CN101695572B - 一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其伪狂犬病活疫苗产品。将生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，继续培养。接毒后2～3日收获细胞培养毒液，并加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗。本发明使细胞密度大大增加，病毒浓度极大提高；疫苗效价提高，副反应减小；降低劳动强度，减少生产成本；疫苗生产可监控性提高；保证产品质量均一稳定。利用本发明生产的伪狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高，对伪狂犬病强毒攻击具有较好的免疫保护作用。

Description

一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体是涉及一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起多种动物的一种急性传染病。该传染病遍布世界主要养猪国家。免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。
当前伪狂犬病活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，该培养方式是培养细胞贴壁生长于玻璃培养瓶的内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定；但转瓶培养技术已经使用数十年，与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为：(1)转瓶细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，培养细胞密度小，培养病毒滴度低，动物的免疫效果差；(2)转瓶细胞培养，细胞碎片与杂蛋白多，疫苗的杂质多，导致免疫动物的副反应大；(3)转瓶细胞培养，细胞批间差异较大，产品质量不均一、不稳定；(4)转瓶细胞培养，生产效率低，生产成本高。
发明内容
为克服上述转瓶细胞培养技术缺陷，本发明的目的是提供一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其伪狂犬病活疫苗产品。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用细胞生长液培养制苗用细胞；
(2)将所述步骤(1)得到的细胞接种含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，并进行繁殖培养；
(3)接毒后2～3日，收获所述步骤(2)得到的细胞培养毒液；
(4)在所述步骤(3)得到的细胞培养毒液中加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗；
其中，上述方法中使用了含微载体的生物反应器进行培养。
优选的，所述步骤(1)包括如下步骤：将所述生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。
优选的，所述步骤(2)包括如下步骤：将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，继续培养。
优选的，所述步骤(1)和(2)中的培养的温度为36℃～37℃。
优选的，所述步骤(1)中的细胞生长液含90％～92％体积百分比的MEM液、抗菌素和8％～10％体积百分比的犊牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～7.2。
优选的，所述步骤(2)中的接种时的接种量为1％～2％体积百分比的生产用细胞毒种的维持液。
优选的，所述步骤(2)中的细胞维持液含95％～98％体积百分比的MEM液、抗菌素和2％～5％体积百分比的犊牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.2～7.4。
优选的，所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。TideCell生物反应器可达到简化至只需一般针筒以及无血清培养细胞方式，培养之载体细胞均匀分布成长，其有效产能经实验证实，一个TideCell生物反应器，产能约一般传统生物反应器的4倍。
优选的，所述制苗用细胞为猪睾丸细胞系ST、猪肾细胞系PK15或猪肾细胞系IBRS-2。
本发明的目的之二是提供一种伪狂犬病活疫苗制品，该伪狂犬病活疫苗制品通过上述方法得到。
本发明利用生物反应器大规模高密度培养，可最大限度地提高生物反应器中单位体积细胞生长密度，在病毒疫苗生产中具有很大潜力和优势，具体表现为：(1)细胞密度大大增加，病毒浓度极大提高；(2)疫苗效价提高，副反应减小；(3)降低劳动强度，减少生产成本；(4)疫苗生产可监控性提高；(5)保证产品质量均一稳定。利用本发明生产的伪狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高，对伪狂犬病强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
利用生物反应器大规模细胞培养技术，生产伪狂犬病活疫苗的生产工艺技术与方法，包括如下步骤：
(1)选择生物反应器：TideCell固定床微载体生物反应器。
(2)选择细胞系作为制苗用细胞：本实施例中选择猪睾丸(ST)细胞系作制苗用细胞。在另两个实施例中，分别选用猪肾(PK15)细胞系和猪肾(IBRS-2)细胞系。
(3)利用生物反应器培养制苗用细胞：选择适宜的细胞系，生物反应器和微载体经消毒后接种适宜的细胞浓度(106～8×106个细胞/m1)并加入适量的培养基，通过调整细胞培养系统中各培养条件：溶氧浓度为50％～100％、CO2浓度调至为5％、葡萄糖含量为500～3000mg/L，pH值为7.0～7.4，培养高密度的细胞系作为制苗用细胞。
(4)选择制苗用毒种：伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株。
(5)生物反应器繁殖制苗用毒液：将生物反应器中生长良好的上述传代细胞微载体培养罐中的细胞生长液弃去，接种含适量毒种的维持液，继续培养；接毒后2～3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存。
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用细胞测定效价，每1ml含病毒≥1010TCID50。
(6)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，符合“伪狂犬病活疫苗”的规定，对猪安全无副作用，每头份疫苗含病毒≥106TCID50。
其中，上述方法中涉及到的具体的条件如下：
步骤(3)、(5)中所述的培养温度是36～37℃。
步骤(5)中所述的接种量为含1％～2％生产用细胞毒种的维持液。
步骤(3)中所用生长液的配方是：90％～92％MEM液、8％～10％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0～7.2。
步骤(5)中所用维持液的配方是：95％～98％MEM液、2％～5％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2～7.4。
按上述方法制备得到的伪狂犬病活疫苗按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，符合“伪狂犬病活疫苗”的规定，对猪安全无副作用，每头份疫苗含病毒≥106TCID50。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用细胞生长液培养制苗用细胞；
(2)将所述步骤(1)得到的细胞接种含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，并进行繁殖培养；
(3)接毒后2～3日，收获所述步骤(2)得到的细胞培养毒液；
(4)在所述步骤(3)得到的细胞培养毒液中加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗；
其中，上述方法中使用了含微载体的生物反应器进行培养；
所述制苗用细胞为猪睾丸细胞系ST；
所述伪狂犬病病毒弱毒毒种为Bartha-K61弱毒株；
步骤(1)培养条件为：溶氧浓度50％～100％、CO2浓度为5％、葡萄糖含量为500～3000mg/L，pH值为7.0～7.4；
所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的接种时的接种量为1％～2％体积百分比的生产用细胞毒种的维持液。
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