CN104694457A - 一种用于生产山羊痘疫苗的细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗的制备领域，更具体的讲是一株用于生产山羊痘疫苗的细胞株，所述细胞株为非洲绿猴肾细胞VeroB10，其于2014年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9705，本发明的有益效果是：与原代细胞生产方法相比，本发明具有以下优势：山羊痘病毒AV41株用VeroB10细胞进行培养，病毒适应性好，返强风险低；传代细胞疫苗在病毒产量、均一性、纯粹等方面都优于原代细胞疫苗；成本低，无需使用动物；传代细胞疫苗的安全性优于原代细胞疫苗，免疫效力不低于原代细胞疫苗。

Description

一种用于生产山羊痘疫苗的细胞株

技术领域

 本发明涉及疫苗的制备领域，更具体的讲是一株用于生产山羊痘疫苗的细胞株及生产该疫苗的方法。

背景技术

 山羊痘(Goatpox)和绵羊痘 (Sheeppox)是分别由羊痘病毒属（Capripoxvirus）的山羊痘病毒和绵羊痘病毒引起的山羊、绵羊的痘病，自19世纪50年代开始流行，期间虽然得到一定的控制，但仍然持续流行于非洲、中东、亚洲和欧洲的多个国家和地区，近几年，随着全球气候变化以及动物、动物产品贸易方式的改变，这两种痘病的流行更加猖獗，是危害经济动物最严重的痘病。

 近年来该病在我国广泛流行。病毒可以感染不同日龄的山羊和绵羊，以发热、体表或者内脏器官出现痘斑为特征，表现为皮肤型和内脏型两种，严重影响羊的采食和生产机能，甚至造成死亡，羔羊及新引种的羊感染后尤其具有很高的死亡率。预防绵羊痘和山羊痘，应用最多的是弱毒疫苗和灭活疫苗，但是由于羊痘病毒感染动物的特殊抗原形式和免疫应答方式，灭活疫苗免疫保护期短暂，出现免疫失败几率较高。

 我国研发的山羊痘细胞弱毒AV41株作为一种细胞弱毒，具有较好的免疫原性，既能够用于预防山羊痘病毒感染，又能够有效预防绵羊痘病毒感染，已经在全国范围内获得广泛应用。但是到目前为止，国内进行山羊痘细胞弱毒AV41株生产的常用细胞仍然是原代绵羊羔睾丸细胞，需要采用4月龄以内雄性羔绵羊，无菌摘取睾丸组织，经过剥离包膜、剪碎、消化、分散等工艺制成。由于制备细胞需要大量新鲜组织，而羔羊组织的无菌摘取要求复杂、组织中细胞数量有限、羔羊成本较高，严重限制了山羊痘疫苗的批生产产量。为扩大生产用细胞范围，降低成本，先后有人尝试利用原代绵羊睾丸细胞、原代绵羊肾细胞、原代犊牛睾丸细胞生产山羊痘疫苗，但是均有一定的局限性。而且，目前国内绵羊养殖水平不一，羔绵羊感染布氏杆菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒等致病菌及病毒的几率较高，也在很大程度上增加了操作人员生物安全风险和生产检验成本。因此，为了进一步降低生产成本，提高疫苗安全性和稳定性，减少使用实验动物，人们开始寻找可以用于培养山羊痘病毒的传代细胞及生产检验方法。

 非洲绿猴肾细胞系Vero是世界卫生组织允许用于疫苗生产的细胞株，它对多种病毒敏感，我们经过试验，选育出该细胞的密度抑制型非洲绿猴肾细胞系克隆株（命名为VeroB10），该细胞界限清晰，整齐、胞质清晰折光性强，具有生长周期长、无致瘤性等优点，且山羊痘病毒AV41在该细胞中能够稳定、高效增殖，可以用于培养生产山羊痘病毒疫苗。我们用这一传代细胞替代羔绵羊原代细胞，建立了传代细胞源山羊痘活疫苗的生产方法和效力、中和抗体检验方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一株用于生产山羊痘疫苗的细胞株及生产疫苗的方法克服现有山羊痘疫苗生产技术存在的缺陷。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于生产山羊痘疫苗的细胞株，所述细胞株为非洲绿猴肾细胞VeroB10，其于2014年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9705。

本发明所述生产山羊痘疫苗的方法包括如下步骤：

（1）细胞传代与培养：将非洲绿猴肾细胞VeroB10细胞以0.25%胰酶消化后，传代培养，以细胞生长液继续培养，37℃继续培养，细胞长成单层时接种病毒；

（2）建立毒种种子批：采用步骤（1）中已经形成良好单层的细胞培养瓶，弃去细胞生长液，分别接种山羊痘病毒AV41株，吸附1小时后，补加维持液，37℃继续培养，至75%以上细胞出现病变，冻融细胞，收获病毒液，再继续进行传代培养至5代，取第1-3代冻存液为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：选择步骤（1）生长良好并形成单层的非洲绿猴肾细胞VeroB10细胞，消化后分别以转瓶或者生物反应器培养至细胞密度10⁶/ml，弃去细胞生长液，接种步骤（2）所制毒种液，加入细胞维持液，继续培养，待72~120小时内细胞病变达到75%以上时收获细胞毒液，置-15℃保存。

（4）配苗，冻干：当细胞毒液病毒含量≧10^4.5TCID₅₀/0.1ml时，取病毒液按照1:1配比与冻干保护剂混合均匀后定量分装，按照程序冻干后轧盖密封即成。

上述方法，所述细胞生长液的组成为：体积百分含量92%~94%DMEM液，6%~8%新生牛血清，pH值为7.0~7.2。

上述方法，所述细胞维持液组成为：体积百分含量98%~99%DMEM液，1%~2%新生牛血清，pH值为7.1~7.4。

本发明还包括一种非洲绿猴肾细胞VeroB10检验山羊痘疫苗效力的方法，即采用传代细胞法代替原代细胞法和山羊效力检验方法，采用的技术方案是：

（1）利用VeroB10细胞制备96孔板细胞单层；

（2）采用VeroB10细胞单层测定山羊痘病毒疫苗的TCID₅₀；步骤如下；

将细胞用胰酶消后，加入细胞生长液，细胞计数后制成细胞悬液2~3×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100L；

在离心管中将病毒液用细胞维持液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-10；

将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100L；

设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排;（100L生长液+100L细胞悬液）；

37℃，5%CO₂培养，逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天；

按Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀;

（3）当每头份疫苗中山羊痘病毒含量不低于10^4.25 TCID₅₀时，判定该疫苗效力合格。

本发明还包括一种应用非洲绿猴肾细胞VeroB10细胞检验羊血清中抗山羊痘病毒抗体效价的方法，该方法包括：

(1)利用VeroB10细胞制备96孔板细胞单层；

(2)采用VeroB10细胞单层测定山羊痘病毒疫苗的TCID₅₀浓度，其步骤与上述非洲绿猴肾细胞VeroB10检验山羊痘疫苗效力的方法中的步骤(2)相同；

(3)采用细胞单层检测中和效价，步骤如下：

将细胞用胰酶消后，加入细胞生长液，细胞计数后制成细胞悬液2～3×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养成单层细胞备用；

按照病毒液TCID₅₀浓度，将山羊痘病毒用细胞维持液稀释成200TCID₅₀/100μL；

在离心管中用细胞维持液将山羊痘阳性血清作连续对比稀释，设置8个浓度梯度，分别为2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8；

将稀释后病毒液与各个稀释度的血清等体积混合，置37℃孵育1h；

弃去96孔培养板中细胞生长液，加入上述混合液，每一稀释度接种6孔，每孔接种100μL；

37℃，5％CO₂培养，逐日观察并记录结果有无细胞病变的孔数；

连续观察5-7天后，按Reed-Muench两氏法计算半数组织保护量P₅₀和血清中和效价10^lgP50。

本发明的有益效果是：与原代细胞生产方法相比，本发明具有以下优势：

(1)山羊痘病毒AV41株用VeroB10细胞进行培养，病毒适应性好，返强风险低；

(2)传代细胞疫苗在病毒产量、均一性、纯粹等方面都优于原代细胞疫苗；

(3)成本低，无需使用动物；

(4)传代细胞疫苗的安全性优于原代细胞疫苗，免疫效力不低于原代细胞疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步描述，这些实例仅用于例证，不限制本发明保护范围。若未特别指明，实施实例中所用的技术手段为本领域常用技术方法。

实施例1

山羊痘病毒AV41株在不同细胞中的增殖能力比较

（1）毒株与细胞：山羊痘病毒鸡胚弱毒株AV41（未纯化）购自中国兽药监察所，仓鼠肾细胞（BHK21）、猪睾丸细胞（ST）、牛胚肾细胞(MDBK)3种细胞均购自中国兽医药品监察所，VeroB10本实验室筛选保存。VeroB10细胞克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.9705。

（2）细胞生长液：（体积百分含量）92%DMEM液，8%新生牛血清，pH值为7.0；细胞维持液：（体积百分含量）98%DMEM液，2%新生牛血清，pH值为7.3。

（3）病毒增殖：按照常规方法传代制备上述4种细胞单层，分别接种山羊痘病毒AV41株，37℃培养并观察细胞病变，当病变达到75%或培养7天后收获细胞培养液，再次分别接种4种细胞单层，连续传代6代。

（4）病毒在不同细胞上的增殖效果比较

在第1代、第3代、第6代时用间接免疫荧光试验和PCR方法检测病毒细胞培养物中是含有否有山羊痘病毒，对出现细胞病变的细胞，采用原代牛睾丸细胞测定病毒培养物的TCID₅₀浓度，检测结果见表1。

由表1结果可以看出，山羊痘病毒AV41株不能在ST细胞系中增殖，在可以在VeroB10、BHK21、MDBK细胞系中增殖并产生不同程度细胞病变，以VeroB10细胞和BHK21细胞的增殖效果较佳。

实施例2

应用两种传代细胞制备山羊痘活疫苗

（1）毒株与细胞：以分别在BHK21，VeroB10上增殖1代的山羊痘病毒AV41株为种毒，以BHK21，VeroB10细胞为生产用细胞。

（2） 细胞传代培养与观察：分别将BHK21、VeroB10细胞用0.25%胰酶消化液消化分散后，BHK21细胞按照1：4传代，VeroB10细胞按照1:3传代，加入细胞生长液，37℃继续培养至细胞长成单层。

（3）病毒接种及收获：分别取已经形成良好单层的BHK21、VeroB10细胞，弃去细胞生长液，接种山羊痘病毒AV41株，吸附1小时后补加维持液，37℃继续培养，待75%细胞病变时收获病毒，所制备细胞毒液即为半成品。

（4）半成品的检验：按《中华人民共和国兽药典》检验应无细菌、霉菌生长。使用原代绵羊羔睾丸细胞对收获的病毒液进行TCID₅₀浓度测定，当病毒液TCID₅₀浓度低于10^-4.5TCID₅₀/0.1ml时，方可用于配苗。

（5）病毒液配苗冻干：取检验合格的病毒液冻融2次后，按照一定比例加入5%蔗糖脱脂牛奶及适量的抗生素，充分混合后定量分装，按照程序迅速进行冷冻真空干燥，轧盖密封。

（6）成品的检验：按《中华人民共和国兽药典》检验，应该特异良好，且无细菌、霉菌、支原体、外源病毒生长，物理性状、剩余水分、真空度均符合要求。使用原代绵羊羔睾丸细胞对疫苗进行TCID₅₀浓度测定，选择每头份疫苗中病毒含量不低于10^3.5 TCID₅₀的2批疫苗接种山羊进行安全检验和效力检验（批号分别为VE6201301，BHK201301）。

实施例3

 不同生产方法制备的山羊痘活疫苗应用评价

（1）试验用疫苗：用两种传代细胞试制的山羊痘疫苗，批号分别为VB10201301，BHK201301；用原代绵羊羔睾丸细胞制备的山羊痘疫苗，批号为STC201301，均经过无菌检验、特异性检验、外源病毒检验和支原体检验合格，且每头份疫苗中病毒含量不低于10^3.5 TCID₅₀。

（2）试验动物：检验用健康山羊18只。

（3）安全检验：用灭菌生理盐水分别将疫苗稀释成每毫升病毒含量为4×10^3.5 TCID₅₀，胸腹部皮内分别注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，各批次疫苗接种的3只山羊在接种后15日内体温均无明显波动、精神佳、采食正常，注射部位发痘情况见表2，按照《中华人民共和国兽药典》规定，判定三批疫苗安全性合格。

（4）效力检验：用灭菌生理盐水将哥批疫苗稀释成每毫升病毒含量为63.25 TCID₅₀，分别胸腹部皮内注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，各批次3只山羊在疫苗注射15日内体温均无明显波动、精神佳、采食正常，注射部位发痘情况见表3，按照《中华人民共和国兽药典》规定，判定VB10201301和STC201301两批疫苗效力符合要求，BHK201301不符合要求。

实施例4

应用VeroB10测定山羊痘活疫苗效力的平行试验

（1）细胞与样品：以VeroB10细胞为检验用细胞，以原代STC细胞为对照细胞；以不同效价的5批疫苗作为待测样品。

（2）测定方法：分别将VeroB10细胞、原代STC细胞胰酶消化后分装至96孔板细胞制备单层，待细胞生长至90%时，分别依次加入使用细胞维持液按照1:10，1:10²，……1:10⁸梯度稀释的病毒液各100μl，每个梯度作8个重复，培养7天，观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒半数致病变量，各批次样品的TCID₅₀浓度见表4。、

根据结果可以判定，可以采用VeroB10细胞替代原代细胞建立效力检验方法，且当每头份疫苗的山羊痘病毒含量不低于10^4. 25 TCID₅₀时，判定该疫苗效力合格。

实施例5

  （1）山羊痘抗血清的制备，以传代细胞试制的山羊痘疫苗批号为VB10201301，VB10201302

VB10201303免疫12月龄绵羊2只，初次免疫1头份/只，30天后二次免疫2头份/只，两只未免疫绵羊痘疫苗山羊作为对照。二次免疫两周后采血，无菌分离血清。

（2）应用VeroB10测定山羊痘病毒抗体效价步骤如下：

将细胞用胰酶消后，加入细胞生长液，细胞计数后制成细胞悬液2~3×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养成单层细胞备用；

按照病毒液TCID₅₀浓度，将山羊痘病毒用细胞维持液稀释成200TCID₅₀/100μL；

在离心管中用细胞维持液将山羊痘阳性血清作连续对比稀释，设置8个浓度梯度，分别为2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8；

将稀释后病毒液与各个稀释度的血清等体积混合，置37℃孵育1h；

弃去96孔培养板中细胞生长液，加入上述混合液，每一稀释度接种6 孔，每孔接种100μL；

37℃，5%CO₂培养，逐日观察并记录结果有无细胞病变的孔数；

连续观察5-7天后，按Reed-Muench两氏法计算半数组织保护量P₅₀和血清中和效价10^lgP50。

Claims (8)

1.一种用于生产山羊痘疫苗的细胞株，其特征在于：所述细胞株为非洲绿猴肾细胞VeroB10，其于2014年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9705。

2.根据权利要求1所述的山羊痘疫苗的生产方法，包括如下步骤：

（1）细胞传代与培养：将非洲绿猴肾细胞VeroB10以0.25%胰酶消化后，传代培养，加入细胞生长液，37℃继续培养，细胞长成单层时接种病毒；

（2）建立毒种种子批：采用步骤（1）中已经形成良好单层的细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种山羊痘病毒AV41株，吸附1小时后，补加细胞维持液，37℃继续培养，至75%以上细胞出现病变，冻融细胞，收获病毒液，再继续进行传代培养至5代，取第1-3代冻存液为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：选择步骤（1）生长良好并形成单层的非洲绿猴肾细胞VeroB10，消化后分别以转瓶或者生物反应器培养至细胞密度10⁶/ml，弃去细胞生长液，接种步骤（2）毒种液，接种量以感染复数值MOI=0.1为准，分别按照转瓶或生物反应器的培养体积补加细胞维持液，继续培养，待72~120小时内细胞病变达到75%以上时收获细胞毒液，置-15℃保存；

（4）配苗，冻干：当细胞毒液病毒含量≧10^4.5TCID₅₀/0.1ml时，取病毒液按照1:1配比与冻干保护剂混合均匀后定量分装，按照程序冻干后轧盖密封即成。

3.根据权利要求2所述的山羊痘疫苗的生产方法，其特征在于：步骤（1）所述细胞生长液的包括体积百分含量92%~94%DMEM液，6%~8%新生牛血清。

4.根据权利要求3所述的山羊痘疫苗的生产方法，其特征在于：所述细胞生长液的pH值为7.0~7.2。

5.根据权利要求2所述的山羊痘疫苗的生产方法，其特征在于：所述细胞维持液包括体积百分含量98%~99%DMEM液，1%~2%新生牛血清。

6.根据权利要求5所述的山羊痘疫苗的生产方法，其特征在于：所述细胞维持液的pH值为7.1~7.4。

7.根据权利要求1所述非洲绿猴肾细胞VeroB10检验山羊痘疫苗效力的方法，该方法包括：

(1)将非洲绿猴肾细胞VeroB10制备96孔板细胞单层；

(2)采用上述细胞单层测定山羊痘病毒疫苗的半数组织感染量TCID₅₀，步骤如 下；

将细胞用胰酶消后，加入细胞生长液，细胞计数后制成细胞悬液2～3×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100μL；

在离心管中将病毒液用细胞维持液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-10；将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μL；

设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排；

37℃，5％CO₂培养，逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天；

按Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀；

(3)当每头份疫苗中，应用上述细胞测定的山羊痘病毒含量不低于10^4.25TCID₅₀时，判定该疫苗效力合格。

8.根据权利要求1所述非洲绿猴肾细胞VeroB10检验羊血清中抗山羊痘病毒抗体效价的方法，该方法包括：

(1)将非洲绿猴肾细胞VeroB10制备96孔板细胞单层；

(2)采用非洲绿猴肾细胞VeroB10单层测定山羊痘病毒疫苗的TCID₅₀浓度；

(3)采用细胞单层检测中和效价，步骤如下：

将细胞用胰酶消后，加入细胞生长液，细胞计数后制成细胞悬液2～3×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养成单层细胞备用；按照病毒液TCID₅₀浓度，将山羊痘病毒用细胞维持液稀释成200TCID₅₀/100μL；在离心管中用细胞维持液将山羊痘阳性血清作连续对比稀释，设置8个浓度梯度，分别为2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8；

将稀释后病毒液与各个稀释度的血清等体积混合，置37℃孵育1h；

弃去96孔培养板中细胞生长液，加入上述混合液，每一稀释度接种6孔，每孔接种100μL；

37℃，5％CO₂培养，逐日观察并记录结果有无细胞病变的孔数；

连续观察5-7天后，按Reed-Muench两氏法计算半数组织保护量P₅₀和血清中和效价10^lgP50。