CN102552896B - 一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，它利用一个激流灌注式生物反应器作为培养工具，制备按如下步骤进行：a.制苗用细胞的培养；b.病毒接种与培养；c.病毒液收获；d.疫苗制备等工序。本发明具有操作简便，污染几率小，生产成本显著降低，疫苗产量大，质量均一稳定，免疫效果优良等优点，整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题，适合大规模生产。

Description

一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，尤其涉及一种利用激流灌注式生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，属生物技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病。目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗进行免疫预防，因此，高效价的病毒液是疫苗生产中非常重要的一个环节。

猪繁殖与呼吸综合征疫苗生产主要是通过转瓶培养细胞，进而增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒。生产中细胞及病毒培养条件难以控制，导致细胞和疫苗质量不稳定，产品批间差异大，而且自动化程度低，劳动强度大，极大的限制了疫苗的质量与产量。

随着生物技术的飞速发展，传统的生产方式已难以满足市场的需求，使用生物反应器不缇是一种很好的选择。但应用反应器生产疫苗也存在诸多问题：比如因接种的细胞状态不一、接种方式不科学导致疫苗批次间差异大、产品质量不稳定；因营养供给方式不科学导致细胞营养缺乏、生长不均匀；因细胞种子链扩增困难导致细胞再扩大培养难以实现；以及因清洗、灭菌带来的操作繁琐、污染几率增大、耗费能源等，诸多问题难以枚举。

综上所述，本领域还需要继续研发一种适用的培养猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，以进一步提高产品质量，优化生产条件，简化生产工艺及流程。

发明内容

本发明目的是克服现有技术之缺陷，提供一种利用激流灌注式生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，它利用一个激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器的液体循环系统由蠕动泵、硅胶管、激流袋、灌注袋、有孔硅胶管与纸片载体组成；所述第一蠕动泵通过硅胶管与激流袋、灌注袋连通、且蠕动泵控制流向为由灌注袋到激流袋；所述第二蠕动泵通过硅胶管与激流袋、灌注袋连通、且控制流向为由激流袋到灌注袋；

制备操作按如下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养 

将细胞悬液（宿主细胞和细胞生长液）接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在纸片载体（8）上，设定设备参数，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞达到最大密度时，排空反应器内液体，将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种步骤a所得制苗用细胞；加入细胞维持液，调节设备参数，启动病毒培养程序，扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒；

c.病毒液收获

收获猪繁殖与呼吸综合征病病毒液，备用；

d. 疫苗的制备

将步骤c收获的病毒液制备疫苗。

上述制备方法，在步骤a中，宿主细胞是经过有限稀释法克隆纯化筛选的Marc-145或者M104细胞。

上述制备方法，在步骤a中，细胞悬液接种采用两步法，第一步：从灌注袋（6）下部打入细胞悬液，充满灌注袋（6），静置吸附1h；第二步：将灌注袋（6）中的液体打出1/4～1/3，再从上部有孔硅胶管（7）内打入细胞悬液，至细胞悬液充满灌注袋（6），再静置吸附0.5～1h；细胞接种密度为：每克载体接种0.6～1.5×10⁷个细胞。

上述制备方法，在步骤a中，系统参数设定为：温度T1：37～37.5℃、T2：42～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：30%～70%，振荡速度30～50rpm。

上述制备方法，在步骤a中，细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管3、硅胶管4内液体颜色保持基本一致。

上述制备方法，在步骤a中，根据细胞耗糖及时补充细胞生长液和10～20g/L的葡萄糖，当残糖量低于1g/L时，进行补液。

上述制备方法，在步骤b中，猪繁殖与呼吸综合征病毒是经过蚀斑法亚克隆纯化筛选后的猪繁殖与呼吸综合征病毒亚克隆株。

上述制备方法，在步骤b中，猪繁殖与呼吸综合征病毒接种剂量为0.01～0.3MOI，接毒吸附时间为30～45min。

上述制备方法，在步骤b中，设备参数为：温度T1：36～37℃、T2：39～43℃、T3：35～36℃，pH：7.2～7.6，DO：30%～70%，振荡速度30～50rpm。

上述制备方法，在步骤b中，接毒后18～20h时需要补充循环系统总体积1/10～1/5的2～5倍浓缩DMEM液和10～20g/L的葡萄糖。

上述制备方法，在步骤a、步骤b中，营养液（细胞生长液、细胞维持液）的流动方式为：液体流过灌注袋的方向是从下到上，从灌注袋（6）抽走液体的管道为深层管—有孔硅胶管（7）。

上述制备方法，在步骤c中，收获猪繁殖与呼吸综合征病病毒液有三种方法：第一种收获方法为一次性收获，在产毒高峰期（32～40h）一次性收获；第二种方法为多次收获，18～24h时首次收获，以后每隔6～8h收获一次，收获同时补充新细胞维持液，共收获3～5次；第三种方法为连续流加收获，24～30h时开始收获，连续收获12～16h，控制每分钟收获量为细胞维持液总体积0.5～2%，至44～50h时收获剩余病毒液。

上述制备方法，细胞生长液的配方为：体积百分含量90%～92%高糖DMEM液，8%～10%新生犊牛血清，调整PH值为7.2～7.4；所述细胞维持液的配方为：体积百分含量98%～99%高糖DMEM液，1%～2%新生犊牛血清，调整PH值为7.2～7.6。

上述制备方法，所述生物反应器有效培养体积为10L、100L和600L三种；制苗用细胞直接在10L或者100L的生物反应器中培养；或者经过10L→100L或10L→100L→600L逐级扩大培养，实现细胞种子链逐级扩增。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、在本发明中，制苗用细胞预先经过有限稀释法克隆纯化筛选，保证了种子细胞的状态均一，减小了批次间差异，确保了生产工艺参数和产品质量的稳定。

2、在本发明中，反应器细胞接种采用两步法，此方法可保证灌注袋（6）各点细胞接种均匀，纸片载体（8）利用充分，有利于提高产毒效价。

3、本发明中在细胞培养过程中逐步提高细胞生长液的循环灌注速度，使营养物质的交换速度更适合细胞增殖。

4、本发明在细胞培养过程中和病毒增殖过程中进行补液，保证了细胞和病毒增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本。

5、本发明营养液的流动方式为：倒灌注、深抽液。此灌注过程不但能保证灌注袋（6）各处细胞营养均匀，又可达到供给细胞营养物质并带走细胞代谢废物的目的。

6、本发明接种的猪繁殖与呼吸综合征病毒系经蚀斑法亚克隆纯化筛选的亚克隆株，保证了种毒的纯度，减小了批次间差异，确保了生产工艺参数和产品质量的稳定。

7、本发明病毒液的收获可以根据目的不同，灵活选择收获方式。

8、应用本法生产猪繁殖与呼吸综合征疫苗，细胞种子链能够实现10L～600L的逐级扩大，且三种规模设备培养的病毒效价基本一致；放大效果好，适合规模化生产。

9、本发明中，使用一次性无生物毒性耗材，使用完毕直接进行无害化处理，减少了罐体式生物反应器的清洗、消毒、灭菌等复杂的工艺环节和工艺配套设施的安装，解决了因消毒不彻底带来的污染问题，同时节约能耗，整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题。

附图说明

图1 是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成示意图；

图2 是本发明的工艺路线图；

图3 是接毒前细胞单日耗糖量曲线图。

图中各标号为：1.第一蠕动泵（灌注出液泵）、2.第二蠕动泵（灌注进液泵），3、4.硅胶管、5.激流袋、6.灌注袋、7.有孔硅胶管、8.纸片载体。

具体实施方式

为使本发明更容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，本实施例仅用于说明本发明而不限于本发明权利的保护范围。 

实施例1  AP20C型激流灌注式生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）

本实施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反应器，灌注袋6体积为5L，激流袋5）体积为15L，灌注袋(6)内含有150g聚酯纤维纸片载体8）；理论有效培养体积收获液体积）为10L。

图1 是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成示意图；其中，制苗用细胞、病毒全部在灌注袋内生长，营养液（细胞生长液、细胞维持液）通过外置蠕动泵（第一蠕动泵1、第二蠕动泵2）在灌注袋和激流袋中循环。

种毒为采用蚀斑法亚克隆纯化筛选后的猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株，保藏号为CCTCC V201138，于2011年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心。

检验用强毒猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株在专利申请201010294953.5中有记载，保藏号NO.2467，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

A、准备工作：

检验系统气密性，校准电极，PBS处理纸片载体8，连接灌注袋6与激流袋5，用细胞生长液浸泡纸片载体8，平衡系统。

B、生产具体步骤如下：

a、制苗用细胞的培养：

选择有限稀释法纯化筛选后的Marc-145细胞作为宿主细胞，在10L转瓶中用含10%新生牛血清、PH7.4的DMEM细胞生长液于37℃培养，长成良好单层时备用；以0.025%胰酶对7瓶长满单层的细胞进行消化，制备种子液6L，细胞总数约2.3×10⁹个。

细胞接种采用两步接种法，第一步：从灌注袋6下部打入细胞悬液（Marc-145细胞和DMEM细胞生长液）4.5L，静置吸附1h；第二步：将灌注袋6中的液体打出1.5L，再从上部深层管内打入余下的细胞悬液，充满灌注袋6，静置吸附0.5h；同时在激流袋5内补充5.5L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种1.5×10⁷个细胞；

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1：37℃、T2：42℃、T3：36℃，PH：7.3，DO：50%，震荡速度45rpm，液体循环速度250ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养；每日取样测残糖量，及时补充细胞营养液和10g/L的葡萄糖；逐渐增大液体循环速度；

b、病毒的接种与培养：

细胞接种后第4日单日耗糖量达到3.63g/d/L，且趋于平稳；确定细胞密度达到了接毒要求；排空反应器内液体，将经亚克隆纯化筛选后效价为 10^7.3TCID₅₀/ml的PRRSV-R98毒液100ml打至激流袋5内，连同激流袋5内的4.0L无血清单倍DMEM，一同打至灌注袋6内，静置吸附45min，同时在激流袋5中补充4.0L含血清4%的DMEM营养液，病毒接种剂量约为0.03MOI。

吸附完成后，调整设备参数如下：温度T1：36.5℃、T2：39℃、T3：36℃，pH：7.4，DO：50%，振荡速度45rpm，液体循环速度250ml/min，启动病毒培养程序开始培养，接毒18h时，补充2倍浓缩DMEM 2L，10g/L葡萄糖100ml；

c、病毒液收获：

接毒34h时开始收获，一次性收获灌注袋6内的上清病毒液，将含有纸片载体8和部分病毒液的灌注袋6冻融两次后取上清病毒液与已收获的病毒液混合，约10.5L，于-20℃冷冻保存；

d、制苗毒液的检验：

按照《中华人民共和国兽药典》（2010年版）附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长；病毒液对猪安全无副作用，收获的病毒液用细胞测定效价，每1ml含病毒10^9.20TCID₅₀；

e、配苗、分装及冻干：

将检验合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脱脂乳冻干保护剂充分摇匀，定量分装，迅速冷冻真空干燥即得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）成品。

C、疫苗安全性检验：

选用7日龄健康易感仔猪3头，每头猪颈部肌肉注射10头份该疫苗。连续观察14日，免疫后仔猪精神、食欲无明显变化，无异常临床反应，疫苗安全性检验合格。

D、疫苗效力检验：

选用30日龄健康易感仔猪10头，随机分为两组，第一组5头各颈部肌肉注射该疫苗1头份，第二组5头不接种疫苗，作为对照，在同等条件下隔离饲养。所有猪各滴鼻攻毒检验用强毒猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒培养液3ml（10^4.5TCID₅₀/ml），每日测温，连续观察28日。结果：对照猪均发病，且死亡2头，5头免疫猪均未发病。疫苗效力检验合格。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价约是10^7.0～7.5 TCID₅₀/ml；本次实验病毒总产量是转瓶工艺的500倍以上。

实施例2用AP200型激流灌注式生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）

本实施例中所用的AP200型激流灌注式生物反应器，灌注袋6体积为50L，激流袋5体积为150L，灌注袋6内含有2000g聚酯纤维纸片载体8；理论有效培养体积（收获液体积）为100L。

A、准备工作：

选用AP20C型和AP200型两种激流灌注式生物反应器，做培养细胞前准备工作。

B、生产工作，具体步骤如下：

a、制苗用细胞的培养：

依实施例1方法用AP20C型生物反应器培养的Marc-145细胞，至第4日，单日耗糖量达到3.8g/d/L时，用0.025%胰酶消化灌注袋6）内细胞，制得细胞悬液17L，约含Marc-145细胞2.5×10¹⁰个。

将消化下来的细胞悬液中加入28L细胞生长液，采用两步接种法接种于AP200灌注袋6内，细胞接种密度为：每克载体接种1.25×10⁷个细胞。吸附同时在激流袋5内补充55L细胞生长液预热。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37℃、T2:42℃、T3:35.5℃，PH7.2，DO:70%，震荡速度43rpm，液体循环速度3L/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。每日取样测残糖量，及时补充营养液、逐渐增大液体循环速度。

种子细胞接种至AP200型生物反应器后，单日葡萄糖的消耗量（g/d/L）呈现增长趋势，以第4、5日增长速度最快，直至第6日细胞单日耗糖达到3.69g/d/L，增长速度趋于缓慢，说明反应器内细胞增长速度趋缓，细胞已经增加到了最大密度，达到了接毒需要（见图3）。

b、病毒的接种与培养：

排空反应器内液体，将经亚克隆纯化筛选的效价为 10^7.4TCID₅₀/ml的PRRSV-R98毒液2000ml打至激流袋5内，与预先打入激流袋5的40L无血清单倍DMEM一同打至灌注袋6内，静置吸附45min，同时在激流袋5中补充40L含血清4%的DMEM营养液，病毒接种剂量约为0.1MOI。

吸附完成后，调整设备参数如下：温度T1：36.5℃、T2：39℃、T3：36℃，pH：7.4，DO：70%，振荡速度45rpm，液体循环速度3.8L/min。启动病毒培养程序开始培养。接毒18h时，补充4倍浓缩DMEM 10L，10g/L葡萄糖1L。

c、病毒液的收获：

接毒40h时开始收获。一次性收获灌注袋6内上清病毒液，将含有纸片载体8和部分病毒液的灌注袋6冻融两次后去上清病毒液液与已收获的病毒液混合，约102L，于-20℃冷冻保存。

d、制苗毒液的检验：

按照《中华人民共和国兽药典》（2010年版）附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液对猪安全无副作用，收获的病毒液用细胞测定效价，每1ml含病毒10^9.12TCID₅₀。

e、 配苗、分装及冻干：

将检验合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脱脂乳冻干保护剂充分摇匀，定量分装，迅速冷冻真空干燥即得成品。

C、疫苗安全性检验：

选用7日龄健康易感仔猪3头，每头猪颈部肌肉注射10头份该疫苗。连续观察14日，免疫后仔猪精神、食欲无明显变化，无异常临床反应，疫苗安全性检验合格。

D、疫苗效力检验：

选用30日龄健康易感仔猪10头，随机分为两组，第一组5头各颈部肌肉注射该疫苗1头份，第二组5头不接种疫苗，作为对照，在同等条件下隔离饲养。所有猪各滴鼻攻毒检验用强毒猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒培养液3ml（10^4.5TCID₅₀/ml），每日测温，连续观察28日。结果：对照猪均发病，且死亡3头，5头免疫猪均未发病。疫苗效力检验合格。

实施例3  三种收获病毒液方法应用比较实验

1、材料与方法

设备、种毒等材料同实施例2；

实验分为三个组，均按照实施例2中同样方法培养制苗用细胞、接种病毒、扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒，但三组采用不同的方法收获病毒液，收获的病毒液均按照常规方法测定病毒液体积和效价。

第一组采用一次性收获法：见实施例2；

第二组采用多次收获法：24h时首次收获，以后每隔6h收获一次，至48h时最后一次收获，共收获5次；前4次收获，每次收获病毒液体积总量的70～90%，并补充等体积量的细胞维持液，最后1次收获操作与实施例2相同；混合收获的全部病毒液；

第三组采用连续流加收获法，24h时开始连续流加收获，24～32h控制收获速度1.5L/min，32～38h收获速度1.0L/min，收获同时连续补充等量细胞维持液；38h时停止连续流加收获，继续培养至48h，同实施例2操作收获剩余病毒液；混合收获的全部病毒液。

2、结果

第一组收获得病毒液体积最小，但是病毒液效价最高，第二组与第三组收获病毒液体积较大，病毒液效价较低，但是病毒收获总量高。（结果见表1）。

表1  收获病毒液测定结果

组   别	第一组	第二组	第三组
				病毒液体积（L）	102	425	1148
病毒液效价（TCID50/1ml）	109.12	108.57	108.20

3、分析与讨论

三种收获方式各有特点，可以根据不同目的选择不同的收获方式，需要较高病毒效价时选择在产毒高峰期一次性收获；需要产量更多时选择多次收获或者连续流加收获。一次性收获法病毒液效价最高，其成品疫苗免疫效果最好，更适用于疫病流行区域预防接种，但是生产成本高于其它两种收获方法。

Claims (8)

1.一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，其特征在于，它利用一个激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器的液体循环系统由两个蠕动泵、硅胶管、激流袋（5）、灌注袋（6）、有孔硅胶管（7）与纸片载体（8）组成；所述第一蠕动泵（1）通过硅胶管（3）与激流袋（5）、灌注袋（6）连通、且蠕动泵（1）控制流向为由灌注袋（6）到激流袋（5）；所述第二蠕动泵（2）通过硅胶管（4）与激流袋（5）、灌注袋（6）连通、且控制流向为由激流袋（5）到灌注袋（6）；

制备按如下步骤进行：

a. 制苗用细胞的培养 

将细胞悬液，内含宿主细胞和细胞生长液，接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在纸片载体（8）上，设定设备参数，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞； 

b.病毒接种与培养

当细胞达到最大密度时，排空反应器内液体，将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种步骤a所得制苗用细胞；加入细胞维持液，调节设备参数，启动病毒培养程序，扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒；

种毒为采用蚀斑法亚克隆纯化筛选后的猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株，保藏号为CCTCC V201138，于2011年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心；

c. 病毒液收获

收获猪繁殖与呼吸综合征病病毒液，备用；

d. 疫苗的制备

将步骤c收获的病毒液制备疫苗；

所述步骤a中，宿主细胞是经过有限稀释法克隆纯化筛选的Marc-145或者M104细胞；

所述步骤a中，细胞悬液接种采用两步法，第一步：从灌注袋（6）下部打入细胞悬液，充满灌注袋（6），静置吸附1h；第二步：将灌注袋（6）中的液体打出1/4～1/3，再从上部有孔硅胶管（7）内打入细胞悬液，至细胞悬液充满灌注袋（6），再静置吸附0.5～1h；细胞接种密度为：每克载体接种0.6～1.5×10⁷个细胞；

所述步骤a中，细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管（3）、硅胶管（4）内液体颜色保持基本一致；

所述步骤a中，根据细胞耗糖及时补充细胞生长液和10～20g/L葡萄糖，当残糖量低于1g/L时，进行补液；

所述步骤b中，猪繁殖与呼吸综合征病毒接种剂量为0.01～0.3MOI，接毒吸附时间为30～45min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中，系统参数设定为：温度T1：37～37.5℃、T2：42～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：30%～70%，振荡速度30～50rpm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，设备参数为：温度T1：36～37℃、T2：39～43℃、T3：35～36℃，pH：7.2～7.6，DO：30%～70%，振荡速度30～50rpm。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，接毒后18～20h时需要补充循环系统总体积1/10～1/5的2～5倍浓缩DMEM液和10～20g/L的葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤a、步骤b中，细胞生长液或细胞维持液的流动方式为：液体流过灌注袋的方向是从下到上，从灌注袋（6）抽走液体的管道为深层的有孔硅胶管（7）。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，收获猪繁殖与呼吸综合征病病毒液采用三种方法中的任一种：第一种收获方法为一次性收获，在病毒高峰期一次性收获；第二种方法为多次收获，18～24h时首次收获，以后每隔6～8h收获一次，收获同时补充新细胞维持液，共收获3～5次；第三种方法为连续流加收获，24～30h时开始收获，连续收获12～16h，控制每分钟收获量为细胞维持液总体积0.5～2%，至44～50h时收获剩余病毒液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞生长液的配方为：体积百分含量为90%～92%的高糖DMEM液，8%～10%新生犊牛血清，调整PH值为7.2～7.4；所述细胞维持液的配方为：体积百分含量98%～99%的高糖DMEM液，1%～2%新生犊牛血清，调整PH值为7.2～7.6。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物反应器有效培养体积为10L～600L；制苗用细胞直接在10L或者100L的生物反应器中培养；或者经过10L→100L或10L→100L→600L逐级扩大培养，实现细胞种子链逐级扩增。

Images