CN1644686A

CN1644686A - 流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其重组毒株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1644686A
Application number: CN 200310100029
Authority: CN
Inventors: 张智清; 董婕; 孙梅生; 徐红; 张立国; 吴昆昱; 齐立
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2023-10-08
Also published as: CN1644686B

Abstract

本发明公开了一种流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其基因重组毒株及其制备和应用，所述毒株包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8所示的核苷酸序列。通过筛选哺乳动物细胞高产的甲型流感病毒母株，获得其全部基因节段的扩增产物，然后克隆入真核细胞高效表达载体中，通过基因工程方法体外转染哺乳动物细胞，获得具有感染能力的病毒颗粒。并利用同样的方法将高产毒株内部基因与流行毒株的HA和NA节段进行重配制备疫苗株，制备出甲型流感疫苗。

Description

流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其重组毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其重组毒株及其制备方法和应用。

背景技术

流行性感冒(简称流感)，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，也是一种古老的和首先实行全球性监测的传染病。流感病毒分甲、乙、丙三型，其中甲型流感对人类威胁最大。由于流感病毒抗原结构不断发生变异，人群特异性免疫状况不稳定，当一个新亚型出现时，短时间内即可席卷全球。老年人及患有各种慢性病或体弱者容易出现严重并发症，病死率高。如1918年席卷全球的西班牙流感风暴，共造成2000万-4000万人死亡，超过第一次世界大战中死亡人数的总和。

流感的突出特征是：起病急、发病率高、并发症多、超额死亡高、传播极快、波及面广。流感易在局部地区或单位突然出现暴发或引起流行、甚至世界性大流行。当发生流感大流行时，可导致交通中断，甚至工厂停工、学校停课，严重影响社会稳定和群众正常生活秩序。此外，对畜禽业和国民经济往往也带来灾难性的损失。

至今，人类尚未掌握流感病毒的变异规律，临床治疗又缺乏特效药物。接种疫苗是预防流感流行，保护易感人群最行之有效的手段。WHO自1948年启动了全球流感监测网络后，每年都要汇总各国流感病毒毒株的流行情况，然后分析下一年可能流行的病毒类型，并提前6个月公布结论，各厂家则以此为依据生产疫苗。尽管许多人认为这个网络行之有效，但它目前的工作效率和研究水平并不能保证病毒致命变种一旦出现时做出准确而迅速的反应。甲型流感病毒由于抗原转换或抗原漂移常导致新的变异抗原的出现，因此疫苗株需要经常被更换(Hoffmann E，Mahmood K，Yang CF，Webster RG，Greenberg HB，Kemble G.Rescue of influenza B virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci U S A.2002Aug 20；99(17)：11411-6)。

传统的流感病毒疫苗生产是用鸡胚大量繁殖病毒。尽管能采取有效的病毒纯化工艺，但是仍然存在着许多不足，如过敏反应。并且鸡胚来源的疫苗有成本高，生产周期长，而且病毒的抗原性易发生改变等缺点。与之相区别的细胞疫苗具有操作简单，成本低，病毒抗原性与野毒相近的优点。有报道组织细胞培养产生的疫苗在动物模型中取得了比较好的保护性(Govorkova EA，MurtiG，Meignier B，de Taisne C，Webster RG.African green monkey kidney(Vero)cellsprovide an alternative host cell system for influenza A and B viruses.J Virol.1996Aug；70(8)：5519-24)。于是WHO号召全球范围寻找适合流感病毒生长的哺乳动物细胞。目前，哺乳动物细胞MDCK细胞被认为是培养甲型和乙型流感病毒最合适的细胞系(Robertson JS.Related Articles，Links An overview of host cellselection.Dev Biol Stand.1999；98：7-11；discussion 73-4)，此细胞系具有感染后迅速产生流感病毒，在短时间内取得高滴度的特点。另外MDCK来源的病毒经过连续传代后，保持了抗原的稳定性(Govorkova EA，Kodihalli S，Alymova IV，Fanget B，Webster RG.Related Articles，Links Growth and immunogenicity ofinfluenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chickeneggs.Dev Biol Stand.1999；98：39-51；discussion 73-4)。

在流感病毒疫苗的生产过程中为解决成本高的问题，常采用的方法是将实验室的已经得到的高产毒株与流行毒株的HA和NA片段进行重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点(Hoffmann E，Mahmood K，Yang CF，Webster RG，Greenberg HB，Kemble G.Rescue of influenza B virus fromeight plasmids.Proc Natl Acad Sci USA.2002 Aug 20；99(17)：11411-6)。但传统意义上的实验室重配产生疫苗株耗时较长，通常需要2-3个月。随着反向遗传技术在流感病毒上的应用使这一周期缩短为2-3周。

Neuman(Gabriele Neumann and Yoshihiro Kawaoka，1 Virology 287，243±250(2001))将反义遗传技术定义为由cDNA产生负链RNA的过程，要由RNP复合物参与。这种技术的发展经历了多个阶段。1989年，辅助病毒系统产生了。Palse研究小组建立了第一个研究负链RNA病毒的系统，开创了从克隆cDNA产生重组_vRNA的新纪元，创造了RNP转染方法。Hobom和Colleagues(Neumann，G.，Zobel，A.，and Hobom，G.(1994).RNA polymerase I-mediatedexpression of influenza viral RNA molecules.Virology 202，477±479.)推进了一步，首次应用了RNAPolymerse1和Helper virus系统。

Polymerse1的特点表现为：

1，Polymerse1转录的特点是定点起始，定点结束无转录后加工过程，不包含5’帽子和3’尾结构，利用这一点可以转录出病毒基因组。

2，用特定长度的启动子和终止子不会延长转录区，保证病毒基因组的完整性Polymerse1系统的优点是比RNP转染方法更便利，不需要体外转录，蛋白纯化，和RNP的装配。

但是值得注意的是以上两个系统都存在着缺点：即产量低，产生的大多是缺陷病毒。辅助病毒背景高，需要大量筛选工作。使得这种技术的实用性显得不足。于是在1994年，Conzelmann等人(Schnell，M.J.，Mebatsion，T.，andConzelmann，K.K.(1994).Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J.13，4195±4203.)用T7RNA聚合酶系统制备了狂犬病毒。1999年Neuman(Neumann，G.，Watanabe，T.，Ito，H.，Watanabe，S.，Goto，H.，Gao，P.，Hughes，M.，Perez，D.，Donis，R.，Hoffmann，E.，Hobom，G.，and Kawaoka，Y.(1999).Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.96，9345±9350.)等人成功克隆了流感病毒，他们采用了12个质粒共转染的方法，其中8个质粒分别转录出病毒的基因组节段，4个质粒表达与病毒复制相关的蛋白这是保证流感复制的最小单位。用这12个质粒共转染哺乳动物细胞，获得了重组病毒颗粒。该系统的缺点是，12个质粒共转染增加了转染的难度，限制了细胞系的使用。此后Hoffmann(Hoffmann E，Stech J，Guan Y.Webster RG，Perez DR.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza.Aviruses.Arch Virol 2001；146：2275-89.)在此基础上发明了8个质粒系统，不仅能转录出病毒的全部基因组，还能表达出所有的病毒蛋白，利用此系统，成功地包装出了流感病毒。

由此可见，寻找一高产的甲型流感病毒母株，获得其全部8个基因片段的克隆，然后将高产毒株基因与流行毒株的HA和NA片段进行重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点，这样来制备甲型流感疫苗，将是流感疫苗生产的重大变革。

发明内容

本发明的目的是提供甲型流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其重组毒株及其制备方法和应用，克服了目前流感病毒鸡胚疫苗的缺点，既保持细胞疫苗抗原性稳定的特性又具有高产的特征。

本发明的目的是提供以下技术方案来实现的：

一株新的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒，其保藏号为CGMCC No.1014。

一种新的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒全基因序列，其包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8所示的核苷酸序列。

一种质粒，所述的质粒包括PCDNA3.1-APB2，PCDNA3.1-APB1，PCDNA3.1-APA，PCDNA3.1-AHA，PCDNA3.1-ANP，PCDNA3.1-ANA，PCDNA3.1-AM，PCDNA-3.1-ANS，PHH21-APB2，PHH21-APB1，PHH21-APA，PHH21-AHA，PHH21-ANP，PHH21-ANA，PHH21-AM，PHH21-ANS，PIVVII-ANS，PIIV II-AM，PIVV II-ANA，PIVV II-ANP，PIVV II-AHA，PIVV II-APA，PIVV II-APB1，PIVV II-APB2，它们是由前述的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒全基因分别克隆到所述载体PCDNA-3.1、PHH21、PIVV II中得到的系列质粒。

一种灭活的重组甲型流感病毒毒株，其包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8所示的核苷酸序列的毒株，经灭活制得。

一种含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的基因重组病毒毒株，该毒株含有SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8内部基因的核苷酸序列；

所述的含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的重配病毒毒株，该毒株适合在哺乳动物细胞和鸡胚上高产；

所述的含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的重配甲型流感病毒毒株，所述的哺乳动物细胞是包括MDCK细胞(狗肾传代细胞)、人胚肾上皮细胞293T细胞和VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)。

一种甲型流感病毒疫苗，包括保藏号为CGMCC No.1014所述的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒为母株、和具有流行株抗原特征的灭活和/或减毒重配病毒。

一种制备新的甲型流感病毒疫苗株的方法，该方法包括以下步骤：

用引物扩增出甲型流感病毒SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8内部基因节段，所述引物1序列为5’-atc gtc tca ggg agcgaa agc agg-3’，引物2序列为5’-gcc gtc tcc tat tag tag aaa caa gg-3’；

将上述基因组节段分别克隆入载体PCDNA-3.1、PHH21或PIVV II中；所述载体优选为PIVV II，将SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8基因组节段分别克隆入载体PIVV II从而获得6个质粒，分别为PIVV II-ANS，PIIV II-AM，PIVV II-ANP，PIVV II-APA，PIVV II-APB1，PIVV II-APB2；

另，分别克隆目前已知流行病毒株的外部HA及NA基因连入所述载体PCDNA-3.1、PHH21或PIVV II中；优选载体PIVV II，将外部HA及NA基因连入载体PIVV II，从而得到2个质粒分别为PIVV II-eHA和PIVV II-eNA，；

将6个质粒和2个质粒，混合转染共转染哺乳动物细胞，即得甲型流感病毒疫苗株。

一种重组流感病毒的基因工程制备方法，包括以下步骤：

用引物扩增出甲型流感病毒SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8基因节段，所述引物1序列为5’-atc gtc tca ggg agc gaa agc agg-3’，引物2序列为5’-gcc gtc tcc tat tag tag aaacaa gg-3’；

将所述基因组节段分别克隆入前述的系列载体；所述系列载体优选为PIVV II，获得8个质粒PIVV II-ANS，PIIV II-AM，PIVV II-ANA，PIVV II-ANP，PIVV II-AHA，PIVV II-APA，PIVV II-APB 1，PIVV II-APB2；

按常规方法将上述获得的8个质粒混合转染哺乳动物细胞，即得重组的流感病毒；

所述方法具体包括将含有细胞高产株名称为A/CNIC/246/00，保藏号为CGMCC.No.1014的SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8六个内部基因片段的质粒与甲1亚型已知流行代表株A/沪防/7/99的两个表面HA，NA基因片段的质粒分别用BsmBI酶切，回收相应片段与酶切处理过的PIVV II载体体外连接，转化大肠杆菌挑选阳性克隆，得到的6种质粒+2种质粒系统，转染MDCK和/或293T共培养细胞获重配病毒：收获病毒液滴定病毒滴度；

所述方法还包括重组/重配毒株的获得及鉴定：

重组/重配毒株经MDCK细胞传代后，采用交叉血抑试验对其进行型别鉴定；连接传代后的病毒滴度稳定在1∶640-1∶1280。

一组构建真核细胞高效表达载体PIVV II的引物，包括

P1：5’-GTG AAG CCT CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCG AAG-3’和P2：5’-ATC CCT AGG GGC GGC CGG GAG GGC GT-3’

所述载体PIVV II的构建方法，包括以下步骤：

以质粒PHH21为模板用pfu DNA polymerase，扩增出一段全长275bpDNA产物；该序列含有225bp人源RNA polymerase I启动子和33bp鼠源RNApolymeraseI终止子。PCR产物两端引入Avr II和HindIII酶切位点；将上述PCR产物用Avr II和HindIII双酶切，质粒载体pcDNA3.1(+)用Xba I和HindIII双酶切，纯化回收相应片段；体外连接质粒载体与目的基因，转化大肠杆菌。挑选阳性克隆，酶切鉴定正确后送测序；测序结果与目的基因相符，命名载体为PIVV II；

本发明提供了一种流感病毒哺乳动物细胞高产株的筛选方法，包括以下步骤：

从临床流感样本获得系列原始毒株，包括序号为A/CNIC/200/00-A/CNIC/300/00的100株原始毒株，分别接种MDCK细胞培养瓶；

置CO₂培养箱，吸附病毒2小时，弃感染液；

每瓶细胞加入TPCK胰酶的细胞维持液后置CO₂培养箱细胞感染后，观察细胞病变(CPE)。当细胞病变呈卌，即病变细胞占总细胞数的75-100％时，收获病毒；

进行病毒滴度测定；取病毒滴度≥1∶160毒株连续传代；每代依上述方法接种，收获，计算病毒滴度；分别于第5、10、15代测定病毒组织培养半数感染量(TCID50)；经筛选获得一株哺乳动物细胞稳定高产的流感病毒，名称为A/CNIC/246/00(H1N1)。

本发明提供了一种流感病毒哺乳动物细胞高产株全基因组克隆的方法，包括以下步骤：

将流感病毒液用Rneasy Mini Kit提取核酸；

采用THERMOSCRIPT^TM RT-PCR System反转录出病毒的cDNA，引物为通用引物，反转录引物序列为5’-atc gtc tca ggg agc gaa agc agg-3’；还有一条引物序列为5‘-gcc gtc tcc tat tag tag aaa caa gg-3’；

采用Pfu DNA Polymerase酶扩增双链的DNA片段；

扩增产物琼脂糖电泳，将各片段的相应条带切胶回收；

将各片段克隆到pGEM-3zf载体，载体经sma I酶切，片段平端连入，挑选阳性克隆酶切正确后送测序。

本发明还提供了一种重配流感病毒的纯化灭活方法，包括以下步骤：

2×10⁸cell/ml MDCK用RIPA缓冲液裂解(缓冲液包括0.01MPH7.2磷酸盐缓冲液、40Mm钠、0.1％SDS、1％TritonX100、Mmedta)；取2×10⁷cell、等量福氏完全佐剂，混合免疫昆明鼠，四周后加强免疫，再过两周放血。Westernblot检测抗体水平。

实际上，根据本发明，发明人得到的甲型流感毒株在哺乳动物细胞上具有高产的特性，它可以克服用鸡胚生产疫苗的不足。这种哺乳动物细胞，特别是MDCK细胞株可以用作为疫苗生产的细胞系，因此本发明的病毒株具有极高的应用价值。

另外，重组毒株外部HA和NA片段外的六个内部基因片段的序列起到了决定高产特性的关键作用，本发明人包装出的毒株的优势在于，转染后产生病毒的时间快，仅在30小时就能产生大量(8×10⁴PFU/ML)的病毒。

应当说明的是，本发明的重组甲型流感病毒毒株在鸡胚和哺乳动物细胞上均高产，特别适于成为疫苗生产的母株。

附图说明

经过本发明方法得到的甲型流感病毒毒株已经于2003年9月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCNO.1014。

图1为SEQ.No.1：A/CNIC/246/2000(H1N1)PB2节段全长2341bp，其阅读框架为2280bp，编码760个氨基酸。

图2为SEQ.No.2：A/CNIC/246/2000(H1N1)PB1节段全长2341bp，其阅读框架为2277bp，编码759个氨基酸。

图3为SEQ.No.3：A/CNIC/246/2000(H1N1)PA节段全长2233bp，其阅读框架为2151bp，编码717个氨基酸。

图4为SEQ.No.4：A/CNIC/246/2000(H1N1)HA节段全长1776bp，其阅读框架为1698bp，编码566个氨基酸。

图5为SEQ.No.5：A/CNIC/246/2000(H1N1)NP节段全长1565bp，其阅读框架为1497bp，编码499个氨基酸。

图6为SEQ.No.6：A/CNIC/246/2000(H1N1)NA节段全长1462p，其阅读框架为1362bp，编码454个氨基酸。

图7为SEQ.No.7：A/CNIC/246/2000(H1N1)M节段全长1027bp。共有两个开放读码框架，其中M1蛋白长253个氨基酸，M2蛋白长97个氨基酸。

图8为SEQ.No.8：A/CNIC/246/2000(H1N1)NS节段全长890bp。共有两个开放读码框架，其中NS1蛋白长231个氨基酸，NS2蛋白长121个氨基酸。

图9为用引物扩增A/CNIC/246/2000(H1N1)全基因组各节段的电泳图谱

M：DL15000，1：PB2(2341bp)，2：PB1(2341bp)，3：PA(2233bp)，

4：HA(1776bp)，5：NP(1565bp)，6：NA(1462bp)，7：M(1027bp)，

8：NS(890bp)。

图10为质粒载体构建图。

图11为质粒载体鉴定的酶切鉴定图谱。

M：DL15000 1：HindIII+Pst1双切(pcDNA3.1(+))

2：HindIII+Pst1双切(PIVVII)。

图12为流行毒株和高产毒株重配原理图。

具体实施方式

实施例1

本发明甲型流感病毒哺乳动物细胞高产毒株A/CNIC/246/2000(H1N1)的获得；

材料

1、病毒株：由国家流感中心提供；

2、MDCK细胞：购自美国ATCC；

3、细胞培养液：DMEM液，加入100U/ml青链霉素，10-15mmol/L Hepes；

4、病毒所配制室配制的Hank’s液。

具体步骤：

将经MDCK细胞分离，病毒滴度≥1∶160的原始毒株进行10^-3，10^-4稀释，取500ul病毒稀释液接种成片生长的MDCK细胞，接种前细胞用Hank’s液洗两遍；置37℃ CO₂培养箱1小时，待病毒完全吸附后，弃感染液，用Hank’s液洗一遍。每瓶细胞加入含终浓度1ug/mlTPCK胰酶的细胞维持液3ml后置37℃ CO₂培养箱，细胞感染后48小时，镜下观察细胞病变。当细胞病变CPE呈卌时，收获病毒。

进行病毒滴度测定，采用红细胞凝集实验，取病毒滴度≥1∶160毒株连续传代，每代依上述方法接种，收获，计算病毒滴度，分别于第5、10、15代测定病毒组织培养半数感染量(TCID50)。具体方法见《流行性感冒病毒及其实验技术》一书，作者：郭元吉，中国三峡出版社。

结果：

经大量筛选获得一株哺乳动物细胞稳定高产的流感病毒，名称为A/CNIC/246/00(H₁N₁)，保藏号为CGMCC.NO1014，连续传代15代，每代病毒滴度平均约为1∶640——1∶1280，Log₁₀TCID50约8.5——9.0。

实施例2

本发明流感病毒哺乳动物细胞高产毒株全基因组的克隆

材料：

1、取实施例1得到的病毒株A/CNIC/246/2000(H1N1)；

2、核酸提取试剂盒Rneasy Mini Kit购自QIAGEN公司；

3、病毒反转录试剂盒THERMOSCRIPT^TM RT-PCR System购自GIBCOBRL公司；

4、Pfu DNA Polymerase购自STRATAGENE公司；

5、PCR产物回收试剂盒QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司；

6、克隆载体pGEM-3zf购自Promega公司。

具体包括以下步骤：

将100ul滴度为1∶640的流感病毒液用QIAGEN公司Rneasy Mini Kit提取核酸；采用GIBCO BRL出品的THERMOSCRIPT^TM RT-PCR System反转录出病毒的cDNA，反转录引物序列为5’-atc gtc tca ggg agc gaa agc agg-3’，另一条引物序列为5‘-gcc gtc tcc tat tag tag aaa caa gg-3’。采用STRATAGENE公司出品的Pfu DNA Polymerase酶扩增双链DNA片段，扩增条件为94℃变性3分钟，94℃ 30秒55℃30秒72℃260秒，共30个循环，72℃延伸5分钟。

扩增产物用0.8％琼脂糖电泳，将各片段的相应条带切胶，采用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收，将各片段克隆到pGEM-3zf载体，载体经sma I酶切，片段平端连入。挑选阳性克隆酶切正确后测序，PCR产物的电泳图谱见图9。

结果：

得到如图1-图8所示的A/CNIC/246/2000(H1N1)全基因组序列：

SEQ.No.1，A/CNIC/246/2000(H1N1)PB2节段全长2341bp，其阅读框架为2280bp，编码760个氨基酸。

SEQ.No.2，A/CNIC/246/2000(H1N1)PB1节段全长2341bp，其阅读框架为2277bp，编码759个氨基酸。

SEQ.No.3，A/CNIC/246/2000(H1N1)PA节段全长2233bp，其阅读框架为2151bp，编码717个氨基酸。

SEQ.No.4，A/CNIC/246/2000(H1N1)HA节段全长1776bp，其阅读框架为1698bp，编码566个氨基酸。

SEQ.No.5，A/CNIC/246/2000(H1N1)NP节段全长1565bp，其阅读框架为1497bp，编码499个氨基酸。

SEQ.No.6，A/CNIC/246/2000(H1N1)NA节段全长1462bp，其阅读框架为1362bp，编码454个氨基酸。

SEQ.No.7，A/CNIC/246/2000(H1N1)M节段全长1027bp。共有两个开放读码框架，其中M1蛋白长253个氨基酸，M2蛋白长97个氨基酸。

SEQ.No.8，A/CNIC/246/2000(H1N1)NS节段全长890bp。共有两个开放读码框架，其中NS1蛋白长231个氨基酸，NS2蛋白长121个氨基酸。

实施例3

本发明甲型流感病毒的真核细胞高效表达载体的构建

材料

质粒：PHH21，根据Neumann，G.，Zobel，A.，和Hobom，G.(1994).RNA的文章“聚合酶I介导的流感病毒RNA分子的表达”(polymerase I-mediatedexpression of influenza viral RNA molecules.Virology 202，477-479)制得；

pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen公司；

限制性内切酶：HindIII，AvrII，Xba I购自Biolabs公司；

pfu DNA polymerase购自Gibco-BRL公司。

具体步骤如下：

以质粒PHH21为模板，扩增出一段全长275bpDNA产物。该序列含有225bp人源RNA polymerase I启动子和33bp鼠源RNA polymerase I终止子。PCR产物两端引入Avr II和HindIII酶切位点。

引物设计如下：

P1：5’-GTG AAG CCT CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCGAAG-3’

P2：5’-ATC CCT AGG GGC GGC CGG GAG GGC GT-3’

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃200秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。PCR产物1％琼脂糖电泳检测，与目的片段大小相符，纯化PCR产物备用。将上述PCR产物用Avr II和HindIII双酶切，质粒载体pcDNA3.1(+)用Xba I和HindIII双酶切，纯化回收相应片段；体外连接质粒载体与目的基因，转化大肠杆菌。挑选阳性克隆，酶切鉴定正确后送测序，质粒构建图见图10，酶切图谱见图11。测序结果与目的基因相符，载体命名为PIVV II。

结果：

该重组质粒特点是在CMV启动子和BHA polyA终止序列之间嵌合了RNA polymerase I启动子和终止子元件，可以使插入其间流感病毒cDNA分子在转录出vRNA同时表达出病毒蛋白质。

实施例4

本发明的获得基因重组流感病毒的方法

材料：

质粒载体：实施例3获得的PIVVII；

克隆质粒：含晡乳动物细胞高产株全部基因片段克隆质粒(见前述)含流行性毒株A/沪防/7/99(H₁N₁)HA，NA基因节段的克隆质粒亦按前述方法获得；

限制性核酸内切酶：BsmBI购自Biolab公司；

293T细胞：由美国疾病控制中心(CDC)提供；

MDCK细胞：由美国疾病控制中心(CDC)提供；

转染试剂Lipofctamine2000(LF2000)购自GIBCO BRL公司；

无血清培养基：Opti-MEMI购自GIBCO BRL公司；

胎牛血清：FBS购自Hyclone公司。

具体步骤如下：

质粒DNA分子的大量制备：将PIVVII质粒载体及克隆了流感病毒基因的质粒分别用BsmBI 55℃酶切作用2小时，回收相应片段。体外连接转化大肠杆菌DH52，挑选阳性克隆。小量制备，酶切鉴定正确后按常规方法大量制备，最后得到8个质粒系统，再转染MDCK和/或293T共培养细胞获重组病毒，即将细胞高产株A/CNIC/246/00的全部8个基因节段的质粒(PIVV II-ANS，PIIV II-AM，PIVV II-ANA，PIVV II-ANP，PIVV II-AHA，PIVV II-APA，PIVV II-APB1，PIVV II-APB2；)混合。

将含有实施例1所述的细胞高产株A/CNIC/246/00六个内部基因片段SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8的质粒(PIVV II-ANS，PIIV II-AM，PIVV II-ANP，PIVV II-APA，PIVV II-APB1，PIVV II-APB2；)与甲1亚型流行代表株A/沪防/7/99的外部片断HA，NA基因片段的质粒(PIVV II-eHA和PIVV II-eNA，)混合，得到6+2质粒系统，各质粒含量为终浓度1μg/μl；将上述混合物按1μg/基因加入2μl LF2000与转染试剂体外混合室温静置45分钟；取293T和MDCK共培养的细胞(细胞浓度约1×10⁶)用opti-MEM液洗2遍，加入上述混合物，转染6小时后，加入opti-MEMI维持液3ml/瓶37℃继续孵育。在转染后30小时加入终浓度为1μg/mlTPCK-TRYPSIN。每日观察细胞病变，待病变为++++(即病变细胞占总细胞数的75-100％)时收获转染液；48-72小时后收获病毒液滴定病毒滴度，得到重组病毒株。

重组病毒株的获得及鉴定：重组毒株经MDCK细胞传代后，血凝滴度达1∶640，采用交叉血抑试验对其进行型别鉴定。重组毒株在MDCK细胞上连接传代，病毒滴度稳定在1∶640-1∶1280，方法可见实施例1所述《流行性感冒病毒及其实验技术》

结果：

1、利用基因工程的方法，在体外实现了完全依靠质粒并无辅助病毒的情况下装配出具有感染活性的流感病毒。

2、该重组病毒生长特性稳定，具有细胞高产特征(病毒滴度在1∶640-1∶1280)而且具有流行毒株的抗原性。

3、该重配病毒经交叉血抑实验证实是甲1重配株，其表面抗原来源于A/沪防/7/99(H₁N₁)

4、该重组病毒与A/CNIC/246/00野毒在抗原性及生长特性上完全一致。

血清病毒	抗A/沪防/7/99(H₁N₁)小鼠抗血清	抗A/CNIC/246/00(H₁N₁)小鼠抗血清
血清病毒	抗A/沪防/7/99(H₁N₁)小鼠抗血清	抗A/CNIC/246/00(H₁N₁)小鼠抗血清	A/沪防/7/99野毒	1∶1280	1∶320
A/CNIC/246/00野毒	1∶320	1∶1280	A/沪防/7/99野毒	1∶1280	1∶320
A/CNIC/246/00野毒	1∶320	1∶1280	A/997-246重配	1∶1280	1∶320
A/CNIC/246/00重组	1∶320	1∶1280	A/997-246重配	1∶1280	1∶320

实施例5

重组流感病毒的纯化灭活：

1、将重组/重配株在MDCK细胞上放大培养。按0.01TCID50/cell接种，方法同实施例4。

2、收获病毒培养上清夜，冻融一次，低速离心3000转/分，10分钟弃残渣。

3、加终浓度为0.025％(w/v)福尔马林32℃24小时灭活。

4、超滤浓缩病毒，滤膜截流分子量10万道尔顿，收集病毒液。

5、采用20％-60％连续蔗糖梯度超速离心的方法纯化病毒。

6、SRD法测病毒HA含量用PBS定量为15μg/ml。

7、Westernblot分析纯化病毒中MDCK细胞蛋白的残留情况。

结果：

1、重组/重配株经超滤浓缩后，病毒蛋白含量浓缩了10倍以上。

2、重组/重配株经超离浓缩后，不含MDCK细胞蛋白。

3、纯化的重组/重配株经SRD法测蛋白含量，最后定量为15μg/ml。

实施例6

本发明流感病毒基因工程灭活疫苗免疫原性的评价

材料：

1、经SRD法HA抗原含量测定为15ug/ml的流感病毒基因工程重配株A/沪防/7/99-A/CNIC/246/00.R。

2、经SRD法HA抗原含量测定为15ug/ml的流感病毒流行代表株A/沪防/7/99。

3、BAb/C小鼠购自协和基础所动物饲养中心。

具体步骤：

将HA抗原含量测定为15ug/ml的上述两种病毒用PBS按1∶4开始行倍比稀释。每稀释度含HA抗原终浓度为15ug/ml，3.75ug/ml(1∶4)，0.938ug/ml(1∶16)，0.234ug/ml(1∶64)，和0.059ug/ml(1∶256)。将上述各稀释度的病毒藕联终浓度为0.2％的AI(OH)₃佐剂免疫动物。

取6-9周大小的BAb/C小鼠，每组10只，每只皮下免疫1ml经稀释的病毒，设立阴性对照组用PBS加终浓度为0.2％AI(OH)₃。免疫四周后用同样剂量的抗原加强免疫一次，加强免疫后两周取血。

每个个体的血清一部分直接经ELASA测定抗体水平。另一部分用RDE(受体破坏酶)处理，1∶5稀释37℃过夜第二日56℃灭活半小时，用A/沪防/7199野毒株作抗原行HI试验测定抗体水平。

统计学分析有效剂量以诱导50％小鼠血清转化为标。ELASA和HI测定的抗体结果分别经过Logit分析确定。

结果见下表：

类型	抗原	来源	ED50(ng)ELASA	ED50(ng)HI
类型	抗原	来源	ED50(ng)ELASA	ED50(ng)HI	A/H1N1	重配毒株	狗肾传代细胞	200	980
	流行代表株	鸡胚	204	1020	A/H1N1	重配毒株	狗肾传代细胞	200	980

基因工程重配株与流行毒株之间统计学分析P＜0.05，两者间无明显差异。证明重配株与流行毒株有着相同的免疫原性。

Claims

1、一株新的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒，其为保藏号为CGMCC No.1014的病毒。

2、一种新的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒全基因序列，其包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8所示的核苷酸序列。

3、一种质粒，所述的质粒包括PCDNA3.1-APB2，PCDNA3.1-APB1，PCDNA3.1-APA，PCDNA3.1-AHA，PCDNA3.1-ANP，PCDNA3.1-ANA，PCDNA3.1-AM，PCDNA-3.1-ANS，PHH21-APB2，PHH21-APB1，PHH21-APA，PHH21-AHA，PHH21-ANP，PHH21-ANA，PHH21-AM，PHH21-ANS，PIVVII-ANS，PIIVII-AM，PIVVII-ANA，PIVVII-ANP，PIVVII-AHA，PIVVII-APA，PIVVII-APB1，PIVVII-APB2。

4、一种灭活的重组甲型流感病毒毒株，其包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8所示的核苷酸序列。

5、一种含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的基因重组病毒毒株，该毒株含有SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.5、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8内部基因的核苷酸序列。

6、根据权利要求5所述的含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的重配病毒毒株，该毒株适合在哺乳动物细胞和鸡胚上高产。

7、根据权利要求6所述的含有甲型流感病毒流行毒株抗原特征的重配甲型流感病毒毒株，所述的哺乳动物细胞是包括狗肾传代细胞、人胚肾上皮细胞293T细胞和非洲绿猴肾细胞。

8、一种甲型流感病毒疫苗，包括以权利要求1所述的具有哺乳动物细胞高产特征的甲型流感病毒为母株、和具有流行株抗原特征的灭活和/或减毒重配病毒。

9、一种制备新的甲型流感病毒疫苗株的方法，该方法包括以下步骤：

将所述基因组节段分别克隆入载体PCDNA3.1，PHH21或PIVVII；

分别克隆目前已知甲型流行株的外部HA及NA基因，连入所述载体PCDNA3.1，PHH21或PIVVII，得到系列质粒；

将上述系列质粒混合转染，即得。

10、一种重组和/或重配流感病毒的基因工程制备方法，包括以下步骤：

用引物扩增出甲型流感病毒SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6、SEQ.NO.7、SEQ.NO.8内部基因节段，所述引物1序列为5’-atc gtc tca ggg agc gaa agc agg-3’，引物2序列为5’-gcc gtc tcc tat tag tagaaa caa gg-3’；

将所述基因组节段分别克隆入权利要求3所述的载体PCDNA3.1，PHH21或PIVVII；

分别克隆目前已知流行株的外部HA及NA基因，连入所述载体PCDNA3.1，PHH21或PIVVII，得到系列质粒；

将上述系列质粒混合转染哺乳动物细胞，即得。