CN104694458A - Mdck克隆细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了MDCK克隆细胞株及其应用，属于MDCK克隆细胞株领域。本发明采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，进一步亚克隆，最终获得2株性能优异的单克隆细胞株；这两株单克隆细胞株的生长速度较母本细胞快，能够很好繁殖禽流感病毒，显著提高病毒在细胞中的复制水平，获得较高效价的病毒液，相比母本细胞培养的病毒HA效价滴度有显著提升。两株细胞株的微生物保藏编号分别为：CGMCC No.10008和CGMCC No.10009。本发明提供的MDCK克隆细胞株能够高效培养病毒，显著提高病毒滴度，在流感病毒的疫苗生产中应用价值高。

Description

MDCK克隆细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及克隆细胞株，尤其涉及MDCK克隆细胞株，本发明还涉及所述MDCK克隆细胞株在培养禽流感病毒中的应用，属于MDCK克隆细胞株的克隆和应用领域。
背景技术
过去中国一直通过鸡胚生产禽流感疫苗，需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制。这种生产方法效率低，不利于应对大规模的流感爆发。禽流感在中国不同地区流行情况不同，并且禽流感在不同地区之间的扩散快；用鸡胚生产禽流感疫苗，必须提前做出精确计划，但一般来说禽流感多呈爆发流行，难以在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。为此，世界卫生组织鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。
以哺乳动物细胞为基质制备疫苗无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。Tina Lombardo等人通过多种细胞培养禽流感病毒，通过比较发现，狗肾来源的MDCK细胞系是禽流感病毒最易感的细胞，具有下列优势：(1)容易扩大；(2)容易收集细胞。
但是，目前MDCK细胞培养流感病毒的病毒滴度与用鸡胚培养方法相比，仍然较低，制约了其在制备禽流感疫苗中的应用。亟需要从MDCK母本细胞株中筛选获取能够有效提升禽流感病毒滴度的MDCK克隆细胞株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是从MDCK母本细胞株中克隆得到能够有效增殖禽流感病毒且显著提高病毒滴度的MDCK克隆细胞株。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明选择种细胞MDCK，采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，然后选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得5株单克隆细胞，分别命名为MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2。
本发明对5株单克隆细胞MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的形态、胰酶敏感性和生长特性进行了研究并对禽流感病毒的适应性进行了分析。实验结果显示，MDCK-1F7和MDCK-2D6两株克隆细胞的性能最优异。与母本细胞相比，单克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6生长速度显著加快；对0.25％胰酶敏感，同母本细胞相比消化效率成倍提高；应用MDCK-1F7和MDCK-2D6接种禽流感病毒H5N1RE-6株，能够很好繁殖重组禽流感病毒H5N1RE-6株，显著提高了该病毒在细胞中的复制水平，并且获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于28，与母本MDCK细胞培养的病毒的HA效价27相比，提高了一个滴度。
本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10008；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-2D6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10009；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述MDCK克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6能够应用于培养病毒，尤其在禽流感疫苗的生产中应用潜力大。其中，所述病毒包括流感病毒(Influenza virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)或人类副流感病毒(Human Parainfluenza Viruses)。
优选的，所述流感病毒(Influenza virus)包括：禽流感病毒(AvainInfluenza Virus)、人流感病毒(Human Influenza Viruses)或马流感病毒(Equine Influenza virus)；最优选为禽流感病毒。
本发明进一步公开了所述MDCK克隆细胞株MDCK-1F7或MDCK-2D6在培养病毒中的应用，包括以下步骤：
(1)培养所述MDCK克隆细胞株株MDCK-1F7或MDCK-2D6；(2)接种病毒，吸附，加入维持液，继续培养；(3)收获病毒液，即得。
其中，步骤(1)所述培养优选为37℃，体积分数为5％CO2的条件下培养48-72h至形成细胞单层，优选为培养48h。
步骤(2)所述接种是按照感染复数MOI＝0.01-1.0接种病毒；优选的，按照感染复数MOI＝0.1接种病毒。
步骤(2)所述的吸附为37℃，体积分数为5％CO2的条件下吸附1h；所述维持液为DMEM维持液；优选的，所述维持液中含终浓度0.5-7.5μg/ml TPCK-胰酶和0.1-2.0％FBS；更优选的，所述维持液中含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶和0.2％FBS。
步骤(2)所述病毒优选为禽流感病毒，更优选为禽流感病毒H5N1RE-6株。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从MDCK母本细胞株中克隆得到了2株性能优异的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6，两株细胞克隆株能够高效的繁殖禽流感病毒H5N1RE-6株，获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于28，比母本MDCK细胞培养病毒的HA效价提高了一个滴度，在禽流感疫苗的生产中有较高的应用价值。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“单细胞克隆”意指将一个细胞进行培养，使之不断分裂，形成一个细胞群的过程，这一群细胞来源于一个共同的祖先细胞。
术语“亚克隆”意指在细胞克隆中，对培养的细胞，从原有的克隆中再筛选出具有某种特性的细胞进行培养。
术语“传代”意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。
附图说明
图1为MDCK克隆细胞株的细胞形态；其中，A：MDCK-1F7；B：MDCK-1E3；C：MDCK-2F6；D：MDCK-2D6；E：MDCK-3E2；F：MDCK；
图2为MDCK克隆细胞株的生长曲线测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
禽流感病毒H5N1RE-6株(由哈药集团生物疫苗有限公司保存)；MDCK细胞(由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心保存)。
实施例1 MDCK克隆细胞株的克隆及鉴定
1实验方法
1.1MDCK克隆细胞株的克隆
(1)选择种细胞MDCK；
(2)细胞传代：首先复苏步骤(1)所选择的种细胞到T25的细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代，克隆前继续传代20次；
(3)采用有限稀释法在96孔板内进行MDCK单细胞克隆，消化后的MDCK细胞计数后稀释到1个细胞/毫升，将稀释好的细胞铺于96孔板，0.1ml/孔，37℃5％CO2培养箱内培养，观察10日；
(4)选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，选取单克隆株进行扩大培养，培养液为DMEM(含10％FBS)，然后，对克隆细胞进行进一步鉴定。
1.2MDCK克隆细胞株的鉴定
1.2.1MDCK克隆细胞株的形态分析
取各克隆细胞株第16代细胞，接种于含10％小牛血清(56℃灭活30min)，10mL青霉素-链霉素的pH 7.2的DMEM培养液中。取24孔板，每孔加入细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液1ml，放入37℃5％CO2恒温孵箱中培养48小时。倒置显微镜下观察各孔内细胞的大小、形状，各形态细胞的比例，细胞核大小及形态，并拍照。
1.2.2MDCK克隆细胞株的生长特性分析
取各细胞株第16代细胞，消化分散后，取24孔板，每孔加入细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液1mL，每细胞株设置三组复孔。放入37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养。每隔8小时取各细胞株的三个复孔计数，取平均值。连续观察48h，绘制生长曲线。
1.2.3MDCK克隆细胞株的胰酶敏感性分析
取各克隆细胞株第16代细胞，接种于细胞培养瓶(T25Corning)中，37℃，5％CO2培养48h形成单层后，弃去培养基，加入2ml 0.25％胰酶(含0.02％EDTA)进行消化，记录并比较各株细胞株消化时间。
1.2.4MDCK克隆细胞株对禽流感病毒的适应性分析
培养MDCK克隆细胞株，15代以后采取1:10的比例进行传代，每隔5代冻存一次直到25代。
将单克隆细胞接种于细胞培养瓶(T25Corning)中，37℃，5％CO2培养48h形成单层后，弃去培养基，PBS(pH 7.2)冲洗两次，按照感染复数(MOI)＝0.1加入禽流感病毒H5N1RE-6株，37℃，5％CO2培养箱中吸附1h，加入9ml DMEM维持液(含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶，0.2％FBS)，37℃，5％CO2继续培养，逐日观察。当病变达到80％(5天内)，反复冻融2次，2,000rpm 4℃离心20分钟后收获上清，进行HA检测。
分别测定不同代次MDCK克隆细胞株的HA，以母本MDCK细胞为对照。
2、实验结果
2.1MDCK克隆细胞株的获得
本发明采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，然后选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得5株单克隆细胞，分别命名为MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2。其中，MDCK-1F7和MDCK-2D6两株克隆细胞的性能最优异。
本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.10008。
本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-2D6提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.10009。
2.2MDCK克隆细胞株的形态分析结果
各株单克隆细胞MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的48h的细胞形态见图1。
2.3MDCK克隆细胞株的生长特性分析结果
MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的生长曲线测定结果(图2)显示，各株克隆细胞与母本细胞相比，MDCK-1F7和MDCK-2D6生长速度较快。
2.4MDCK克隆细胞株的胰酶敏感性分析结果
MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的胰酶敏感性试验结果见表1。结果表明，单克隆细胞MDCK-1F7和MDCK-2D6对0.25％胰酶敏感，同母本细胞相比，消化效率成倍提高。
表1 克隆细胞胰酶敏感性实验结果
2.5MDCK克隆细胞株对禽流感病毒的适应性分析
各株单克隆细胞MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2对禽流感疫苗株的适应性实验结果见表2。
表2 单克隆细胞株对禽流感疫苗株的适应性实验结果
结果表明，两株单克隆细胞MDCK-1F7和MDCK-2D6能够很好繁殖重组禽流感病毒H5N1RE-6株且获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于28，与母本MDCK细胞培养病毒的HA效价(27)相比，提高了一个滴度。
实验例1 利用MDCK克隆细胞株MDCK-1F7或MDCK-2D6培养禽流感病毒条件的优化实验
1、实验方法
利用本发明实施例1克隆的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7或MDCK-2D6培养禽流感病毒并进行培养条件的优化。
单克隆细胞MDCK-1F7或MDCK-2D6接种于细胞培养瓶(T25Corning)中，37℃，5％CO2培养48h形成单层后，弃去培养基，PBS(pH7.2)冲洗两次，按照一定的感染复数加入禽流感病毒H5N1RE-6株，37℃，5％CO2培养箱中吸附1h，加入9ml DMEM维持液，37℃，5％CO2继续培养，逐日观察。当病变达到80％(5天内)，反复冻融2次，2,000rpm 4℃离心20分钟后收获上清。
1.1病毒感染复数的优化实验
按照感染复数MOI＝0.01、0.1、0.2、0.5、1.0加入禽流感病毒H5N1RE-6株，DMEM维持液中分别含终浓度5μg/ml的TPCK-胰酶，收获病毒上清，进行HA检测。
1.2维持液中TPCK-胰酶浓度的优化实验
按照感染复数MOI＝0.1加入禽流感病毒H5N1RE-6株，DMEM维持液中分别含终浓度0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml的TPCK-胰酶，收获病毒上清，进行HA检测。
1.3维持液中血清浓度的优化实验
按照感染复数MOI＝0.1加入禽流感病毒H5N1RE-6株。DMEM维持液中分别含终浓度0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％的FBS和5μg/mlTPCK-胰酶，收获病毒上清，进行HA检测。
2、实验结果
2.1病毒感染复数的优化结果
实验结果见表3。结果表明，按照感染复数MOI＝0.1加入禽流感病毒H5N1RE-6株，获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA达到27。
表3 不同MOI对病毒复制的影响
2.2维持液中TPCK-胰酶浓度的优化结果
实验结果见表4。结果表明，维持液中含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶，病毒血凝效价HA达到27。
表4 不同TPCK-胰酶浓度对病毒复制的影响
2.3维持液中血清浓度的优化实验
实验结果见表5。结果表明，维持液中含终浓度0.2％FBS，病毒血凝效价HA达到28。
表5 不同血清浓度对病毒复制的影响
综上，本发明确定利用本发明实施例1克隆的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7或MDCK-2D6培养禽流感病毒，按照感染复数MOI＝0.1接种病毒，DMEM维持液中含终浓度5μg/ml的TPCK-胰酶和0.2％FBS，收获病毒的血凝效价HA达到28。

Claims (10)

1.一株MDCK克隆细胞株MDCK-1F7，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.10008。
2.一株MDCK克隆细胞株MDCK-2D6，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.10009。
3.权利要求1或2所述MDCK克隆细胞株在培养病毒中的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述病毒包括流感病毒(Influenza virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)或人类副流感病毒(HumanParainfluenza Viruses)。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，所述流感病毒(Influenzavirus)包括：禽流感病毒(Avain Influenza Virus)、人流感病毒(HumanInfluenza Viruses)或马流感病毒(Equine Influenza virus)；优选为禽流感病毒。
6.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养权利要求1或2所述MDCK克隆细胞株；(2)接种病毒，吸附，加入维持液，继续培养；(3)收获病毒液，即得。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(1)所述培养为在温度37℃，体积分数为5％CO2的条件下培养48-72h至形成细胞单层。
8.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述接种是按照感染复数MOI＝0.01-1.0接种病毒；优选的，按照感染复数MOI＝0.1接种病毒。
9.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述的吸附为在温度37℃，体积分数为5％CO2的条件下吸附1h；所述维持液为DMEM维持液；优选的，所述维持液中含终浓度0.5-7.5μg/ml TPCK-胰酶和0.1-2.0％FBS；更优选的，所述维持液中含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶和0.2％FBS。
10.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述病毒为禽流感病毒，优选为禽流感病毒H5N1RE-6株。
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Inventor after: Guan Junwei

Inventor after: Yu Hongtao

Inventor after: Ding Guojie

Inventor after: Lu Aiguo

Inventor after: Tu Yingxia

Inventor after: Zheng Tiexin

Inventor after: Chen Xin

Inventor after: Li Lili

Inventor after: Wang Hao

Inventor after: Sun Kai

Inventor after: Mao Chunling

Inventor after: Bu Fan

Inventor after: Wang Dandan

Inventor before: Tu Yingxia

Inventor before: Yu Hongtao

Inventor before: Li Lili

Inventor before: Wang Dandan

Inventor before: Li Yanwei

Inventor before: Ding Guojie

Inventor before: Mao Chunling

Inventor before: Bu Fan

Inventor before: Lu Aiguo

Inventor before: Zheng Tiexin

Inventor before: Wang Hao

Inventor before: Sun Kai

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CB03 Change of inventor or designer information
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Inventor after: Chai Hua

Inventor after: Bu Fan

Inventor after: Wang Dandan

Inventor after: Yu Hongtao

Inventor after: Ding Guojie

Inventor after: Lu Aiguo

Inventor after: Zheng Tiexin

Inventor after: Chen Xin

Inventor after: Xing Yugang

Inventor after: Zhao Gang

Inventor after: Li Lili

Inventor after: Wang Hao

Inventor after: Sun Kai

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Inventor before: Chen Xin

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