CN102120768B - 利用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体生产的技术领域，更具体是涉及一种用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法。
背景技术
1975年Koehler和Milstein(Nature Vol.256，pp 495-497)用杂交瘤技术制备了世界上第一个鼠源单克隆抗体，为生物技术打开了一个全新的领域。随着生物技术的发展，单克隆抗体技术也有了很大的发展。如今，单克隆抗体已广泛用于生物医学(包括人类和兽医)的各个领域，尤其在病毒感染的预防和治疗的基础研究和临床应用领域，正日益发挥着极其重要的作用。
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)感染是犬的一种急性传染病。1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)。CPV感染的犬临床表现为出血性肠炎或非化脓性心肌炎，多发生于幼犬，病死率10％～50％；另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。
制备治疗性犬细小病毒单克隆抗体的传统方法是体内生产法。此方法将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗。不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括Ig)，因此要提纯后才能使用。另外，这种方法的产量低，生产周期长、批间差异大，不适合进行批量化的治疗性单抗的生产。
因此，本领域中特别需要新的生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法。
发明内容
本发明中出乎意料地发现，可以采用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体。通过这样的方法生产的治疗性犬细小病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。
因此，本发明提供了一种生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法，其中包括在生物反应器中培养分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及收获所述抗犬细小病毒单克隆抗体。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供了一种生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法，其中包括以下步骤：
(1)将分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞接种到生物反应器内的培养液中；
(2)在生物反应器中培养杂交瘤细胞；
(3)收获杂交瘤细胞所生成的抗犬细小病毒单克隆抗体。
在本发明中，“生物反应器”是指为培养生长的和非固定化的细胞提供良好封闭环境的生物反应装置，通常又称为细胞发酵罐。有多种生物反应器可以适用于本发明中，包括例如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器和流化床生物反应器等。
生物反应器培养细胞主要有批式(Batch)、流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三种。在简单的批式培养中，随着营养物的消耗和副产物的积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止产生，生产效率很低。流加式培养，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间隔地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物。整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止，回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞生长和产物形成过程中，不断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。
在一个具体实施方式中，本发明采用批式方法在生物反应器中培养目的细胞。在另一个具体的实施方式中，采用流加式方法在生物反应器中培养目的细胞。在又一个具体实施方式中，采用灌流式方法在生物反应器中培养目的细胞。
具体而言，使用生物反应器培养的步骤可以是：
从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85％DMEM液、15％犊牛血清培养液或无血清杂交瘤细胞培养液，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素进行细胞扩大培养。
同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度，pH值，溶氧等备用。
当生产细胞种子增殖达到合适总量，按细胞终浓度的合理范围(接种浓度范围1×105～1×106/ml，优选范围2×105～8×105/ml，更优选范围4×105～5×105/ml)接种到生物反应器中。当细胞密度达到1×106/ml以上时，设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵转速，改变灌注体积。更优选在细胞密度达到2×106/ml以上时，尤其是达到5×106/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得培养上清即为治疗性犬细小病毒单克隆抗体。
在上述方法中可以采用任何合适的分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞可以来源于已有的保藏物例如来源于保藏机构的保藏物，或者从商业途径购得，或者自行构建。普通技术人员知晓构建分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，例如可以用犬细小病毒CPV-2AMS-1株免疫小鼠，当血凝抑制效价(HI)达到1∶640后，取血清HI滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做HI筛选阳性融合株，1次或数次(例如3次)克隆后获得杂交瘤细胞株。在本发明中，所述抗犬细小病毒单克隆抗体可以针对犬细小病毒的任何合适抗原或表位，例如：VP1、VP2、VP3抗原等。另外，所述杂交瘤细胞分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的水平可以在HI效价1∶32～1∶128范围内。优选地HI效价1∶64以上，该杂交瘤细胞以HI效价1∶64以上水平生产抗犬细小病毒单克隆抗体。在一个优选的实施方式中，本发明采用2010年11月3日以保藏号为CGMCC No.4304保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的小鼠杂交瘤细胞系。
在本发明中，可以采用任何适合于杂交瘤细胞生长的液体培养基。在一个优选的实施方式中，所用的培养液配方是：85％DMEM液、15％犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。在另一个实施方式中，所用的培养基是无血清杂交瘤细胞培养基。
在本发明中，可以以任何合适的浓度将杂交瘤种子细胞接种到生物反应器中。在一个具体实施方式中，接种到生物反应器中的种子细胞的最低浓度为105/ml。在另一个具体实施方式中，接种到生物反应器中的种子细胞的最低浓度为2×105/ml。在又一个具体实施方式中，接种到生物反应器中的种子细胞的最低浓度为5×105/ml。当然，普通技术人员可以容易地确定种子细胞接种浓度的合理范围。例如，接种浓度范围1×105～1×106/ml，优选范围2×105～8×105/ml，更优选范围4×105～5×105/ml。
可以在任何合适的温度下培养种子细胞，例如温度可以是20～38℃，优选25～37℃，更优选30～37℃，尤其是33～37℃。在一个具体的实施方式中，培养种子细胞的温度为36～37℃之间。
在另一个具体的实施方式中，培养种子细胞的pH值控制在7.0～7.2之间。可以通过在培养过程中添加合适酸或碱而将培养液pH控制在合适的范围内，例如二氧化碳和碳酸氢钠等。
在一个具体的实施方式中，在生物反应器培养过程中，所用培养液的pH值控制在7.0～7.2之间。
在另一个具体实施方式中，在生物反应器培养过程中，所用培养液的溶氧范围在50％～90％之间。
在又一个具体实施方式中，生物反应器培养温度在36～37℃之间。
在一个具体实施方式中，生物反应器培养时的流加体积在每天1～5罐体积之间。
当生物反应器中的细胞生长至合适的密度后，收获培养上清液。优选地，当细胞密度达到106/ml以上时，收获培养上清液。更优选在细胞密度达到2×106/ml以上时，尤其是达到5×106/ml以上时，收获培养上清液。可以通过多种合适的方法收获上清液，例如离心、过滤、沉淀等方法，这是本领域普通技术人员所熟知的。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法进一步包括将收获的治疗性单克隆抗体进行过滤和浓缩的步骤。采用如下方法：取无菌检验呈阴性，效价检测合格的单克隆抗体上清液，将蠕动泵连接到单克隆抗体收集瓶，利用0.45μm预滤系统过滤除去细胞碎片等杂质，然后连接平板膜包超滤系统(截留分子量为30kDa)，开启蠕动泵进行单克隆抗体的超滤浓缩，调节进料口和出料口压力在20～30psig，当达到超滤浓缩的倍数时停止超滤浓缩系统。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法进一步包括将浓缩的单克隆抗体无菌、定量分装到灭菌的容器中。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)用生物反应器替代了利用小鼠制造治疗性犬细小病毒单克隆抗体注射液，可解决鼠源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的治疗性犬细小病毒单克隆抗体注射液纯粹，确保治疗性犬细小病毒单克隆抗体注射液的安全性。
(2)采用本发明培养的治疗性犬细小病毒单克隆抗体产量高，成本低，显著提高该产品经济效益。
(3)本发明生产工艺简单且稳定、易操作，抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。对治疗犬细小病毒病有很好的疗效。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
实施例
以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明进一步的描述。应当理解，这些附图和实施例仅仅是示例性的，它们不以任何方式限定本发明的范围。
实施例1分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞系的获得
1.1使用CPV(CPV-2 AMS-1株，HA效价为1∶5120，来源于农业部兽医诊断中心)免疫Balb/c小鼠。病毒液与福氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射300ul。首次免疫后15d和29d，分别用同样剂量的病毒液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。第二加强后采血检测HI的抑制效价。
1.2杂交瘤的制备：
当效价达到1∶640后，取小鼠脾脏做融合。融合前72h再次加强免疫，经尾静脉注射病毒液1次，50ul/只。制备10块融合板。
融合：取血清HI滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用1min将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过血凝抑制(HI)实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。
杂交瘤的筛选：融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做血凝抑制(HI)检测，阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定抑制AMS-1株CPV-2病毒与猪血发生凝集为止。
筛选结果：获得1株杂交瘤细胞株，将其命名为CPV 1D3，于2010年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.4304。
杂交瘤细胞株的鉴定：符合治疗性犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞标准，细胞形态呈圆形，染色体平均数在96～103之间，核型应相同。按《中华人民共和国兽药典》进行支原体检验，应无支原体生长。按《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。当细胞数达到5×105个/ml以上时，上清液犬细小病毒血凝抑制效价≥32，猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒血凝抑制效价≤8；分泌单克隆抗体为IgG1类型，与CPV的VP2蛋白有抗原反应。
实施例210L(贝朗)生物反应器培养
(1)将实施例1中的CPV 1D3细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到109/500ml以上。
种子细胞的鉴定：当细胞数达到5×105个/ml以上时，上清液犬细小病毒血凝抑制效价≥128，猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒血凝抑制效价≤8；分泌单克隆抗体为IgG1类型，与CPV的VP2蛋白有抗原反应；
(2)治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85％DMEM液、15％犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素的培养液进行细胞扩大培养。
同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.00，溶氧范围80％，备用。
当生产细胞种子增殖达到109/500ml，按细胞终浓度4.5×105/ml接种到生物反应器中。当细胞密度达到1×106/ml以上时，设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。细胞密度达到5×106/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得培养上清即为治疗性犬细小病毒单克隆抗体。
上述所用培养液的配方是：85％DMEM液(GBICO)、15％犊牛血清(BIOCHROM AG)或无血清杂交瘤细胞培养基(GBICO)、加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，pH值调整为7.0～7.2。
溶氧范围在80％，温度在37℃。收集时流加体积在每天10L。
对收获的细胞培养上清液按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥256。
(3)治疗性单克隆抗体培养液的浓缩与纯化：收获上清培养液用超滤系统滤过，根据治疗性单克隆抗体培养液效价确定浓缩倍数。用过滤系统去除细胞碎片，收获的液体置-15℃以下保存；
浓缩液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥1280。
(4)分装：将浓缩、纯化的治疗性单克隆抗体，无菌、定量分装到灭菌的容器中。分装后迅速加灭菌塞、压盖后即得成品，-15℃以下保存。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，血凝抑制效价≥1280。
实施例330L(贝朗)生物反应器培养
(1)将实施例1中的CPV 1D3细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到3×109/500ml以上。
种子细胞的鉴定：当细胞数达到5×105个/ml以上时，上清液犬细小病毒血凝抑制效价≥128，猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒血凝抑制效价≤8；分泌单克隆抗体为IgG1类型，与CPV的VP2蛋白有抗原反应；
(2)治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85％DMEM液、15％犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素的培养液进行细胞扩大培养。
同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.00，溶氧范围80％等备用。
当生产细胞种子增殖达到3×109/500ml以上，按细胞终浓度4.5×105接种到生物反应器中。当细胞密度达到1×106/ml以上时，设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。细胞密度达到5×106/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得培养上清即为治疗性犬细小病毒单克隆抗体。
上述所用培养液的配方是：85％DMEM液(GBICO)、15％犊牛血清(BIOCHROM AG)或无血清杂交瘤细胞培养基(GBICO)、加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，pH值调整为7.0～7.2。
溶氧范围在80％，温度在37℃。收集时流加体积在每天30L。
对收获的细胞培养上清液按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥256。
(3)治疗性单克隆抗体培养液的浓缩与纯化：收获上清培养液用超滤系统滤过，根据治疗性单克隆抗体培养液效价确定浓缩倍数。用过滤系统去除细胞碎片，收获的液体置-15℃以下保存；
浓缩液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥1280。
(4)分装：将浓缩、纯化的治疗性单克隆抗体，无菌、定量分装到灭菌的容器中。分装后迅速加灭菌塞、压盖后即得成品，-15℃以下保存。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，血凝抑制效价≥1280。
实施例4100L(贝朗)生物反应器培养
(1)将实施例1中的CPV 1D3细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到1010/500ml以上。
种子细胞的鉴定：当细胞数达到5×105个/ml以上时，上清液犬细小病毒血凝抑制效价≥128，猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒血凝抑制效价≤8；分泌单克隆抗体为IgG1类型，与CPV的VP2蛋白有抗原反应；
(2)治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85％DMEM液、15％犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素的培养液进行细胞扩大培养。
同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.00，溶氧范围80％等备用。
当生产细胞种子增殖达到1010/500ml以上，按细胞终浓度4.5×105/ml接种到生物反应器中。当细胞密度达到1×106/ml以上时，设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。细胞密度达到5×106/ml以上时逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得培养上清即为治疗性犬细小病毒单克隆抗体。
上述所用培养液的配方是：85％DMEM液(GBICO)、15％犊牛血清(BIOCHROM AG)或无血清杂交瘤细胞培养基(GBICO)、加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，pH值调整为7.0～7.2。
溶氧范围在50％～90％之间，温度在36～37℃之间。收集时流加体积在每天100L～300L罐体积之间。
对收获的细胞培养上清液按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥256。
(3)治疗性单克隆抗体培养液的浓缩与纯化：收获上清培养液用超滤系统滤过，根据治疗性单克隆抗体培养液效价确定浓缩倍数。用过滤系统去除细胞碎片，收获的液体置-15℃以下保存；
浓缩液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥1280。
(4)分装：将浓缩、纯化的治疗性单克隆抗体，无菌、定量分装到灭菌的容器中。分装后迅速加灭菌塞、压盖后即得成品，-15℃以下保存。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，血凝抑制效价≥1280。
实施例5本发明制备得到的犬细小病毒单克隆抗体注射液对细小病毒强毒人工感染犬的疗效研究
1材料与方法
1.1CPV-2AMS-1株：每毫升病毒105.0TCID50，军事医学科学院实验动物中心渠川玫惠赠。
1.2犬细小病毒单克隆抗体注射液：实施例2中制备的3批犬细小病毒单克隆抗体注射液，批号分别为：20090301(效价1280)、20090326(效价1280)、20090422(效价2560)。经过物理性状、pH值、活性、无菌、支原体、外源病毒、安全等检验合格后用于试验。
1.3试验动物的选择
8周龄健康断奶比格犬(北京玛斯生物技术有限公司)，未进行犬细小病毒疫苗免疫，测量体温正常(38.3-38.7℃)，采血测定CPV-2HI效价低于20。
1.4犬细小病毒胶体金快速检测试纸条：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司研制。
1.5人工感染
20只8周龄健康断奶比格犬，分成4组，每组5只。于正式试验前采集每只犬的血液，测定其CPV-2HI效价，确定CPV-2抗体水平小于1∶20。而后分别以CPV-2AMS-1株毒液1ml经口和静脉注射感染各实验犬，每日采集粪便，检查排毒情况，并观察临床症状，包括精神状态、食欲、腹泻情况等。待感染犬出现腹泻症状，并经犬细小病毒试纸检测阳性后，第1组至第3组分别使用批号为：20090301、20090326、20090422的犬细小病毒单克隆抗体注射液，按1.5ml/kg体重的剂量肌肉注射，每日一次，连用3日进行治疗；第4组：1.5ml/kg体重的生理盐水，肌肉注射，每日一次，连用3日；
每日采集粪便检查排毒情况，观察各实验犬临床症状的发展情况，记录试验结果。本试验以病犬精神、食欲、排便恢复正常以及CPV-2检测阴性为康复指征。
2结果
人工感染后四组试验犬全部发病，通过3批犬细小病毒单克隆抗体注射液的治疗，其治愈率达到100％。治疗后第5天的结果见表1。
表1治疗效果测定结果
第1组、第2组和第3组犬治愈达100％，第4组空白对照犬症状逐渐加剧，其中1只犬于感染后7日死亡。
3分析与讨论
试验结果表明，三批犬细小病毒单克隆抗体注射液对发生细小病毒病的犬治疗3天后临床症状明显缓解，治愈达到100％。
以上通过具体实施例解释了本发明，但本发明不限于此。凡根据本发明的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：
(1)将分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞接种到生物反应器内的培养液中，其中杂交瘤细胞的接种密度为4×105～5×105/ml；
(2)在生物反应器中培养杂交瘤细胞；当细胞密度达到1×106/ml以上时，设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液；当细胞密度达到5×106/ml以上时逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得培养上清液即为治疗性犬细小病毒单克隆抗体；
其中所述杂交瘤细胞是CGMCC No.4304。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)所用的细胞培养液配方是：85％DMEM液、15％犊牛血清或无血清杂交瘤细胞培养基以及200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中培养杂交瘤细胞的温度是36～37℃。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中培养液的pH值控制在7.0～7.2之间。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，所用培养液的溶氧范围在50％～90％之间。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，生物反应器连续灌流培养时的流加体积在每天1～5罐体积之间。
7.根据权利要求1的方法，其中在步骤(1)中将分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞接种到生物反应器内的培养液中之前对所述杂交瘤细胞进行预培养，所用预培养液的pH值控制在7.0～7.2之间，培养温度在36～37℃之间。
8.根据权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：
(3)将收获的治疗性单克隆抗体过滤和浓缩，采用如下方法：取无菌检验呈阴性、效价检测合格的单克隆抗体上清液，将蠕动泵连接到单克隆抗体收集瓶，利用0.45μm预滤系统过滤除去细胞碎片等杂质，然后连接平板膜包超滤系统，截留分子量为30kDa，开启蠕动泵进行单克隆抗体的超滤浓缩，调节进料口和出料口压力在20～30psig，当达到超滤浓缩的倍数时停止超滤浓缩系统。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括以下步骤：
(4)将浓缩的治疗性单克隆抗体无菌、定量分装到灭菌的容器中。
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