CN102191225A - 一种用mdck细胞获得流感病毒高产毒株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，通过以下步骤进行制备：对流感病毒毒株的筛选；对流感病毒株的毒力检验；流感病毒基因组RNA的提取；RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；PCR产物的纯化；用氯化钙法制备感受态宿主菌；制备质粒DNA限制性内切酶；DNA片段回收；用体系惊醒连接与转化；提取质粒小量；进行序列测定和与病毒原始序列对比；用此方法生产的流感病毒毒株制备周期短(一周左右时间)，具有高产特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用哺乳动物细胞获得流感病毒疫苗毒株制备方法，特别涉及一种用MDCK细胞获得流感病毒毒株的方法。
背景技术
流感病毒是威胁人类健康的重大传染病之一，主要通过呼吸道传播，具有传播速度快，致死率高及快速变异的特点，在人类历史上多次发生过多次全球范围的流感大流行。流感病毒分为A，B，C(又称甲、乙、丙)三型。其中A型病毒容易发生变异，依其两种主要抗原(HA，NA)的不同，区分为不同的亚型。现发现一共有15种HA(H1-H15)及9种NA(N1-N9)亚型。B型病毒的变异比较缓慢，C型病毒甚少对人类造成威胁。
疫苗免疫仍是目前预防控制流感流行的行之有效的手段，临床上应用的是用鸡胚生产的三价灭活疫苗。早在20世纪30年代，流感的灭活疫苗就开展了动物实验研究。1941年鸡胚培养的流感疫苗在美国首次获得批准。目前应用的流感疫苗为三价灭活疫苗包括：H1N1、H3N2、B型。但是经过多年的临床应用表明，灭活的流感病毒疫苗的效果基本上是肯定的，但也有不理想的地方，主要由于：1、疫苗株与当前流行的毒株不匹配，因为疫苗的生产需要经过疫苗株的筛选和制备阶段，耗时的特点限制了它的合理时效；2、鸡胚供应和生长活性的限制，导致流感病毒的低产值；3、部分接种者对鸡胚蛋白过敏，甚至危及到生命。近年来流感病毒全球流行有愈演愈烈之势，对流感病毒疫苗的需求日趋增加。
在研发的非鸡胚培养的新型流感疫苗中利用哺乳动物细胞(主要是MDCK细胞)代替鸡胚培养病毒，可以达到降低成本，减少过敏反 应，培养后的病毒株更接近自然分离的病毒(即病毒的抗原性保持不变)的特点。而且经过试验表明，MDCK被连续传代100代，每代均做鼠的成瘤性实验结果阴性，证明该细胞系不具备致瘤性，用于疫苗生产也是安全可靠的。
传统上利用哺乳动物细胞培养新型流感疫苗毒株是利用弱毒株与当前流行的毒株进行基因重配获得，而弱毒株疫苗的生产要有冷适应毒株与流行毒株重配的步骤，通过免疫压力筛选大约需要1-2个月的时间才能获得重组毒株，而在疫苗的生产过程中，疫苗生产周期的长短决定了对流感病毒变异的反应能力，也直接决定了疫苗的质量，因此能否在较短的周期内制备高产的毒株成为疫苗生产过程中亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种制备周期短，只需一周左右时间，具有高产特性的流感病毒疫苗毒株的制备方法。
本发明的解决方案是一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，包括以下步骤：
步骤一：对流感病毒毒株进行筛选，选取5～50株原始毒株行10-3-10-4稀释，取200μL-1000μL稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中1～2个小时，等到病毒完全吸附后取出，在24～72小时之间加入浓度为1μg/ml-4μg/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“卌”时，收获病毒；
步骤二：用50％组织细胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落监测方法(PFU法)来检测和计算病毒株的毒力；
步骤三：提取流感病毒基因组RNA；
步骤四：RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；
步骤五：对PCR产物进行纯化；
步骤六：用氯化钙法制备感受态宿主菌；
步骤七：制备质粒DNA限制性内切酶体系，此体系包括：
10×限制性内切酶缓冲液 1μl-2μl
10×乙酰化BSA(1mg/ml) 1μl-2μl
质粒DNA 0.2μg-1.0μg
限制性内切酶 2U-4U
灭菌去离子水 10μl-20μl；
步骤八：DNA片段回收；
步骤九：制备以下体系进行连接反应，
5×T4DNA Ligase Buffer 2μl-4μl
PGEM-3ZF载体(50ng/μl) 1μl-2μl
PCR产物(经纯化) 2μl-5μl
T4DNA Ligase 0.5μl-1μl
去离子水 5μl-8μl
步骤十：提取质粒小量；
步骤十一：将PCR扩增的片段克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer进行测序，从而确定高产毒株的基因序列；
步骤十二：利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。
所述步骤一中优选10株原始毒株行10-3-10-4稀释，取500μL稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中1个小时，等到病毒完全吸附后取出，在48小时之间加入浓度为2μg/mlTPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“卌”时，收获病毒。
所述步骤二中优选用50％组织细胞感染量(TCID50)方法来检测和计算病毒株的毒力。
所述50％组织细胞感染量(TCID50)方法是将病毒株行倍比稀释，接种24孔板，每稀释度设置平行4个复孔，每孔加入200μL稀释液，35℃CO2培养箱孵育1小时后用Hank’s液洗一遍，然后加入含终浓度2μg/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35℃CO2培养箱培养，并于感染后24，48，72小时再分别加入终浓度2μg/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖，在感染后的72小时收获病毒。
所述步骤三中提取流感病毒基因组RNA方法为：取100μL病毒液，加入1.5mLEppendorf管中，然后加入500μL Lysis BufferRLT、β-巯基乙醇、600μL 70％乙醇，混匀，吸出600μL混合液进行离心，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。
所述步骤四中RT-PCR扩增流感病毒各基因节段，选用病毒反转录试剂盒RT-PCR System对模板RNA进行反转录或Pfu DNAPolymerase进行PCR扩增。
所述步骤五中对PCR产物进行纯化的方法是通过PCR产物纯化试剂盒，把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer，进行离心收集，然后加40μL双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。
所述步骤六中用氯化钙法制备感受态宿主菌的方法为：取DH5α单菌落，接种无抗菌素LB培养液，振摇培养，当至菌液0D600nm值为0.4-0.6时停止培养，于冰上预冷10分钟，离心后加入灭菌甘油，混匀，分装于Eppendorf管中，贮于低温冰箱中。
所述步骤八中DNA片段回收的方法为采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收。
所述步骤十中提取质粒小量的方法为：取单菌落于5ml含氨 苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，离心后将沉淀悬浮于150μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，PH8.0)，冰浴5分钟；加新鲜配制20μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，混匀，冰浴10分钟；加入150μl预冷的溶液III(3.0mol/L KCl，pH4.8)，混匀，冰浴10分钟，再次离心，用70％乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50μl含RNA酶(20μl/ml)的TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，37℃水浴30分钟。
本发明的流感疫苗毒株制备方法是建立在流感病毒反向遗传学技术基础上的，方便体外对病毒基因的操作，在无辅助病毒存在的情况下，完全由质粒转染的形式获得疫苗病毒株，达到周期短，产量高的效果。
流感病毒MDCK细胞高产株反向遗传技术平台的建立，其方法步骤如下：
1、流感病毒真核表达载体的构建
以质粒pHH21为模板，扩增出一段全长275bpDNA产物。该序列含有225bp人源RNA polymerase I启动子和33bp鼠源RNApolymerase I终止子。PCR产物两端引入Avr II和HindIII酶切位点。
引物设计如下：AAG CTT
P1：5’-GTG-----CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCG AAG-3’
HindIII
CCT AGG
P2：5’-ATC-----GGC GGC CGG GAG GGC GT-3’
Avr II
PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72 ℃200秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。PCR产物1％琼脂糖电泳检测，与目的片段大小相符，纯化PCR产物备用。将上述PCR产物用Avr II和HindIII双酶切，质粒载体pcDNA3.1(+)用Xba I和HindIII双酶切，纯化回收相应片段；体外连接质粒载体与目的基因，转化大肠杆菌。挑选阳性克隆，酶切鉴定正确后送测序；测序结果与目的基因相符，命名载体为PIVV II；
2、流感病毒反向遗传8质粒及6+2质粒系统的构建
将构建成功的PIVV II质粒载体用BSMB1酶切线性化，然后用Qiagen回收试剂盒回收线性化的PIVV II片段。同样，将连接到PGEM-T载体的目的基因片段用BSMBI酶切，回收目的片段。将A/CNIC/246/00(H1N1)的1-8节段分别连接到PIVV II载体上，体系为3μl目标片段，1μl载体，1μlT4DNA连接酶15μlddH2O，从而得到连接产物PIVV II-AX系列8质粒。另外将甲1亚型流行代表株A/沪防/7/99的HA，NA基因片段扩增，依上述方法克隆入PIVV II。替代pIVV II-AX系列中的HA，NA质粒，构成6+2系列。
3、转化
将得到的连接产物转化到感受态菌(Sure菌)中，42℃热休克60秒，冰浴5分钟，37℃震荡(转速小于200转/分钟)45分钟，离心，取沉淀涂布抗性平板，37℃孵育过夜，次日挑单菌落接种于5ml含抗菌素的LB培养基中，37℃震荡过夜后小提质粒。
4、酶切鉴定
用内切酶鉴定目标序列是否与载体相连，实验条件参照相关酶的使用说明。
5、质粒的大量制备：(聚乙二醇沉淀法)
挑取单菌落接种5ml含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基中， 37℃震荡培养过夜。将培养物转接200ml含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养12-16小时，5000rpm离心15分钟，弃上清；重悬细菌于100ml冰预冷STE(0.1mol/LTris-HCL，1mmol/L EDTA PH8.0)。5000rpm离心15分钟，收集细菌；10ml溶液1(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL，10mmol/L EDTAPH8.0)重悬细菌，混匀，冰浴10分钟；加入20ml新配置的溶液2(0.2mol/L NaOH 1％SDS)，混匀，冰浴10分钟；加入15ml预冷的溶液3(3.0mol/L KCL，PH4.8)，混匀，冰浴10分钟；10000rpm离心15分钟，弃沉淀；加入等体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀1小时；10000rpm离心15分钟，弃上清，干燥；3ml TE(10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，PH8.0)溶解沉淀，再加入3ml冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，10000rpm离心15分钟，弃沉淀；上清中加入等体积冰预冷的异丙醇，充分混匀，10000rpm离心15分钟，弃上清，干燥沉淀；用500μl含RNA酶(20μg/ml)的TE(10mmol/L EDTA，pH8.0)溶解沉淀，转移到Eppendorf管中，室温放置30分钟；加入500μl含13％聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混匀，-20℃沉淀2小时，于台式离心机上12000rpm离心10分钟，弃上清；400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；转移水相于新的Eppendorf管，加100μl 10M乙酸铵，充分混匀，加2倍体积乙醇，-20℃沉淀1小时，12000rpm离心10分钟。70％冰预冷乙醇洗涤沉淀一次，晾干；50μl TE(pH8.0)溶解沉淀，储存于-20℃冰箱备用。
6、转染
将293T细胞培养在六孔细胞培养板中。80％成片后，将8个质粒DNA各取1μg共8μg与20μlLF2000混合在室温放置45分钟，然后加入到培养板内。6小时后，用optim-MEM维持液在33℃孵箱中继续孵育，分别收获24小时，48小时和72小时的细胞培养上清接种 MDCK细胞，维持液中含TPCK-Trypsin至终浓度1μg/ml。
7、重配病毒单向血凝抑制实验鉴定
首先RDE处理标准参照血清，然后制备用于血凝抑制试验的4个血凝单位的抗原。具体实施单向血凝抑制实验的步骤：加PBS或生理盐水25μl于96孔板的第B行至H行的每一孔。加1∶10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50μl于A行的每一孔。用多通道移液器从A行各孔取25μl血清，倍比稀释至H排各孔，最后25μl弃去。取25μl被检病毒的4个血凝单位抗原加至相应一排各孔，混匀，室温静置15-30min，所有孔中加50μl的红血球(0.5％鸡红细胞或0.75％豚鼠红细胞)，室温静置30-60min(鸡血球30min；豚鼠血球60min)后观察结果。结果判定：血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI实验的效价。
8、6+2重配病毒的基因型鉴定
收获重配病毒，依第一章实验方法所述提取病毒核酸，应用甲1亚型特异性引物作RT-PCR，用QIAGEN公司的试剂盒回收PCR产物，然后测定DNA序列，结果提交NCBI比对。
具体实施方式
结合具体实施列进行说明。
实施例1
通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产H1N1毒株：
1、高产H1N1毒株的筛选
将10株备选毒株H1N1(经MDCK细胞分离，病毒滴度≥1∶160的原始毒株)行10-3，10-4稀释。取500μL病毒稀释液接种成片生长的MDCK细胞(25cm2培养瓶)，细胞记数约3-4×106，接种前细胞用Hank’s液洗两遍。正常MDCK细胞，细胞计数密度为3-4×106，病毒的接种量MOI为1×10-4TCID50/细胞和×10-5TCID50/细胞。维持 液中含有TPCK胰酶，并于感染后的24，48小时分别加入，使TPCK胰酶的终浓度达到1μg/ml。置于35℃CO2培养箱培养，于感染后72小时或96小时收获病毒，测定病毒血凝滴度。
置35℃CO2培养箱1小时，待病毒完全吸附后，弃感染液，用Hank’s液洗一遍。每瓶细胞加入含终浓度2μg/ml TPCK胰酶的细胞维持液3ml，置35℃CO2培养箱培养。并于感染后24，48，72小时再分别加入终浓度2μg/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖。细胞感染后48小时，镜下观察细胞病变(CPE)。当CPE呈卌时，收获病毒。病毒滴度测定，采用红细胞凝集实验，计算血凝单位。
2、H1N1毒株的毒力检测
TCID50检测和计算：将H1N1毒株行倍比稀释，接种24孔板，每稀释度设置平行4个复孔。每孔加入200μL稀释液，35℃CO2培养箱孵育1小时后用Hank’s液洗一遍。然后加入含终浓度2μg/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35℃CO2培养箱培养。并于感染后24，48，72小时再分别加入终浓度2μg/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖。在感染后的72小时收获病毒。-80℃冰箱冻存，待血凝滴度的测定。
PFU检测：将H1N1毒株进行倍比稀释，接种于小方瓶，每小方瓶加入500μL病毒稀释液，33℃孵育1小时后，用HANKS液冲洗，然后加入第一层覆盖液，33℃孵育72小时后加入第二层覆盖液，24小时后计数空斑。
3、H1N1病毒基因组RNA的提取
取100μL病毒液，加入1.5mLEppendorf管中，然后加入500μL Lysis Buffer RLT、β-巯基乙醇、600μL 70％乙醇，混匀，吸出600微升混合液转入带吸附柱的离心管中，12000rmp离心15秒，弃离心液。将上部剩余的其它液体再此上柱离心。12000rmp离心15秒，弃离心液。向柱内加入700μL Washing Buffer RW1，12000rmp离心 15秒，弃离心液。将柱子移到新的收集管上，加入500μL WashingBuffer RPE，12000rmp离心15秒，弃离心液。再于柱子上加入500μL Washing Buffer RPE，13000-14000rmp离心2分钟。将柱子移到一无Rna se污染的Eppendorf管上，加入40μLDEPC处理的水，室温放置1-3分钟，12000rmp离心1分钟，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。
4、RT-PCR扩增流感病毒各基因节段
使用GIBCO BRL公司的病毒反转录试剂盒THERMOSCRIPTTM RT-PCRSystem对模板RNA进行反转录。
取一只无Rnase，无Dnase的Eppendorf管，依次加入：
RNA模板 5μL
引物F(20pM) 1μL
ddH2O 4μL
混匀后，在90℃水浴中加热3分钟，置于冰浴3分钟使之迅速冷却。然后加入：
cDNA Buffer 4μL
DEPC-water 1μL
0.1M DTT 1μL
Rnase OUT 1μL
dNTPs 2μL
RT 1μL
60℃作用1小时，85℃5分钟，然后置冰上。加RnaseH 1μL 37℃作用30分。即为反转录好的cDNA。此步反应由通用引物完成全部8个基因节段的反转录。
使用STRATAGENE公司Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增PCR反应体系：
10×PCR Buffer 5μL
dNTPs 1μL
Primer F(20pM) 1μL
Primer R(20pM) 1μL
Pfu酶(5U/μL) 1μL
cDNA 2μL
ddH2O 40μL
Total 50μL
PCR反应条件：
94℃预变性5分钟
94℃30秒
55℃30秒
72℃420秒；共30个循环
72℃延伸5分钟
5、PCR产物的纯化
采用PCR产物纯化试剂盒，具体步骤如下：把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer，上柱，13000rmp离心45秒，弃离心液。向纯化柱中加750μL的PE Buffer，13000rmp离心45秒，弃离心液。以同样的速度再离心1分钟充分去除洗液。将柱子放在一支干净的Eppendorf管上，加40μL双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。13000rmp离心1分钟收集离心液，-20℃保存。
6、用氯化钙法感受态宿主菌的制备
取DH5α单菌落，接种无抗菌素LB培养液，37℃振摇培养过夜，次日按1∶100转入新的LB中继续培养2小时左右，至菌液0D600nm值为0.4-0.6时停止培养。于冰上预冷10分钟，4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清；以10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟；4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清；按每50ml培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15％体积灭菌甘油，混匀，分装于Eppendorf管中，贮于-70℃低温冰箱中备用。
7、质粒DNA限制性内切酶消化
取一灭菌Eppendorf管，依次加入限制性内切酶缓冲液、乙酰化BSA、质粒DNA、限制性内切酶，并以灭菌的去离子水补充至所需体积。以20μl总反应体系为例：
10×限制性内切酶缓冲液 2μl
10×乙酰化BSA(1mg/ml) 2μl
质粒DNA 1.0μl
限制性内切酶 4U
灭菌去离子水 补充至20μl
混匀，于离心机上快速离心5秒，将反应管至于37℃水浴保温1-4小时。
8、DNA片段回收
采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收，方法如下：将待回收的DNA片段经电泳分离后，在长波紫外光下从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，转移到1.5mlEppendorf管中，于天平上称量，然后用1个吸头捣碎，动作轻柔； 加入60μl L1 Buffer，在50℃水浴中加热15min，每3min摇动1次，使琼脂糖完全融化。将液体转入吸附柱中，放在套管上，13000rpm离1min；倒掉套管中的液体，向吸附柱中加入500μl L1 Buffer，，室温下放置1min，1300rpm离1min；弃去套管中的液体，向吸附柱中加入700μl L2 Buffer，室温下放置5min，13000rpm离1min；弃去管中的液体，再以1300rpm离1min；将吸附柱放于1.5mlEppendorf管中，加入30μl去离子水(或TE溶液，10mmol/LTris-HCL，1mmol/L EDTA，ph8.0)，室温下放置1min，13000rpm离心2min，所得液体中即含有回收的DNA片段，置于-20℃保存。
9、连接反应体系的制备与转化
按下列体系进行连接反应：
5×T4DNA Ligase Buffer 4μl
PGEM-3ZF载体(50ng/μl) 2μl
PCR产物(经纯化) 5μl
T4DNA Ligase 1μl
去离子水 8μl
混合均匀后，于4℃连接过夜。取上述连接产物5μl，加入到100μl DH5a感受态细菌中，置冰浴上45min后，42℃热休克2min，再置于冰浴上2min，加入无抗生素的LB培养液400μl，37℃摇床振摇1h后，取100μl菌液，向其中加入40μl 120mg/ml 5’-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4μ120mg/ml异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混匀后涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培养12-16h，挑取白色菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定。
10、提取质粒小量
取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜，取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀悬浮于150μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA，PH8.0)，冰浴5分钟；加新鲜配制20μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，混匀，冰浴10分钟；加入150μl预冷的溶液III(3.0mol/L KCl，pH4.8)，混匀，冰浴10分钟.12000rpm5分钟，转移上清至新的离心管，加等体积酚/氯仿抽提；转移上层相至新的离心管，再用等体积氯仿抽提一次。取上清，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃沉淀30分钟，12000离心5分钟。70％乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50μl含RNA酶(20μl/ml)的TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，37℃水浴30分钟，-20℃保存备用。
11、将PCR扩增的片段以平端连接的方式克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer进行测序。为了保证病毒基因组中的点突变是高产毒株所特有的，而不是PCR过程中发生的变异，我们对每一个基因节段至少测定3个克隆，并且各克隆序列符合率≥99％，从而确定高产毒株的基因序列。
12、利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。
制备好毒株后，将10株流感病毒MDCK分离株血凝滴定，再进行10-3，10-4稀释接种细胞，两代后血凝滴度仍保持≥1∶160有四株，四代后血凝滴度仍保持≥1∶160有两株，五代以上仍保持高产特性的有一株，命名为A/CNIC/246/00(H1N1)。
图1为高产H1N1毒株细胞传代记录图。
由上图可知，H1N1病毒株在传代5代以后滴度＞1∶640，高产性状稳定下来。
再对上述高产毒株做血凝抑制实验，试验结论如下：
由上表可知高产毒株A/CNIC/246/2000(H1N1)P1，P10，P15代之间针对两种标准血清的血凝抑制效价没有差别，初步证实高产毒株的抗原性保持不变。高产毒株针对当前流行毒株A/SH/7/99(H1N1)的血凝抑制效价比A/BJ/1/86(H1N1)的血凝抑制效价要高。
实施例2
通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产H2N2毒株：
1、高产H2N2毒株的筛选
将5株备选毒株H2N2(经MDCK细胞分离，病毒滴度≥1∶160的原始毒株)行10-3，10-4稀释。取200μL病毒稀释液接种成片生长的MDCK细胞(25cm2培养瓶)，细胞记数约3-4×106，接种前细胞用Hank’s液洗两遍。维持液中含有TPCK胰酶，并于感染后的24，48小时分别加入，使TPCK胰酶的终浓度达到1μg/ml。置于35℃CO2培养箱培养，于感染后96小时收获病毒，测定病毒血凝滴度。置35℃CO2培养箱1.5小时，待病毒完全吸附后，弃感染液，用Hank’s液洗一遍。每瓶细胞加入含终浓度2μg/mlTPCK胰酶的细胞维持液3ml，置35℃CO2培养箱培养。并于感染后24，48，72小时再分别加入终浓度2μg/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖。细胞感染后48小时，镜下观察细胞病变(CPE)。当CPE呈卌时，收获病毒。病毒滴度测定，采用红细胞凝集实验，计算血凝单位。
2、H2N2毒株的毒力检测
PFU检测：将H2N2毒株进行倍比稀释，接种于小方瓶，每小方瓶加入500μL病毒稀释液，33℃孵育1小时后，用HANKS液冲洗，然后加入第一层覆盖液，33℃孵育72小时后加入第二层覆盖液，24小时后计数空斑。
3、H2N2病毒基因组RNA的提取
取100μL病毒液，加入1.5mLEppendorf管中，然后加入500μL Lysis Buffer RLT、β-巯基乙醇、600μL 70％乙醇，混匀，吸出600微升混合液转入带吸附柱的离心管中，12000rmp离心15秒，弃离心液。将上部剩余的其它液体再此上柱离心。12000rmp离心15秒，弃离心液。向柱内加入700μL Washing Buffer RW1，12000rmp离心15秒，弃离心液。将柱子移到新的收集管上，加入500μL Washing Buffer RPE，12000rmp离心15秒，弃离心液。再于柱子上加入500μL Washing Buffer RPE，13000-14000rmp离心2分钟。将柱子移到一无Rnase污染的Eppendorf管上，加入40μLDEPC处理的水，室温放置1-3分钟，12000rmp离心1分钟，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。
4、RT-PCR扩增流感病毒各基因节段
使用GIBCO BRL公司的病毒反转录试剂盒THERMOSCRIPTTM RT-PCRSystem对模板RNA进行反转录。
取一只无Rnase，无Dnase的Eppendorf管，依次加入：
RNA模板 5μL
引物F(20pM) 1μL
ddH2O 4μL
混匀后，在90℃水浴中加热3分钟，置于冰浴3分钟使之迅速冷却。然后加入：
cDNA Buffer 4μL
DEPC-water 1μL
0.1M DTT 1μL
Rnase OUT 1μL
dNTPs 2μL
RT 1μL
60℃作用1小时，85℃5分钟，然后置冰上。加RnaseH 1μL 37℃作用30分。即为反转录好的cDNA。此步反应由通用引物完成全部8个基因节段的反转录。
使用STRATAGENE公司Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCR Buffer 5μL
dNTPs 1μL
Primer F(20pM) 1μL
Primer R(20pM) 1μL
Pfu酶(5U/μL) 1μL
cDNA 2μL
ddH2O 40μL
Total 50μL
PCR反应条件：
94℃预变性5分钟
94℃30秒
55℃30秒
72℃420秒；共30个循环
72℃延伸5分钟
5、PCR产物的纯化
采用PCR产物纯化试剂盒，具体步骤如下：把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer，上柱，13000rmp离心45秒，弃离心液。向纯化柱中加750μL的PE Buffer，13000rmp离心45秒，弃离心液。以同样的速度再离心1分钟充分去除洗液。将柱子放在一支干净的Eppendorf管上，加40μL双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。13000rmp离心1分钟收集离心液，-20℃保存。
6、用氯化钙法感受态宿主菌的制备
取DH5α单菌落，接种无抗菌素LB培养液，37℃振摇培养过夜，次日按1∶100转入新的LB中继续培养2小时左右，至菌液0D600nm值为0.4-0.6时停止培养。于冰上预冷10分钟，4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清；以10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟；4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清；按每50ml培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15％体积灭菌甘油，混匀，分装于Eppendorf管中，贮于-70℃低温冰箱中备用。
7、质粒DNA限制性内切酶消化
取一灭菌Eppendorf管，依次加入限制性内切酶缓冲液、乙酰化BSA、质粒DNA、限制性内切酶，并以灭菌的去离子水补充至所需体积。以20μl总反应体系为例：
10×限制性内切酶缓冲液 1μl
10×乙酰化BSA(1mg/ml) 1μl
质粒DNA 0.2μl
限制性内切酶 2U
灭菌去离子水 补充至10μl
混匀，于离心机上快速离心5秒，将反应管至于37℃水浴保温1-4小时。
8、DNA片段回收
采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收，方法如下：将待回收的DNA片段经电泳分离后，在长波紫外光下从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，转移到1.5mlEppendorf管中，于天平上称量，然后用1个吸头捣碎，动作轻柔；加入60μl L1 Buffer，在50℃水浴中加热15min，每3min摇动1 次，使琼脂糖完全融化。将液体转入吸附柱中，放在套管上，13000rpm离1min；倒掉套管中的液体，向吸附柱中加入500μl L1 Buffer，，室温下放置1min，1300rpm离心1min；弃去套管中的液体，向吸附柱中加入700μl L2 Buffer，室温下放置5min，13000rpm离心1min；弃去管中的液体，再以1300rpm离1min；将吸附柱放于1.5mlEppendorf管中，加入30μl去离子水(或TE溶液，10mmol/LTris-HCL，1mmol/L EDTA，ph8.0)，室温下放置1min，13000rpm离心2min，所得液体中即含有回收的DNA片段，置于-20℃保存。
9、连接反应体系的制备与转化
按下列体系进行连接反应：
5×T4DNA Ligase Buffer 2μl
PGEM-3ZF载体(50ng/μl) 1μl
PCR产物(经纯化) 2μl
T4DNA Ligase 0.5μl
去离子水 5μl
混合均匀后，于4℃连接过夜。取上述连接产物5μl，加入到100μl DH5a感受态细菌中，置冰浴上45min后，42℃热休克2min，再置于冰浴上2min，加入无抗生素的LB培养液400μl，37℃摇床振摇1h后，取100μl菌液，向其中加入40μl 120mg/ml 5’-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4μl 20mg/ml异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混匀后涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培养12-16h，挑取白色菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定。
10、提取质粒小量
取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm离心 1分钟，弃上清，沉淀悬浮于150μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA，PH8.0)，冰浴5分钟；加新鲜配制20μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，混匀，冰浴10分钟；加入150μl预冷的溶液III(3.0mol/L KCl，pH4.8)，混匀，冰浴10分钟.12000rpm5分钟，转移上清至新的离心管，加等体积酚/氯仿抽提；转移上层相至新的离心管，再用等体积氯仿抽提一次。取上清，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃沉淀30分钟，12000离心5分钟。70％乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50μl含RNA酶(20μl/ml)的TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，37℃水浴30分钟，-20℃保存备用。
11、将PCR扩增的片段以平端连接的方式克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer进行测序。为了保证病毒基因组中的点突变是高产毒株所特有的，而不是PCR过程中发生的变异，我们对每一个基因节段至少测定3个克隆，并且各克隆序列符合率≥99％，从而确定高产毒株的基因序列。
12、利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。
所测高产H2N2毒株细胞传代记录与图1大体一致。
实施例3
通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产H3N2毒株：
与实施例1的不同之处在于，在第一步骤中筛选50株原始毒株H3N2行10-4稀释，取1000μL稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中2个小时，等到病毒完全吸附后取出，在72小时之间加入浓度为4μg/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“卌”时，收获病毒；其它步骤相同。
所测高产H3N2毒株细胞传代记录与图1大体一致。
Claims (10)
1.一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：对流感病毒毒株进行筛选，选取5～50株原始毒株行10-3-10-4稀释，取200μL-1000μL稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中1～2个小时，等到病毒完全吸附后取出，在24～72小时之间加入浓度为1μg/ml-4μg/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“卌”时，收获病毒；
步骤二：用50％组织细胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落监测方法(PFU法)来检测和计算病毒株的毒力；
步骤三：提取流感病毒基因组RNA；
步骤四：RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；
步骤五：对PCR产物进行纯化；
步骤六：用氯化钙法制备感受态宿主菌；
步骤七：制备质粒DNA限制性内切酶体系，此体系包括：
10×限制性内切酶缓冲液 1μl-2μl
10×乙酰化BSA(1mg/ml) 1μl-2μl
质粒DNA 0.2μg-1.0μg
限制性内切酶 2U-4U
灭菌去离子水 10μl-20μl；
步骤八：DNA片段回收；
步骤九：制备以下体系进行连接反应，
5×T4DNA Ligase Buffer 2μl-4μl
PGEM-3ZF载体(50ng/μl) 1μl-2μl
PCR产物(经纯化) 2μl-5μl
T4DNA Ligase 0.5μl-1μl
去离子水 5μl-8μl
步骤十：提取质粒小量；
步骤十一：将PCR扩增的片段克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer进行测序，从而确定高产毒株的基因序列；
步骤十二：利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。
2.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤一中优选10株原始毒株行10-3-10-4稀释，取500μL稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中1个小时，等到病毒完全吸附后取出，在48小时之间加入浓度为2μg/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“卌”时，收获病毒。
3.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤二中优选用50％组织细胞感染量(TCID50)方法来检测和计算病毒株的毒力。
4.根据权利要求3所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述50％组织细胞感染量(TCID50)方法是将病毒株行倍比稀释，接种24孔板，每稀释度设置平行4个复孔，每孔加入200μL稀释液，35℃ CO2培养箱孵育1小时后用Hank’s液洗一遍，然后加入含终浓度2μg/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35℃ CO2培养箱培养，并于感染后24，48，72小时再分别加入终浓度2μg/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖，在感染后的72小时收获病毒。
5.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤三中提取流感病毒基因组RNA方法为：取100μL病毒液，加入1.5mLEppendorf管中，然后加入500μL Lysis Buffer RLT、β-巯基乙醇、600μL 70％乙醇，混匀，吸出600μL混合液进行离心，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。
6.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤四中RT-PCR扩增流感病毒各基因节段，选用病毒反转录试剂盒RT-PCR System对模板RNA进行反转录或Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增。
7.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤五中对PCR产物进行纯化的方法是通过PCR产物纯化试剂盒，把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer，进行离心收集，然后加40μL双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。
8.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤六中用氯化钙法制备感受态宿主菌的方法为：取DH5α单菌落，接种无抗菌素LB培养液，振摇培养，当至菌液0D600nm值为0.4-0.6时停止培养，于冰上预冷10分钟，离心后加入灭菌甘油，混匀，分装于Eppendorf管中，贮于低温冰箱中。
9.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤八中DNA片段回收的方法为采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收。
10.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于：所述步骤十中提取质粒小量的方法为：取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，离心后将沉淀悬浮于150μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，PH8.0)，冰浴5分钟；加新鲜配制20μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，混匀，冰浴10分钟；加入150μl预冷的溶液III(3.0mol/L KCl，pH4.8)，混匀，冰浴10分钟，再次离心，用70％乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50μl含RNA酶(20μl/ml)的TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，37℃水浴30分钟。
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