CN110101855A - 小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其制备方法。本发明采用小反刍兽疫病毒PPRV 75/1‑Clone 9株和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾细胞培养收获的病毒液经灭活处理后浓缩，两者再混合后加佐剂经乳化制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联灭活疫苗。该方法采用山羊肾细胞培养山羊痘病毒，改进了生产工艺，克服了用原代细胞制备抗原带来的外源病毒污染、批次不稳定等问题；浓缩及灭活工艺确保的疫苗效力，解决了活疫苗潜在的毒力返强的风险，该产品的研发成功，为规模化厂羊痘及小反刍兽疫的净化提供了物质保障，也为我国小反刍兽疫根除计划的实施提供基础。

Description

小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
小反刍兽疫和山羊痘是山羊的两种传染性疫病。
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)也称为小反刍兽伪牛瘟、卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症，是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)引起的小反刍兽一种急性传染病。联合国粮农组织(FAO)和国际兽医局(OIE)都将此病列为A类烈性传染病，在我国该病也被列为一类动物传染病。
1942年，世界上首次在西非的科特迪瓦报道发生小反刍兽疫。随后的几年里，在尼日利亚、塞尔维亚和加纳等非洲国家都报道发生此病。近几年来，小反刍兽疫又有进一步蔓延发展的趋势，并且流行形势日益严峻。到目前为止，中非、东非、西亚以及南亚的许多国家都报道发生过小反刍兽疫。世界各国对此病都予以高度重视，美国、韩国、印度等国家都在积极进行相关方面的研究工作。我国在2007年7月首次在西藏阿里地区报道发生小反刍兽疫，给我国的养羊业造成了重大的损失。
PPRV主要感染山羊和绵羊等小反刍兽，但是不同品种的羊敏感性有显著差别。山羊比绵羊更易感，其中欧洲品系的山羊更为易感。幼龄动物易感性较高，但是哺乳期的动物抵抗力较强。PPR一般多发生在雨季以及干燥寒冷的季节。山羊的发病率可以达到100％，死亡率在20％-90％不等，严重爆发时死亡率也能够达到100％。耐过动物经过一段时间可以恢复健康。
研究表明，山羊在感染PPRV后的四年时仍能够检测到抗体。防制PPR的主要措施就是进行疫苗免疫接种。由于PPRV和牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)之间的抗原相关性很强，可用RPV组织培养的牛瘟活疫苗对绵羊、山羊进行免疫，并获得了很好的免疫保护效果，但是这种疫苗不利于在全球牛瘟消灭计划的实施，主要在非洲一些少数国家和地区有所使用。目前OIE在发生小反刍兽疫的国家和地区推荐使用的疫苗是PPRV 75/1株的生产的弱毒活疫苗。有研究人员还利用基因反向遗传技术研究成功PPRV/RPV的嵌合体疫苗，即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相应糖蛋白基因。利用这种方法构建的疫苗，对PPRV能够产生良好的免疫原性。此外，G.Berhe等将小反刍兽疫的F基因克隆到山羊痘病毒中构建了基因重组疫苗，能够抵抗小反刍兽疫强毒的感染，但是还没有应用到临床生产实践中。
小反刍兽疫活疫苗是由1975年从尼日利亚分离到的PPRV 75/1株病毒接种Vero细胞并连续传代达70代以后致弱获得的疫苗毒株。目前OIE参考实验室已经传代至120代，病毒仍然保持一定的免疫保护力。毒株在细胞上繁殖以后以冻干的形式－20℃条件下保存。
山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Goat pox virus)引起的山羊的一种高度接触性传染病。临床特征与绵羊痘相似。主要表现为皮肤和粘膜上出现疱疹，进而形成痘肿，并渐进发展为化脓，结痂和引起全身痘及全身性反应。但临床上也有痘肿不经化脓过程的，即所谓“石痘”。重症患羊多出现内脏器官病变和死亡。本病在地中海地区，非洲、和亚洲的一些国家，以及中、近东一带均有发生。也偶见欧洲部分地区和澳大利亚。呈散发或地方性流行。其病状和死亡率，因毒株及宿主不同而有差异。有报告称土耳其的死亡率为3％～40％(Chefik)；摩洛哥的死亡率为5％～70％(Grimpret)等。
本病在我国五十年代，仅见三北地区(西北、华北、东北)流行。但最近几年，南方数省、区亦有发生。山羊痘在我国的发病率可高达37.59％(陕西榆林地区，1985)。死亡率多在3％(青海省，1953年)～15.13％(陕西榆林地区，1985)之间。山羊痘严重影响了我国养羊业和制革工业的发展。
山羊痘病毒为双股DNA病毒，属豆病毒科，山羊痘病毒属成员。该病毒嗜上皮性，没有血清型的区别。病毒容易在羔羊及犊牛的睾丸细胞和肾细胞上生长、繁殖，并致明显的细胞病变(CPE)。病毒也可在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上繁殖，但继代时要与羊体交替进行。否则，继代的代数有限。
山羊痘疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。前者，是国外至今广为使用的疫苗。后者，是我国1984年以来使用的疫苗。
目前市场上已有小反刍兽疫活疫苗和山羊痘活疫苗，需要多次分别注射，使用不方便，而多联疫苗虽然使用比较方便，但疫苗各免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。因此在制备小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗时，应保证两者不产生免疫干扰现象，即不降低各自的免疫效果。
发明内容
本发明目的在于用小反刍兽疫病毒弱毒Clone9株接种Vero细胞培养，山羊痘病毒弱毒AV41株接种山羊肾细胞培养，收获细胞培养物，将培养物浓缩后分别经β-丙内酯灭活，以适当比例混合后与矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防小反刍兽疫和山羊痘。
本发明技术方案
1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株灭活病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goat poxvirus)弱毒株灭活病毒，可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。
2.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants)PPRV 75/1-Clone 9株，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13388。
3.本发明所述的小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊痘病毒弱毒株活病毒为山羊痘病毒(Goat pox virus)温度敏感弱毒株，保藏编号为：CVCCNo.AV41。
4.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述小反刍兽疫病毒75/1Clone9株(CGMCC No.13388)和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(AV41)病毒作为疫苗生产毒株，分别接种Vero细胞和山羊肾细胞单层，当细胞出现细胞病变达70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，分别收获病毒液经灭活处理；再将其混合后加疫苗佐剂、乳化后制成小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗。
5.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中的佐剂为206佐剂。
本发明的有益效果
本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其制备方法。本发明采用小反刍兽疫病毒PPRV 75/1-Clone 9株和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾细胞培养收获的病毒液经灭活处理后浓缩，两者再混合后加佐剂经乳化制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联灭活疫苗。该方法采用山羊肾细胞培养山羊痘病毒，改进了生产工艺，克服了用原代细胞制备抗原带来的外源病毒污染、批次不稳定等问题；浓缩及灭活工艺确保的疫苗效力，解决了活疫苗潜在的毒力返强的风险，该产品的研发成功，为规模化厂羊痘及小反刍兽疫的净化提供了物质保障，也为我国小反刍兽疫根除计划的实施提供基础。
本发明涉及生物材料资源信息
小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)PPRV 75/1-Clone 9株，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13388；反刍兽疫强毒康塔乌(Кентау)株，获赠自哈萨克斯坦生物安全研究所。山羊痘病毒(Goat pox virus)温度敏感弱毒株(CVCC AV41)；山羊痘病毒强毒青海株(CVCC AV40)；Vero细胞(CVCC CL28)：F168代，中国兽医药品监察所制备并提供，Vero细胞和山羊肾细胞(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p150,150,348)。
具体实施方式
本品系用小反刍兽疫病毒弱毒Clone9株接种Vero细胞培养，山羊痘病毒弱毒AV41株接种山羊肾细胞培养，收获细胞培养物，分别将培养物浓缩后经β-丙内酯灭活，以适当比例混合后与矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防小反刍兽疫和山羊痘。
1.小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备
(1)生产用毒种小反刍兽疫病毒75/1-Clone 9株(CGMCC No.13388)生产用基础种毒和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC AV41)生产用基础种毒。
(2)生产用细胞Vero细胞：中国兽医药品监察所保存(CVCC CL 28)；山羊肾细胞：用新鲜山羊肾脏制备。
(3)小反刍兽疫病毒液的制备将PPRV 75/1-Clone 9株毒种用无血清MEM水化后，按0.1％、0.5％、1％、2％同步接种不同细胞浓度的Vero细胞悬液，细胞悬液浓度分别调整为20～30万/ml、50～60万/ml。混匀后分别分装细胞瓶，置37℃培养箱培养，每天观察细胞病变，病变达到70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，收获病毒液，并经浓缩处理至原体积的1/10。
(4)山羊痘病毒液制备将山羊痘毒种用无血清MEM培养液水化后，按细胞维持液总量0.1％、0.5％、1％、2％的比例接种山羊肾细胞，接种时间分别为山羊肾细胞铺满程度为80％、100％，接种后置37℃培养箱培养，每天观察细胞病变，病变达到75％以上时，将细胞瓶移至-20℃冻融3次，收获病毒液，，并经浓缩处理至原体积的1/10。
(5)病毒液检验分别提取两种进行病毒液样品进行无菌检验、支原体检验和病毒含量测定。
1)无菌检验及支原体检验按现行《中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典》二〇一五年版(三部)中国农业出版社，2016，本发明以下称《中国兽药典》)进行检验。
2)病毒含量测定将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释，取10-1～10－ 88个稀释度病毒液，接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。
(6)灭活两种浓缩后病毒液分别将入灭活剂进行灭活处理。
(6)配苗与乳化将检验合格的灭活PPR病毒液、灭活山羊痘病毒液与佐剂按(V/V/V)1:1:2混合后充分混匀进行乳化、分装而成。
2.成品检验
(1)性状
1)外观应为乳白色或淡粉红色均匀乳状液。
2)剂型为双相油乳剂(W/O/W)。用一清洁吸管吸取少许疫苗，滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
3)稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，水相析出应不超过0.5ml。
4)粘度按现行《中国兽药典》(三部)附录进行检验，应符合规定。
(2)安全检验
1)选取体重为250～300g豚鼠2只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，所有动物均应健活。
2)选取体重为18～22g小白鼠5只，每只皮下注射0.5ml，观察14日，所有动物均应健活
3)将疫苗颈部肌肉接种1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒、羊痘病毒中和抗体滴度均≤l:4)5只，每只2头份(2ml)，接种前3天每日上午测定体温1次，取平均值作为基础体温。接种后连续观察14日，每日测定体温1次，除一过性体温升高外(体温升高，超过基础体温1.5℃，连续不超过两个温次)，应无异常临床反应。
(3)效力检验
1)小反刍兽疫效力检验
将疫苗经颈部肌肉接种1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒、羊痘病毒细胞中和抗体滴度均≤l:4)5只，1ml/只，与5只对照羊同条件饲养28日后，采血，测定小反刍兽疫病毒中和抗体效价；5只免疫山羊至少有4只血清PPRV中和抗体效价应不低于1:40。5只对照山羊血清PPRV中和抗体滴度均应不高于1:4。
2)山羊痘效力检验
上述免疫羊和对照羊采血后，每只羊后腿内侧皮内接种山羊痘强毒(安徽株)(含1000ID50/0.5ml)0.5ml。攻毒后连续观察10日，观察期结束后剖检观察继发痘情况，免疫组应至少有4只羊保护。对照组山羊应至少有4只发病。
实施例
一下实施例为进一步对本发明作出说明，不对本发明构成限制。
实施例1——制苗用种毒
1.小反刍兽疫病毒Clone9株毒种
(1)病毒含量将毒种用无血清MEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5三个稀释度，接种96孔细胞培养板，每稀释度接种5孔，每孔0.1ml；每孔再加入浓度为20～30万/ml的Vero细胞悬液0.1ml。置37℃、5％CO2培养箱培养6日，期间每日观察细胞病变，根据出现细胞病变的孔数按Reed-Muench法计算TCID50，每1ml病毒含量应不低于105.5TCID50。
(2)安全性选取1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒中和抗体小于1:4)。将毒种用无血清MEM细胞培养液稀释成105.0TCID50/ml，颈部皮下接种山羊3只，每只1ml。接种后观察14日，每日测定体温，接种山羊除一过性体温升高外(体温升高，超过基础体温1.5℃，连续不超过两个温次)，应无其它异常临床反应。
(3)特异性将毒种用无血清MEM细胞培养液稀释成每0.1ml含200TCID50，加入等体积小反刍兽疫阳性血清，病毒对照管加入等体积无血清MEM细胞培养液，37℃作用1小时，接种96孔细胞培养板，病毒中和液和病毒对照液各接种8孔，每孔0.1ml，同时设立8孔正常细胞对照，所有孔均加入浓度为20～30万/ml Vero细胞悬液0.1ml，在37℃、5％CO2培养箱培养6日，期间每日观察细胞病变，病毒对照孔均应出现细胞融合等典型细胞病变，中和组及正常细胞对照孔均不得出现细胞病变。
(4)免疫原性选取1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒中和抗体效价小于1:4)。将毒种用生理盐水稀释成103.0TCID50/ml，颈部皮下接种山羊5只，每只1ml，设立同条件对照山羊3只。接种后21日分别采血测定中和抗体效价(附注1)，免疫羊血清中和抗体效价应不低于1:10，对照羊中和抗体效价应不超过1:4。
2.山羊痘睾丸细胞培养弱毒株AV41
(1)病毒含量将毒种用不含血清的MEM培养液作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5 3个滴度，接种绵羊羔睾丸细胞或山羊肾细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，37℃吸附1h,每孔加入0.1ml含2％牛血清MEM营养液；同时设不接毒的细胞对照，置37℃、5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，记录细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。每1ml病毒液病毒含量应不低于104.5TCID50。
(2)最小发痘量用MEM培养液将毒种作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5 3个滴度，每个滴度胸腹部皮内接种1～4岁健康易感山羊3只(山羊痘病毒中和抗体<1:4)，每只2颗，每颗0.5ml(也可在每只羊体上同时注射10-3、10-4、10-5 3个滴度，每个滴度2颗，每颗0.5ml)。观察15日，其10-4或10-5稀释度至少应有1只羊发痘，但其痘不应出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等反应。
(3)安全性将毒种用无血清MEM细胞营养液做25倍稀释，胸腹部皮内注射1～4岁健康易感山羊(山羊痘病毒中和抗体<1:4)3只，每只2颗，每颗0.5ml，观察15日，应至少有2只山羊的注射部位发痘，但其痘肿均不应出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等反应。
(4)特异性将毒种用MEM细胞培养液稀释至100TCID50/ml，与等量的抗山羊痘病毒特异性血清混合，37℃作用1h，接种山羊肾细胞或绵羊羔睾丸细胞4瓶(25cm2)，1ml/瓶，同时设立病毒对照2瓶，置37℃培养4～6日，每日观察细胞病变情况，中和试验组应不出现细胞病变，病毒对照组应全部出现以细胞圆缩为特征的细胞病变。
实施例2——疫苗制造及半成品检验
1.小反刍兽疫病毒液的制备和检验
(1)制备
将生产用毒种按1％加入含5％～6％牛血清的MEM细胞生长液配制的Vero细胞悬液，分装细胞转瓶，或按1％加入含2％牛血清MEM细胞维持液，接种已长成良好单层的Vero细胞转瓶，在37℃条件下按照8～10r/h旋转培养5～6日，当细胞病变程度达到70％以上时，将细胞瓶移至-20℃，冻融3次后收获病毒液，取样进行半成品检验，将收获的病毒液置-20℃以下冻结保存。
(2)检验
1)无菌检验逐瓶取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌生长。
2)病毒含量将病毒液用无血清MEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5四个稀释度，接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，每孔再加入细胞浓度为20～30万/ml Vero细胞悬液0.1ml。同时设立正常细胞对照，置37℃、5％CO2培养箱培养6日，期间每日观察细胞病变，根据出现细胞病变的孔数，按Reed-Muench法计算TCID50，每1ml病毒含量应不低于105.5TCID50。
3)病毒浓缩将半成品检验合格的病毒液以6000r/min离心30min，再用超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/10。
4)灭活按照浓缩病毒液总量的1/4000加入β-丙内酯，2～8℃作用24h。再置37℃水解2h，取样进行灭活检验。将灭活病毒液置2～8℃保存，应不超过30日。
5)灭活检验取灭活病毒原液，按细胞生长液总量的10％接种Vero单层细胞4瓶(25cm2)，37℃吸附1小时后，加入含2％血清的MEM细胞维持液，置37℃培养6日后，将接种细胞按常规方法分散传代2代，待细胞形成单层后再培养6日，期间每日观察细胞病变，原代培养和传代培养均应不出现细胞病变。
2.山羊痘病毒液制备和检验
(1)制备
选用生长良好的山羊肾细胞，弃去生长液，更换为含1％～2％山羊痘毒种的细胞维持液，置37℃以8～10r/h旋转培养4～5日。接毒后每日观察，记录细胞病变情况。接毒细胞一般在接种后第4日出现病变，待5～8日细胞病变达75％左右，将细胞转瓶置-20℃反复冻融3次，收获病毒液。
(2)检验
1)无菌检验逐瓶取样，按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
2)病毒含量测定每毫升病毒含量不低于104.5TCID50者可用于配苗。
表1半成品制备与检验
备注：“-”表示无菌生长或灭活完全；“+”表示有菌生长或灭活不完全。
(3)病毒浓缩将半成品检验合格的病毒液以6000r/min离心30min，再用超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/10。
(4)灭活按照浓缩病毒液总量的1/4000比例加入β-丙内酯(百灵威化学公司生产)，2-8℃作用24h。再置37℃水解2h，取样进行灭活检验。将灭活病毒液置2～8℃保存，应不超过30日。
取灭活病毒原液，按细胞生长液总量的10％接种山羊肾细胞4瓶(25cm2)，37℃吸附1小时后，加入含2％血清的MEM细胞维持液。37℃培养6日后，将接种细胞按常规方法分散传2代，待细胞形成单层后再培养6日，期间每日观察细胞病变，原代培养和传代培养均应不出现细胞病变。
3.配苗
将疫苗佐剂进料到乳化缸中，高压灭菌冷却后，在搅拌条件下，将两种灭活病毒液按1:1混合后缓慢进料到乳化缸中，投完料后循环搅拌使之与206佐剂(上海赛比克ISA 206佐剂)充分混合，再通过均质机乳化成双相油乳剂灭活疫苗。
附注：
山羊肾细胞的制备
选取新生山羊羔1只，无菌采集肾脏，置超净工作台内备用。放入灭菌的玻璃器皿内，剪除外膜、肾盂，将肾皮质剪成1～2mm小块，用汉氏液冲洗肾脏皮质4次，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉氏液洗2～3次，加入0.25％胰酶溶液50ml。置37℃水浴消化20～30min，弃去胰酶溶液，用汉氏液洗2～3次，再加入适量MEM营养液(含8％胎牛血清)吹打，用4～6层纱布滤过，制成含活细胞100万～150/ml万个的细胞悬液，分装于培养瓶内，置37℃进行培养成山羊肾细胞。
实施例3——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗成品检验
1.性状
外观应为乳白色或淡粉红色均匀乳状液。
剂型为双相油乳剂(W/O/W)。用一清洁吸管吸取少许疫苗，滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，水相析出应不超过0.5ml。
粘度按现行《中国兽药典》(三部)附录进行检验，应符合规定。
2.安全检验
(1)选取体重为250～300g豚鼠2只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，所有动物均应健活。
(2)选取体重为18～22g小白鼠5只，每只皮下注射0.5ml，观察14日，所有动物均应健活
(3)将疫苗颈部肌肉接种1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒、羊痘病毒中和抗体滴度均≤l:4)5只，每只2头份(2ml)，接种前3天每日上午测定体温1次，取平均值作为基础体温。接种后连续观察14日，每日测定体温1次，除一过性体温升高外(体温升高，超过基础体温1.5℃，连续不超过两个温次)，应无异常临床反应。
检验结果见表1。
3.效力检验
(1)小反刍兽疫效力检验
将疫苗经颈部肌肉接种1岁龄左右健康易感山羊(小反刍兽疫病毒、羊痘病毒细胞中和抗体滴度均≤l:4)5只，1ml/只，与5只对照羊同条件饲养28日后，采血，测定小反刍兽疫病毒中和抗体效价；5只免疫山羊至少有4只血清PPRV中和抗体效价(附注1)应不低于1:40。5只对照山羊血清PPRV中和抗体滴度(附注1)均应不高于1:4。
(2)山羊痘效力检验
上述免疫羊和对照羊采血后，每只羊后腿内侧皮内接种山羊痘强毒(安徽株)(含1000ID50/0.5ml)0.5ml。攻毒后连续观察10日，观察期结束后剖检观察继发痘情况，免疫组应至少有4只羊保护。对照组山羊应至少有4只发病(附注2)。
检验结果见表2。
表2小反刍兽疫、羊痘二联灭活疫苗中间试制产品成品安全检验和效力检验结果
附注1小反刍兽疫血清中和试验操作方法
1.将小反刍兽疫Clone9株病毒液用无血清MEM细胞培养液稀释成102.0TCID50/0.1ml。
2.将被检羊血清、阳性对照血清、阴性对照血清在56℃水浴灭能30分钟。
3.试验操作
(1)将非免疫羊血清和阴性血清用无血清MEM细胞培养液作1:2、1:4、1:8稀释，将免疫羊血清和阳性对照血清先作1:5稀释，再进行2倍系列稀释，将各稀释度被检血清及阳性和阴性对照血清分别加入96孔细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml。
(2)同时设立病毒回归对照，即将100TCID50/0.1ml病毒工作液用无血清MEM细胞培养液10倍系列稀释成10TCID50/0.1ml、1TCID50/0.1ml、0.1TCID50/0.1ml，取病毒工作液和3个稀释度病毒液，每个滴度接种5孔，每孔0.1ml。
(3)向所有血清孔加入100TCID50/0.1ml病毒工作液0.1ml，向细胞对照孔加入0.2ml无血清MEM细胞培养液，向病毒对照孔中加入0.1ml无血清MEM细胞培养液，37℃作用1小时。
(4)向所有孔加入浓度为20～30万/ml的Vero细胞悬液0.1ml，置37℃、5％CO2培养箱培养6日，期间每日观察细胞病变。
4.试验结果判定
10TCID50以上病毒对照及阴性血清对照孔均应出现小反刍兽疫病毒特有的细胞融合等细胞病变，1TCID50病毒对照部分孔出现细胞病变，0.1TCID50病毒对照、阳性血清对照1:160稀释度以下细胞孔和细胞对照孔应不出现细胞病变。记录被检血清各稀释度细胞病变孔数，以5个试验孔均未出现细胞病变的血清最高稀释度为中和抗体效价。
附注2羊痘发病与保护判定标准
1.羊痘发病判定标准
同时符合下列情况之二者，判为发病。
(1)体温升高(超过基础体温1.5℃)持续2～3日，羊食欲减少，精神沉郁。
(2)除注射点形成痘肿外，在身体其他部位出现痘肿；
(3)注射点形成丘疹或隆起的结节，并出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等。
2.免疫羊判定标准
同时符合下列情况，判为保护。
(1)体温升高(超过基础体温1.5℃)持续不超过2日。
(2)注射点形成痘肿，痘肿直径小于4.0cm，为无色或微红色痘肿。
(3)精神食欲正常，无继发痘。
实施例4——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗安全性试验研究
1.一次单剂量接种的安全性试验
选取健康易感山羊、绵羊各15只，各将其随机分为3组，5只/组，每批疫苗免疫山羊和绵羊各5只，每只羊颈部肌肉注射小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗1ml，同时设立山羊和绵羊对照各3只，免疫后观察14天，免疫羊体温正常，采食、精神状态均良好，未见不良反应。临床症状观察结果见表3。
表3一次单剂量接种安全性试验结果
2.单剂量重复接种安全性试验
4～12月龄左右山羊和绵羊经颈部肌肉接种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗后，观察至第14天，再次以相同方式接种该疫苗，临床观察免疫羊体温正常，采食、精神状态良好，未见不良反应。临床症状观察结果见表4。
表4单剂量重复接种安全性试验结果
3.一次超剂量接种安全性试验
选取健康易感山羊、绵羊各15只，各将其随机分为3组，5只/组，每批疫苗免疫山羊和绵羊各5只，每只羊颈部肌肉注射小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗2ml，同时设立山羊和绵羊对照各3只，免疫后观察14天，除个别免疫羊有一过性体温升高外，其余免疫羊采食及精神状态均良好，未见不良反应。临床观察结果见表5。
表5一次超剂量接种安全性试验临床观察结果
4.怀孕羊单剂量接种安全性试验
选取怀孕2～3个月健康易感山羊和绵羊各15只，各将其随机分为3组，5只/组，每批疫苗免疫山羊和绵羊各5只，每只羊颈部肌肉注射小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗1ml，同时设立同条件山羊和绵羊对照各5只，接种后观察14天，未见异常临床症状，免疫后无流产或死胎现象发生，也未观察到其他不良反应；跟踪观察至怀孕母羊分娩，接种母羊所产羊羔数和对照母羊所产羊羔数无明显差异，接种母羊所产羊羔均正常，采食及健康状况与对照无差异(表6，表7)。
表6小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗接种怀孕羊产羔数
表7小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗接种怀孕羊安全性试验临床观察结果
5.羔羊一次单剂量接种的安全性试验
选取健康易感1月龄山羊羔、绵羊羔各15只，各将其随机分为3组，5只/组，每批疫苗免疫山羊和绵羊各5只，每只羊颈部肌肉注射小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗1ml，同时设立同条件山羊和绵羊对照各3只，接种后观察至第14天，所有免疫羔羊体温正常，未见异常临床症状。
6.非靶动物的安全性试验
采用小白鼠和豚鼠进行非特异性安全检验。
每批疫苗接种体重为200～250g健康豚鼠2只，每只皮下注射疫苗1ml，接种后观察至第14天，均未见因注射疫苗引起的不良反应。
每批疫苗接种18～22g小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5ml，接种后观察至第14天，均未见因注射疫苗引起的不良反应。
本实验研究了小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗对健康易感山羊、绵羊的一次单剂量接种、单剂量重复接种、一次超剂量接种、怀孕靶动物单剂量接种、羔羊一次单剂量接种及非靶动物的安全性研究。试验结果表明该疫苗对不同种类、不同年龄的羊均安全，接种羊在试验过程中精神、食欲均正常，除个别接种羊表现一过性体温升高外，未见其他局部或全身不良反应；怀孕母羊观察至分娩，接种母羊与对照母羊所产羔羊数量无明显差异，所产羔羊均健活，采食及健康状况良好，无死胎或流产现象发生。接种小白鼠和豚鼠未见异常临床反应，全部健活，表明本疫苗安全性良好；可用于临床预防羊的小反刍兽疫和羊痘。
实施例5——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗小反刍兽疫部分免疫剂量与PPRV中和抗体及免疫攻毒保护相关性
筛选4～10月龄小反刍兽疫病毒抗体阴性山羊65只，随机分为13组，5只/组。取小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗3批，每批疫苗各免疫山羊4组，每组免疫剂量分别为3ml/只，2ml/只，1ml/只，0.5ml/只，每个剂量颈部肌肉接种5只山羊，另留1组做对照，各剂量组接种山羊均单独羊舍隔离饲养。
小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗免疫后28天采血。测定PPRV中和抗体。
筛选6-12月龄小反刍兽疫病毒抗体阴性山羊16只，随机分为4组，4只/组。攻毒前连续3天测定山羊正常体温。
取稀释毒种4个适宜稀释度，每个稀释度接种易感山羊1组(4只)，每只山羊颈部皮下注射稀释病毒液1ml。攻毒后连续观察14天，观察有无发热、口炎、腹泻等临床症状。用反刍兽疫强毒康塔乌(Кентау)株(由哈萨克斯坦生物安全研究所制备并提供)攻毒后14天，剖检，看肺部有无肺炎等病理变化。
根据攻毒后山羊发病或死亡情况，按Reed-Muench法计算小反刍兽疫强毒LD50。
小反刍兽疫部分攻毒试验结果表明，小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗以3ml/头免疫山羊，免疫羊中和抗体均在1:160以上，对PPRV强毒的攻击产生100％的保护；以2ml/头免疫山羊，免疫羊中和抗体均在1:160以上，对PPRV强毒的攻击产生100％的保护；以1ml/头免疫山羊，免疫羊80％中和抗体均在1:40以上，对PPRV强毒的攻击产生80％的保护；以0.5ml/头免疫山羊，免疫羊53.3％％中和抗体在1:40以上，对PPRV强毒的攻击产生53.3％的保护。
所有免疫的60只羊中，PPRV中和抗体在1:40以上的有50只，对PPRV强毒攻击均产生有效保护；PPRV中和抗体在1:40以下的有10只，PPRV强毒攻击后均发病(表8)。
根据上述试验结果，以1ml/头免疫山羊，对PPRV强毒攻击产生80％保护；确定以1ml为疫苗最小免疫剂量。根据PPRV中和抗体和攻毒保护的相关性，确定免疫羊血清小反刍兽疫中和抗体滴度不低于1:40为小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗小反刍兽疫部分效力检验标准。
表8 PPRV不同免疫剂量中和抗体测定及免疫攻毒保护结果
实施例6——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗羊痘部分免疫剂量与免疫攻毒保护相关性研究取小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗各3批，每批疫苗分别按3ml/头、2ml/头、1ml/头、0.5ml/头经颈部肌肉接种山羊各5只，接种后观察免疫山羊健康状况。
疫苗所有免疫山羊在免疫期间未见不良反应，均健活。
免疫后28天，颈静脉采血后，连同条件相同对照羊5只，每只山羊后腿内侧皮内接种羊痘强毒(安徽株)0.5ml(含1000ID50)，连续观察10日，每日观察临床症状，10日后剖检。
免疫后28天采血，分离血清，测定POX中和抗体效价，结果见表9和表10。
表9免疫羊POX中和抗体效价与攻毒保护相关性统计
POX中和抗体效价 1:160 1:80 1:40 1:20 1:10 1:5
发病羊数 0 1 0 4 1 3
保护羊数 4 9 8 12 13 5
表10不同免疫剂量与攻毒保护相关性统计
羊痘部分攻毒试验结果表明，小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗免疫山羊后，其中和抗体水平和免疫攻毒保护虽然有一定的相关性，但不呈正相关，无法根据小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗免疫羊后的羊痘中和抗体水平进行效力评价，确定采用免疫攻毒方式评价小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗羊痘部分疫苗效力。
小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗以3ml/头免疫山羊，对羊痘强毒的攻击产生100％的保护；以2ml/头免疫山羊，对羊痘强毒的攻击产生100％的保护；以1ml/头免疫山羊，对羊痘强毒的攻击产生80％的保护；以0.5ml/头免疫山羊，对羊痘强毒的攻击产生60％的保护；根据上述试验结果，确定以1ml为疫苗最小免疫剂量。
实施例7——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗最小免疫剂量研究
取200804、200805、200806批小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，经颈部肌肉分别接种健康易感山羊和绵羊，每批疫苗接种山羊和绵羊各20只，分别按0.2ml/只、0.5ml/只、1ml/只、2ml/只的剂量进行接种，每个剂量接种5只。
免疫后4周采血，分离血清并测定PPRV和羊痘病毒中和抗体。在免疫后28天用山羊痘强毒(安徽株)进行攻击，根据PPRV中和抗体效价和羊痘攻毒结果确定疫苗最小免疫剂量。
发现1ml免疫剂量组PPRV中和抗体滴度均大于或等于1:40；羊痘攻毒保护达到4/5～5/5。1ml免疫后，母羊PPRV中和抗体滴度均大于或等于1:40；羊痘攻毒保护达到4/5～5/5，妊娠母羊所产羔羊28日龄时PPRV中和抗体滴度均大于或等于1:80；对羊痘攻毒保护可达4/5，确定小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗最小免疫剂量为1ml。
实施例8——小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗免疫期研究
将200804、200805、200806批小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗按1个使用剂量(1ml)分别免疫山羊和绵羊，每批疫苗免疫山羊和绵羊各15只。
免疫3个月后进行母羊攻毒试验时，选择已产羔羊的母羊进行羊痘攻毒。免疫后6个月、9个月，随机选择母羊进行羊痘强毒攻击。将200804、200805、200806批小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗按1个使用剂量(1ml)免疫山羊和绵羊，分别于免疫后3、6、9个月采血测定小反刍兽疫、羊痘病毒中和抗体，并进行羊痘强毒攻击试验。试验结果表明该疫苗按1个使用剂量(1ml)免疫山羊后，免疫9个月后，PPRV中和抗体滴度均不低于1:80；羊痘攻毒保护均在4/5以上，说明疫苗免疫9个月后仍可产生有效保护。将该疫苗免疫期定为9个月。见表11。
表11小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗免疫不同时间后效力检验结果汇总
妊娠母羊所产羔羊中和抗体测定及羊痘攻毒结果
妊娠母羊所产羔羊于免疫后28日龄、42日龄采血，测定小反刍兽疫、羊痘病毒中和抗体，并进行羊痘强毒攻击试验。试验结果表明，42日龄羔羊PPRV中和抗体不低于1:40；羊痘攻毒后28日龄为4/5保护，42日龄为3/5～4/5保护(表12)。
表12免疫母羊所产羔羊PPRV中和抗体及羊痘攻毒结果统计
采血时间 种类 PPRV抗体 羊痘攻毒结果 羊痘攻毒对照
28日龄 山羊 15/15≥1:80 4/5保护 4/5发病
28日龄 绵羊 15/15≥1:80 4/5保护 4/5发病
42日龄 山羊 15/15≥1:40 3/5保护 4/5发病
42日龄 绵羊 15/15≥1:40 4/5保护 4/5发病

Claims (5)

1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株灭活病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goat pox virus)弱毒株灭活病毒，可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。
2.权利要求1所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants)PPRV 75/1-Clone 9株，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13388。
3.权利要求1所述的小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊痘病毒弱毒株活病毒为山羊痘病毒(Goat pox virus)温度敏感弱毒株，保藏编号为：CVCC No.AV41。
4.本发明权利要求1所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述小反刍兽疫病毒75/1 Clone9株(CGMCC No.13388)和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(AV41)病毒作为疫苗生产毒株，分别接种Vero细胞和山羊肾细胞，当细胞出现细胞病变达70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，分别收获病毒液经灭活处理；再将其混合后加疫苗佐剂、乳化后制成小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗。
5.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中的佐剂为206佐剂。
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