CN113575758A - 一种复合益生素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合益生素及其制备方法，通过优化培养地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，使地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌芽孢率均达到80％以上；制备地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌粉；将制得的地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉按照质量比例为1:1混合均匀后在与中药提取物混合，制得复合益生素，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与山豆根多糖能较好地联合应用，规避掉两者的负面作用并起到协同作用得到的复合益生素绿色环保无污染。

Description

一种复合益生素及其制备方法

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一种复合益生素及其制备方法。

背景技术

抗生素作为一种提高畜禽生长效率的饲料添加剂推动了养殖业的发展，但由于长期不合理、无节制的使用，导致了多重耐药细菌的出现。我国农业农村部已在2019年7月9日颁布了相关的饲料禁抗政策，养殖业迎来了无抗养殖的新时代，研究开发无残留、无污染有效的替抗产品成为市场需求。我国已在研究替抗产品方面取得了一定的成果，益生素、中药提取物、抗菌肽、酶制剂等均能在一定程度上取代抗生素的使用。

益生菌是指定植在动物体内，通过提高免疫应答能力来增强机体的抗病力或通过抑制有害菌群的生长、调节肠道的菌群组成，从而优化肠道环境且对机体有益的活性微生物。养殖业应用益生菌产品以来，对益生菌的评价褒贬不一，经市场产品抽检发现，各种益生菌产品的标示菌种、活菌数含量差异非常大，或许这也是造成益生菌产品质量差异的原因之一。因此还需不断改善现有的菌剂制备工艺，提高益生菌制剂中活菌数的含量及稳定性。但单一的替抗产品有时作用效果不明显，不能满足养殖业的需求。复合益生菌，或将其与其他制剂联合使用、科学配伍，例如中药提取物等，则能使其最大化的发挥效用。研究表明，益生菌可以降低中药的毒副作用、促进中药有效成分的溶出、提高中药的药效，而中药则可以促进益生菌的增殖。两者结合既可以更好地提高动物的生长性能、免疫力，也可以加强其抑菌效果。但部分益生菌可能会分解代谢掉中药提取物中具有生物活性的有效成分，而部分中药提取物也可能会抑制益生菌的生长繁殖，两者联合应用可能会产生颉颃作用。

发明内容

针对上述的不足，本发明的第一目的是提供一种复合益生素；

本发明的第二目的是提供一种复合益生素的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种复合益生素，所述复合益生素按照重量份数包括有如下原料组分：枯草芽孢杆菌0.5-2g、地衣芽孢杆菌0.5-2g、4％泊洛沙姆1-3g、玉米淀粉4-8g、山豆根多糖0.006-0.012g。

进一步，所述复合益生素按照重量份数包括有如下原料组分：枯草芽孢杆菌1g、地衣芽孢杆菌1g、4％泊洛沙姆2g、玉米淀粉8g、山豆根多糖0.012g。

进一步，具体步骤如下：

1)分别优化培养地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，在冷处理环境为4-8℃，热处理环境为37℃的处理条件下交替3次，每次2h，使地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌芽孢率均达到80％以上。

2)制备菌粉：取步骤1)中的地衣芽孢杆菌0.5-2g和枯草芽孢杆菌0.5-2g分别在两个固体培养平板上扩大培养后，用1-3g热保护剂分别洗脱两个固体培养平板上的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，再用4-8g玉米淀粉吸收菌液，并在40℃条件下热烘干至恒重，分别制得粉状的地衣芽孢杆菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉。

3)将步骤2)中制得的地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉按照质量比例为1:1混合均匀后在与0.006-0.012g的中药提取物混合，制得复合益生素。

进一步，所述枯草芽孢杆菌为1g、地衣芽孢杆菌为1g、热保护剂为2g、玉米淀粉为8g、中药提取物为0.012g。

进一步，所述中药提取物选自连翘苷、双花绿原酸、黄芪多糖、山豆根多糖中的一种或多种，所述热保护剂选自4％明胶、60％甘油生理盐水、4％泊洛沙姆中的一种或多种。

进一步，所述中药提取物为山豆根多糖，所述热保护剂为4％泊洛沙姆。

进一步，所述地衣芽孢杆菌菌粉的活菌数为1.51×109-9.49×109cfu/g、枯草芽孢杆菌菌粉的活菌数为4.5×109-8.9×109cfu/g。

进一步，所述的一种复合益生素在制备提高畜禽生长效率的饲料添加剂中的应用。

采用以上方案，本发明具有如下优点：

1、本发明中主要探索了益生菌与中药联合后的有效性，并初步研究复合益生素产品的制备流程，为替抗产品的进一步研究提供数据参考和理论依据。

2、本发明中的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与山豆根多糖能更好地联合应用，规避掉两者的负面作用并起到协同作用，最终使两者的配伍产品即复合益生素能够成为绿色有效的替抗产品。

3、本研究使用了常用的抗生素进行体外抑菌试验，而本试验所用到的屎肠球菌，除对药物阿米卡星、氟苯尼考、克林霉素敏感，对土霉素、多西环素、泰乐菌素、阿奇霉素、林可霉素及利高霉素为中介外，对其他常用药物均为严重耐药，可能携带有耐药基因，可能会转移到动物机体中的其他细菌中，使该动物在患病时无药可治，所以本试验最终选用枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌来进行益生素的制备。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。

附图说明

图1为本发明的实验流程图；

图2为①～⑦号细菌菌落及革兰氏染色结果；

图3为①～⑦号菌PCR产物电泳图；

图4为①号菌株的同源性种属关系；

图5为②号菌株的同源性种属关系；

图6为③号菌株的同源性种属关系；

图7为④号菌株的同源性种属关系；

图8为⑤号菌株的同源性种属关系；

图9为⑥号菌株的同源性种属关系；

图10为⑦号菌株的同源性种属关系；

图11为复合益生素制备前枯草与地衣芽孢杆菌混合菌粉的菌种分布比例；

图12为复合益生素制备后枯草与地衣芽孢杆菌混合菌粉的菌种分布比例；

图13为鸡血的培养结果；

图14为鸡血的抑菌结果；

图15为三黄鸡的体重变化比较；

图16为不同试验组三黄鸡的免疫器官指数比较；

图17为不同试验组三黄鸡的抗体水平比较图；

图18为不同试验组三黄鸡血清中GSH-Px的活力比较；

图19为不同试验组三黄鸡血清中MDA的含量比较；

图20为不同试验组三黄鸡血清中SOD的活力比较；

图21为三黄鸡试验组A、B、C与对照组E的粪便活菌数变化比较；

图22为三黄鸡试验组D与对照组E的粪便活菌数变化比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述，但实施例并不对本发明作任何形式的限定，除非特别说明，本发明所涉及的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：复合益生素的制备，如图1所示。

具体步骤如下：

1)分别优化培养地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，在冷处理环境为4-8℃，热处理环境为37℃的处理条件下交替3次，每次2h，使地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌芽孢率均达到80％以上。

2)制备菌粉：取步骤1)中的地衣芽孢杆菌1g和枯草芽孢杆菌1g配置成菌液后，分别在两个固体培养平板上扩大培养至两个固体培养平板分别长满地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，然后用2g4％泊洛沙姆分别洗脱两个固体培养平板上的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，将洗脱后的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别用8g玉米淀粉吸收菌液，并在40℃条件下热烘干至恒重，分别制得粉状的地衣芽孢杆菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉。

3)将步骤2)中制得的地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉按照质量比例为1:1混合均匀后在与0.012g的山豆根多糖混合，制得复合益生素。

实施例2：益生菌的鉴定与筛选实验

1、实验材料

广西大学动物科学技术学院药理实验室分离的7株菌，依次编号为①、②、③、④、⑤、⑥、⑦号，分别是从某益生菌产品、民间食品、酸奶中分离得到。

2、实验方法

2.1益生菌的复苏和传代

将7株保存在半固体培养基中的益生菌，分别用接种环取样加至营养肉汤中，置于37℃恒温培养箱中培养，当肉汤浑浊，即细菌生长达到稳定时，取出。分别用接种环取适量菌液，划线接种至营养琼脂培养基表面，37℃恒温培养箱培养18h得到单个菌落，观察记录益生菌的生长特性及菌落形态。之后将获得的单个菌落再划线接种至营养琼脂培养基表面，连续传三代，观察各个益生菌的生长情况。

2.2益生菌的鉴定

分别挑取2.1中营养琼脂培养基上的菌落进行革兰氏染色镜检，观察记录菌体颜色及形态。7株益生菌分别使用微量生化鉴定管进行M.R-V.P，硝酸盐还原，L-阿拉伯糖，棉子糖，山梨醇，淀粉水解等项目作生化特性研究；

提取7株益生菌的DNA，进行PCR扩增，16S rDNA扩增引物采用通用引物：上游引物5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；下游引物5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′。PCR反应体系(25μL)：2×Taq Master Mix(Dye)，12.5μL；ddH2O，8.5μL；上、下游引物(10μmol/L)各1μL；DNA模板，2μL。扩增条件：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s，30个循环；最终延伸72℃10min；4℃终止反应。取16S PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

2.3抗菌药体外抑菌试验

用打孔器将滤纸片制成圆形纸片(直径为6mm)，分装至EP管，高压灭菌(121℃15min)后烘干备用。选用青霉素、链霉素、土霉素、氟苯尼考、泰乐菌素、林可霉素、磺胺嘧啶(SD)、恩诺沙星、多粘菌素、泰妙菌素、利高霉素、痢菌净等抗菌药，严格按照CLSI标准，以100片为基准称量抗菌药，并用适宜的溶剂将其溶解。将制好的药液均匀滴加至灭菌的圆形纸片上，于干燥箱中烘干，最后分装至EP管中，4℃保存，备用；

选用已经鉴定的细菌②、④、⑥号，将活化后的④、⑥号菌液划线接种在营养琼脂平板上、②号接种在MRS平板上，放于37℃温箱中培养18h，用医用棉签将平板上的②、④、⑥号益生菌分别刮取下来，用生理盐水洗脱得到菌悬液，并用生理盐水稀释使其浓度为0.5麦氏比浊管对比浓度；

用医用棉签沾取④、⑥号菌悬液均匀的涂抹在LB平板上、②号菌悬液均匀地涂抹在MRS平板上，待菌液完全吸附后，将制好的药敏纸片贴在平板(间距＞30mm)上，每个平板贴4～5个药敏纸片，之后放置37℃温箱中培养24h，用游标卡尺测量各抑菌圈的直径，两次测量取平均值。

3、实验结果

益生菌的传代：在益生菌的传代过程中，①号菌在传至第三代时就失去了活性不再生长，其余6株菌仍有生长活性，且生长良好。

益生菌的鉴定：形态学鉴定，如图2所示，①号菌菌落呈灰白色、扁平、边缘光滑不整齐、生长不良，革兰氏染色后，菌体为红色、细长的杆状、单个或成对、革兰氏阴性杆菌。②号菌菌落呈乳白色细小圆形、边缘整齐光滑，革兰氏染色后，菌体为蓝紫色、圆形或椭圆形、单个或成对或短链状排列的革兰氏阳性菌。③、④、⑤号菌菌落呈灰白色、扁平、边缘不整齐、表面粗糙有褶皱、形似地衣状，革兰氏染色后，菌体为蓝紫色、杆状、单个或成对成链排列的革兰氏阳性菌。⑥号菌菌落为白色、边缘不规则、表面粗糙有很多皱褶、中央有突起呈伞状，革兰氏染色后，菌体为蓝紫色、杆状、单个或成对成链排列的革兰氏阳性菌。⑦号菌菌落为灰白色、扁平、边缘不整齐、表面粗糙、呈白蜡状，革兰氏染色后，菌体为蓝紫色、杆状、单个或成对成链排列、有芽孢、芽孢呈卵圆形、位于菌体中央或稍偏于一端、革兰氏阳性菌；

生化鉴定，如表1所示，①号菌各个生化反应均为阴性；②号菌的MR、V-P反应为阳性，还可以发酵L-阿拉伯糖、山梨醇和D-密二糖；③、④、⑤号菌V-P反应为阳性，还可还原硝酸盐、水解淀粉和发酵L-阿拉伯糖；⑥号菌V-P反应为阳性，还可还原硝酸盐、水解淀粉和发酵山梨醇；⑦号菌MR、V-P反应为阳性，还可还原硝酸盐、发酵D-密二糖；

表1生化试验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

16S rDNA基因序列分析鉴定，如图3-10所示，①号试验菌株与侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)同源性达99.1％，属于短芽孢杆菌属侧孢短芽孢杆菌种(登陆号KY949476.1)；②号试验菌株与屎肠球菌(Enterococcus faecium)同源性达99.7％，属于肠球菌属屎肠球菌种(登陆号KJ803878.1)；③号试验菌株与地衣芽孢杆菌同源性达100％，④号和⑤号试验菌株与地衣芽孢杆菌同源性达99.9％，属于芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌种(登陆号按顺序分别为LR134165.1、KT986159.1、MG428727.1)；⑥号试验菌株与枯草芽孢杆菌同源性达100％，属于芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种(登陆号KM013814.1)；⑦号试验菌株与蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)同源性达100％，属于芽孢杆菌属蜡样芽胞杆菌种(登陆号FJ493043.1)，7株菌相应的形态特点和生化反应结果也均与前人研究的结果一致；

在本试验中所用的侧孢短芽孢杆菌不易培养，在传代过程中易失活，可能是该菌受体内遗传物质的调控发生老化，或是该菌的营养条件较为特殊，尚未找出可使其稳定传代的营养因子。在本试验中所用的蜡样芽孢杆菌则与食物中毒有关，当食物中该菌的含量＞105cfu/g时就会引起食物中毒。通常食物长期放置在高温环境中，蜡样芽孢杆菌就会大量繁殖，夏季高温时就很容易引起蜡样芽孢杆菌的生长繁殖。根据上述原因，本试验初步选用屎肠球菌、地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌进行抗菌药体外抑菌试验；

抗菌药体外抑菌试验：如表2所示，β-内酰胺类抗生素中，②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林均表现为耐药；

氨基糖苷类抗生素中链霉素、卡那霉素、庆大霉素、大观霉素对②号屎肠球菌表现为耐药；卡那霉素、庆大霉素、大观霉素、安普霉素对④号地衣芽孢杆菌表现为敏感，阿米卡星对②号屎肠球菌表现为敏感；

四环素类抗生素中的土霉素和多西环素对④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌均表现为敏感；

酰胺醇类的氟苯尼考对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌表现为敏感；

大环内酯类抗生素中泰乐菌素对④号地衣芽孢杆菌、阿奇霉素对⑥号枯草芽孢杆菌均表现为敏感，替米考星对②号屎肠球菌表现为耐药；

林可胺抗生素中林可霉素对④号地衣芽孢杆菌表现为耐药，克林霉素对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌均表现为敏感；

磺胺类抗生素中磺胺嘧啶(SD)对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌均表现为耐药；

喹诺酮类抗生素中恩诺沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星对②号屎肠球菌表现为耐药，对④号地衣芽孢杆菌表现为敏感，对⑥号枯草芽孢杆菌表现为敏感；

多肽类的多粘菌素对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌表现为耐药；

双萜烯类的泰妙菌素对②号屎肠球菌、④号地衣芽孢杆菌表现为耐药，利高霉素对三种菌的抑菌效果表现为中介，痢菌净对②号屎肠球菌表现为耐药，对④号地衣芽孢杆菌、⑥号枯草芽孢杆菌表现为敏感。

表2 10类抗菌药对3种益生菌的体外抑菌试验结果

注：抑菌圈直径(Φ)<10mm为不敏感，即耐药(R)，10mm≤Φ<15mm为中介，Φ≥15mm为敏感(S)。

实施例3：对益生菌生长无抑制作用的中药提取物筛选实验

1、实验材料

地衣芽孢杆菌(1.8×10⁷cfu/mL)、枯草芽孢杆菌(1.6×10⁷cfu/mL)、中药连翘苷、双花绿原酸、黄芪多糖、山豆根多糖。

2、实验方法

地衣芽孢杆菌：采用试管二倍稀释法，取灭菌的2mL EP管48个，以12个2mL EP管为一组，共四组，每组分别编号，于每组的第1个EP管中加入无菌地衣芽孢杆菌培养液2mL，其余10个分别加入无菌地衣芽孢杆菌培养液1mL，然后于四组的第1个EP管中分别加入320mg的连翘苷、双花绿原酸、黄芪多糖、山豆根多糖，各自混匀后，分别放入水中反复煮沸3次，待其冷却，各自取出1mL加到每组中的第2个EP管中，以此类推，每组直到第10个EP管中取出1mL弃去；每组第11个EP管分别只加入1mL无菌地衣芽孢杆菌培养液，不加药液，为细菌阳性对照组；每组第12个EP管分别只加入1mL无菌地衣芽孢杆菌培养液，不加药液和细菌，作阴性对照组；然后向每组的1-11个管中分别加入浊度为1.8×10⁷cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌液10μL，摇匀，均置37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果，以不发生浑浊现象的最高稀释倍数作为该组的MIC值。

枯草芽孢杆菌：采用试管二倍稀释法，取灭菌的2mL EP管48个，以12个2mL EP管为一组，共四组，每组分别编号，于每组的第1个EP管中加入无菌枯草芽孢杆菌培养液2mL，其余10个分别加入无菌枯草芽孢杆菌培养液1mL，然后于四组的第1个EP管中分别加入320mg的连翘苷、双花绿原酸、黄芪多糖、山豆根多糖，各自混匀后，分别放入水中反复煮沸3次，待其冷却，各自取出1mL加到每组中的第2个EP管中，以此类推，每组直到第10个EP管中取出1mL弃去；每组第11个EP管分别只加入1mL无菌枯草芽孢杆菌培养液，不加药液，为细菌阳性对照组；每组第12个EP管分别只加入1mL无菌枯草芽孢杆菌培养液，不加药液和细菌，作阴性对照组；然后向每组的1-11个管中分别加入浊度为1.6×10⁷cfu/mL的枯草芽孢杆菌菌液10μL，摇匀，均置37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果，以不发生浑浊现象的最高稀释倍数作为该组的MIC值。

3、实验结果

表3中药提取物对地衣芽孢杆菌的MIC

注：+表示有细菌生长，－表示无细菌生长

表4中药提取物对枯草芽孢杆菌的MIC

注：+表示有细菌生长，－表示无细菌生长

由表3、表4可知，4种中药提取物中，连翘、双花、黄芪提取物对地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC均分别为20，40，80mg/mL。山豆根提取物对地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生长没有影响。阳性对照组均长菌，阴性对照组均无细菌生长。结果表明，当连翘、双花、黄芪提取物的浓度升高时，会对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌产生不同程度的抑制效果，而山豆根提取物则无抑制效果，因此，连翘、双花、黄芪提取物不适合与本试验的益生菌联用而山豆根多糖对地衣和枯草芽孢杆菌没有抑制作用可选用山豆根多糖作为本发明中复合益生素的联用中药提取物。

实施例4：复合益生素粉剂制备方法及保护剂的筛选实验

1、实验材料

地衣芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、玉米淀粉、甘油、脱脂奶粉、PEG6000、菊糖、泊洛沙姆、明胶。

2、实验方法

冷冻干燥法：菌种复苏后，各配制4瓶100mL的枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液，分别低速冷冻离心4 000r/min，30min后，每瓶各余4mL菌液，活菌计数后，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌浓缩后的菌液分别两两混合为8mL菌液。再分别选用菊糖、PEG6000、脱脂奶粉、甘油配制成浓度为10％的溶液作为保护剂，分别与混合好的枯草芽孢杆菌浓缩菌液、地衣芽孢杆菌浓缩菌液1:1混匀，再各自加入2g玉米淀粉，混匀后，平铺于平板中，进行真空冷冻干燥-70℃预冷冻2h，-50℃、真空度10Pa，冻干20h，得到粉状益生菌，3个重复组，用活菌计数法分别测定制备前菌液中的活菌数和制粉后活菌数。

热干燥法：菌种复苏后，将地衣芽孢杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液各取100μL分别均匀涂布在固体培养基上，做3个平行，在37℃温箱中培养，待益生菌长满固体培养平板，再分别用等剂量的4％明胶、60％甘油生理盐水、4％泊洛沙姆洗脱固体培养基上的益生菌，用相等重量的玉米淀粉吸收，40℃烘干至恒重，制成粉状益生菌，3个重复，并用活菌计数法分别测定菌悬液活菌数和制粉后活菌数。

益生菌粉剂的活性复测：分别冷冻干燥法、热干燥法中制备的活菌数含量较高且制备前后活菌数差异不显著的菌粉，常温放置1个月后进行菌粉的活性复测，即取出适量菌粉加入相应的培养液再采用梯度稀释平板计数法进行活菌计数，从而筛选出稳定性良好的菌剂。

3、实验结果

表5保护剂对益生菌冻干菌粉存的活菌数测定

表6保护剂对益生菌热干燥菌粉的活菌数测定

注：将每种洗脱液制粉后活菌数与制备前的菌液活菌数比较，数据肩标*表示差异显著(P＜0.05)，无肩标表示差异不显著(P＞0.05)。

表7益生菌菌粉活性复测定结果的对比

由表5可知，冷冻干燥法中，冻干保护剂菊糖、PEG6000、脱脂奶粉、甘油对益生菌菌粉的保护性有一定的差别，其中菊糖与甘油都会使菌粉结块凝固，无法研磨混匀，而以脱脂奶粉作为保护剂时，冻干菌粉的活菌数最高，为1.03×109cfu/g，存活率为23.62％；

由表6可知，热干燥法中，4％明胶制备的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌粉，其中地衣芽孢杆菌活菌数前后差异不显著(P＞0.05)，但枯草芽孢杆菌活菌数前后差异显著(P＜0.05)；60％甘油生理盐水制备的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌粉，其中地衣芽孢杆菌活菌数前后差异不显著(P＞0.05)，但枯草芽孢杆菌活菌数前后差异显著(P＜0.05)；4％泊洛沙姆制备的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌粉，其中地衣芽孢杆菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数前后差异均不显著(P＞0.05)；

由表7可知，活性复测中，低温热干燥法制备的菌粉，活菌数含量较高，且4％泊洛沙姆作为保护剂制备的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌粉活菌数含量前后差异均不显著(P＞0.05)，因此1个月后对其进行活菌数复测，结果显示，4％泊洛沙姆热保护剂制备的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌粉，活菌数由1个月前的(5.50±3.99)×10⁹cfu/g和(6.70±2.20)×10⁹cfu/g分别降低为(1.37±0.14)×10⁹cfu/g和(3.78±0.06)×10⁹cfu/g，活菌数前后差异均不显著(P＞0.05)，本发明选用40℃热干燥法对地衣和枯草芽孢杆菌进行菌粉的制备，结果表明菌粉中的活菌数仍能保持较高水准，因此选用热干燥法制备菌粉，并选择泊洛沙姆作为保护剂。

实施例5：复合益生素的安全性测试试验

1、实验材料

以实施例1的条件下制备的复合益生素、18-22g 6周龄清洁级昆明系小鼠10只，购自广西医科大学。

2、实验方法

参照徐淑云主编的《药理试验方法学》中最大耐受量测定方法进行，按0.4mL/10g的最大给药剂量灌胃小鼠。选取10只健康昆明种小鼠，均衡随机分为试验组和对照组，每组5只，并用饱和苦味酸溶液进行标记，试验组依次灌胃已制备好的复合益生素混悬液，对照组则灌胃等剂量的灭菌生理盐水；

灌胃后，观察并记录小鼠的外观、行为、饮食、分泌物、排泄物等的变化，持续观察7d，发现死亡小鼠立即进行病理解剖，从实质器官分离细菌。第7d采用颈椎脱臼处死小鼠，将心、肝、脾、肺、肾、脑等主要器官进行细菌分离，即划线接种至营养琼脂培养基，37℃恒温培养24h，观察有无细菌生长。

3、实验结果

小鼠灌胃给予益生素混悬液后，外观、行为、饮食、分泌物、排泄物均无异常，试验观察期内无小鼠死亡，第7d剖杀小鼠，实质器官心、肝、脾、肺、肾、脑中均分离不到细菌。且试验前后小鼠的体重如表8所示，试验组与对照组小鼠的体重增重值差异不显著(P＞0.05)。

表8试验前后小鼠的体重

注：将试验组的数据与对照组的进行统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)

实施例6：复合益生素的质量检测试验

1、实验方法

以实施例1的条件下制备好的复合益生素和制备复合益生素前的枯草与地衣芽孢杆菌菌液，送至天一辉远检测中心进行宏基因组测序(Metagenomic Sequencing)，即对样品中的多种细菌的基因组进行高通量测序，探究益生素制备过程中是否对样本中的微生物组成造成了影响。

3、实验结果

为了探究复合益生素制备前后其微生物的组成变化，宏基因组测序从NCBI的核酸序列(NT)数据库中筛选了大量微生物的序列构建新的对比数据库，将益生素中测出的序列与构建好的新数据库进行比对，对每个测序条带进行分析(LCA算法)，将分析结果即益生素中各个物种的丰度信息绘制成百分比统计表，“种”水平下益生素中各菌种的分布比例如图11和图12所示，其具体地含量数值比例对比则如表9所示(表中仅列举部分重要菌种含量)，菌粉的制备过程不会改变原有益生菌的含量比例，其前后差异不显著(P＞0.05)，该种检测方法可以定性，却无法定量，因此可结合活菌计数法一同检测。

表9益生素制备前后菌液、菌粉中部分菌种的含量比例

实施例7：复合益生素的的功效测试试验

1、实验材料

5周龄的脱温健康三黄鸡50只

2、实验方法

选取5周龄的脱温健康三黄鸡50只，集中笼养，自由采食、自由饮水、自然光照，适应性喂养1周，称重、编号，随机分为5组，每组10只，处理前采直肠粪样测个体鸡只的肠道活菌数，测定其初期NDV的抗体水平并记录，并按下列各组要求给予处理，每日1次，试验期为4周，试验期内按常规程序进行新城疫点眼、滴鼻免疫，鸡只自由采食和饮水。

A组：氨苄西林组(给药三天后停药)，按30mg/kg剂量给小鸡灌服氨苄西林原粉(含量≥99.9％)。

B组：氨苄西林给药三天后停药，停药后连续饲喂益生素，按30mg/kg(活菌含量≥1×108cfu/g)给小鸡灌服。

C组：氨苄西林+山多益生素组，按30mg/kg(活菌含量≥1×108cfu/g)剂量给小鸡灌服。

D组：益生素组，按30mg/kg(活菌含量≥1×108cfu/g)剂量给小鸡灌服。

E组：空白对照组，灌喂同样剂量的生理盐水。

2.1三黄鸡试验前的检查

用微生物法检查试验所用的三黄鸡。将保存的枯草与地衣芽孢杆菌菌液，用医用棉签适量沾取分别均匀涂布在TSA培养基表面，做好标记备用。每组随机挑选两只鸡，分别用1mL无菌注射器(提前用肝素浸润)进行翅下静脉采血(0.05～0.1mL)，拔下注射器针头，先将鸡血接种至营养肉汤中，2个重复，再将剩余鸡血浸透空白圆形纸片(制备方法如3.3.5)，贴在已涂好枯草与地衣芽孢杆菌的培养基上，之后放入37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。

2.2生长性能的检测

试验期内每周称取三黄鸡的体重，记录鸡只的周增重并计算其增重百分率，进行数据分析。

2.3免疫器官指数和血清抗体水平的影响

免疫器官指数：在试验期的第28d，对试验所用的三黄鸡进行称重及解剖，摘取免疫器官：胸腺、脾脏和法氏囊，剔除器官表面的多余脂肪后称重，按照公式分别计算各个器官的指数，公式如下：

免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)/三黄鸡体重(g)。

NDV血清抗体水平：分别在试验期的第7d、14d、21d、28d，对每组三黄鸡进行翅下静脉采血，装于1.5mL EP管中放置1h，之后进行离心(3000r/min 15min)，将分离出的血清装于新的EP管，-20℃保存。在试验第28d，将血清统一进行HI试验，测定鸡NDV血清抗体的血凝抑制效价，以log2表示计算，对每组数据进行t检验和单因素方差分析，并将所得抗体水平变化数据绘制成折线图进行对比，具体操作如下：

(1)1％鸡红细胞液的制备

用10mL注射器吸取肝素约2mL，取无任何抗体的鸡只，翅下静脉采血约8mL，将抗凝血置于50mL离心管中，加入2倍体积的PBS溶液，轻轻混匀后，将其离心(1000r/min10min)，吸去上清液(尽可能吸去白细胞薄膜)，沉淀物再加入PBS进行洗涤，轻轻混合，再离心(1000r/min 10min)，弃上清，重复洗涤3次后，观察离心管中沉淀的红细胞体积(mL)，加入等体积的PBS，配成1:1的红细胞悬液，放入4℃冰箱，保存备用(存储时间≤5d)。试验时，取出保存的红细胞悬液离心(1000r/min 10min)，弃上清，观察余下沉淀的红细胞体积，加入99倍体积的PBS，置于锥形瓶中，轻轻摇晃使其混合均匀即为1％鸡红细胞液。

(2)4HA100单位抗原的配制

取96孔微量反应板，分别向1～12孔中加入30μL的PBS。再取30μL的NDV血凝抑制抗原加入第1孔，充分混匀后，吸取30μL加入第2孔，依次类推至第11孔并吸弃30μL混合液，第12孔为空白对照。最后分别向12个孔中加入1％鸡红细胞液，微量振荡器振荡1min，放置37℃温箱孵育20min。观察结果，取发生凝集反应的最后一孔的稀释倍数/4，即为配制4HA100单位抗原所需的对原抗原的稀释倍数。将上述步骤做3个重复，保证4HA100单位抗原的准确性。

(3)HI试验

取96孔微量反应板，分别向1～12孔中加入30μL的PBS。吸取30μL待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取30μL至第二孔，依次稀释至第十一孔并从中吸弃30μL，第12孔为空白对照。每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同上。再向每孔中加入4HA100单位的抗原30μL，最后每孔中加入30μL 1％鸡红细胞悬液，微量振荡器振荡1min，放置37℃温箱孵育20min。孵育过后将96孔微量反应板取出，适量倾斜判定红细胞开始发生凝集的最高稀释倍数/2，以此作为抗体效价。

2.4抗氧化功能的测定

在试验期的第28d，对每组鸡只进行翅下静脉采血，取血后，静置1h，置于离心机内以3000r/min离心15min，分离血清后，严格按照试剂盒说明方法测定SOD，GSH-Px的活力及MDA的含量。

2.5三黄鸡肠道菌群的检测

试验期内的第一和第二周，每周采直肠粪样测个体鸡只的肠道活菌数两次；第三和第四周每周则只测一次，具体检测方法如下：

用无菌的医用棉签对鸡只进行直肠粪便采取，将采取好的少量新鲜粪便装至EP管中进行称量后加入等量的生理盐水，混匀后备用。取4只1.5mL EP管内有生理盐水0.9mL，取0.1mL备好的粪便混悬液加到第一管，混匀为10-1的混悬液后取0.1mL加到第2管，以此类推。从稀释后的EP管中各吸取0.1mL的混悬液均匀涂布在TSA培养基表面，放置数分钟待液体彻底吸收后，倒扣放入37℃恒温培养箱中培养24h，之后取出计菌落数，乘以稀释倍数，即为备用粪便混悬液中的活菌数，之后再除以粪便质量，即为粪便中的活菌数。可将稀释后的混悬液作2～3个重复，计算平均值。

3、实验结果

3.1三黄鸡试验前的检查

如图13所示，培养24h后，接种鸡血的营养肉汤未混浊，表明没有细菌生长，试验所用的三黄鸡健康状况良好；

如图14所示，培养24h后，培养基中的血纸片周围没有出现抑菌圈，所以试验所用的三黄鸡血液中没有抑制枯草与地衣芽孢杆菌的成分，即三黄鸡可以用来进行山多益生素作用的研究。

3.2生长性能的检测

表10三黄鸡的体重变化比较

注：将每周试验组的增重率与对照组的进行统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)。

试验期内不同试验组，三黄鸡的体重变化如表10和图15所示，饲喂氨苄西林且给药三天后停药的A组，三黄鸡的体重增重百分率每周都在下降；在第一、二周时，饲喂氨苄西林+山多益生素的C组增重效果较明显，在三、四周时增重效果降低，但与A组相比，C组的增重率明显较高；饲喂氨苄西林给药三天后停药，停药后连续饲喂益生素的B组和饲喂益生素的D组其增重率无明显变化特点。因此，与对照组相比，山多益生素有益于三黄鸡的生长；与饲喂氨苄西林的A组相比可以得出，山多益生素能对三黄鸡起到保护作用，减少氨苄西林对其生长的负面影响。

3.3免疫器官指数和血清抗体水平的影响

表11不同试验组三黄鸡的免疫器官指数比较

注：将试验组的免疫器官指数与对照组进行统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)

三黄鸡免疫器官指数的试验结果：不同试验组，三黄鸡的免疫器官指数如表11和图16所示，各试验组的免疫器官指数与对照组相比，差异均不显著(P＞0.05)。由图可见，饲喂氨苄西林且给药三天后停药的A组，其三黄鸡的免疫器官指数均略低于对照组。饲喂氨苄西林给药三天后停药，停药后连续饲喂益生素的B组，其脾脏和法氏囊的指数均高于A组；饲喂氨苄西林+山多益生素的C组，其三黄鸡的免疫器官指数均高于其他各组，尤其是脾脏的指数高于对照组最多。由此可知，氨苄西林可能会抑制三黄鸡免疫器官的生长，通过饲喂益生素可减缓其抑制作用；山多益生素可提高免疫器官的生长。

三黄鸡特异性抗体水平变化的试验结果：

表12不同试验组三黄鸡的抗体水平比较表

注：将每周试验组的抗体指数与对照组的统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。

不同试验组，其血清中的NDV抗体效价在试验期内的变化比较如表12和图17所示，HI效价则以Log2表示，其中试验所用的三黄鸡的初始抗体指数为2.47±0.38，饲喂氨苄西林+山多益生素的C组，其血清中的NDV抗体水平在试验期的四周内均显著高于对照组(P＜0.05)和其他试验组；而仅饲喂益生素的D组，其血清中的NDV抗体水平则与对照组的抗体水平变化相似；饲喂氨苄西林且给药三天后停药的A组和饲喂氨苄西林给药三天后停药，停药后连续饲喂益生素的B组，其血清中的NDV抗体水平有一定的不稳定性，第一周抗体水平均低于对照组，之后则与对照组的相近。由此可知，山多益生素在一定程度上可增强三黄鸡的体液免疫功能。

3.4抗氧化功能的测定

表13不同试验组三黄鸡血清GSH-Px、SOD和MDA的含量比较表

注：将试验组的数据与对照组的进行统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)。

不同试验组，三黄鸡血清中的GSH-Px、SOD活力和MDA的含量如表13和图18-20所示，仅饲喂氨苄西林的A组与饲喂氨苄西林后饲喂益生素的B组相比较，B组的GSH-Px、SOD活力和MDA的含量均略高于A组，且A组各值均小于对照组，初步表明氨苄西林可能会降低三黄鸡的抗氧化功能，而益生素对其具有调节作用，减轻氨苄西林的抑制；饲喂氨苄西林+山多益生素的C组，其抗氧化指标均高于其他组别，SOD的活力更是显著的高于对照组(P＜0.05)。由此可知，氨苄西林可能对抗氧化功能有抑制效果，益生素可在一定程度上缓解抑制效果，山多益生素则可以有效的提高抗氧化作用。

3.5三黄鸡肠道菌群的检测

表14不同试验组三黄鸡的粪便活菌数比较表(单位：×105cfu/g)

注：将试验组的数据与对照组的进行统计分析，*表示差异显著(P＜0.05，α＝0.05)。

不同试验组的三黄鸡其初始粪便活菌数与在试验期的第3d、7d、10d、14d、21d、28d的粪便活菌数比较如表14和图21-22所示，各试验组的直肠粪便活菌数与对照组相比，差异均不显著(P＞0.05)。由图5-11可知，与对照组相比，饲喂氨苄西林可降低三黄鸡直肠粪便的活菌数，A组与B组相比较可得，饲喂益生素可在短时间内调节肠道菌群，提高肠道菌群含量，较快的恢复氨苄西林造成的肠道菌群损伤；C组和对照组相比，直肠粪便活菌数的变化趋势较为一致，表明山多益生素对肠道菌群具有一定的保护作用，规避了氨苄西林对菌群的破坏。由图22可知，饲喂益生素可在短时间内提高直肠粪便的活菌数，改变肠道菌群，但在两周后继续饲喂益生素其直肠粪便活菌数与对照组相比已无变化，可能是肠道菌群适应了益生菌，又恢复了平衡。

最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种复合益生素，其特征在于，所述复合益生素按照重量份数包括有如下原料组分：枯草芽孢杆菌0.5-2g、地衣芽孢杆菌0.5-2g、4％泊洛沙姆1-3g、玉米淀粉4-8g、山豆根多糖0.006-0.012g。

2.如权利要求1所述的一种复合益生素，其特征在于，所述复合益生素按照重量份数包括有如下原料组分：枯草芽孢杆菌1g、地衣芽孢杆菌1g、4％泊洛沙姆2g、玉米淀粉8g、山豆根多糖0.012g。

3.如权利要求2所述的一种复合益生素的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)分别优化培养地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，在冷处理环境为4-8℃，热处理环境为37℃的处理条件下交替3次，每次2h，使地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌芽孢率均达到80％以上。

2)制备菌粉：取步骤1)中的地衣芽孢杆菌0.5-2g和枯草芽孢杆菌0.5-2g分别在两个固体培养平板上扩大培养后，用1-3g热保护剂分别洗脱两个固体培养平板上的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，再用4-8g玉米淀粉吸收菌液，并在40℃条件下热烘干至恒重，分别制得粉状的地衣芽孢杆菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉。

3)将步骤2)中制得的地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉按照质量比例为1:1混合均匀后在与0.006-0.012g的中药提取物混合，制得复合益生素。

4.如权利要求3所述的一种复合益生素的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为1g、地衣芽孢杆菌为1g、热保护剂为2g、玉米淀粉为8g、中药提取物为0.012g。

5.如权利要求4所述的一种复合益生素的制备方法，其特征在于，所述中药提取物选自连翘苷、双花绿原酸、黄芪多糖、山豆根多糖中的一种或多种，所述热保护剂选自4％明胶、60％甘油生理盐水、4％泊洛沙姆中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的一种复合益生素的制备方法，其特征在于，所述中药提取物为山豆根多糖，所述热保护剂为4％泊洛沙姆。

7.如权利要求4所述的一种复合益生素，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌菌粉的活菌数为1.51×10⁹-9.49×10⁹cfu/g、枯草芽孢杆菌菌粉的活菌数为4.5×10⁹-8.9×10⁹cfu/g。

8.如权利要求1-3所述的一种复合益生素在制备提高畜禽生长效率的饲料添加剂中的应用。

Images