发明内容
为克服上述生产水貂犬瘟热抗原蛋白复合物过程繁琐复杂周期长、劳动强度大、费工费 力,且质量不稳定,批间差异大,制备的病毒抗原复合物注射动物后副反应较高等问题,本 发明提供一种使用低血清悬浮培养VeroE6-TY株细胞制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物的方 法、抗原蛋白复合物及其应用。
首先,本发明的目的是筛选和驯化一株适应低血清悬浮VeroE6-TY株细胞培养的水貂犬 瘟热病毒适应株用于水貂犬瘟热抗原蛋白复合物的生产。
本发明的技术方案为:用低血清培养基悬浮VeroE6-TY株细胞连续培养驯化水貂犬瘟热 病毒,使之适应悬浮培养条件。驯化后的病毒接种到低血清培养液悬浮培养的VeroE6-TY株 细胞培养液,培养增殖后收获毒液,制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物。
上述方法具体包括以下步骤1.VeroE6-TY株细胞复苏;2.将步骤1得到的复苏后的VeroE6-TY株细胞用低血清培养液进行放大培养,得到VeroE6-TY株细胞培养液;3.水貂犬瘟热病毒进行低血清培养基悬浮VeroE6-TY株细胞培养驯化,筛选出驯化的水貂犬瘟热病毒; 4.接种步骤3得到的驯化后水貂犬瘟热病毒至步骤2得到的VeroE6-TY株细胞培养液,增殖 后收获毒液;5.利用步骤4得到的毒液制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物;所述步骤按照步骤 1、2、3、4、5的顺序进行,或按照步骤3、1、2、4、5的顺序进行。
所述步骤1的具体方法为:
取液氮冻存的VeroE6-TY株悬浮培养型细胞,置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有 低血清悬浮培养液300ml的摇瓶中,低血清悬浮培养液的血清浓度为体积百分比1-5%,置于 37℃、60rpm、5%(v/v)CO2摇床培养72小时,细胞密度可达2.0×106个/ml,细胞活力≧ 90%,得到复苏后的VeroE6-TY株细胞。
所述步骤2的具体方法为:
A)把步骤1得到的复苏后的VeroE6-TY株细胞按照与培养液体积比1:3接种于装有低血 清培养液的摇瓶中,于37℃5%CO2摇床培养72小时,60r/min。悬浮细胞数量不低于1.5×106个/ml,细胞活力≧90%,得到摇瓶生长的细胞悬浮液,将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到 齐志BC-7L型(工作体积5L)生物反应器,接种体积为500-1500mL,补加低血清培养液至 2.5L,反应器参数设定三路气体,分别为空气、氧气和二氧化碳,转速为60-75rpm,温度37℃、 PH 7.1,培养36小时后溶氧设定为50%,继续培养36小时后细胞密度不低于2.0×106个/ml, 细胞活力≧90%;B)将步骤A)中得到的细胞培养液补加低血清悬浮培养及至5.0L,培养条 件同步骤A),培养72h后,细胞密度不低于2.0×106个/ml。C)将步骤B)中得到的细胞培养液 3.5L转移至型号为齐志BC-14L型(工作体积10L)生物反应器,补加低血清培养液至10L, 反应器参数设定三路气体,分别为空气、氧气和二氧化碳,转速为75-85rpm,温度37℃、PH 7.1、溶氧70%,继续培养72小时进行台盼蓝染色法计数及活力检测,活细胞密度不低于 2.0×106个/mL时得到可用作接毒的细胞培养液;BC-7L型(工作体积5L)生物反应器剩余细 胞培养液1.5L补加培养液至5L,按步骤B)方法继续培养,作为细胞种子连续培养。
所述步骤3的具体方法为:
1)将步骤2A)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液离心,1500rpm、10min,倒掉上清液,用 少量低血清培养液吹打细胞沉淀使细胞呈单个散在状态,补加低血清培养液至细胞悬浮液原 有体积,加入10%(v/v)的由贴壁Vero细胞培养增殖的水貂犬瘟热病毒毒种(105.8TCID50);2)先于37℃5%(v/v)CO2摇床培养24小时后,再于35℃5%(v/v)CO2摇床继续培养 72小时。每24小时取样检测其病毒效价(TCID50);3)将步骤2)中第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒,接毒剂量为细胞悬浮液体积的10%,按步骤2)条件培养,每24小 时取样检测其病毒效价(TCID50);4)将步骤3)第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接 毒,接毒剂量为细胞悬浮液体积的10%,按步骤2)条件培养,每24小时取样检测其病毒效 价(TCID50);5)将步骤4)第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒,接毒剂量为细胞 悬浮液体积的10%,按步骤2)条件培养,每24小时取样检测其病毒效价(TCID50),筛选 出一株病毒效价高且适应悬浮培养条件的稳定病毒株,即为水貂犬瘟热病毒悬浮株,命名为 CDV3-X株,并于2017年11月28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号CGMCC NO.14883,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号,邮编100101。
所述步骤4的具体方法为:
取步骤2C)得到的可用作接毒的细胞培养液,按细胞培养液体积的10-15%比例接入步骤 3筛选得到的驯化的水貂犬瘟热病毒CDV3-X株,培养条件为反应器参数设定三路气体,分 别为空气、氧气和二氧化碳,转速为75-85rpm,先于37℃5%(v/v)CO2摇床培养24小时 后,再于35℃5%(v/v)CO2摇床继续培养72小时。每24小时取样进行台盼蓝染色法细 胞计数及活力检查,活细胞密度低于5.0×105个/mL或细胞活性≦50%后,在无菌条件下收获病毒液。
所述步骤5的具体方法为:
将步骤4得到的毒液用0.1mol/L NaHCO3调整PH值为7.4,按3份体积病毒液加入2份 体积含有5wt%蔗糖的脱脂牛奶作为稳定剂,充分混合均匀后定量分装于西林瓶中,按现行《中 国兽药典》附录迅速进行冷冻真空干燥,得到水貂犬瘟热抗原蛋白复合物。
更具体为:将步骤4得到的毒液,以批为单位进行取样,按现行《中国兽药典》附录进 行无菌检验及病毒含量测定。结果应无细菌霉菌生长,每毫升病毒含量应≥104.33TCID50。合 格的半成品于-20℃以下冻存。将检验合格的病毒液融化后,用0.1mol/LNaHCO3调整PH值 为7.4,按3份病毒液加入2份5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂,充分混合均匀后定量分装于西林瓶 中。分装后,按现行《中国兽药典》附录迅速进行冷冻真空干燥。得到水貂犬瘟热抗原蛋白 复合物。
所述低血清培养液,为含体积百分比1-5%的新生牛血清的VeroE6细胞专用低血清悬浮 培养液。所述低血清培养液的制备方法为:
(1)取5袋(10L/袋)包装的VeroE6细胞专用低血清悬浮培养基干粉分别溶解于灭菌 注射用水中,配制成培养基的终体积为50L,本步骤中注射用水的体积为终体积的80-90%, 搅拌至澄清;
(2)将所述步骤(1)中得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至7.0,并用注射用水将溶液体积补充至终体积;
(3)将所述步骤(2)中得到的溶液加入终体积1-5%体积的新生牛血清后0.2微米滤膜 过滤除菌,分装备用,于2-8℃保存。
本发明还提供上述方法制备得到的抗原蛋白复合物。另外本发明还提供前述抗原蛋白组 合物在制备诱导对水貂犬瘟热病毒的免疫应答的药物中的应用。
本发明的有益效果为:
①本发明通过实验参数的调整,筛选出一株适应低血清悬浮VeroE6-TY株细胞培养的水 貂犬瘟热病毒适应株用于水貂犬瘟热抗原蛋白复合物的生产。解决了传统贴壁细胞制备的病 毒在悬浮细胞工艺中易感性不好,增殖慢的弊端。为悬浮工艺在水貂犬瘟热抗原蛋白复合物 制备中的应用解决了技术难点。
②本发明选用低血清悬浮VeroE6-TY株细胞系代替传统贴壁VeroE6细胞制备水貂犬瘟 热抗原蛋白复合物,解决了因转瓶贴壁细胞生长瓶间、批间差异大而导致产品质量批间差异 大的问题,并且为将来下游纯化工艺提供了有利条件。保证了产品质量均一稳定。有望终结 制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物的转瓶时代。
③本发明选用低血清悬浮VeroE6-TY株细胞系代替传统贴壁VeroE6细胞制备水貂犬瘟 热抗原蛋白复合物,降低了血清浓度,节约生产成本的同时,减少了产品因血清因素带来的 副反应。提高了产品的安全性。
④本发明选用低血清悬浮VeroE6-TY株细胞系代替传统贴壁VeroE6细胞制造水貂犬瘟 热抗原蛋白复合物,细胞易于放大培养,操作简单,污染率低。使得水貂犬瘟热疫苗生产的 周期缩短,人工减少,年产量增加,效益显著。
⑤本发明选用低血清悬浮VeroE6-TY株细胞系代替传统贴壁VeroE6细胞制备水貂犬瘟 热抗原蛋白复合物,减少了培养基的使用量,收获的病毒液的量就是消耗的培养基量,而传 统转瓶工艺消耗的培养基的量是收获病毒液的2倍。节约了生产成本。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的细胞为:低血清悬浮细胞VeroE6-TY株。系引进于郑州爱科生物科技有 限公司。
本发明涉及的微生物为:水貂犬瘟热病毒CDV3-X悬浮株,系申请人将CDV3-CL株经悬浮细胞连续传代驯化,获得的低血清悬浮适应毒株。命名为CDV3-X悬浮株。于2017年 11月28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号 CGMCCNO.14883,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
六、具体实施方式
下列实施例中的实验方法和所用的试剂,如无特别说明,均为常规方法和常规试剂。
材料:
VeroE6-TY株细胞株:VeroE6-TY株低血清悬浮细胞,由郑州爱科生物科技有限公司提 供。
病毒:水貂犬瘟热病毒CDV3-CL株(贴壁细胞培养获得),由吉林特研生物技术有限责 任公司保藏。
干粉培养基:由郑州爱科生物科技有限公司提供,名称:VeroE6细胞专用低血清悬浮培 养基干粉,货号:V-6012-D。
新生牛血清(简称血清):内蒙古金源康新生牛血清,批号:20170110。
制备低血清培养液:
(1)取5袋(10L/袋)包装的VeroE6细胞专用低血清悬浮培养基干粉分别溶解于灭菌 注射用水中,配制成培养基的终体积为50L,本步骤中注射用水的体积为终体积的80-90%, 搅拌至澄清;
(2)将所述步骤(1)中得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至7.0,并用注射用水将溶液体积补充至终体积;
(3)将所述步骤(2)中得到的溶液加入终体积1-5%体积的新生牛血清后0.2微米滤膜 过滤除菌,分装备用,于2-8℃保存。
仪器设备:
离心机,HITACHI CT-16RX型;悬浮细胞培养瓶(500mL;1000mL)郑州爱科生物科技有限公司提供;磁力搅拌器USA BELLCO公司产品
实施例一
1.VeroE6-TY株细胞复苏
取液氮冻存的VeroE6-TY株悬浮培养型细胞,置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有 低血清悬浮培养液300ml的摇瓶中,置于37℃、60rpm、5%(v/v)CO2摇床培养72小时,细胞密度可达2.0×106个/ml,细胞活力≧90%,得到复苏后的VeroE6-TY株细胞。
2.低血清培养液进行放大培养VeroE6-TY株细胞培养液
A)把步骤1得到的复苏后的VeroE6-TY株细胞按照与培养液体积比1:3接种于装有低血 清培养液的摇瓶中(3个摇瓶),每瓶补加低血清培养液至300ml,于37℃5%CO2摇床培养 72小时,60r/min。悬浮细胞数量不低于1.5×106个/ml,细胞活力≧90%,得到摇瓶生长的细 胞悬浮液,将摇瓶生长的细胞悬浮液直接全部(900mL)接种到齐志BC-7L型(工作体积5L) 生物反应器,补加低血清培养液至2.5L,反应器参数设定三路气体,分别为空气、氧气和二 氧化碳,转速为60-75rpm,温度37℃、PH 7.1,培养36小时后溶氧设定为50%,继续培养 36小时后细胞密度不低于1.0×106个/ml,细胞活力≧90%;B)将步骤A)中得到的细胞培养 液补加低血清悬浮培养及至5.0L,培养条件同步骤A),培养72h后,细胞密度不低于2.0×106个/ml。C)将步骤B)中得到的细胞培养液3.5L转移至型号为齐志BC-14L型(工作体积10L) 生物反应器,补加低血清培养液至10L,反应器参数设定三路气体,分别为空气、氧气和二 氧化碳,转速为75-85rpm,温度37℃、PH 7.1、溶氧70%,继续培养72小时进行台盼蓝染 色法计数及活力检测,活细胞密度不低于2.0×106个/mL时得到可用作接毒的细胞培养液;
BC-7L型(工作体积5L)生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加培养液至5L,按步骤A) 方法继续培养,为细胞种子连续培养。
3.水貂犬瘟热病毒进行低血清培养基悬浮VeroE6-TY株细胞培养驯化,筛选出驯化的水 貂犬瘟热病毒
1)将步骤2A)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液离心,1000rpm、10min,倒掉上清液,用 少量低血清培养液吹打细胞沉淀使细胞呈单个散在状态,补加低血清培养液至细胞悬浮液原 有体积,加入10%(v/v)的由贴壁VeroE6细胞培养增殖的水貂犬瘟热病毒毒种(105.8TCID50)。
2)先于37℃5%(v/v)CO2摇床培养24小时后,再于35℃5%(v/v)CO2摇床继续 培养72小时。每24小时取样检测其病毒效价(TCID50);步骤1)、2)重复进行3次,检测 悬浮细胞条件下的原病毒敏感性。
3)将步骤2)中第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒,接毒剂量为细胞悬浮液体 积的10%,按步骤2)条件培养,每24小时取样检测其病毒效价(TCID50)。
4)将步骤3)第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒,接毒剂量为细胞悬浮液体积 的10%,按步骤2)条件培养,每24小时取样检测其病毒效价(TCID50)。
5)将步骤4)第96小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒,接毒剂量为细胞悬浮液体积 的10%,按步骤2)条件培养,每24小时取样检测其病毒效价(TCID50)。如此连续接毒驯化5代,筛选出一株病毒效价高并且适应悬浮培养条件的稳定增殖的病毒株,即为水貂犬瘟热病毒悬浮株,命名为CDV3-X。同样方法制备3批低血清悬浮细胞培养水貂犬瘟热病毒的病毒液。
悬浮病毒株的检测:上述步骤中涉及到的病毒效价(TCID50)检测具体步骤为:
病毒效价检测:将上述适应于VeroE6-TY株低血清悬浮细胞的待检病毒液用无血清 MEM营养液(Gibco产品)作10倍系列稀释,取10-3~10-6共4个稀释度,同步接种于已加入100微升/孔VeroE6-TY株贴壁细胞的96孔微量细胞培养板,每个稀释度设8个重复,同 时设8个重复孔为正常细胞对照。将接种好的96孔微量细胞培养板置于37℃5%CO2恒温 培养箱培养96小时,记录细胞病变效应情况,按Reed-Muench法计算TCID50。
驯化结果:
按以上方法制备出3批贴壁细胞制备的病毒的悬浮培养病毒待检毒液2)1-3和3批低血 清悬浮细胞培养水貂犬瘟热病毒待检病毒液5)1-3;
病毒效价检测结果分别见表1、2;
表1各批次水貂犬瘟热病毒效价检测结果
批次 |
0h |
24h |
48h |
72h |
96 |
阳性对照 |
步骤2)-1 |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.43</sup> |
10<sup>4.56</sup> |
10<sup>4.25</sup> |
≤10<sup>3.50</sup> |
10<sup>5.81</sup> |
步骤2)-2 |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.25</sup> |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.00</sup> |
10<sup>3.56</sup> |
10<sup>5.63</sup> |
步骤2)-3 |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.31</sup> |
10<sup>4.19</sup> |
10<sup>3.75</sup> |
≤10<sup>3.50</sup> |
10<sup>5.63</sup> |
表2各批次水貂犬瘟热病毒效价检测结果
批次 |
0h |
24h |
48h |
72h |
96 |
阳性对照 |
步骤5)-1 |
10<sup>4.25</sup> |
10<sup>4.63</sup> |
10<sup>5.38</sup> |
10<sup>5.94</sup> |
10<sup>6.25</sup> |
10<sup>5.81</sup> |
步骤5)-2 |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.63</sup> |
10<sup>5.63</sup> |
10<sup>6.13</sup> |
10<sup>6.50</sup> |
10<sup>5.81</sup> |
步骤5)-3 |
10<sup>4.50</sup> |
10<sup>4.56</sup> |
10<sup>5.25</sup> |
10<sup>5.75</sup> |
10<sup>6.19</sup> |
10<sup>5.63</sup> |
结果可以看出,3批贴壁细胞制备的病毒在悬浮培养条件下,病毒增殖不明显,且有下 降的趋势,说明原有CDV3-CL株病毒不适应悬浮培养条件。经过低血清悬浮细胞连续驯化 培养5代后,制备的水貂犬瘟热病毒三个批次的病毒效价均在接毒96小时出现峰值,且均高 于直接接种由贴壁VeroE6-TY株细胞培养增殖的CDV3-CL病毒株的病毒液。因此,该驯化 毒株已适应于VeroE6-TY株低血清悬浮细胞的水貂犬瘟热病毒病毒株,即驯化的水貂犬瘟热 病毒,将其命名为CDV3-X株,达到规程要求,可做为生产毒种,将该毒种于2017年11月 28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号CGMCCNO.14883,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
毒种检验标准:
筛选得到的驯化的水貂犬瘟热病毒悬浮株应符合下列标准
病毒含量将毒种用细胞维持液作10倍系列稀释,取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度, 每个稀释度接种8孔,每孔0.1mL,然后每孔补充含Vero株细胞的营养液0.1mL,置37℃培 养并观察3-5日,观察细胞病变(CPE),计算TCID50,每毫升病毒含量应不低于105.00TCID50。
免疫原性毒种稀释至每毫升病毒含量为103.50TCID50,皮下接种健康水貂5只,每只1 mL,同时设对照水貂3只。接种21日后,采血、分离血清,测定血清中和抗体效价,对照 水貂血清中和抗体效价应≤1:4,试验水貂中和抗体效价应≧1:46;接种21日后,连同对照水貂均注射100个ID50的犬瘟热病毒HBF-1株脏器毒,观察15日,免疫组5/5获得保护,对 照组全部发病,至少2只出现典型症状。
特异性用细胞维持液将毒种稀释成200个TCID50/0.1mL,与犬瘟热病毒特异性血清等 量混合,37℃中和1小时后接种4个培养孔,每孔0.1mL,各孔加入Vero细胞悬液0.9mL,同时设不中和病毒对照组,置37℃培养5日。病毒对照组应全部出现CPE;试验组应不出现CPE。
纯净度毒种应无细菌、霉菌(按现行《中国兽药典》附录进行)、支原体(按现行《中国兽药典》附录进行)及外源病毒污染。
基础种子代数7~16代。
检验用强毒为水貂犬瘟热病毒HBF-1株脏器毒。
效检用强毒标准:
对水貂的半数感染量(ID50)将水貂犬瘟热病毒强毒HBF-1株,用生理盐水进行10倍系列稀释,取原液、10-1、10-2、10-3四个稀释度,每个稀释度皮下注射健康水貂4只,每只2mL,同时滴鼻0.5mL,观察15日,计算ID50,HBF-1株强毒对水貂的ID50应≤10-2.1ID50/mL。
外源病毒检验毒种应无外源病毒污染。
毒种保存:
基础毒种保存悬浮细胞培养湿毒种-70℃保存期为3年;-70℃以下冻干毒种保存期为3 年。
强毒毒种保存脏器毒种在-70℃以下,保存期为1年。
筛选得到的毒种按上述毒种标准鉴定。符合标准的毒种作为生产用种子。
4.接毒与收毒
取步骤2C)得到的可用作接毒的细胞培养液,按细胞培养液体积的10%比例接入步骤4 筛选得到的驯化的水貂犬瘟热病毒CDV3-X,培养条件为反应器参数设定三路气体,分别为 空气、氧气和二氧化碳,转速为75-85rpm,温度37℃、PH 7.1、溶氧70%,每24小时台盼 蓝染色法细胞计数及活力检查,培养96h后,在无菌条件下收获病毒液,并检测病毒效价TCID50。
按以上方法重复制备三批病毒液并检测,批号分别为XF-1、XF-2、XF-3。细胞密度及细 胞活力结果见表3。
表3细胞密度及细胞活力检测结果
|
细胞密度 |
细胞活力 |
摇瓶生长72h后 |
≧2.0×10<sup>6</sup> |
≧90% |
反应器(5L) |
≧3.0×10<sup>6</sup> |
≧90% |
反应器(10L) |
≧3.0×10<sup>6</sup> |
≧90% |
表4病毒效价TCID50
样品批号 |
病毒效价 |
XF-1 |
10<sup>6.25</sup> |
XF-2 |
10<sup>6.50</sup> |
XF-3 |
10<sup>6.19</sup> |
制备的三批病毒液病毒效价均能稳定达到且超过制苗要求,可用于下一步抗原蛋白复合 物的生产。
用于下一步抗原蛋白复合物生产的毒液按以下方法进行病毒含量检测:
将毒种用细胞维持液作10倍系列稀释,取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度,每个稀释 度接种4孔,每孔0.1mL,补充含Vero株细胞的营养液0.9mL,置37℃培养并观察3-4日,观察细胞病变(CPE)计算TCID50,每毫升病毒含量应不低于105.00TCID50。
半成品检验:
无菌检验先将步骤5收获的病毒液以组为单位分别取样,按《中国兽药典》(2005年第三部)附录15页进行,应无菌生长。
病毒含量测定以组为单位分别取样,检测病毒效价,每毫升病毒含量应≥104.33TCID50。
5.制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物
配制与分装将检验合格的病毒液融化后,若干组病毒液混合组成一批,同时用0.1mol/L NaHCO3调整PH值为7.4,按3份体积病毒液加入2份体积含有5wt%蔗糖的脱脂牛奶作为稳 定剂,充分混合均匀后定量分装与西林瓶中,分装后按现行《中国兽药典》附录迅速进行冷 冻真空干燥。
按以上本发明技术方案制备三批抗原蛋白复合物,批号分别为20171001、20171002和 20171003。
成品检验:
物理性状冻干抗原蛋白复合物呈微黄色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,稀释后为粉 红色液体。
无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行,应无细菌、霉菌生长。(结果见表5)
表5物理性状、无菌检验结果
批号 |
物理性状检测结果 |
无菌检测结果 |
判定 |
20171001 |
微黄色海绵状疏松团块 |
无菌生长 |
合格 |
20171002 |
微黄色海绵状疏松团块 |
无菌生长 |
合格 |
20171003 |
微黄色海绵状疏松团块 |
无菌生长 |
合格 |
安全检验每批抗原蛋白复合物随机取若干瓶,用灭菌注射用水溶解后混合,皮下接种 中和抗体效价≤1:4的2-10月龄健康水貂5只,每只10头份,分5点注射,观察14日,精神、 食欲、体温与粪便应无异常变化。(结果见表6)
表6抗原复合物安全检验结果
批号 |
检测结果 |
判定 |
20171001 |
水貂5/5检项无异常 |
合格 |
20171002 |
水貂5/5检项无异常 |
合格 |
20171003 |
水貂5/5检项无异常 |
合格 |
效力检验
中和抗体效价测定每批抗原蛋白复合物随机取1瓶,按规定头份加灭菌注射用水溶解 复原,皮下注射中和抗体效价≤1:4的2-10月龄健康水貂5只,每只1头份,同时设立不接 种对照水貂3只,免疫后21日分别采血,分离血清,测定犬瘟热病毒血清中和抗体。(结果见表7)
表7效力检测结果
批号 |
中和抗体效价(实验组) |
中和抗体效价(对照组) |
判定 |
20171001 |
1:91 |
≤1:4 |
合格 |
20171002 |
1:128 |
≤1:4 |
合格 |
20171003 |
1:64 |
≤1:4 |
合格 |
对比例
采用三种不同方法进行水貂犬瘟热病毒的培养,分别进行病毒含量TCID50的测定,结果 如下表8。
1、高血清Vero株转瓶贴壁细胞毒:病毒在转瓶中的培养将1瓶MEM培养基培养至72h且长满致密单层的转瓶Vero细胞,弃掉培养液,经PBS洗涤,胰酶消化后,用消化终止 液收集细胞,按1:3比例接种于事先加入过滤除菌的含有8%-10%新生牛血清的1000mL细 胞培养液中。混匀后上转机,置于37℃条件下温室培养,转速7-14转/min。细胞生长72h后, 长满致密单层,弃去细胞培养液,经PBS洗涤,胰酶消化后,用消化终止液收集细胞,按1: 3比例接种于事先加入过滤除菌的含有2-5%新生牛血清的1000mL细胞维持液中并按体积比1.5-3%接种犬瘟热病毒CDV3-CL株,混匀后上转机,温室35℃转机培养。接毒后培养68h-72h, 细胞病变达到75%-85%时,细胞出现空包似蜘蛛网时收获病毒,冻融后进行TCID50检测。 按此方法制备三批,批号分别为TB201704、TB201705、TB201706。
2、微载体悬浮培养Vero株细胞毒:病毒在生物反应器Cytodex-1微载体悬浮培养Vero 株细胞中的培养将转瓶培养72h后,细胞长满致密单层的细胞经PBS洗涤、胰酶消化后, 收集细胞液。反应器洗刷,组装,电极校准及保压实验合格后,2L PBS液预处理5gCytodex-1 微载体,高压灭菌。以初始细胞密度5.0×105cells/mL,接种生物反应器。设定反应器参数: 温度37℃、CO2含量5.0%,pH7.0~7.1、DO 45%、搅拌速率55~75rpm,开启反应器自动 控制。当细胞于微载体颗粒表面长满致密单层,细胞平均密度达2.49×106cells/mL时,以一 定感染复数MOI为0.005接种CDV3-CL株。定时取样检测病毒含量TCID50。按此方法制 备三批,批号分别为ZT201707、ZT201708、ZT201709。
3、低血清VeroE6-TY株生物反应器悬浮细胞毒:方法同实施例1步骤1-4,制备三批, 批号分别为XF201701、XF201702、XF201703。
表8不同方法进行水貂犬瘟热病毒培养样品检测结果
三种细胞培养方式制备病毒抗原复合物的综合对比分析,结果如下表9
表9三种细胞培养方式制备病毒抗原复合物的综合对比分析结果
采用Vero细胞转瓶贴壁培养制备病毒抗原。细胞培养阶段往往需要加入较高浓度新生牛 血清(8-10%),待细胞长满单层后需要弃去培养液,经PBS洗涤,胰酶消化后换用新生牛血 清浓度为2-5%的细胞维持液,不仅工艺繁琐,且由于操作熟料程度不同导致细胞传代生长情 况好坏不一,接毒后病毒增殖快慢不同,最后影响产品质量的均一稳定性。另外,高浓度血 清的使用不仅增加了生产成本,且血清中杂蛋白在后期分离纯化工作中很难去除,接种后副 反应大。另外,血清中可能存在外源病毒和支原体,增加了产品的生物安全风险。由于转瓶 细胞生长面积有限,不利于细胞放大培养,且需要足够的温室与转机,占地多,人工多。
采用生物反应器微载体悬浮培养Vero细胞制备病毒抗原。第一,血清浓度高,具体同 2.1实验方法所述,存在成本高、副反应大及生物安全风险等不利因素。第二,微载体的市场 价格比较昂贵,且国产微载体质量参差不齐,只能依靠国外进口,使得生产成本进一步提高。 第三,微载体生物反应器消化放大难以很好的控制,细胞经胰酶作用后,生长远不如第一次 培养,不利于规模化放大生产,多数企业采取转瓶细胞直接接种大体积反应器,大量的转瓶 消化操作,无疑增加了污染的风险。第四,虽然微载体半成品效价较高,但由于微载体在后 期纯化中较难除净,效价也会有很大损失,一般在0.5个滴度左右,使得微载体生物反应器 培养受到很大的限制。
采用生物反应器低血清悬浮培养VeroE6-TY株细胞制备病毒抗原。第一,自动化程度高, 需要人员少,且可以采用具有工业化价值的低血清(1-5%)培养基,抗原成本比较优势显著。 第二,低血清悬浮培养可大大减少血清中杂蛋白等热源物质,降低了产品后期纯化的难度及 副反应的发生几率,使产品更具有安全性。第三,悬浮培养VeroE6-TY株细胞,细胞增殖良 好,易于放大培养,同时降低劳动强度。第四,降低培养基使用量,收获的病毒液的量就是 消耗培养基的量,而其他工艺消耗培养基的量是收获病毒液的2倍。第五,病毒含量TCID50均不低于其他两种培养工艺,达到生产规程要求。第六,该方法制备的病毒抗原复合物安全 有效,对水貂病毒性肠炎起到了保护作用,具有较好的市场应用和推广前景。