一层的可用于做牛津杯试验，此菌液浓度为106CFU/mL，将菌液配成这个浓度备用。
1.7牛津杯法测定藏药组合物的对细菌的体外作用
取2个MHA平皿，各吸取100μL配好的巴氏杆菌菌悬液于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个上面放置4个牛津杯，每个牛津杯里加入200μL方剂的2-1～2-8倍的稀释药液，每个方剂再做2组重复实验，将做好的平皿正置于37℃培养箱中培养18h，观察细菌生长情况，并测定抑菌环直径、记录数据。
1.8藏药组合物对细菌的MIC值的测定
牛津杯试验有抑菌圈的可以做MIC值的测定实验。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的微生物临床检验标准，采用宏量肉汤稀释法来测定MIC值。
取10支试管，试管标号1-1、1-2～1-9、1-10，在每支试管里加1mL的MHB培养基，在1-1试管加入1mL无菌的藏药组合物原液，原液浓度为1g/mL，混匀，吸取1mL至1-2试管中，混匀，再从1-2试管中吸取1mL至1-3试管中，此为2倍稀释，依次稀释至1-8试管，混匀后从1-8试管吸出1mL扔掉。最后于试管1-1、1-2～1-9中分别加入配好的菌液(浓度为1×106CFU/mL)1mL，即每根试管里最终菌液浓度为5×105CFU/mL，前8管药液浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91、1.95g/L。试管1-9为菌液的阴性对照，试管1-10为空白对照。再做2组重复试验。将其放于37℃摇床中培养18h，取出观察试管里是否有细菌生长。
2.结果
2.1细菌鉴定结果
鉴定结果如表2所示。
表2
鉴定编号 鉴定结果 可靠性(％) 鉴定水平 鉴定次数
1 多杀性巴氏杆菌 97％ E 1
注：E：Excellent；VG：Very good；G：Good；A：Acceptable.
2.2牛津杯法测定藏药组合物的对细菌的体外作用
藏药组合物药液浓度为500g/L时，对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈直径平均值为28.8mm。
2.3最小抑菌浓度(MIC)实验结果
藏药组合物对多杀性巴氏杆菌的MIC值为3.9g/L。
实施例3：
藏药组合物对多杀性巴氏杆菌的体内抑菌试验：
1材料与方法
1.1藏药组合物与菌种
藏药组合物由草乌，诃子，藏木香，安息香，翼首草，兔耳草，草果，红景天，轮叶棘豆组成，以上药材均购买于西藏亚郎藏药材销售有限公司。
菌种：多杀性巴氏杆菌(编号CVCC 1659)，购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；
培养基：MH琼脂培养基(Mueller-Hinton Agar，MHA)，MH肉汤培养基(Mueller-Hinton borth，MHB)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；
1.2实验动物
昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，连续饲喂7d，自由采食饮水，注意观察。
1.3仪器和试剂
HFsafe-1500生物安全柜，购自于上海力申科学仪器有限公司；高压灭菌锅(LDZS-50KBS)，购自于上海申安医疗器械厂；TDZ4-WS低速离心机，购自于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；；HNYC-202T恒温培养振荡器，购自于天津欧诺仪器股份有限公司；VITEK 2COMPACT仪器，购自于生物梅里埃公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自于上海鸿都电子科技有限公司沃特浦制水机，购自于四川沃特尔水处理有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，购自于昆山市超声仪器有限公司；CO2培养箱，购自于TABAI ESPEC CORD，Japan；革兰氏阴性细菌鉴定卡，产品批号2410112103，购自于梅里埃诊断产品(上海)有限公司；注射用硫酸链霉素，产品批号170103，购自于合肥强力动物药品有限责任公司；注射用青霉素钠，产品批号16050905-1，购自于哈药集团。
1.4细菌的鉴定
在小鼠感染细菌后，取感染后小鼠脏器，涂板接种于血平皿中划出单菌落，按照VITEK 2 COMPACT仪器，将细菌配制为0.50-0.63麦氏浓度的菌悬液，按照革兰氏阴性细菌鉴定卡的操作说明，利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK 2 COMPACT)对感染模型是否成功进行鉴定。
1.5藏药组合物不同梯度浓度的配制
将配制的药液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。取8支10mL灭菌过的离心管，分别标号1-1、1-2～1-8，在超净台中每支管中分别加入3mL的无菌超纯水，在1-1管中加入3mL无菌的方剂1，混匀后吸出3mL于1-2管中，这是2倍稀释，再从1-2中吸出3mL于1-3管中，依次至1-8，则2-1～2-8倍的药浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.91g/L，做好标记，封口膜封上，于4℃冰箱备用。1.6菌悬液的计数和制备
取8支灭菌离心管，每支里面准确加入2.7mL灭菌过的PBS，将离心管依次标记为10-1～10-8，精密吸取0.3mL的菌悬液至10-1离心管中，此为10倍稀释，反复吹打使菌液混匀，从离心管中吸取0.3ml至10-2管中，混匀，依次稀释到10-8离心管，将每个离心管的菌液吸取100μL于MHA平皿上，涂布棒涂匀，每个浓度涂布2个板子，37℃恒温培养箱中培养18h，对菌落数在10～100之间的平皿进行计数，求平均值，单位为CFU/mL。菌落均匀平铺一层的可用于做牛津杯试验，此菌液浓度为106CFU/mL，将菌液配成这个浓度备用。
1.7小鼠体内感染巴氏杆菌防治作用
经预实验测定使小鼠致死率达到80％以上的多杀性巴氏杆菌的最小细菌浓度是1×10CFU/mL。配制该浓度菌液：挑取血平皿上的一个巴氏杆菌单菌落接种于6mL MHB中，37℃180r/min培养7h，再吸取100μL接种于新的6mL MHB中，37℃140r/min培养12h，过夜放一天，稀释至10-7倍，现用现配。
将小鼠随机分为预防组(3个剂量组)、治疗组(3个剂量组)和对照组(阴性、阳性、空白对照组)共计9个实验组，每组12只，雌雄各半。
预防组3个剂量组，每天分别灌胃该藏药组方药液，所用药液浓度为125g/L，分别灌胃0.5mL、0.3mL和0.1mL，连续灌胃5d，在第5d给药后1h，每只小鼠腹腔注射50μL的巴氏杆菌液(浓度是1×10CFU/ml)，观察统计小鼠精神状况及死亡情况。
治疗组3个剂量组组，每只小鼠腹腔注射50μL的巴氏杆菌液(浓度是1×10CFU/ml)，感染1h后再治疗，分别灌胃0.5mL、0.3mL和0.1mL，所用药液浓度为125g/L。
对照组有阴性对照组，阳性对照组和空白对照组，阴性对照组只感染巴氏杆菌，不治疗，阳性对照组感染巴氏杆菌1h后使用青链霉素治疗，空白对照组既不感染细菌，也不给药，每日正常饲喂饮水，观察小鼠死亡情况，并记录。
2实验结果
2.1细菌鉴定结果
按照革兰氏阴性细菌鉴定卡的操作说明，利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK 2COMPACT)对感染模型是否成功进行菌种鉴定，鉴定结果如表3所示，表明感染模型已成功建立。
表3
Figure BDA0001459757640000081
注：E：Excellent；VG：Very good；G：Good；A：Acceptable.
2.2小鼠体内防治实验结果
空白组小鼠正常存活，阳性对照组小鼠死亡率为0。实验组结果如表4所示：
预防组：方剂中0.3mL和0.1mL剂量组预防效果良好，死亡率比阴性对照死亡率75％，降低了33.3％和25％；
治疗组：方剂的0.3mL剂量组治疗较好，较之阴性对照死亡率75％降低了25％。
整体看来，该藏药组合物在浓度为125g/L，给药量为0.3mL时，具有良好的预防和治疗作用，具有很好的临床应用前景。
小鼠体内防治实验结果如表4所示。
表4
Figure BDA0001459757640000091
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物，其特征在于，是由按照重量份计的以下原料药制备得到的：草乌3～6份，诃子5～10份，藏木香4～8份，安息香4～8份，翼首草6～12份，兔耳草5～10份，草果4～8份，红景天4～6份，轮叶棘豆6～12份。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物，其特征在于，是由按照重量份计的以下原料药制备得到的：草乌4 .5份，诃子7 .5份，藏木香6份，安息香6份，翼首草9份，兔耳草7 .5份，草果6份，红景天5份，轮叶棘豆9份。
3.根据权利要求1所述的一种用于防治多杀性巴氏杆菌引起的出血性败血症的藏药组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按照权利要求1所述的重量配比，分别准确称取草乌、诃子、藏木香、安息香、翼首草、兔耳草、草果和红景天，放置于20L-30L的圆筒锅中，加水量为每100g药材加水10-12L，浸泡2 .5-3h；
2)将加入原料药的圆筒锅放置于加热器上，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W ,使其慢慢煮沸120min，用双层纱布进行过滤，得到第一次煎煮过滤的滤液，保存备用；
3)将第一次煎煮过滤的滤渣，再按每100g药材加水12-15L加入纯净水，2200W条件下加热40～60分钟至沸腾，然后降低加热器功率到600～800W ,使其慢慢煮沸120min，将准确称量的配比量的轮叶棘豆加入，继续煮沸30min，用纱布进行过滤，得到第二次煎煮过滤的滤液，保存备用；
4)合并第一次煎煮过滤的滤液和第二次煎煮过滤的滤液，2200W条件下加热25～30分钟至沸腾，然后降低加热器功率到1200-1600W，煮沸210-240min，挥发多余水分后得到药物组合物浓缩液至2000～4000ml，冷却后密封保存于4℃冰箱备用；
5)将药物组合物浓缩液倒出50mL于离心管中，4000r/min离心30min，吸取上清液于100mL三角瓶中，瓶口用纸紧密包两层，于100℃流通蒸汽灭菌30min，将灭菌后的药液放入4℃冰箱备用。
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