CN103100082B - 一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 - Google Patents
一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的方法包括以下步骤：培养PK-15细胞；接种猪圆环病毒2型；培养猪圆环病毒2型，取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液；制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。本发明通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度低，生产成本相对较低；操作简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品质量高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高，副作用小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其涉及一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。
背景技术
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒。
PCV-2是断乳仔猪多系统综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。自1991年PMWS在北美最先发现以来，已在世界范围内流行。由于PCV-2经常与多种病原混合感染，典型性临床症状有消瘦、皮肤苍白、腹泻、呼吸障碍及轻度的黄疸，还包括神经症状、繁殖障碍、皮炎等。PCV-2及其相关的猪病死亡率10%~30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。目前还没有治疗这种疾病的方法，现有预防和控制猪圆环病毒病最为有效的方法就是接种疫苗。
目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖猪圆环病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢。而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如PH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。另外由于该病毒是一种DNA病毒，病毒变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2一型。而PCV2的生物学特殊性比较特殊，它在细胞上的增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此产毒滴度较低也是一个更为重要的问题，并且与当前大规模动物疫苗生产不相适应。此外如要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。
综上所述，本领域还需继续研发一种适用的制备猪圆环病毒疫苗的新方法。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。
发明内容
本发明的目的为提供生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低，操作工艺程序不繁琐，批间差异小，产品质量高且稳定的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。
为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
该利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO60%-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO60-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型72-120h后，每隔6-12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
进一步，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
进一步，所述的纸片载体密度为15-20g/L。
进一步，所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
本发明采用以上技术方案，通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；操作工艺程序简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品质量高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高，副作用小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
附图说明
图1为本发明的激流式生物反应器示意图；
图2为本发明的工艺流程图；
图1中1为灌注袋，2为激流袋。
具体实施方式
本发明的技术方案为：本发明所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋1和激流袋2形成循环系统，灌注袋1内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO60%-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO60-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型72-120h后，每隔6-12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
进一步，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
进一步，所述的纸片载体密度为15-20g/L。
进一步，所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
本发明采用以上技术方案，通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；操作工艺程序简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品质量高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高，副作用小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
所用的激流式生物反应器工作体积可为5L，10L，20L，50L等。
下面将结合附图1-2之一所示和以激流式生物反应器的工作体积10L为具体实施例对本发明进一步说明：
实施例1
激流式生物反应器，生产厂家：杭州安普生物工程有限公司；型号：AP20SC II；工作体积：10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为20g/L，即纸片载体的质量为20g/L×10L为200g。
配制细胞生长液：含体积浓度为10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
配制病毒维持液：含体积浓度为2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为5×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.4、温度37.5℃及溶氧DO90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度500mL/min、振荡器转速60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.4、温度37℃及溶氧DO90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度500mL/min和振荡器转速60rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型120h后，每隔6h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）采用常用方法制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表1为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表1本发明与传统转瓶比较
| 比较项目 | 传统转瓶 | 本发明 |
| 表面积 | 4500cm2 | 约19.2m2 |
| 病毒数（产毒量） | 1.5L液，5.0的毒价 | 10L液，5.5－5.7的毒价 |
| 500个转瓶所需的种毒 | 7500mL | 50-150mL |
| 500个转瓶所需的培养基 | 1500L | 20-30L |
| 500个转瓶所需的血清 | 90000mL | 1540-2240mL |
| 时间（1个转瓶为基础） | 17-18天 | 12-13天 |
| 人员 | 15-20人 | 2-3人 |
从表1中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
实施例2
激流式生物反应器，生产厂家：杭州安普生物工程有限公司；型号：AP20SC II；工作体积：10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为15g/L，即纸片载体的质量为15g/L×10L为150g。
配制细胞生长液：含体积浓度为8%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
配制病毒维持液：含体积浓度为1%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2、温度36.8℃及溶氧DO60%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450mL/min、振荡器转速50rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.4、温度36.5℃及溶氧DO60%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450mL/min和振荡器转速50rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型72h后，每隔12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表2为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表2本发明与传统转瓶比较
| 比较项目 | 传统转瓶 | 本发明 |
| 表面积 | 4500cm2 | 约19.2m2 |
| 病毒数（产毒量） | 1.5L液，5.0的毒价 | 10L液，5.5－5.7的毒价 |
| 500个转瓶所需的种毒 | 7500mL | 50-150mL |
| 500个转瓶所需的培养基 | 1500L | 20-30L |
| 500个转瓶所需的血清 | 88650mL | 1517-2206mL |
| 时间（1个转瓶为基础） | 17-18天 | 12-13天 |
| 人员 | 15-20人 | 2-3人 |
从表2中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
实施例3
激流式生物反应器，生产厂家：杭州安普生物工程有限公司；型号：AP20SC II；工作体积：10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为18g/L，即纸片载体的质量为18g/L×10L为180g。
配制细胞生长液：含体积浓度为9%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
配制病毒维持液：含体积浓度为1.5%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为3×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.3、温度37℃及溶氧DO75%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度470mL/min、振荡器转速55rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.5、温度36.8℃及溶氧DO75%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度470mL/min和振荡器转速55rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型90h后，每隔9h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表3为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表3本发明与传统转瓶比较
| 比较项目 | 传统转瓶 | 本发明 |
| 表面积 | 4500cm2 | 约19.2m2 |
| 病毒数（产毒量） | 1.5L液，5.0的毒价 | 10L液，5.5-5.7的毒价 |
| 500个转瓶所需的种毒 | 7500mL | 50-150mL |
| 500个转瓶所需的培养基 | 1500L | 20-30L |
| 500个转瓶所需的血清 | 85500mL | 1463-2128mL |
| 时间（1个转瓶为基础） | 17-18天 | 12-13天 |
| 人员 | 15-20人 | 2-3人 |
从表3中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
Claims (2)
1.一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，其特征在于：所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：
1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5×109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO 60%-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
2）加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO 60-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型；
3）培养猪圆环病毒2型72-120h后，每隔6-12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；
4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗；
所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变；
所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于：所述的纸片载体密度为15-20g/L。
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Address after: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd. Address before: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Patentee before: FUZHOU DA BEI NONG BIOTECH Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200618 Address after: 211102, 999 Ting Dong Road, Jiangning economic and Technological Development Zone, Nanjing, Jiangsu Co-patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd. Patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co.,Ltd. Address before: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Patentee before: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |