CN108220221A

CN108220221A - 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法

Info

Publication number: CN108220221A
Application number: CN201711408923.0A
Authority: CN
Inventors: 李莉; 赵海源; 曾显营; 陈化兰; 田国彬; 陈宏�; 冯玉强; 王玉红; 朱长动; 蒋晓梅; 张天舒; 杜鑫; 张丽娜; 高晓庆; 刘金伟; 曾晓敏; 王仁君; 王琳雅
Original assignee: Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明涉及禽流感病毒疫苗制备领域，特别涉及一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，包括以下步骤：重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞驯化培养，收获的培养物接种，以此重复培养，培养至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥10^7.5EID₅₀；然后接入悬浮细胞；培养至细胞病变达75％以上时收获病毒液，即得。本发明先将鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞驯化培养，再接种于悬浮MDCK细胞，有效增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性，得到的悬浮毒HA≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀。

Description

一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法

技术领域

本发明涉及禽流感病毒疫苗制备领域，具体而言，涉及一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，我国也将之列为一类动物疾病。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感暴发的主要措施，我国目前大多数厂家以鸡胚为基质生产禽流感疫苗，该工艺对鸡胚有很大的依赖性；所产出的病毒液滴度不稳定；培养过程中条件不够均一，批间差异较大；鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的健康的鸡胚，鸡胚带有潜在的污染的可能，而且培养周期长，不易于控制质量，且不利于应对大规模突发流感大流行。由于鸡胚污染情况不可避免，致使疫苗内内毒素偏高，对免疫效果造成很大影响；同时鸡胚生产造成大量的鸡胚废弃物，对生态环境也是很大污染。世界卫生组织、美国政府等鼓励发展细胞培养技术来替代目前的鸡胚培养技术来生产禽流感疫苗。

目前重组禽流感病毒灭活疫苗(H5亚型)采用鸡胚工艺生产，其种毒在SPF鸡胚上进行扩繁，用灭菌生理盐水将毒种作10^-4稀释，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，密封针孔，置36℃孵育。接种后，每日照蛋2次，直至72小时，不论死亡与否，全部取出，置2～8℃冷却12小时。收获尿囊液，测定HA、病毒含量(EID₅₀)。扩繁的种毒适应鸡胚毒的传代，无法满足禽流感灭活疫苗(H5亚型)全悬浮细胞培养的生产工艺，制备疫苗的种毒需进行一定代次的MDCK细胞适应性驯化，方可用于扩大化生产。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，将H5亚型重组禽流感病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞进行驯化培养，待生长稳定后，接入悬浮MDCK细胞进行培养，获得适应MDCK细胞增殖H5亚型重组禽流感病毒，解决了重组禽流感病毒灭活疫苗(H5亚型)大规模细胞培养的种毒供应问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，包括以下步骤：

(a)重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞培养，接种量为0.1％-3％，所述重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀，所述MDCK单层细胞采用含有TPCK-胰酶的DMEM培养基培养，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1∶512时收获培养物；

(b)收获的培养物按照步骤(a)接种，以此重复培养，培养至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥10^7.5EID₅₀，得到驯化的重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒；

(c)对数生长期的悬浮MDCK细胞调整细胞密度为3.0×10^6.0～4.0×10^6.0个/ml，按MOI感染复数10^-3～10^-4接入所述驯化的重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒；

(d)培养至细胞病变达75％以上时收获病毒液，即得。

本发明人发现，重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒直接接种于悬浮细胞培养效果不佳，经过摸索，先将重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞驯化培养，至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥10^7.5EID₅₀，得到驯化的重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒；以驯化后的重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于悬浮MDCK细胞，能有效的增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性，得到的悬浮毒HA≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀。

进一步地，步骤(a)中，以MDCK细胞贴壁的面积25cm²计，所述MDCK单层细胞的量为5.0×10⁶～7.0×10⁶。

进一步地，步骤(a)中，所述MDCK单层细胞通过以下方法制备：

取生长70-75h的MDCK细胞，胰酶消化，用含8％-12％胎牛血清的DMEM培养液吹打分散细胞，得到细胞液；

以MDCK细胞贴壁的面积25cm²计，接种细胞为5.0×10⁵～7.0×10⁵个，放入CO₂培养箱中培养，CO₂的含量为5％±1％，培养温度为37±1℃，培养70-75h，得到所述MDCK单层细胞。

优选地，步骤(a)中，以MDCK细胞贴壁的面积25cm²计，添加的含有TPCK-胰酶的DMEM培养基的体积为5m1；

所述含有TPCK-胰酶的DMEM培养基中，TPCK-胰酶的浓度为1～5μg/ml。

试验发现，添加TPCK-胰酶能有效的增加病毒的增殖速度和效价。

进一步地，步骤(b)中，接种的次数为11次以上，优选为11-12次。

经过11次以上的接种驯化，使得重组禽流感病毒H5亚型增殖性能与效价稳定。

进一步地，步骤(c)中，悬浮MDCK细胞经活化和扩增后接种，细胞密度达到6.0×10^6.0～9.0×10^6.0个/ml，调整悬浮MDCK细胞调整细胞密度为3.0×10^6.0～4.0×10^6.0个/ml。

优选地，步骤(c)中，所述悬浮MDCK细胞扩增培养的条件为：

转速80～100转/分、温度37±1℃、溶氧30％～60％、pH7.2±0.2。

优选地，步骤(d)中，培养参数为：转速80～100转/分、pH值7.4±0.2、溶氧30％～60％、温度36±0.5℃。

进一步地，步骤(d)中，培养的时间为72～96小时。

优选地，所述重组禽流感亚型病毒为H5亚型或H7亚型，所述H5亚型为Re-8株，所述H7亚型为H7-Re1株。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明先将重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞驯化培养，得到的培养物即种毒性能更稳定，为接入悬浮MDCK细胞提供良好的基础。

(2)本发明将在MDCK单层细胞驯化培养的性能稳定的种毒接种于悬浮MDCK细胞，有效增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性，得到的悬浮毒HA≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀。

(3)本发明经过多次试验摸索，限定了各步骤的参数，有效保证了悬浮毒生产品质的稳定性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

悬浮MDCK细胞的制备，步骤如下：

贴壁培养型MDCK细胞由西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心(简写GsACC)从ATCC引进，引进时间：2011年2月，ATCC编号：CCL-34，代次：P56，保存号：58860056。在GsACC扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为:GsACC2B0000090。

用含10％的FBS的DMEM/F12培养液复苏MDCK细胞，生长致密后传代。

挑选生长良好的细胞，逐步驯化培养，具体如下：

用胎牛血清含量为8％的DMEM/F12培养基传代培养3次；

用胎牛血清含量为5％的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用胎牛血清含量为2％的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；

少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，用低血清培养基传代培养5次；

消化、离心，得到的细胞以细胞密度为1×10⁶cells/ml、转速为30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液；

待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约5.0×10⁵cells/ml，并逐步提高摇床转速，先提高转速20r/min，再提高转速30r/min，每次转速适应培养3-5代，最终转速提高到80r/min；

转速提高到80r/min共传代5次，得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株，冷冻保藏；

复苏低血清培养的细胞，稳定培养4代后，挑选生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为4:1混合的培养液培养，适应培养5代。

挑选生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为2:1混合的培养液培养，适应培养5代；

挑选生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为1:2混合的培养液培养，适应培养5代；

挑选P120代生长良好的细胞，离心1000r/min 5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml，用无血清培养基培养，适应培养10代得到生长稳定的无血清悬浮培养的悬浮MDCK细胞。

此后，不再离心换液，保留原培养液，补入新的培养基，进行稀释传代即可。

制得的无血清悬浮培养的悬浮MDCK细胞，以1.5×10⁶cells/ml的密度接种，72小时达到峰值1.75×10⁷cells/ml，曲线特征为近“S”型曲线，此后细胞进入衰退期，细胞密度开始下降。细胞倍增时间20小时。

实施例2

重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞培养的驯化，步骤如下：

1.MDCK细胞制备：取生长72h MDCK细胞，以0.25％EDTA-胰酶消化，25cm²单层细胞胰酶使用量为0.5ml，(若为75cm²单层细胞，胰酶使用量为1.5ml，以此类推)，37℃作用3min。待90％左右的细胞圆缩，用DMEM培养液(含10％胎牛血清)吹打分散细胞，细胞计数。

依据计数结果传代，25cm²单层接种细胞为5.0×10⁵～7.0×10⁵个，75cm²单层接种细胞为1.5×10⁶～2.1×10⁶个，以此类推。

置37℃、CO₂培养箱(CO₂浓度为5％)中培养。生长72h后，细胞计数，25cm²单层细胞数为5.0×10⁶～7.0×10⁶，75cm²单层细胞数为1.5×10⁷～2.1×10⁷个，以此类推。

2.选取重组禽流感病毒H5亚型Re-8株、H7亚型H7-Re1株鸡胚种毒，种毒标准为HA不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀。生长72hMDCK细胞以PBS清洗2次，加入适宜体积维持液(含1～5μg/ml TPCK-胰酶的DMEM培养基)，25cm²单层细胞维持液体积为5ml，75cm²单层细胞维持液体积为15ml，以此类推。以0.1％～3％接毒量接种加入维持液的MDCK细胞，密封瓶口置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(CPE)达到80％以上，HA效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。

3.测定培养物HA，病毒含量(TCID₅₀、EID₅₀)，选取HA≥1∶512、每1ml病毒含量≥10^7.0TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.0EID₅₀的培养物作为新一代细胞毒。

4.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72hMDCK细胞，加入维持液，选取步骤3的新一代细胞毒以感染复数MOI 10^-3～10^-4接种生长良好的MDCK单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(CPE)达到80％以上，HA效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。

5.测定培养物HA，病毒含量(TCID₅₀、EID₅₀)，选取HA≥1∶512、每1ml病毒含量≥10^7.5TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀的培养物作为二代细胞毒。

6.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72h MDCK细胞，加入维持液，选取步骤5的二代细胞毒以感染复数MOI 10^-3～10^-5接种生长良好的MDCK单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(CPE)达到80％以上，HA效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。

7.测定培养物HA病毒含量(TCID₅₀、EID₅₀),选取HA≥1∶512、每1ml病毒含量≥10^7.5TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀的培养物作为三代细胞毒。

8.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72hMDCK细胞，加入维持液，选取步骤7的三代细胞毒以感染复数MOI 10^-3～10^-6接种生长良好的MDCK单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(CPE)达到80％以上，HA效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。

9.测定培养物HA，病毒含量(TCID₅₀、EID₅₀)，选取HA≥1∶512、每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀的培养物作为四代细胞毒。

10.按照上述方法传代至12代，重组禽流感病毒H5亚型Re-8株、H7亚型H7-Re1株在MDCK细胞上的生长情况如表1和表2所示。

表1 Re-8株测毒结果

表2 H7-Re1株测毒结果

不同代	HA	TCID₅₀	EID₅₀
				V1	1:512	10^7.67	10^7.5
V2	1:512	10^7.67	10^7.83
				V3	1:512	10^8.0	10^8.17
V4	1:512	10^8.33	10^8.17
				V5	1:1024	10^8.67	10^8.5
V6	1:1024	10^8.5	10^8.37
				V7	1:1024	10^8.33	10^8.17
V8	1:1024	10^8.33	10^8.0
				V9	1:1024	10^8.17	10^8.0
V10	1:1024	10^8.33	10^8.37
				V11	1:1024	10^8.33	10^8.37
V12	1:1024	10^8.33	10^8.37

从表1和表2可以看出，重组禽流感病毒H5亚型Re-8株、H7-Re1株在贴壁MDCK细胞上，经过三代以上的驯化，即可达到得到的病毒的性能温度，并且增加种毒的侵染以及增殖能力。

实施例3

悬浮MDCK细胞种毒制备：

1.悬浮细胞制备

按常规方法从液氮中复苏冻存的悬浮MDCK细胞，用吸管将细胞液加入到500ml三角摇瓶中，加入pH为7.2±0.2的过滤除菌的无血清细胞培养液至100ml。将摇瓶置于CO₂摇床内，37℃，80～100转/分进行培养扩繁。

2.反应器放大培养

取经摇瓶培养的悬浮MDCK细胞，以1.0×10^6.0～2.0×10^6.0个/ml的细胞密度接种到5L反应器培养，转速80～100转/分、温度37℃、溶氧30％～60％、pH7.2±0.2。

待细胞密度≥6.0×10^6.0个/ml时，流加细胞培养液，使细胞起始密度调整为1.0×10^6.0～2.0×10^6.0个/ml，调整反应器控制参数(转速80～100转/分、温度37℃、溶氧30％～60％、pH7.2±0.2)继续培养。待细胞密度达到6.0×10^6.0～9.0×10^6.0个/ml时，转至下一级适宜的反应器培养，使细胞接种密度为1.0×10^6.0～2.0×10^6.0个/ml。以此方法可逐级放大，终极反应器可放大至6000L反应器。

3.病毒接种

将细胞密度达到8.0×10^6.0～1.0×10^7.0个/ml，转入灭菌并预孵病毒培养液的反应器中，调整细胞密度为3.0×10^6.0～4.0×10^6.0个/ml，搅拌均匀后将实施例2驯化后的重组禽流感H5亚型Re-8株或H7亚型H7-Re1株生产用细胞毒按MOI感染复数10^-3～10^-4接种于生长良好的悬浮MDCK细胞，细胞活力90％以上，同时加入浓缩的TPCK-胰酶，使其终浓度为1μg/ml～5μg/ml。调整反应器培养参数转速80～100转/分、pH值7.4±0.2、溶氧30％～60％、温度36±0.5℃进行病毒培养。

4.病毒液的收获

接毒培养72～96小时，当细胞病变达75％以上时收获病毒液并取样。测定病毒液HA、TCID₅₀、EID₅₀。Re-8株及H7-Re1株悬浮毒HA≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀。

5.悬浮种毒也可作为生产用种毒，代次应控制在3代以内。

具体测定数据如表3所示。

表3不同代生产的悬浮种毒

上述得到的1代悬浮种毒进行了免疫原性测定，具体方法为：用3～4周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗0.3ml，取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，同等条件下隔离饲养。接种后21日，各滴鼻接种禽流感病毒强毒株病毒液0.1ml(含100LD50)，连续观察10日。对照鸡应全部死亡，免疫鸡应全部健活；攻毒后第5日，采集每只免疫鸡泄殖腔棉拭子，进行病毒分离。免疫鸡病毒分离应全部为阴性。

表4攻击HPIV的排毒情况

结果表明，细胞源禽流感疫苗与鸡胚源禽流感疫苗具有相同的免疫原性。

实施例4

将实施例2-3所用的悬浮MDCK细胞，采用市售产品，结果同上一致。

对比例1

选取重组禽流感病毒H5亚型Re-8株、H7亚型H7-Re1株鸡胚种毒，按MOI感染复数10^-3～10^-4接种于悬浮MDCK细胞，悬浮MDCK细胞的相关参数同实施例3。

接毒培养72～96小时，当细胞病变达75％以上时收获病毒液并取样。测定病毒液HA、TCID₅₀、EID₅₀。Re-8株悬浮毒HA为1:512，TCID₅₀毒为10^7.0，EID₅₀为10^6.7。

H7-Re1株悬浮毒HA为1:512，TCID₅₀毒为10^6.8，EID₅₀为10^6.5。

也就是说，鸡胚种毒直接接种于悬浮MDCK细胞，得到的悬浮种毒性能低，也正是基于此，发明人经多次试验，提出本发明的技术方案。

对比例2

重组禽流感病毒亚型驯化过程中不添加维持液。重组禽流感病毒H5亚型Re-8株、H7亚型H7-Re1株在MDCK细胞侵染弱，侵染后得到的培养物的种毒达不到生产的要求。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(d)培养至细胞病变达75％以上时收获病毒液，即得。

2.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(a)中，以MDCK细胞贴壁的面积25cm²计，所述MDCK单层细胞的量为5.0×10⁶～7.0×10⁶。

3.根据权利要求2所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述MDCK单层细胞通过以下方法制备：

4.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(a)中，以MDCK细胞贴壁的面积25cm²计，添加的含有TPCK-胰酶的DMEM培养基的体积为5m1；

5.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(b)中，接种的次数为10次以上，优选为10-12次。

6.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(c)中，悬浮MDCK细胞经活化和扩增后接种，细胞密度达到6.0×10^6.0～9.0×10^6.0个/ml，调整悬浮MDCK细胞调整细胞密度为3.0×10^6.0～4.0×10^6.0个/ml。

7.据权利要求6所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述悬浮MDCK细胞扩增培养的条件为：

转速80～100转/分、温度37±1℃、溶氧30％～60％、pH7.2±0.2。

8.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(d)中，培养参数为：转速80～100转/分、pH值7.4±0.2、溶氧30％～60％、温度36±0.5℃。

9.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，步骤(d)中，培养的时间为72～96小时。

10.根据权利要求1-9任一项所述的全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法，其特征在于，所述重组禽流感亚型病毒为H5亚型或H7亚型，所述H5亚型为Re-8株，所述H7亚型为H7-Re1株。