CN1065912C - 用遗传工程方法生产减毒病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用遗传工程方法通过改变病毒基因的非编码区或编码序列，加工减毒病毒。描述了的调节转录和/或复制的非编码区的改变。通过在复制期间生产缺陷型颗粒，或减少病毒复制期间生产的子代病毒粒子数，这些改变会导致病毒基因的下降调节及病毒减毒。也描述了病毒编码序列和改变，这种改变将产生重组体或嵌合病毒病毒。

Description

用遗传工程方法生产减毒病毒

本发明涉及通过改变病毒基因的非编码区或编码序列，用遗传工程方法生产减毒病毒。描述了调节转录和／或复制的非编码区的改变。这些改变会导致对病毒基因的下降调节并通过在复制期间生产缺陷型病毒颗粒，或减少病毒复制期间生产的子代病毒粒子数导致病毒的减毒。还描述了可产生重组体或嵌合减毒病毒的病毒编码序列的改变。

通过“杀死”病毒病原体，如经加热或福尔马林处理以便使其不能复制，从而制备失活的病毒疫苗。由于失活疫苗不能提供持久的免疫性，因而只能提供有限的预防作用，从而，它们只有有限的实用性。另一种生产病毒疫苗的方法涉及使用减毒的活病毒疫苗。减毒病毒能复制，但不致病，因此可提供较长的持久免疫性并提供更有效的预防作用。然而生产减毒病毒的传统方法涉及偶然分离的宿主范围突变体，其中许多是温度敏感型的，如经非天然宿主将病毒传代，选择致免疫的但不致病的子代病毒。

由于可谨慎地将特定的突变加工到病毒基因组中，因此，理论上，重组DNA技术和遗传工程技术可提供较好的生产减毒病毒的方法。然而病毒减毒所需的遗传改变是未知的或不可预料的。通常，主要目标是试图用重组DNA技术加工病毒疫苗，生产仅含参与免疫应答的病原体蛋白质亚基的亚单位疫苗。并且是在重组病毒载体如牛痘病毒或杆状病毒中的表达。最近，已经用重组DNA技术着手生产疱疹病毒缺失突变体或模仿自然界中发现或已知宿主范围突变体的减毒病毒的脊髓灰质炎病毒。直到前不久，负链RNA病毒还一点也不适于进行位点特异性操作，因此，也就不能用遗传工程方法加工。

本发明涉及用重组DNA技术生产减毒病毒。描述了至少两种加工减毒病毒的方法。一种方法涉及加工改变调节病毒基因转录和／或复制的病毒的非编码区，以便下降调节至少一个病毒基因。该方法可用于各种不同的病毒，并且有助于将其用于遗传工程加工经切割的病毒，在所述病毒中，对一个病毒片段合成的下降调节导致每次病毒复制一轮，产生缺陷型颗粒以便子代病毒表现减毒的特征。在未切割的病毒中，病毒基因的下降调节可引起减少复制期间生产的感染性病毒粒子数量从而该病毒表现出减毒的特征。

第二种方法涉及加工改变病毒的编码区，以便通过氨基酸残基或抗原决定簇的插入，缺失或取代而改变所表达的病毒蛋白质，并生产减毒的嵌合病毒。

本发明的减毒病毒有利于安全地用于配制活病毒疫苗。按本文所用的，术语“减毒”病毒指有感染性的但不致病的病毒；或者是或不是致病的感染性病毒，但其在每轮复制中要以生产缺陷型颗粒，要么生产出少于相应的野生型病毒在复制期间生产的子代病毒粒子。用遗传工程方法加工以生产缺陷型颗粒或数量减少的子代病毒粒子的致病病毒是“减毒”，因为既使这种病毒能致病，但在按种个体中得到的病毒滴定度仅提供无症状水平的感染。

图1．流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒NA片段的非编码序列。将5′-和3′-末端序列绘制成柄状狭长结构，由两个碱基对的基和一个在中间的错配的内环组成。从流感B／Lee病毒的NS基因得到NA／E-NS病毒的嵌合NA基因的非编码核苷酸。大写字母表示两个NA基因的不同的5′和3′末端区域(分别含13和12个核苷酸)的核苷酸。将野生型病毒NA基因的柄状狭长结构分成区域A／D，B／E，和C／F，并将减毒基因的相应结构分成a／d，b／e，和c／f。B／E和b／e区分别含NA和NA／B-NS基因的第二个基区域。空三角表示NA／B-NS病毒的NA基因中发生变化的Kozak序列。

图2．NA／B-NS病毒RNA的特征。A．RNA电泳。在含7．7M脲的3％聚丙烯酰胺凝胶上分析从纯化病毒中提取的RNA并经银染色观察。泳道1，流感AWSN／33病毒的RNA；泳道2，NA／B-NS转染子病毒的RNA；泳道3，从生产嵌合NARNA的质粒Pt₇NA／B-NS报废转录得到的RNA。B．用核糖核酸酶保护检测(RPA)分析N病毒粒子中的NA RNA。按Materialsand Methods中的描述，在与正意义的NS和NA特异性核糖探针的杂交反应中使用50ng从纯化病毒中提取的RNA。在含7M脲的6％丙烯酰胺凝胶上电泳保护的探针。泳道1：未用RNaseA／T₁消化的核糖探针，泳道2：在RNase A／T₁消化后的核糖探针；泳道3：由流感A／WSN／33病毒的RNA保护的核糖探针；和泳道4：由NA／B-NS转染与病毒RNA保护的核糖探针。C．通过引物延伸定量病毒中NA特异的RNA。按Materials and Methods所述用NS和NA片段特异性引物，经Rnase H负型反转录酶反转录从WSN／33病毒(泳道2)或NA／B-NS转染子病毒(泳道3)提取的vRNA。NS RNAs的产物是195nt长，NA RNAs的产物约260nt长。在含7M脲的6％聚丙烯酰胺凝胶上分析上述产物。在左边列出了大小标记物。

图3．在MDBK细胞中mRNA合成的时间过程。A．在核糖核酸酶保护检测分析中(RPA)在不同时间p．i．定量测定NA-和NS-特异性的mRNAs。上面的图示意说明该方法。NS和NA探针是负意义链，并含相当于cRNA3′末端侧的序列，用空白长方形说明在3′末端，该序列侧面的载体序列。在上方表示出了探针的大小，在图下部说明了所得产物的大小。在顶部说明了时间点(hrs)。分别用向左和向右的箭头说明凝胶上探针和产物的位置。B．NS特异性MRNA合成的时间过程。通过直接计算从组A所示凝胶中切出的相应带中的放射活性(每分钟计数)：测量NS MRNA的量。C．在感染细胞中比较转染子病毒和A／WSN／33病毒的NA特异性MRNA合成。按组B中所述，确定每个时间点上mRNA的量。

图4．利用引物延伸方法在感染细胞中分析NA特异性vRNA合成。按Materials and Methods中所述，用反转录酶和NA及NSvRNA特异性引物反转录从感染细胞中分离的RNA。将从纯化病毒中提取的vRNA作为对照(右)。在6％丙烯酰胺变性凝胶上展示所得的产物。NS RNAs的反转录产物是195nt长，而NA特异性片段的产物是约260nt长．如由向右的箭头表示。上面的数字表示感染后的时间(hrs)。病毒粒子代表从纯化病毒中得到的RNA。

图5．分析病毒粒子和感染细胞中的NA蛋白质。A．Western分析病毒粒子中的NA蛋白质。按Materials and Methods所述，用抗碳水化合物的单克隆抗体定量分析病毒中的糖蛋白。用在右侧的HAO(未裂解的HA)，HA1(HA的亚单位1)及NA表示蛋白质。B．在感染细胞中合成的病毒蛋白质。在感染后不同时间(hrs p．i．)，用³⁵S[半胱氨酸]将病毒蛋白质标记30分钟，并在10％Laemmli凝胶上分析。在右侧标出了不同的蛋白质。用箭头表明NA蛋白质的位置。用NP和M1蛋白质作对照，经计算凝胶的放射性AMBIS显像系统确定NA蛋白质的量。

图6．有关构建嵌合HA分子的载体。图6A．嵌合HA／ME1疟疾构建体。图6B．嵌合HA／polio VP1构建体。

图7．神经氨糖酸苷酶(NA)的示意结构。描述插入在病毒膜中的四单体NA。Ct，胞质尾；TM，横跨膜区；茎：茎区；头：病毒膜最末端的球形区。

图8．神经氨糖酸苷酶突变体的图示。表明了神经氨糖酸苷酶分子的四个区域：CT，胞质尾；TM，横跨膜区；茎，茎区以及头，病毒膜最末端的球形区。氨基酸的编号系统是根据Hiti和Nayak，1982 J．Virol．41：730-734的。缺失是按说明的，在茎区域的插入和突变划了线。该图不是按比例画的。(+)说明突变体RNA转染后，重新得到的感染病毒。

图9．从纯化病毒中提取的vRNAs的凝胶分析。按9．1部分所述制备病毒和vRNAs。在含7．7M脲的2．8％聚丙烯酰胺凝胶上分析200ng病毒粒子RNA。按前文所述(Enami et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)通过银染色肉眼观察RNA片段。在左边表示每种RNA片段。泳道1，野生型转染的病毒。泳道2，Del 16突变病毒。泳道3，Ins．12突变病毒。泳道4，Ins 24突变病毒。泳道5，Ins41突变病毒。箭头表示NA基因在每种RNA制剂中的位置。

图10通过反转录和PCR分析vRNA。将从纯化病毒中提取的RNA反转录；然后按部分9．1中所述通过PCR扩增NA基因特异性的转录产物。在含7M脲的6％聚丙烯酰胺凝胶(Luo et al．，1991，J．Virol．65：2861-2867)上分析用γ-³²[P]ATP标记的PCR产物。所需的野生型NA，Del 18m，Del 23N和Del 28N突变体NAs的产物分别为214，160，145和130个核苷酸长。用γ³²[P]ATP标记phix174 RF DNA／HaeⅢ片段(BRL，Bethasda，MD)并将其作为大小标记物。在左侧标明了DNA片段的大小。泳道1，大小标记物。泳道2，野生型NA(T3NAmod)的产物。泳道3，Del 18m突变体NA的产物。泳道4，Del 23N突变体NA的产物。泳5，Del 28N突变体NA的产物。箭头说明PCR产物的位置。

图11．转染子病毒在MDBK(A．)和MDCK(B．)细胞中的生长曲线。细胞是用0．001m．o．i的野生型或突变体病毒感染的。按部分9．1中所述，在所标明的时间，确定收集的上清液的病毒效价。

本发明涉及用遗传工程方法加工的减毒病毒，以及有关其生产的方法。可用重组DNA技术将位点特异性突变加工到病毒基因组的一个或多个非编码区，从而导致一个或多个病毒基因的下降调节。另外，也可用重组DNA技术将突变(包括但不限于氨基酸残基或抗原决定簇的插入，缺失，或取代)加工到病毒基因组的编码区以便由加工过的病毒表达经改变的或嵌合病毒蛋白。本发明部分基于发现切割病毒中病毒基因的下降调节可导致在每轮复制中生产缺陷型颗粒，以便使病毒表现减毒特征。在未切割病毒中，病毒基因的下降调节可导致生产比相应野生型病毒更少的子代病毒粒子。所述的病毒蛋白质的变化也可导致原因还不很了解的减毒作用。

可以用许多方法将活减毒病毒制剂导入人或动物主体以诱导免疫应答；这些方法包括但不限于口服，皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内，皮下及鼻腕内途径。优选的是经其自然感染途径导入嵌合病毒疫苗。

根据本发明，可以加工任何病毒以生产适用作安全活病毒疫苗的减毒菌株，包括但不限于属于下列表Ⅰ中所列科的病毒。

表Ⅰ

         人及动物病毒科病毒特征                     病毒科包装的                       痘病毒科

                         疱疹病毒科未包装的                     腺病毒科

                         乳多泡病毒科

                         肝DNA病毒科未包装的                     微小病毒科未包装的                     呼肠(孤)病毒科包装的

正意义基因组

在复制中没有DNA步骤      外衣病毒科

                         黄热病病毒科

                         冠状病毒科

                         丙型肝炎病毒

在复制中有DNA步骤   反转录病毒科

负意义基因组

未切割的基因组       副粘液病毒科

                     棒状病毒科

已切割的基因组       正粘液病毒科

                     布尼亚病毒科

                     沙粒病毒科未包装的                 微小核糖核酸病毒毒科

                     杯状病毒科所用的缩写：ds=双链；ss=单链，已包被的=有一个从宿主细胞膜得到的类脂双层外膜；正意义链基因组=对RNA病毒来说，其基因组由直接在核糖体上翻译的核苷酸序列组成，对于DNA病毒，其基因组由与mRNA相同的核苷酸序列组成；负意义链基因组=由与正意义链互补的核苷酸序列组成的基因组。

用现有技术已知的重组DNA技术(如，参见Paoletti的美国专利No 4，769，330；Smith的美国专利No．4，215，051；Racanielloet al．，1981，Science 214：916-919)可很容易地加工DNA病毒(如牛痘，腺病毒，杆状病毒)和正链RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒)。然而直到最近，由于该病毒RNAs是非感染性的，负链RNA病毒(如，流感病毒)还不能适用于位点特异性的遗传工程操作。但是，最近发展起的一种称作“反向遗传工程方法”的技术可加工并生产重组负链RNA病毒。

反向遗传工程技术涉及制备含负链病毒非编码区的合成重组病毒RNAs，所述非编码区对于由病毒多聚酶识别的病毒RNA以及生产成熟病毒粒子所需的包装信号是必需的。从重组DNA模板合成重组RNAs，并将其在体外与纯化的病毒多聚酶复合体重新结合以形成可用于感染细胞的重组核糖核蛋白(RNPs)。如果在合成RNAs的体外转录期间存在病毒多聚酶蛋白质，则可达到更有效的转染。可以将合成的重组RNPs挽救为感染性病毒颗粒。在未审定的系列申请No．07／527，237(1990年5月22日申请)和Enami＆Palese，(1991，5．Virol．65：2711-2713)描述了上述技术(每篇文献均全部引入本文作为参考)，以及NA基因茎部分含有插入，缺失和突变的流感A病毒，其中之一种已改变的病毒可用作宿主类突变体。用反向遗传工程技术，加工下列的重组负链病毒：含9个不同RNA片段的流感病毒；已用属于流感B病毒的NS基因取代其NA基因非编码区的嵌合流感A病毒(NA／B-NS)；含不同流感亚型抗原决定簇的嵌合血细胞凝集素的流感A病毒(Enami et al．，1991，Virology 185：291-298；Muster et al．，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：5711-5781；未审定的系列申请No．07／841，310，1992年2月3日申请；和Li et al．，1992，J．Virol．66：399-404；每篇文献均全文引入本文作为参考)；在NA基因茎部分含插入、缺失和突变的流感A病毒，其中一种作为宿主类突变体。在下文各小部分及下文的实施例中将更详细地讨论本发明，为了更明确，用流感病毒详细描述本发明。然而，该原理可类似地应用于构建其它减毒病毒。

根据本发明，可以改变病毒的非编码调节区以下降调节任何病毒基因，如减少其mRNA的转录和／或减少vRNA(病毒RNA)的复制，以便生产减毒病毒。

对任何病毒均适用的本方法，特别适用于加工有经切割的基因组的病毒，即将基因组分成片段并包装到病毒粒子中的病毒。例如，流感A病毒(正粘液病毒)的切割基因组由8个线性负意义单链RNA分子组成，它们编码10个多肽，包括：由RNA多聚酶指导的RNA合成蛋白质(PB2，PB1和PA)和形成核蛋白壳的核蛋白(NP)；从被膜上伸出的两个表面糖蛋白：血细胞凝集素(HA)及神经氨糖酸苷酶(NA)；和其功能尚未知的非结构蛋白(NS1)和NS2)。每个片段的末端都含有对于病毒多聚酶识别及生产成熟病毒粒子所需包装信号所必需的非编码区。在所有8个片段中，末端序列都是高度保守的。作为另一实例，呼吸道肠道病毒的切割基因组由10到12个编码6到10个主要结构多肽，转录酶和其它酶的线性双链RNA组成。

导致病毒基因片段复制下降调节和／或病毒基因转录的下降调节的切割病毒非编码调节区的改变会造成在每轮复制中生产缺陷性颗粒；即：包装少于为具完全感染性，致病性的病毒所需的病毒片段的全套染色体的颗粒。因此，由于该病毒在每轮复制中，将散发比野生型颗粒有更大缺陷的颗粒，所以经改变的病毒会表现出减毒特征。但是，由于在每轮中野生型病毒和缺陷型颗粒合成的蛋白质量相似，所以上述减毒病毒能诱导良好的免疫应答。

上述方法可等同地应用于未切割的病毒，其中，病毒基因转录的下降调节将减少其mRNA的生产及所编码的基因产物。在病毒基因编码结构蛋白，如衣壳，基质，表面或被膜蛋白的情况下，将会减少复制期间生产的颗粒数量以便改变的病毒表现出减毒特征，如导致症状不显水平感染的效价。例如，病毒衣壳表达的降低将减少复制期间包装的核蛋白壳数量，而被膜蛋白表达的减少可降低子代病毒粒子的数量和／或感染性。另外，减少进行复制所需的病毒酶，如多聚酶，复制酶，蜗牛酶等的表达将降低复制期间生产的子代基因组数量。由于降低了复制期间生产的感染性颗粒数量，所以经改变的病毒表现出减毒特征。但是，所生产的抗原病毒颗粒数量足以诱导强有力的免疫应答。

可按本发明加工任何降低其有效性或强度的受限制非编码区的变化。例如，改变茎结构可减弱病毒启动子的强度。本文详述的实验中，发现在组成已切割的负链RNA病毒，如流感病毒的柄状狭长结构的vRNAs的末端启动子(图1B／E)第二茎结构中特定核苷酸的改变会造成一个vRNA片段合成的下降调节。尤其是，嵌合流感突变体NA／DeF／Abc的UCCU／AGGA核苷酸(部分7．2．1，表Ⅲ)是所涉及的重要碱基对(野生型中类似的碱基对是CUC／GAG)。

将该碱基对组合物导入到其它病毒基因的非编码调节区。结果说明，这样生产的嵌合病毒也是减毒的。显然，在该第二茎结构中的改变将造成病毒片段的vRNA合成降低，随之减少含有全套8个RNA片段的感染颗粒数量。应该注意，由于回复需要同时改变两个核苷酸，所以已改变的茎结构的回复率极低。

由于加工后vRNA或mRNA减少，而产生减毒作用，同时并没有显著降低特异于该基因的病毒蛋白质。事实上，它可能需要将强翻译信号加工到病毒基因中，以便能将以低浓度存在的基因转录产物有效地翻译成所需的病毒蛋白质，从而提供一定程度的复制。

下文详述实施例中的实验目的是用来理解目标在于发展一种活病毒疫苗原型的，以已改变的嵌合NA／B-NS病毒，以及本文描述的其它加工病毒(如RAM3，HA／疟疾ME1，和HA／脊髓灰质炎病毒1)生长特征为基础的分子机制。NA／B-NS是含嵌合NA基因的转染子流感A病毒，其中嵌合NA基因的非编码序列与在未审定的系列申请No．07／841，310(由Palese等人，1992年2月3日申请)笔Muster等人(1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88：5177-5181)(两篇文献均全文引入本文作为参考)中描述的流感B／Lee病毒NS基因的相应序列相同。在组织培养中，该病毒有许多特有的生长特征并且在小鼠中是高度减毒的。

从本文所述实验中得到的一些迹象说明，从流感B／Lee病毒基因得到的cis元素对引起NA／B-NS转染子病毒嵌合NA基因的转录和复制有引人注目的影响。发现在纯化病毒制品中，NA基因比其余7个RNA(参见部分6．2．2和6．2．4下文)的显现性低6倍。一种RNA的惊人低的显现性与NA／B-NS转染子病毒的感染颗粒与天然颗粒比率比野生型病毒的相应比率低5-到10-倍这一发现一致(见部分6．2．1，下文)。据推测感染性病毒需要存在全套共8个流感病毒RNA片段。但许多NA／B-NS子代病毒缺一个NA基因，因此，比野生型病毒感染的情况下形成更多的缺陷型颗粒。还不清楚这种效价降低5-到10-倍是否仅反映了NA基因较低的显现性还是其它因子也起作用。例如，一些病毒可含有能降低制品感染效价的缺陷型干扰RNA。

在转染子病毒感染的细胞中，也大大地降低了NA的mRNA合成(参见部分6．2．4，下文)。令人惊奇的是，这并不会导致相应地降低蛋白质合成。病毒感染细胞和纯化病毒与野生型感染细胞或纯化野生型病毒本身比较，仅显示出两倍低的NA蛋白质水平(参见部分6．2．3．下文)。这种在转染子病毒中比预期水平高的NA蛋白质水平可能是在嵌合NA基因中存在良好的kozak序列的结果。该嵌合NA基因在-3位有一个A取代了野生型NA RNA中的U(见图1的空白三角形)。该资料也表明NA活性的两倍降低并不显著地影响病毒的致病性，因为构建了其它转染子病毒(如，下面所示的NAM3)，其中用在组织培养中不影响病毒生长的10因子下降调节NA基因的表达(参见部分7．2．2和表Ⅳ，下文)：

AG．A    A    UUUGAACAAACAUU

AGU    AAC．．AGGAGUUU

UCG    UUG    UCCUCAAA

 …U     CG         CUUAC

应该注意在转染子病毒中，并不改变其它7个基因的表达。具体地，NA／B-NS病毒生产与野生型病毒中相同水平的HA蛋白质，并且，将类似量的HA包装到病毒被膜中。看起来，用NA特异性vRNA的低水平合成及所得的含全套8个RNA片段颗粒的低水平显现性能最恰当地解释减毒特征。

流感A病毒怎样包装其8个RNA基因组片段仍是一个有趣的问题。过去，设想了两个关于流感病毒RNA包装的不同机制：一个认为，选择性地包装8个RNA而另一个认为随机地包装病毒RNA(Compans et al．，1970，In The Biology of Large RNA病毒，Barry＆Mahy，Eds．pp．87-108，Academic Press，N．Y．；Lamb＆Choppin，1983，Ann．Rev．Biochem．467-506；Simth＆Hay，1982，Virology 118：96-108)。支持随机包装机制的证据正在积累。随机包装理论起源于流感病毒具有感染病毒颗粒和天然颗粒的比率低这一实事。如果人们推测每个病毒粒子包装平均11个RNA，则预期的比率与体内发现的一致(Enami et al．，1991，Virology 185：291-298)。重排体病毒的发现也支持该模式，该病毒含有从两种不同病毒得到的两拷贝相同片段(Scholtissek，1978，Virology 89：506-516)。且关于需9个RNA才具感染性的流感A病毒的最新报告进一步支持该理论(Enami et al．，1991，Virology 185：291-298)。下文实施例中描述的关于NA／B-NS转染子病毒的特征似乎也支持随机包装机制而不是选择机制。病毒粒子中存在的较低水平的嵌合NA RNA与感染细胞中其合成的降低一致。在选择性包装模式中，期望将约等克分子量的嵌合NA RNA包装到病毒颗粒中。

总之，下文描述的实验说明，vRNA片段的合成被下降调节的流感病毒在复制期生产缺陷型颗粒。由于该病毒蛋白质与野生型病毒相比没有改变，所以减毒作用肯定是无效的cis作用信号造成的结果。可以将该减毒原理用于其它带包切割基因组的病毒中。例如，将修饰导入轮状病毒基因或其它经切割双链RNA病毒(Roner et al．，1990，Virology 179：845-852)基因的非编码序列，也可以改变这些病毒的致病性。

5．2病毒蛋白质的修改

另一条加工减毒病毒的途径涉及将修改包括但不限于一个或多个氨基酸残基和／或抗原决定簇的插入，缺失或取代导入一个或多个病毒蛋白质中。将适当的修改加工到相应的病毒基因序列中可以很容易地达到上述目的。可以按本发明完成改变病毒蛋白质活性以修饰或降低病毒复制的任何变化。

例如，可以将影响但不完全消除病毒附着到宿主细胞受体上并随之进行感染的修改加工到病毒表面抗原或涉及加工处理的病毒蛋白酶中以便生产减毒菌株。根据该实施方案，修饰病毒表面抗原以使之包含影响或降低病毒抗原与宿主细胞受体结合亲和性的一个或多个氨基酸或抗原表面决定簇的插入，取代或缺失。该方法还提供了另一优点，即可以生产也表现减毒特性的能表达外源抗原决定簇的嵌合病毒。上述病毒是用作活重组疫苗的理想侯选病毒。例如，可以加工到本发明的嵌合病毒中的异源基因序列包括但不限于人免疫缺陷性病毒(HIV)如gp120的抗原决定簇；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；疱疹病毒的糖蛋白(如，gD，gE)；脊髓灰质炎病毒的VP1；非病毒病原体如细菌和寄生物，仅举几个例子的抗原决定簇。

从这点上说，流感病毒是加工外源抗原决定簇的理想系统，因为，从用于构建嵌合病毒的上千流感病毒变异体中选择的能力，排除了用其它病毒载体如牛痘时遇到的宿主抗性或免疫耐受性问题。另外，由于流感病毒刺激旺盛的分泌腺及细胞毒素T细胞应答，所以存在于流感病毒中的外源抗原决定簇也可提供分泌免疫性和细胞介导的免疫性。作为例子，也可以加工流感病毒HA蛋白质中氨基酸残基的插入，缺失或取代以便生产减毒病毒株。从这点考虑，可以利用HA的B区或E区的修改。按照该方法，将(Plasmodium yoelli)(NEDSYVPSAEQI)的疟疾抗原决定簇(ME1)导入流感病毒血细胞凝集素的抗原位点E。在小鼠中检测时，所得的嵌合病毒比野生型病毒有500-到1000倍低的LD₅₀(半致死量)。在另一实施方案中，将脊髓灰质炎病毒1型的主要抗原决定基，即脊髓灰质炎病毒1型VP1的BC环(PASTTNKDKL)加工到流感病毒HA蛋白质的B区。该嵌合病毒也是减毒的(如，见部分8，下文)。

在另一实施方案中，可以将加工病毒蛋白质所需病毒蛋白酶的修改用遗传工程方法加工以产生减毒作用。影响酶活性并在加工时提供低效酶的修改，可影响病毒的感染性，包装，和／或释放以生产减毒病毒。例如，可加工流感病毒的NA蛋白质的变化以降低NA酶活性并在复制期降低释放的子代病毒数量和／或感染性。部分9中提供的实施例描述了在NA基因茎区含有缺失的流感A重组病毒的生产。该突变体可作为一种宿主类突变体，即：失去了影响某种细胞类型能力的病毒。在另一实施例中，可以改变外衣病毒，黄热病病毒或丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白酶，以便降低病毒多蛋白的适当裂解，从而减少复制期间生产的子代病毒粒子量。

在另一实施方案中，改变涉及病毒复制和病毒基因转录的病毒酶，如病毒多聚酶，复制酶，蜗牛酶等等以便降低酶的有效性或活性。上述酶活性的降低可以导致生产较少的子代基因组和／或病毒转录产物以便复制期生产较少的感染性的颗粒。

加工到任何病毒酶中的修改包括但不限于该分子活性位点上氨基酸序列中的插入，缺失和取代。例如，可以改变酶的结合位点以便降低其与底物的结合亲合性，从而降低酶的特异性和／或有效性。例如，由于在所有多聚酶蛋白质中都存在温度敏感突变，所以选择的靶目标是病毒多聚酶复合体。因此，将导入(与上述温度敏感性相关的)氨基酸位置中的修改用遗传工程方法加工到病毒多聚酶基因中以便生产减毒菌株。

6．实施例：降低流感NA／B-NS的NA基因的转录与复制可引起减毒作用

为了理解引起转染子病毒NA／B-NS减毒作用的分子特性，完成下面一系列实验以从分子水平上分析病毒。下面各小部分中的资料说明减毒作用归因于经改变的cis元素对嵌合NA基因复制的影响。该病毒制品中低水平的NA基因导致产生比野生型病毒制品中具更高比例的缺陷型颗粒。另外，该资料支持有关将vRNAs包装到流感病毒颗粒中的随机理论。

6．1材料和方法

6．1．1病毒和细胞

通过使其在含2μg／ml胰蛋白酶的强化MEM培养基(REM．)中的Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞内生长，从纯化的噬菌斑中制备流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒(Musteret al．，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：5177-5181)原种。MDBK细胞用于使病毒形成噬菌斑并研究病毒特异性RNA的合成。

6．1．2质粒

为了得到核探针，构建几个质粒。pSP64-NS DNA含A／WSN／33病毒的全部NS片段，该片段以用SP6 RNA多聚酶可生产mRNA有意义NS RNA的方向，插入到psP64载体的SalⅠ位点。将通过用HindⅢ和EcoRⅠ消化从pSP64-NS中得到的片段插入到IBI30载体的HindⅢ和EcoRⅠ位点之间。用T7 RNA多聚酶，所得的质粒IBI30-NS可生产负意义NS RNA。为了得到生产负意义NA特异性RNA探针的质粒△T3NAV，通过缺失BamHⅠ和EcoRⅠ位点间的片段而缩短pT3NAv质粒(Enami et al，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)中的DNA。另外，通过将pT3NAv的XbaⅠ和EcoRⅠ位点间的片段插入到IBI30载体中；我们可得到称为IBI30-NA的质粒。该质粒通过T7多聚酶转录可生产正意义NA特异性的RNA。

6．1．3．病毒纯化及RNA提取

将流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒在MDBK细胞中生长。然后按照以前描述的(Enami et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)方法通过30-60％蔗糖梯度离心将其纯化。将从四个175cm²烧瓶的MDBK细胞中纯化的病毒再悬浮于0．3ml TMK缓冲液(10mM Tris，pH7．5，1．5mM MgCl₂，10mM KCl)，并经在56℃用9μl 1．0％SDS和7．5μl蛋白酶K(10mg／ml)培养10分钟破碎，接着加入3 5μl SLN缓冲液(5 ％ SDS，1．4M LiCl，100mM NaOAC，pH 7．0)。用酚-氯仿提取病毒粒子RNA，并用乙醇沉淀收集。为了从感染细胞中分离病毒RNA，用流感A／WSN／33病毒或NA／B-NS转染子病毒以m．o．i=1感染MDBK细胞，并在确定的时间点收集。用冰-冷的PBS将细胞洗涤两次并用4M异硫氰酸胍(Sigma)将其溶解。在5．7 M氯化铯(Fisher)中通过平衡离心纯化全部的RNA(Luo et al．，1991，J．Virol 65：2861-2867)。

6．1．4确定感染性与天然颗粒的比率

为了确定流感A／WSN／33病毒与NA／B-NS转染子病毒天然颗粒的总数，将病毒制品与等体积每毫升4×10⁹颗粒浓度的羧化聚苯乙烯珠(0．1μ直经)(PolyScience，Inc，Warring-ton，PA)的悬浮液混合，然后用磷钨酸染色。在电子显微镜下数两种不同的颗粒，确定病毒和聚苯乙烯珠的比率。为了测定制品中感染颗粒数目，将病毒原种连续稀释并在MDBK细胞中形成噬菌斑。

6．1．5RNA电泳

在150伏，含7．7M脲的3％聚丙烯酰胺凝胶上将从流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒中提取的RNA电泳2小时。按以前所述(Enami et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)用银染色，肉眼观察RA片段。

6．1．6．核糖核酸酶保护检测

核糖核酸酶保护检测(RPA)用于定量分析病毒颗粒中的病毒粒子RNA以及测量感染MDBK细胞中病毒mRNA和cRNA。选择NS片段作为一个内对照。为了测量病毒粒子RNA，用sp6或T7型RNA多聚酶以及己用NcoⅠ线性化的质粒psp64 DNA和已用FoKⅠ消化的质粒IBI30-NA，经特异的报废转录分别生产正意义NS和NA特异的RNA探针。为了确定mRNA和cRNA量，分别从DdeⅠ消化的IBI30-NSDNA和PvuⅡ切割的△T3NA DNA上分别用T7或T3 RNA多聚酶转录负意义NS和NA特异的RNA探针。用a³²p[UTP)(800ci／mM，Du Pont，NEN，Boston，MA)标记RNA探针。通常，将从纯化病毒中提取的50ng病毒粒子RNA与各5×10⁴cpm的正意义NS及NA特异性探针杂交，或者将从病毒感染细胞中分离的5μg总RNA与各5×10⁴cpm的负意义NS及NA特异性探针杂交。在45℃保温培养12小时后，按制造商的说明(Ambion Inc．Austin，Texas)用RNase A／T₁消化杂交混合物，在6％丙烯酰胺变性凝胶(Luo et al．，1990，J．Virol．64：4321-4328)分析所得的产物。

6．1．7引物延伸

用引物延伸(Luo＆Taylor，1990，J．Virol．64：4321-4328)定量分析流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒NA及NS片段的基因组RNA(vRNA)。用于检测NS及NA特异性vRNA的引物是21nt长，并与负意义vRNA互补。NS引物5′-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3′横跨NS cRNA的695到714核苷酸之间的区域。NA引物5′-GTGGCAATAACTAATCGGTCA-3′覆盖NA cRNA的1151到1171核苷酸。将NS和NA引物与γ³²p-ATP(3000Ci／mM，Du Pont，NEN，Boston，MA)及T4 DNA激酶(Biolabs，Beverly，MA)一起保温培养而标记两个引物的5′末端。在各存在3×10⁵cpm 5′的末端标记的NS和NA引物的情况下，用RNase H负MLV反转录酶(BRL，Gaithersburg，MD)反转录从病毒中提取的100ng RNA或从感染的MDBK细胞中分离的5μg总RNA。37℃保温培养2小时后，加入EDTA至10mM，停止反应，接着酚-氯仿提取及碱处理(Luo＆Taylor，1990，J．Virol．64：4321-4328)。在含7M脲的6％聚丙烯酰胺凝胶上分析产物。直接计算凝胶片的放射活性测量产物量，所述凝胶片相应于胶片上的每个带。

6．1．8神经氨糖酸苷酶检测及WESTER分析

为了检测流感A／WSN／33和NA／B-NS转染子病毒的神经氨糖酸苷酶活性，用2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨糖酸(Sigma)作为底物。反应混合物由25μl 2mM底物，25μl病毒及含2mM CaCl₂的50μl 0．2 M磷酸盐缓冲液(pH6．0)。37℃保温培养10分钟后，加入2ml 0．5M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10．6)停止反应，然后用甲基繖形酮作为标准，测量在365nm激发并在450nm发射的荧光，确定神经氨糖酸苷酶的活性。用Bio-Rad蛋白质检测盒测量病毒的蛋白质浓度。为了对WSN／33和NA／B-NS病毒的NA及HA蛋白质进行Western分析，在10％Laemmli凝胶(Laemmli，1970，Nature 227：680-685)上电泳病毒蛋白质，随后将其转移到硝化纤维素膜(Schleicher＆Schuell，Keene，NH)上。用抗碳水化合物的单克隆抗体检测病毒的NA及HA糖蛋白。用抗小鼠卡巴链的大鼠抗体使Western印迹显色，该链用125碘标记。

6．1．9．分析感染细胞中的蛋白质合成

将WSN／33病毒或NA／B-NS转染子病毒以约3moi感染MDBK细胞(35mm盘)。因为NA／B-NS转染子病毒不能生长到较高的效价，所以使用多个重复。在标明的时间，在不含半胱氨酸的培养基中，用100μCi／ml的[³⁵S]半胱氨酸(1027Ci／mmol，Du Pont，NEN Research Products)介质将蛋白质标记30分钟。然后用冰-冷PBS缓冲液将细胞洗涤两次，并溶解在150μl含1％NP-40，150mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8．0和1mM PMSF的裂解缓冲液中。将约1／20的样品载到10％Laemmli凝胶(Laemmli，1970，Nature 227：680-685)上。

6．2结果

下面描述的结果说明了vRNA片段合成被下降调节的流感病毒可在复制期间生产缺陷型颗粒。由于与野生型病毒相比，未改变NA／B-NS病毒的蛋白质，所以，减毒作用肯定是cis信号失效的结果。

6．2．1感染性与天然颗粒的比率

转染子NA／B-NS病毒与野生型流感A／WSN／33病毒基因组的区别仅在于NA基因的非编码区。因此，看起来转染子病毒生物学特性的改变是位于嵌合NA基因非编码区cis信号改变的结果。具体地说，早就注意到，在MDBK细胞，MDCK细胞和小鼠中，转染子病毒比野生型病毒生长至较低的效价。另外，组织培养中低多重性生长曲线与野生型病毒的(Muster et al．，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：5177-5181)相比明显地延迟。检测转染子病毒的温度敏感型表型，可以解释改变的生长特征。但是，NA／B-NS病毒在30℃，33℃，37℃和38℃的生长曲线图与在相应温度的野生型病毒的图形没有区别。为了回答缺陷型颗粒是否存在于NA／B-NS病毒制品中这个问题，在电子显微镜下计算天然颗粒并将该数字与制品的噬菌斑形成单位比较，描述该病毒的特征。有趣的是，NA／B-NS转染子病毒与野生型病毒有相似数目的天然颗粒，但始终有较低的PFU效价(Muster et al．，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：5177-5181)(表Ⅱ)

表Ⅱ

流感A／WSN／33病毒和NA／B-NS转染子病毒的感染

性颗粒与天然颗粒的比率病毒       天然颗粒数(pp)   感染性颗粒数(ip) 比率(pp／ip)WSN／33    1．8×10⁹／ml    1．2×10⁸／ml        15NA／B-NS   1．2×10⁹／ml    1．0×10⁷／ml        120

因此，在MDBK细胞中生长的NA／B-NS病毒比WSN／33野生型病毒有至少5到10倍低的感染颗粒与天然颗粒比率。

6．2．2减毒病毒RNA的特征

由于NA／B-NS病毒含许多缺陷型颗粒，所以检测病毒RNA是否存在缺陷型RNA。从纯化病毒中提取后，在含7．7M脲的3％聚丙烯酰胺凝胶上分离基因组RNA。如图2组A所示，在凝胶上几乎看不见NA／B-NS转染子病毒的嵌合NA RNA，而其余七个片段以约等克分子浓度存在。增加凝胶上的RNA量后，可以看出嵌合NA RNA迁移到相同于图2泳道3对照RNA位置。然而，电泳及银染色不能定量分析包装在病毒粒子中的嵌合NARNA。为了达到该目的，进行核糖核酸酶保护检测(RPA)和引物延伸实验。在相同的反应中，将正意义NS特异性和NA特异性探针与来自WSN／33病毒(图2，泳道2)或NA／B-NS转染子病毒(图2，泳道3)的纯化病毒粒子RNA杂交，然后用RNase A／T₁消化。在含7 M脲的6％聚丙烯酰胺凝胶(Luo et al．，1991，J．Virol．65：2861-2867)上分析所得的产物，通过计算相应于胶片上带的凝胶片的放射性，计算出vRNA量。如图2组B所示，嵌合NA RNA保护的探针比野生型基因的迁移更快，这是因为两个NA基因5′非编码序列不同。当与WSN／33病毒的NA片段比较时，用NA基因作为内对照转染子病毒中嵌合NA RNA的量约低6倍。在图2组C所示的引物延伸实验表明，病毒粒子中包装的嵌合NA RNA与NS基因相比，有相似的降低，这说明在转染子病毒制品中，嵌合NA基因有特异低的显现性。

6．2．3减毒病毒蛋白质的特征

为了确定NA／B-NS转染子病毒是否也含有较少的神经氨糖酸苷酶蛋白质，进行病毒颗粒中的神经氨糖酸苷酶检测和NA蛋白质的Western分析。为了进行神经氨糖酸苷酶的酶促检测，首先用蛋白质检测确定病毒蛋白质的总浓度，然后使用相同量的纯化病毒。NA／B-NS转染子病毒比WSN／33野生型病毒有仅两倍低的NA活性。用Western分析得到了相似的结果，它表明有1．9倍的NA蛋白质，但NA／B-NS转染子病毒与WSN／33病毒的病毒粒子相比，HA蛋白质的量相同(图5，组A)。

6．2．4．感染细胞中病毒特异性RNA合成

以NA／B-NS转染子病毒的vRNA分析为基础，不再怀疑病毒颗粒中含有较少的嵌合NA RNA。可能由导致NA RNA低效包装的包装信号的改变或者基因组NA RNA合成的改变引起病毒粒子中低水平的嵌合NA RNA，上述基因组NA RNA合成的改变可能是流感A病毒多聚酶不能有效识别流感B病毒特异性启动子的结果。为了确认精确的机制，检验感染MDBK细胞中嵌合NA基因的合成。认为vRNA主要是在感染晚期合成的(Shapiro et al．，1987，J．Virol．61：764-773)，在感染后7，8-1／2和10小时从细胞中提取RNA。用从病毒感染细胞中提取的5μg总RNA进行引物延伸分析。图4中的资料表明，与对照病毒相比，嵌合NA基因的vRNA合成有显著降低。与WSN／33病毒的NA RNA合成相比较时，在感染后7，8-1／2和10小时，嵌合NA基因分别减少了9，8和8倍。但是，关于NA／B-NS转染子病毒的NS片段，未观察到vRNA合成的减少。该结果说明，转染子病毒中嵌合NA RNA的减少是细胞内某较低合成的结果而不是由于嵌合NA RNA包装的缺陷。

为了确定嵌合NA基因mRNA合成水平，用WSN／33病毒或NA／B-NS转染病毒感染MDBK细胞，然后，在不同的感染后时间点，从病毒感染的细胞中分离全部的RNA。随后，用RPA定量分析病毒特异性mRNA的水平。再用NS片段作为对照(见图3)。从该时间过程看出，显然与野生型病毒相比，嵌合NAmRNA的水平显著降低，并且随时间变化仅有轻微的增加。在感染后5小时，嵌合NAmRNA的水平比WSN／33病毒(组C)低5倍，而在指明的时间(组B)，NA／B-NS转染子病毒的NS特异性mRNA的合成与WSN／33病毒相似。应该注意NS特异性mRNA的合成好像比较早，而且比WSN／33和NA／B-NS转染子病毒感染的细胞(实验中使用相似活性的探针)中NA特异性mRNA合成更有效。该情况与以前的报告(Enami et al．，1985，Virology142：68-77)相吻合，并且说明不同流感病毒RNA片段的mRNA合成是逐级调节的。由于发现cRNA合成仅仅是mRNA合成的3-5％，所以条件的检测不能定量地分析出嵌合NA基因的cRNA水平。

6．2．5体内NA蛋白质合成的降低

在NA／B-NS转染子病毒的病毒粒子中，发现NA蛋白质减少了2倍，而嵌合NA mRNA的合成降低得更多。然后又产生了问题，由细胞内嵌合NA mRNA编码的NA蛋白质是否等于其mRNA量，或者是神经氨糖酸苷酶选择性地插入到病毒被膜中。为了回答这个问题，测量感染细胞内合成的NA蛋白质。在感染后1，3，5和7小时，用³⁵S[半胱氨酸]标记病毒蛋白质。在10％Laemmli凝胶(Laemmli，1970，Nature 227：680-685)上分析细胞溶解产物。并且通过AMBIS放射性分析成像系统(Luo＆Taylor，1990 J．Virol．64：4321-4328)而定量该蛋白质。如图5B组所示，在感染后5和7小时，NA／B-NS转染子病毒NA蛋白质的合成比野生型病毒低两倍。从该实验中，可以得出结论组装到病毒粒子中的NA蛋白质等于其在感染细胞中的合成。

7．实施例：与流感病毒减毒作用有关的柄状狭长碱基对

下面描述的实验目的是用于确定引起减毒作用的核苷酸序列以及基因表达对病毒复制的影响。

7．1．材料的方法

用反向遗传工程技术将突变加工到流感病毒NA片段的柄状狭长结构中。按上文部分6．1和及小部分中所述制备，纯化并分析病毒及细胞的减毒作用。

7．2．结果

7．2．1在病毒启动子第二茎结构中的减毒序列

在下面表Ⅲ中列出了构建的一系列嵌合突变体并分析其减毒。结果说明NA／DeF／Abc流感突变体的UCCU／AGGA是与减毒作用有关的重要碱基对。

7．2．2蛋白质及酶活性的降低

另一个叫做NAM-3的减毒突变体有下列结构：

   AG．A    A         UUUGAACAAACAUU

AGU    AAC．．AGGAGUUU

UCG    UUG    UCCUCAAA

    …U    CG        CUUACNAM3，象NA／B-NS一样，表明减毒作用是由于在每轮复制期间生产了缺陷型颗粒。但NAM3也证明，在神经氨糖酸苷酶表达及酶活性方面有10倍的降低(表Ⅳ)。酶表达的这种降低并不影响病毒复制。

表Ⅳ

在流感病毒突变体中NA表达及活性菌株     蛋白质¹   酶活性²

               10分钟   20分钟   40分钟WSN-wt    1．00    3．6     5．48    5．17NAM3      0．14    0．19    0．29    0．67

1．在感染细胞SDS-PAGE上表现的NA带的相关密度。见部分6．1．9．的方法。

2．部分6．1．3中所述在含Ca⁺⁺的蔗糖上纯化病毒。按部分6．1．8中所述检测酶活性，并将其表达成由1ng病毒／分钟产生的底物转化为百分数。

8．实施例在流感病毒HA的抗原位点B或E中表达外源

   抗原决定簇会导致减毒作用。

下面描述的实验说明可以加工HA的B或E区的变化以构建减毒嵌合流感病毒。

8．1．材料和方法

用在上文部分6．1．1中描述的反向遗传工程技术(a)将Plasmodium Yoelii的疟疾抗原决定簇(ME1)(NEDSYVPSAEQI)导入流感病毒HA的抗原位点E(见图6A)；或(b)将脊髓灰质炎病毒1型的主要抗原决定基，即脊髓灰质炎病毒1型VP1的BC环(PASTTNKDKL)导入流感病毒HA的抗原位点B(见图6B)。用Karber方法(参见，Muster，et al．，1991，Proc，Natl．Acad，SciUSA 88：5177-5181)在小鼠中测定嵌合及野生型流感病毒的LD₅₀。

8．2结果

在小鼠中检测时，嵌合流感／疟疾病毒比野生型病毒有低500到1000倍的LD₅₀。同样，嵌合流感／脊髓灰质炎病毒也有较低的LD₅₀。

9．实施例：流感病毒神经氨糖苷酶茎的缺失和插入：产生宿主类实变体

用反向遗传工程系统，通过将缺失，插入和突变加工到流感A／WSN／33病毒神经氨糖酸苷酶(NA)基的茎区域，改变该基因的该区域。本实施例中的资料表明NA茎的长度是可变的。有趣的是，缺失28个氨基酸会产生一个宿主种类突变体病毒，该病毒在MDCK细胞中的生长率与MDBK细胞中的相比，有显著的降低。另外，将41个额外的氨酸酸插入到茎区并不明显地影响在MDCK或MDBK细胞中的病毒生长，这说明茎区域可以耐受导入较长的外源抗原决定簇。

9．1材料和方法

9．1．1细胞和病毒

将Madin-Darby牛肾(MDBK)用于RNP转染。将Madin-Darby犬肾(MDCK)和MDBK细胞用于制备病毒以及确定病毒的生长特征。让MDBK细胞生长在用10％FCS(GIBCO，Gaithersburg，MD)补充的强化最小基本培养基(REM)(Whittaker，Walkersville，MD)上，让MDCK细胞在含10％FCS(GIBCO)的最小基本培养基(MEM)(Whittaker)上生长。将MDBK和MDCK细胞分别维持在含0．42％牛清蛋白(BA)的REM和MEM中。将流感WSN-HK(HINZ)病毒，一种重排体病毒用于RNP转染实验(Enami，et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)。该病毒有流感A／Hong Kong／8／68病毒的NA基因以及来自A／WSN／33病毒的其它7个RNA片段，并且在没有胰蛋白酶的情况下在MDBK细胞中不生长。在11天龄受孕的母鸡蛋中繁殖WSN-HK病毒，并在MDCK细胞中滴定。

9．1．2．构建NA突变体

以前描述了(Enami et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3802-3805)含流感A／WSN／33病毒NA基因cDNA的克隆pT3NAv。在NA蛋白质茎编码区中未发现独特的限制酶位点。选择之一是破坏核苷酸875的StyⅠ／DsaⅠ位点以便在核苷酸169的StyⅠ位点及在核苷酸253的DsaⅠ位点成为特有的。为了达到该目的，在核苷酸875处用NcoⅠ切割pT3NAv并用标准方法(Sambrooket al．，1989，Molecular Choning：A Laboratory Manual，Znd．．ed．，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，和绿豆核酸酶处理。然后在核苷酸926用PstⅠ消化DNA。用多聚酶链反应(PCR)片段代替核苷酸875和926之间的片段，该PCR片段用一个无症状突变改变核苷酸877。用pT3NAv作为模板，寡核苷酸NA01和NA02作为引物(表Ⅴ)制备PCR片段(Erlich，1989，PCR Technology：Principles and Applica-tionS for DNA Amplification，Stockton Press)。用PstⅠ消化后，将PCR片段连接到用NcoⅠ和PstⅠ消化的pT3NAv DNA中。该经过修饰的pT3NAv称为pT3NAmod。使用pT3NAmod克隆，可产生一系列在NA蛋白质茎区有缺失，插入和突变的NA突变体。在表Ⅴ中列出了用于生产这些构建体的寡核苷酸。

表Ⅴ

NA突变体的构建*对于所有PCR反应，将pT3NAv用作模板。

划线的核苷酸说明新产生的AvaⅠ位点的位置。通过用退火的寡核苷酸NA03和NA04取代pT3NAmod中StyⅠ和DsaⅠ位点间的片段而产生Del 16。通过无症状突变，在质粒Del 16中产生一个特有的Ava位点(表Ⅴ中划线的核苷酸)。用pT3NAv作为模板，M13／Puc前进的测序引物(5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)及NA05，NA06和NA08作为引物经PCR分别得到突变体Del 18、Del 23N和Del 28N。用EcoRⅠ和AvaⅠ消化PCR产物并将其插入到用相同酶消化的质粒Del 16 DNA中。除分别用NA07和NA09作为引物外，用同样的8方法也可经PCR得到突变体Del23C和N72Q／C76s。用DsaⅠ和EcoRⅠ消化该PCR产物，并将其插入用相同酶消化的pT3NAmod中。将退火的寡核苷酸NA03和NA10插入到pT3NAmod StyⅠ位点，得到Ins．12和Ins．24。Isn 24含有双倍的Ins．12中的插入片段。用pT3NAv作为模板，寡核苷酸NA11和NA12作为引物，经PCR得到Ins．41。用DsaⅠ消化该PCR片段并将其插入pT3NAmod的DsaⅠ位点。为了得到Del 28C，用DsaⅠ切割质粒pT3NAmod，并用反转录酶(BRL，Bethesda，Maryland)填平。然后用StyⅠ消化DNA，用绿豆核酸酶修补并连接平整末端。

9．1．3．RNP转染

利用以前报告(Enami and Palese，1991，J．Virol．65：2711-2713)的标准方法完成RNP转染实验。简而言之，用限制酶Ksp6321或EarⅠ消化质粒DNA。在转录条件下，在50μl体积中将1μg线性化的DNA在10μl从流感A／PR／8／34病毒分离的病毒核蛋白及多聚酶蛋白(约1μg)及100U T3 RNA多聚酶(Stratagene，La Jolla，CA)培养。然后，将该体外重建的RNP复合体转染到MDBK细胞中，用WSN-HK重排体病毒以感染复数(m．o．i)=1感染MDBK细胞，感染24小时后，收集上清液并用于MDBK细胞中的噬菌斑检测以选择转染子病毒。

9．1．4．病毒制备及RNA提取

分离转染子病毒并将MDBK细胞中的单个噬菌斑进行扩增。使病毒在175cm²大烧瓶的MDCK细胞中繁殖，并经30-60％蔗糖梯度纯化。按以前所述(Luo et al．，1992，J．Virol 66：4679-4685)从纯化病毒中提取病毒粒子RNA。

9．1．5．vRNA片段的电泳及银染色

在含7．7M脲的2．8％丙烯酰胺凝胶上分析从病毒中提取的vRNA。然后按以前的报告用银染色(Enami et al．，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA87：3802-3805)观察vRNA片段。

9．1．6反转录及PCR

用寡核苷酸5′-GTCAATCTGTATGGTAGTCGG-3′作为引物(覆盖核苷酸52到核苷酸72)，用反转录酶(BRL，Bethesda，HD)转录含野生型NA或Del 18m，Del 23N及Del 28N突变体NAs的病毒的NA特异性RNA。用上述的寡核苷酸和寡核苷酸NA12(表Ⅴ)作为引物，用PCR扩增反转录产物(Luo et al．，1991，J．Virol．65：2861-2867)。用γ³²[P]ATP标记引物N／A12。用碱将PCR产物变性，并在含7M脲的6％聚丙烯酰胺凝胶上分析PCR产物。

9．1．7生长曲线

用野生型病毒及各种转染子病毒以m．o．i．=0．001感染MDBK和MDCK细胞，并维持在含0．5μg／ml胰蛋白酶的REM和MEM培养基。在感染后12，24，36和48小时收集上清液。在MDBK细胞中，经噬菌斑检测确定每种上清液噬菌斑形成单位(PFU)的数量。

9．2结果

流感病毒神经氨糖酸苷酸(NA)蛋白质在感染循环中作为一种除去末端唾液酸的酶而起作用。其作用可防止病毒颗粒的自我聚集，并在病毒从宿主细胞萌发期间促使其释放(Palese et al．，1974，Virol．61：397-410)。NA是一种作为一种同四聚物吸附在病毒膜上的整合膜糖蛋白。在电子显微镜下观察时，在表面或病毒粒子上，每个四聚NA象一个磨菇形的钉子(图7)(Laver and Valentine，1969，Virol．38：105-119；Wrigley et al．，1973，Virol 51：525-529)。结构上，NA单体由四个不同的区组成(图7)：胞质和模跨膜区域，细茎，球形的头部(Blok and Air，1982，Biochem．21：4001-4007；Colman，1989，in″The InfluenZa Viruses″，R．M．Krug，ed．pp．175-218，Plenum Press，NY)。虽然头部区域的结构及作用已经知道的很多，但茎区域的结构与功能关系还了解得很少。下面列举了对NA茎区域的研究，其中通过缺失，插入和突变改变茎的长度和结构。

9．2．1将NA的缺失突变体重新挽救为感染性病毒

以比较不同流感A病毒NA基因序列为基础，已经表明，在25和57氨基酸之间，NA的茎区有变化(Blok and Air，1982，Biochem．21：4001-4007；Blok and Air，1982，Virol．118：229-234；Els et al．，1985，Virol．142：241-247；Colman，1989，in″TheInfluenza Viruses″，R．M．Krug，ed．，pp．175-218，Plenum Press，NY)。在本研究中所用的流感A／WSN／33病毒NA的茎区约41个氨基酸长(Blok and Air，1982，Biochem．21：4001-4007，Blokand Air，1982，Biochem．21：4001-4007，Blok and Air，1982，Virol．118：229-234；Hiti and Hagar，1982，J．Virol．41：730-734；Colman，1989，in″The Influenza Viruses″，R．M．Krug，ed．，pp．175-218，Plenum Press，NY)。首先要问的是，是否可以将有较大缺失的NA突变体重新挽救为感染病毒颗粒。构建的第一个突变基因，Del 16缺失48个核苷酸(53-69位氨基酸)(图8)，接着分离RNP转染感染病毒。在含7．7M脲的2．8％丙烯酰胺凝胶上分离纯化的RNA，且表明，有48个核苷酸缺失的NA片段(Del 16)比野生型NA RNA迁移得快(图．9：比较泳道1和泳道2)。这表明流感A／WSN／33病毒可耐受茎区仅为约25个氨基酸的神经氨糖酸苷酶。然后构建编码有28个氨基酸缺失的NA的基因(Del 28C，图8)。但RNP转染后，没有重新得到感染病毒。该结果可能归因于茎区域的截短或者74位潜在糖基化位点和／或76位半胱氨酸的缺失。由于在不同NAs之中，潜在糖基化位点及半胱氨酸残基是高度保守的(Blok and Air，1982，Biochem．21：4001-4007)，首先研究的可能性是，该缺失破坏了重要的结构元素。从这点考虑，构建了其它3个NA突变体：N72Q／C76S，Del 23C，和Del 18m(图8)。在N72Q／C76S突变体中，分别将72位的天冬酰胺(N)和76位的半胱氨酸(C)诱变为谷氨酰胺(Q)和丝氨酸(S)。虽然该基因与野生型基因有相同的茎长度，但未重新得到感染病毒。为了仔细研究糖基化位点及半胱氨酸残基的作用，通过将72位的天冬酰胺变成亮氨酸并缺失53到71位的氨基酸来构建突变体Del 18m。有趣的是，在Del 18m NA RNA的RNP转染后，得到了感染性子代病毒。该事实说明76位半胱氨酸对于形成感染病毒是必需的，而不是72位的潜在糖基化位点。但是，还不清楚是否可耐受除半胱氨酸以外的缺失。因此，设计了突变体Del23C，其中将潜在糖基化位点和半胱氨酸再导入NA中，但缺失C末端到半胱氨酸的两个氨基酸。没有得到含Del 23C突变体基因的病毒。因此，看起来，茎区域后的序列不耐受缺失，说明该区域是NA“头”的一部分。然而，由于可以进一步将NA基缩短5个氨基酸，所以排除了Del 23C突变体病毒是非感染性的可能性。因此产生了另外两个构建体：Del 23N和Del 28N。Del 23N突变体在氨基酸47和69间有23个氨基酸的缺失，Del 28N突变体缺失了从42位氨基酸到69位氨基酸之间的28个氨基酸。Del 23N和Del 28N均产生感染性流感病毒。这说明约12个氨基酸的NA基就足以产生感染性病毒。没有进一步进行缺失分析，因为含Del 28N突变体NA的病毒与野生型病毒一样不能生长(见下文)，并且有一个缺失，在靠近病毒膜的N末端仅剩几个氨基酸，在C末端侧仅有半胱氨酸。为了证实突变体病毒的NA RNA有平截的茎区域，将NA特异性RNA反转录并用标记引物经PCR分析。野生型，Del 18m、Del 23N及Del 28N的PCR产物的大小与预期的一样(图10．泳道2-5)。

9．2．2．将NA的插入突变体重新挽救为感染性病毒

缺失分析表明NA茎的长度是可变的。甚至当病毒含有茎区域几乎完全缺失的NA时，仍能存活。然而，问题仍然是，是否NA分子的茎区可耐受额外氨基酸的插入。为了回答这个问题将12和24个氨基酸插入到氨基酸50和51之间的NA茎区域，如图8所示(分别为Ins．12和Ins．24)。在RNP转染后，Ins 12和Ins．24突变体NA RNA均重新获得感染性转染子病毒。这两个NA突变体可以存活的事实说明，可以插入附加的氨基酸。最后，将41个氨基酸插入到39和40位之间，产生突变体Ins．41。Ins 41突变体含有双倍的NA茎。此外重新得到感染病毒，说明NA茎区可耐受41个氨基酸的插入。在聚丙烯酰胺凝胶上分析Ins．12，Ins 24和Ins 41突变体病毒的纯化RNA，并发现重新得到的NA RNAs迁移到预期的位置(图9，泳道3，4，和5)。

9．2．3．NA转染子病毒的生长特征

为了确定NA分子茎区中的缺失和插入是否对病毒生长有影响，在MDBK和MDCK细胞中测定转染子病毒的特征。在图11中列出了结果。由于通过分离MDBK细胞中的子代病毒即重新得到所有突变体病毒，允许进行抗辅助病毒的选择，所以所有突变体在该细胞型中均可生长是不奇怪的(图11A)。看起来突变体Del28N和突变体Ins．24生长得稍微慢些，并比其它剩余的突变体或野生型病毒的效价低。也应注意，目前所用的MDBK细胞系比其它MDBK细胞系产生较低的总效价。在MDCK细胞中的产量(图．11B)比野生型病毒高约1个log，但突变体Del 18m和突变体Del 28N不同，它们分别长至10²及10⁴倍低的效价。因此，突变体Del 28N是宿主类突变体，它在MDCK细胞中比在MDBK细胞中的有效生长低约1，000倍。

本发明并不限于所描述的具体实施方案的范围内，所描述的实施方案仅用于说明本发明的具体方面，任何功能等同的构建体或病毒均在本发明范围内。除本文所示及所描述以外，从上文描述及附图来看，本发明的各种修饰对于本领域专业人员是显而易见的。上述修饰也在权利要求范围内。

Claims (6)

1．用遗传工程方法加工的减毒流感病毒，它含有至少一个经修饰的非编码区，所述经修饰的非编码区包含茎结构的改变，该改变下降调节至少经修饰的病毒基因片段的合成，使得在宿主中每轮病毒复制期间生产至少一些缺陷型颗粒。

2．用遗传工程方法加工的减毒流感病毒，它含有至少一个经修饰的非编码区，所述经修饰的非编码区包含茎结构的改变，该改变下降调节至少经修饰的病毒基因的转录，使得在复制期间生产的子代病毒粒子在宿主中提供无症状水平的感染。

3．权利要求1或2的减毒病毒，其中修饰包括茎结构中的缺失。

4．含有权利要求1或2的减毒病毒的疫苗。

5．产生减毒流感病毒第一毒株的方法，其包括：

(a)将重组负链RNA模板导入一个细胞系，所述模板含有至少一个经修饰的非编码区，所述经修饰的非编码区包含茎结构的改变，该改变下降调节至少经修饰的病毒基因片段的合成，所述细胞系包含能够产生流感病毒RNA片段的辅助病毒；

(b)从细胞系中收集病毒。

6．权利要求5的方法，其进一步包括将减毒病毒制成疫苗。

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