TWI396741B - 非洲綠猴腎細胞培養之流感病毒及疫苗 - Google Patents

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Description

VERO CELL-BASED INFLUENZA VIRUS STRAINS AND VACCINES
本發明係有關於流感病毒株，特別係關於適合在哺乳類寄主細胞中增加A型流感疫苗產量的A型流感病毒株，以及所產生的疫苗。
流感病毒，特別是A型和B型流感病毒與主要爆發的流行性感冒有關，且會對動物造成嚴重的罹病率和死亡率。感染B型病情通常較A型輕微。A型流感病毒通常帶原在禽類，但是可能感染幾種哺乳動物。目前所知的流感A病毒的亞型都是發生在區域性的禽類身上。禽類有最多數量和範圍的流感病毒株。這些流感病毒株持續在經歷抗原的微變，或許是被人類感染後產生選擇性抗體的壓力所驅動，造成在某些地區季節性的流行。最近，發現高致病性的H5N1亞型的禽類流感A病毒在東亞一帶傳播開來。目前已分離出某些人類H5N1病毒株，並在2005年，藉由反轉錄基因工程製造出血凝素蛋白缺乏多鹽基的減毒H5N1疫苗株(Emerging Infectious Disease；Vol.11,No.10,October 2005,1515-1521)。
流感病毒是一種RNA病毒，屬於正黏液病毒科Orthomyxoviridae，包括負股RNA的基因體(genome)，大約可編碼為10個流感蛋白。這10個流感蛋白包含RNA介導的RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)，核蛋白(NP)，神經氨酸酶(NA)，血凝素蛋白(HA，經過酵素切解後形成HA1和HA2次單位聯合)，基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)(Krug et al.,In The Influenza Viruses,R.M.Krug,ed.,Plenum Press,New York,1989,pp.89-152)。
過去幾十年來，受精雞蛋是繁殖流感病毒來生產疫苗的主要宿主系統。除此之外，非洲綠猴腎細胞(Vero cell)和Madin-Darby氏狗腎臟上皮細胞(MDCK)已經被廣泛的用於製造季節性流感的疫苗。(Audrey et al.,Expert Opin Biol Ther 4(5)：709-17(2004)；Ghendon et al.,Vaccine 23(38)：4678-84(2005))。
NIBRG-14是現在的流感H5N1疫苗株，是由英國國家生物暨血清控制研究所(NIBSC)提供，是一株包含A/Vietnam/1194/2004(H5N1)的HA和NA基因部份和A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的其他6個內部的基因部份製成的重組病毒(reassortant virus)。此疫苗株發現可以在雞胚胎蛋和MDCK細胞中有效率的生長，卻不能在非洲綠猴腎細胞中快速生長。(Govorkova,E.A.,S.Kodihalli,etal.,Dev Biol Stand 98：39-51(1999))。然而，世界性流感大流行時，利用雞蛋製造流感疫苗將不足夠，而MDCK細胞則具有令人擔憂的潛在致癌性。
因此，需要有一株可在非洲綠猴腎細胞快速生長來增加流感疫苗產量的流感病毒株。本發明可滿足這樣的需求。
一方面，本發明的實施例是有關於一株可以在哺乳類宿主細胞中有效生長且適合在哺乳類宿主細胞中增加產量的A型流感病毒株，此A型流感病毒株包括由下列群組中選出之至少一修飾流感蛋白的至少一個基因：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，包括位在相對於序列識別號：1的195位置處的白胺酸基；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，包括位在相對於序列識別號：3的359位置處的酪胺酸基；(c)一修飾流感核蛋白(NP)，包括分別位在相對於序列識別號：5的255，410和446位置處的一個天冬胺酸和二個苯丙胺酸基；(d)一修飾流感間質蛋白(M)，包括位在相對於序列識別號：7的236位置處的苯丙胺酸基；(e)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，包括位在相對於序 列識別號：9的465或494位置處的組胺酸或甘胺酸基；以及(f)一修飾流感非結構蛋白(NS)，包括(i)位在相對於序列識別號：11的90和110位置處的二個脯胺酸基；或(ii)在相對於序列識別號：11的122處的一個停止密碼；其中該至少一個基因的表現導致A型流感病毒株在哺乳類宿主細胞中的產量增加。
另一方面，本發明的實施例是有關於流感疫苗。疫苗包括根據本發明的實施例的A型流感病毒株和藥劑可接受的載體。本發明的實施例也與製備流感疫苗的方法有關。此方法包括根據本發明實施例的流感病毒株和藥劑可接受載體的結合。
另一方面，本發明的實施例是有關於一分離的核酸分子，其編碼為由下列群組中選出之至少一修飾流感蛋白：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，包括位在相對於序列識別號：1的195位置處的白胺酸基；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，包括位在相對於序列識別號：3的359位置處的酪胺酸基；(c)一修飾流感核蛋白(NP)，包括分別位在相對於序列識別號：5的255，410和446位置處的一個天冬胺酸和二個苯丙胺酸基；(d)一修飾流感間質蛋白(M)，包括位在相對於序列識別號：7的236位置處的苯丙胺酸基；(e)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，包括位在相對於序列識別號：9的465或494位置處的組胺酸或甘胺酸基；以及(f)一修飾流感非結構蛋白(NS)，包括(i)位在相對於序列識別號：11的90和110位置處的二個脯胺酸基；或(ii)在相對於序列識別號：11的122處的一個停止密碼； 其中該至少一個基因的表現導致A型流感病毒株在哺乳類宿主細胞中的產量增加。
本發明的實施例是有關於上述分離的修飾流感蛋白。
其他方面，本發明的特色及優點將會在下列說明中顯而易見。包含發明的詳細敘述和較佳實施例和附加的專利申請範圍。
本發明是有關於適合在哺乳類宿主細胞中複製的高度生長流感病毒株。根據本發明的實施例，H5N1的疫苗病毒株容易在哺乳類一級細胞像是非洲綠猴腎細胞中連續繼代，如NIBRG-14，此高成長病毒株已被選擇、分離出和定性了。
除非有其他的定義，本文中所有關於技術和科學的術語與本發明所屬的一般技巧有相同意義，本申請中特定術語使用頻繁，在這份專利說明書前文中應該要賦予意義。必須注意的是文中和專利範圍申請中的單數形式“一”，“一個”或“這個”包含複數指示物，除非內文有其他明確的指出。
本文中，重組(reassortant)病毒指同時包含源自二或更多不同病毒株的基因部分。重組病毒將同時具有親代血統的特性。例如，重組病毒可以由感興趣的病毒株得到編碼成抗原蛋白(如HA和NA基因)的基因部分，且從適合培養生長的病毒(或減毒病毒)編碼成其他病毒蛋白的基因部分，如聚合酶複合體(PB2，PB1和PA基因)和其他病毒蛋白(如非醣蛋白基因，包含M基因，S基因和NP基因)。因此重組病毒本身攜帶想望的抗原特性或允許在宿主細胞中有效產生的種源株。如此的重組病毒是產生製備疫苗所需的病毒時想望的”病毒種子”。本發明中的一個實施例，重組病毒包含NIBRG-14株和任何NIBRG-14修飾過的病毒株，如vero-15株和vero-16株。
本文中，術語”修飾株”意指首代病毒株經過連續繼代和/或經由在哺乳類宿主細胞中的首代病毒和它的後代所選出而獲得的病毒株。在本發明中的一個實施例，修飾株比首代病 毒株已增加了病毒在哺乳類宿主細胞的產量。
在本文中，術語”流感蛋白”意指由流感基因編碼出來的任何多肽或蛋白質。
在本文中，”基因”牽涉到產生胜肽，多肽或蛋白質的核酸分子部分，且信使RNA(mRNA)編碼成這些蛋白質種類，包含密碼區，非密碼區前面的5’非轉譯區(“5’ UTR)接著3’非轉譯區(“3’ UTR)密碼區。”基因”也包含穿插在二個獨立密碼區序列(表現子exons)的非密碼序列(introns)。基因可能進一步包含控制基因表現的調控序列。調控序列包含啟動子(promoters)、加強子(enhancers)，和其他控制表現的元素，如多腺嘌呤化(polyadenylation)訊號，核醣體結合處(細菌表現)，和/或操縱子(operator)。啟動子意指牽涉到RNA聚合酶的結合進而啟動基因轉錄的調控序列。促進子通常位在基因轉錄起始位置的上游(“5’到)端處。加強子意指依照遠端確定方位的形式來調控基因表現的調控序列。密碼區指的是編碼成胺基酸與相對應三個一組多肽轉譯之起始和停止訊號的這部份基因。
在本文中，”流感基因”可以是任何流感病毒最初分離和/或鑑別過的任何基因。本發明中的特別實施例，流感基因是由A型流感病毒最初分離和/或鑑別過的基因。
在本文中，術語”修飾流感蛋白”意指包含未修飾過或參考流感蛋白的胺基酸序列中的一處或更多處修飾的蛋白質。修飾化包含例如插入，取代，或刪除位於未修飾過或參考流感蛋白序列中的一個或更多胺基酸基。因此，修飾過的流感蛋白能有至少一個修飾過的胺基酸基和/或密碼佔據在未修飾過或參考流感蛋白鑑別過的位置。
為了簡單明瞭的目的，修飾流感蛋白中的修飾化是由它在特定參考的流感病毒株中的流感蛋白的相對位置所鑑別，如流感NIBRG-14。然而，此鑑別並非將修飾流感蛋白僅限於修飾流感NIBRG-14蛋白。修飾流感蛋白可以是任何流感病毒的 修飾流感蛋白，其包含相對於在NIBRG-14蛋白的位置修飾。
在本文中，術語”胺基酸取代”指胺基酸存在修飾過的蛋白的胺基酸序列中一個被鑑別過的位置上。胺基酸取代發生在相關於任何其他可能佔據未修飾或參考蛋白胺基酸位置的胺基酸。由胺基酸取代組成的修飾過的蛋白質也可能包含其他修飾。
在本文中，修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，包括位在相對於序列識別號：1的195處的白胺酸基，意指修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，在相對於序列識別號：1的195處有一個白胺酸基。修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，不限於從流感NIBRG-14中的修飾聚合酶蛋白(PB1)，在相對於序列識別號：1的195處用白胺酸取代離胺酸。白胺酸基存在相對於其他任何可能佔據未修飾或參考聚合酶蛋白(PB1)的胺基酸基。修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，可能是除了NIBRG-14之外的A型流感病毒中的修飾聚合酶蛋白(PB1)，只要是修飾聚合酶蛋白(PB1)在相對於序列識別號：1的195處有白胺酸基。修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，也包含除了指定的白胺酸基之外的修飾。在本文中，"序列識別號：1的195位置"是指胺基酸基在從序列識別號：1的N端算來第195個胺基酸。從目前的說明看來，從其他A型流感病毒的序列識別號：1相對195位置的聚合酶蛋白(PB1)，的位置可以用文中已知技巧毫無困難的鑑別，如序列對齊分析。相似的說明適用在其他修飾流感蛋白，如PB2，NP，M，PA和NS，他們在本文中以相似的方式敘述。
本文中，術語"修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，"意指包含未修飾或參考流感聚合酶蛋白(PB1)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白。流感聚合酶蛋白(PB1)是由流感PB1基因編碼而來，為一個流感RNA依賴的RNA聚合酶的單體。流感PB1基因落在A型流感基因體部分的負股部分2上。含有流感PB1基因的例子但不受限A型流感病毒的PB1基因，例如，從NIBRG-14病毒分離出的序列識別號：2，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_004911.1，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007372.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007375.1，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_002021.1，從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_007358.1。
在本文中，術語"修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，"意指包含未修飾過或參考流感聚合酶蛋白(PB2)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白質。流感聚合酶蛋白(PB2)是由流感PB2基因編碼而來，為一個流感RNA依賴的RNA聚合酶的單體。流感PB2基因落在A型流感基因體分段的負股片段1上。含有流感PB2基因的例子但不受限於A型流感病毒的PB2基因，例如：從NIBRG-I4病毒分離出的序列識別號：4，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_004910.1，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007373.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007378.1，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_002023.1，或從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_007357.1。
在本文中，術語"修飾過的流感核蛋白(NP)，"意指包含未修飾過或參考流感核蛋白(NP)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白質。流感核蛋白(NP)，由流感NP基因編碼而來，為一個流感核蛋白。流感NP基因落在A型流感基因體分段的負股片段5上。含有流感NP基因的例子但不受限於A型流感病毒的NP基因，例如：從NIBRG-14病毒分離出的序列識別號：6，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分 離出的核酸資料庫登記號NC_004905.2，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007369.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的基因庫識別號：3655111，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_002019.1，或從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的基因庫登記號NC_007360.1。
在本文中，術語"修飾過的流感間質蛋白(M)，"意指包含未修飾過或參考流感間質蛋白(M)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白質。流感間質蛋白(M)，是二種基質蛋白中較大的，由流感M基因編碼而來。流感M基因落在A型流感基因體分段的負股片段7上。含有流感M基因的例子但不受限於A型流感病毒的M基因，例如：從NIBRG-I4病毒分離出的序列識別號：8，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分離出的核酸資料庫登記號NC 004907.1，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分離出的核酸資料庫登記號。NC 007367.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的核酸資料庫登記號。NC_007377.1，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號。NC_002016.1，或從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_007363.1。
在本文中，術語"修飾過的流感聚合酶蛋白(PA)，"意指包含未修飾過或參考流感聚合酶蛋白(PA)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白質。流感聚合酶蛋白(PA)，由流感PA基因編碼而來，為一個流感聚合酶PA。流感PA基因落在A型流感基因體分段的負股片段3上。含有流感PA基因的例子但不受限於A型流感病毒的PA基因，例如：從NIBRG-I4病毒分離出序列識別號：10，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_004912.1，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分 離出的核酸資料庫登記號NC_007371.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007376.1，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_002022.1，或從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_007359.1。
在本文中，術語"修飾過的流感非結構蛋白(NS)，"意指包含未修飾過或參考流感非結構蛋白(NS)的胺基酸序列中的一處或更多處所修飾的蛋白質。流感非結構蛋白(NS)，由流感NS基因編碼而來，為一個流感非結構蛋白。流感NS基因落在A型流感基因體分段的負股片段8上。含有流感NS基因的例子但不受限於A型流感病毒的NS基因，例如：序列識別號：12，從NIBRG-I4病毒分離出，從influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_004906.1，從influenza A/New York/392/2004(H3N2)分離出的核酸資料庫登記號NC_007370.1，從influenza A/Korea/426/68(H2N2)分離出的基因資料庫識別號3655110，從influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_002020.1，從influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)分離出的核酸資料庫登記號NC_007364.1。
在本文中，術語"核苷酸序列"意指去氧核醣核酸或核醣核酸以聚合形成單股或雙股的排列組合。核酸序列可以由下列天然的核苷酸鹽基和/或合成天然核苷酸的相似物組成：胸腺嘧啶，腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，和尿嘧啶；分別簡寫為T，A，C，G，和U。
在本文中，”分離的”核酸分子是實質上由天然來源的核酸中的至少其中之一所分離出來的核酸分子，或是當核酸分子是化學合成時實質上游離出至少一個化學前驅物或其他化合物。”分離的”核酸分子也可以是由在生物起源的基因體自 然位在DNA 5’和3’端的核酸分子當中實質上游離出至少一個核酸序列的核酸。核酸分子是”實質上來自”或”實質上游離出自”其他核酸分子或化合物中用來製備核酸分子應當少於約30%、20%、10%、5%和更少，且在其他核酸分子或化合物中最好少於1%(乾重)(參見本文”污染的核酸分子”或”污染的化合物”)。
分離的核酸分子包括但不受限獨立於其他序列的核酸分子分類(如cDNA或由PCR產生而來和限制酶處理而來的基因片段)，以及核酸分子嵌入可自行複製質體的載體、病毒(如。反轉錄病毒，腺病毒或泡疹病毒)，或嵌入原核細胞或真核細胞的基因體中。除此之外，分離的核酸分子可以包含雜交或融合的部份。分離的核酸分子可以是核酸序列：(i)體外試驗放大，如聚合酶鏈反應(PCR)(ii)由合成的方式，如化學合成；(iii)由質株重組產生或(iv)經斷裂和電泳或層色分析而純化得來。
在本文中，術語”多肽”和”蛋白質”是可以在文中交換使用的意指胺基酸餘基由胜肽鍵或是修過的生肽鍵連結的胺基酸鏈。胺基酸鏈可以適於任何大於二個胺基酸的長度。除非在其它地方有註明，術語”多肽”和”蛋白質”也包含各種修飾過的樣式。這種修飾過的樣式可能是自然發生或是化學性的修飾樣式。修飾樣式包含但不受限於下列範例glycosylated forms，phosphorylated forms，myristoylated forms，palmitoylated forms，ribosylated forms，acetylated forms，ubiquitinated forms，等等。修飾化也包含分子內交聯和與各式各樣的moieties，如脂質、黃素、生物素、polyethylene glycol或有關的衍生物等等共價鍵結的一部分。除此之外，修飾化可能也包含cyclizatioh，分枝和交聯。除了二十種必須胺基酸之外的胺基酸是由基因的密碼子編碼而來的也被含括在多肽。
”分離的蛋白質”和”分離的多肽”是實質上由天然來 源的蛋白質中的至少其中之一所分離出來的蛋白質，或實質上經由至少一種化學步驟游離出來的或蛋白質化學性合成時的化合物。蛋白質實質上”被分離出”或由游離的蛋白質或其他化學製備的蛋白質是少於約30%、20%、10%、or 5%和更少，且在其他蛋白質或化合物中最好少於1%，(乾重)(參見本文”污染的蛋白質”或”污染的化合物”)
分離的蛋白質可以有幾種不同的天然形式。分離的蛋白質可以以全長新生(full-length nascent)或未處理的(unprocessed)多肽或部分處理的多肽或已處理的多肽結合樣式存在。全長新生多肽可以由特定的蛋白質裂解項目進行轉譯後修飾，導致全長新生多肽片段的形成。片段或實體上關連的片段有與全長新生多肽有關的生物活性，然而單獨片段活性大小是會改變的。
分離的多肽或分離的蛋白質可以是非自然發生多肽。例如，分離的多肽可以是”雜交多肽”。也可以是由天然多肽經由胺基酸附加或刪除或取代衍生而來。分離的多肽也可以是”純化的多肽”在本文指特定的多肽，實質上同源製備，實質上由其他細胞組成物、其他多肽、病毒物質或培養基游離，或當多肽是化學合成地，化學前驅物或與化學合成相關的附產品。”純化多肽”可利用標準純化技術由天然或重組宿主細胞中獲得，或藉由化學合成，這對於有技術的技工是很顯而易見的。
"分離的流感病毒株"或"分離的流感病毒"基本上是由其中至少一種其他在天然環境中的病毒分離出來的病毒，或當病毒是由親代病毒株衍生或修飾過實質上游離而來，除此之外是源自於親代株。病毒”實質上被分離出”或”實質上游離”的病毒或其他病毒少於約30%、20%、10%、or 5%和更少，其他的病毒最好少於1%,(乾重)(參見本文”污染的病毒”)。
一方面，因此本發明是有關於可以在哺乳動物細胞中產生高效價的分離出流感病毒株。本發明實施例關於分離的流感 病毒株包括至少一個修飾過的流感蛋白中的至少一個基因，且至少一個修飾過的蛋白的表現導致流感病毒的產生量增加。根據本發明的範例，宿主細胞可能從適合製備人用疫苗的哺乳類細胞組合中選擇。本發明的特別範例，哺乳類細胞可能是根據世界人類組織(WHO)的核准和certified製備疫苗的非洲綠猴腎細胞。由下列群組選擇之至少一個修飾過之流感蛋白：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，包括位在相對於序列識別號：1的195位置處的白胺酸基；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，包括位在相對於序列識別號：3的359位置處的酪胺酸基；(c)一修飾流感核蛋白(NP)，包括分別位在相對於序列識別號：5的255，410和446位置處的一個天冬胺酸和二個苯丙胺酸基；(d)一修飾流感間質蛋白(M)，包括位在相對於序列識別號：7的236位置處的苯丙胺酸基；(e)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，包括位在相對於序列識別號：9的465或494位置處的組胺酸或甘胺酸基；以及(f)一修飾流感非結構蛋白(NS)，包括(i)位在相對於序列識別號：11的90和110位置處的二個脯胺酸基；或(ii)在相對於序列識別號：11的122處的一個停止密碼；本發明實施例中一個特別的範例係關於流感病毒株Vero-15。分離的和修飾過的流感病毒株Vero-15包括一修飾流感PB1基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：1的胺基酸序列，在序列識別號：1的195處取代為白胺酸基。一修飾流感PB2基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：3的胺基酸序列，在序列識別號：3的359處取代為酪胺酸基。一修飾流感PA基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：9的胺基酸序列，在序列識別號：9的494處取代為甘胺酸基。一修飾流感NS基因 編碼成的蛋白質包括序列識別號：11的胺基酸序列，在序列識別號：11的90和110處取代為2個脯胺酸基。流感病毒株Vero-15進一步包括HA基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：13的胺基酸序列，包括NA基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：15的胺基酸序列，包括NP基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：5的胺基酸序列，包括M基因編碼成的蛋白質包括序列識別號：7的胺基酸序列。
以核苷酸的觀點而言，流感病毒株Vero-15包括具有序列識別號：2之核苷酸序列的PB1基因，在序列識別號：2的583，584和1257處取代為有三胸腺嘧啶且1737處取代為腺嘌呤，具有序列識別號：4之核苷酸序列的PB2基因，在序列識別號：4的1077處取代為三胸腺嘧啶，具有序列識別號：10之核苷酸序列的PA基因，在序列識別號：10的1482處取代為鳥嘌呤，具有序列識別號：12之核苷酸序列的NS基因，在序列識別號：12的271，331和335處分別取代為胞嘧啶。流感病毒株Vero-15包括具有序列識別號：14之核苷酸序列的HA基因，具有序列識別號：16之核苷酸序列的NA基因。流感病毒株Vero-15也進一步包括具有序列識別號：6之核苷酸序列的NP基因，具有序列識別號：8之核苷酸序列的M基因。
比較Vero-15和NIBGR-14的核苷酸序列，在PB2，PB1，PA和NS四部份有1到4個不同核苷酸，但HA，NA，NP和M片段核苷酸序列則與NIBGR-14沒有不同。詳細的比較見表1及第5圖至第10圖。
根據本發明實施例的另一個範例，提供修飾的流感病毒株Vero-16。流感病毒株Vero-16包括一修飾流感PB1基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：1的胺基酸序列，在序列識別號：1的195處取代為白胺酸基。一修飾流感PB2基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：3的胺基酸序列，在序列識別號：3的359處取代為酪胺酸基。一修飾流感NP基因編碼成 的蛋白質，具有序列識別號：5的胺基酸序列組成，在序列識別號：5的255，410和446處分別取代為一個天冬胺酸和二個苯丙胺酸基。一修飾流感M基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：7的胺基酸序列，在序列識別號：7的236處取代為苯丙胺酸基。一修飾流感PA基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：9的胺基酸序列，在序列識別號：9的465處取代為組胺酸基。一修飾流感NS基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：11的胺基酸序列，在序列識別號：11的122處的取代為一個停止密碼。流感病毒株進一步包括HA基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：13的胺基酸序列，包括NA基因編碼成的蛋白質，具有序列識別號：15的胺基酸序列。
以核苷酸的觀點而言，流感病毒株Vero-16包括具有序列識別號：2之核苷酸序列的PB1基因，在序列識別號：2的583，584和1257處取代為三個胸腺嘧啶且1737處取代為腺嘌呤，具有序列識別號：4之核苷酸序列的PB2基因，在序列識別號：4的1077上處取代為腺嘌呤，具有序列識別號：6之核苷酸序列的NP基因，在序列識別號：6的921，1229，1337和1413處分別取代為四個胸腺嘧啶，具有序列識別號：8之核苷酸序列的M基因，在序列識別號：8的694和706處取代為二個胸腺嘧，具有序列識別號：10之核苷酸序列的PA基因，在序列識別號：2的895，1054和1394處分別取代為三個胞嘧啶，具有序列識別號：12之核苷酸序列的NS基因，在序列識別號：2的365處刪除核苷酸。流感病毒株Vero-16包括具有序列識別號：14之核苷酸序列的HA基因，具有序列識別號：16之核苷酸序列的NA基因。
比較Vero-16和NIBGR-14的核苷酸序列，在PB2，PB1，PA，NS，NP和M六個部分上有1到5個不同核苷酸，但HA和NA部份核苷酸序列則和NIBGR-14沒有不同。詳細的比較見表1和第5圖至第10圖。
根據本發明提供一種改進產生H5N1流感疫苗的方法。這 種改進方法包括使用修飾種子病毒。修飾種子病毒至少包括一個由以下群組中所選擇之修飾：一修飾流感PB1基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：1的195處具有白胺酸基，一修飾流感PB2基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：3的359處具有酪胺酸基，一修飾流感NP基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：5的255，410和446處具有天冬胺酸基和二個苯丙胺酸基，一修飾流感M基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：7的236處具有苯丙胺酸基，一修飾流感PA基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：9的465或494處具有組胺酸基或甘胺酸基，一修飾流感NS基因編碼成的蛋白質，包括在相對於序列識別號：11的90和110處具有2個脯胺酸基或在122處具有停止密碼。
以核苷酸的觀點而言，用來產生H5N1流感疫苗的修飾種子流感病毒株包括由以下群組中選擇之至少一個修飾，包括修飾PB1基因分別在序列識別號：2的583，584和1257處具有三個胸腺嘧啶，且在1737處具有腺嘌呤，修飾PB2基因在序列識別號：4的1077處具有腺嘌呤，修飾NP基因分別在序列識別號：6的763處具有鳥嘌呤並在921，1229，1337和1413處具有四個胸腺嘧啶，修飾M基因分別在序列識別號：8的694和706處具有二個胸腺嘧啶，修飾PA基因在序列識別號：10的1482處具有鳥嘌呤或在895，1054和1394處具有三個胞嘧啶，修飾NS基因分別在序列識別號：12的271，331和335處具有三個胞嘧啶或在365處刪除核苷酸。
本發明的其他構面是有關於根據本發明的實施例的流感疫苗包括至少一個修飾過的流感病毒株的，或是有關於本發明中的任何組合。根據本發明揭示的流感病毒株可以是減毒的或去毒的、或經過配方且可接種的，根據已知的方法去做為誘發哺乳類的免疫反應的疫苗。用任何文中為人所知的標準方法用來測定抗原性。疫苗組成可能包含製藥可接受的載體。詞彙”製藥可接受的載體”意指分子實體和組成是製藥可忍受的且 當給予人類不會誘發典型的過敏或類似不幸的反應。如腸胃不適，暈眩諸如此類的。術語”載體”意指稀釋液、佐劑、生理食鹽水和葡萄糖液和甘油比較常做為載體，特別是用於可注射的溶液。術語”佐劑”指的是可以增加抗原免疫反應的複合物或混合物。
本發明的疫苗可能是經皮接種的、經血液的、經黏膜的，如口服的、經鼻的、經直腸的或經皮膚的。接種方式包含經血液的，如經靜脈注射但不受限於經血液的、動脈內的、肌肉內的、皮下的、穴位內的、腹膜內的、靜脈內的和顱骨內的。
本發明的構面也與分離的核酸分子編碼成修飾過的流感蛋白有關和他們產生，分離和使用方法也有關。例如這樣分離的核酸分子可以用在流感病毒的建構，使其在宿主細胞中產生更有效率。本發明發現當流感病毒包含一個或多個文中所述修飾過的流感蛋白時，病毒在宿主細胞中生長更有效率。因此，為了獲得快速生長的病毒株，編碼成修飾過的流感蛋白的核酸分子可以與有興趣的病毒基因藉由重組或其他操控基因的方式結合。這樣的基因方法可能會被擅長藉由本發明的人而得知。分離的核酸分子也可以用在重組由分離的核酸分子編碼的修飾過的流感蛋白的產生。
本發明更與分離的修飾過的流感蛋白和其相關的產生方法，分離和使用有關。如此分離的蛋白可以被用來產生對此修飾過蛋白的抗體。
本發明現在將參考以下特定但不限定的範例做進一步的描述。
範例
NIBRG-14在非洲綠猴腎細胞的修飾化
流感病毒株NIBRG-14是由英國國家生物暨血清控制研究所(NIBSC)提供且培養在雞胚胎蛋中。世界人類組織(WHO)疫苗核准的非洲綠猴腎細胞是由台灣疾管局提供的，使用含5%胎牛血清(FBS)的M199培養液(Gibco BRL，USA)，培 養代數在135到150代之間。流感病毒株NIBRG-14在T75容器中，經過非洲綠猴腎細胞連續3次繼代，培養過程中培養基加入2μg/ml of L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone(TPCK)trypsin(Sigma，St.Louis，MO)。收集繼代培養後的病毒懸浮液放在96孔盤中選殖，接著再在6孔盤中經過2次的選殖，選殖時在培養基中加入4μg/ml TPCK-trypsin。每一植株，藉由細胞病變效應和HA滴定方法估算病毒累積量。HA滴定在96孔盤中使用火雞紅血球細胞(RBC)用標準技術進行。病毒感染效價以基於細胞病變效應(cytopathic effect)的50%組織培養感染劑量分析(TCID50)或基於菌斑形成單位(PFU)的菌斑分析法對非洲綠猴腎細胞進行測量(WHO用在動物流感診斷和監控的方法，WHO 2002)，進行試驗時培養基中加入4μg/ml of TPCK-trypsin。
經由選殖而得到的流感H5N1疫苗病毒株，接著感染生長在T25容器並在培養基中加入4μg/ml的TPCK-trypsin的非洲綠腎猴細胞，收集感染後第3天的病毒懸浮液，進行HA滴定和病毒感染效價測試。二株可以快速生長且適應非洲綠猴腎細胞(Vero-adapted)的流感H5N1疫苗病毒株被選擇出並分別命名為Vero-15和Vero-16。量測NIBRG-14在非洲綠猴腎細胞的生長曲線，分別使用感染密度(MOI)是10-1，10-2和10-3 TCID50/cells。馴化非洲綠猴腎細胞(Vero-adapted)Vero-15和Vero-16的感染密度(MOI)是10-3和10-4 TCID50/cells。
如第1圖和第2圖所示，NIBRG-14在感染非洲綠猴腎細胞6天後形成小且不明的菌斑，病毒滴定的尖峰約106 PFU/ml。經過在非洲綠猴腎細胞中連續繼代和菌斑純化，由大菌斑中選出二個高生長的植株(Vero 15和Vero-16)。參考第1圖，第3圖和第4圖，這二株經過非洲綠猴腎細胞修飾的病毒株，Vero 15和Vero-16在感染非洲綠猴腎細胞3天後形成清楚且大的菌斑，病毒滴定的尖峰約108TCID50/ml。進一步 使用這二株經過非洲綠猴腎細胞修飾的病毒株在T75或T150容器中製成病毒原液。這二株經過非洲綠猴腎細胞修飾的病毒株的病毒原液有相似的病毒效價(Vero-15是1.14 x 108 PFU/ml和1.81 x 108 TCID50/ml而Vero-16是0.99 x 108 PFU/ml和2.96 x 108 TCID50/ml)。
鑑定病毒核苷酸序列和進行比對
每株病毒株的病毒RNA都是使用商業套組(Geneaid,Taoyuan,Taiwan)萃取出來。萃取出的病毒RNA中HA和NA使用一步驟RT-PCR(one-step RT-PCR)(Promega,Madison,WI)放大，而其他六個基因部分使用二步驟RT-PCR(two-step RT-PCR)(Invitrogen,Rockville,MD)。本研究使用的單核苷酸的引導子(primers)是序列根據NIBRG-14的基因序列毫無困難而來的。放大的DNA利用ABI 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc，Foster City CA)定序。
表1列出馴化非洲綠猴腎細胞(Vero-adapted)的病毒株Vero-15和Vero-16和NIBRG-14核酸序列和胺基酸序列在進行比較後所得到的差異數目。注意Vero-15株，與NIBRG-14比較儘管HA，NA，NP和M的核酸序列與NIBRG-14沒有不同，但在四個部份則有1到4個核苷酸不同，如第1圖所示為PB2，PB1，NS和PA。注意Vero-16株，與NIBRG-14比較儘管HA和NA的核酸序列與NIBRG-14沒有不同，但在六個部份則有1到5個核苷酸不同，如第1圖所示為PB2，PB I，PA，NS，NP和M。
* Vero-16有刪除依個核苷酸導致在序列識別號：11的122處有停止密碼。
NT：核苷酸
AA：胺基酸
從圖.5到10.顯示三株流感病毒株的胺基酸(AA)和核苷酸(NT)序列分析
抗原性測試
為了測量NIBRG-14和修飾過的非洲綠猴腎細胞病毒株之間抗原性關係。使用標準凝血素抑制分析法(hemagglutinination inhibition(HI)assay)(WHO 2002)，利用多株綿羊抗NIBRG-14標準抗血清(polyclonal sheep anti-NIBRG-14 standard antisera)(NIBSC)來量測抗NIBRG-14和修飾過的Vero病毒株抗體效價。
以HI滴定法決定NIBRG-14，Vero-15和Vero-16的抗原性表現，結果顯示在表2。結果指出這三株病毒有相似的抗原性。Vero-15和Vero-16都適合用在疫苗產生。
感謝所有擅長於改變上述實施例而不會背離這些廣泛而徹底地概念的人。因此，可以被了解的是本發明不受已揭示特定的實施例所限制，而是打算藉由附加專利申請範圍來涵蓋本發明修飾化的精神和範圍。
以上摘要，以及本發明的較佳實施例的詳細敘述，與附加圖表連結在一起閱讀時將會較容易瞭解。為了說明本發明，下列展示目前較佳實施例的圖表。然而，應該要知道的是本發 明是不受展示的特定實施例所限制。
在圖表中。
第1圖係說明病毒株NIBRG-14(第1A圖)、流感病毒株vero-15(第1B圖)和vero-16(第1C圖)感染非洲綠猴腎細胞後的菌斑形態。(第1A圖)為NIBRG-14感染非洲綠猴腎細胞6天後。(第1B圖)和(第1C圖)則分別為流感病毒株vero-15和vero-16感染非洲綠猴腎細胞3天後的菌斑型態。
第2圖係說明NIBRG-14使用不同感染密度(MOI)感染非洲綠猴腎細胞後，在不同感染天數(Days Post Infection,DPI)時的病毒效價，分別以HA(50ul)滴定(第2A圖)或菌斑分析法(PFU/ml)(第2B圖)來進行效價偵測。
第3圖係說明vero-15使用不同感染密度(MOI)感染非洲綠猴腎細胞後，在不同感染天數(DPI)時的病毒效價，分別以HA(50ul)滴定(第3A圖)或菌斑分析法(PFU/ml)(第3B圖)來進行效價偵測。
第4圖係說明vero-16使用不同感染密度(MOI)感染非洲綠猴腎細胞後，在不同感染天數(DPI)時的病毒效價，分別以HA(50ul)滴定(第4A圖)或菌斑分析法(PFU/ml)(第4B圖)來進行效價偵測。
第5圖係說明以序列對齊分析vero-15，vero-16和NIBRG-14的流感病毒聚合酶蛋白(PB1)，的胺基酸序列(第5B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第5A圖)。
第6圖係說明將序列對齊分析vero-15，vero-16和NIBRG-14的流感病毒聚合酶蛋白(PB2)，的胺基酸序列(第6B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第6A圖)。
第7圖係說明將序列對齊分析vero-15，vero-16和NIBRG-14的流感病毒核蛋白(NP)，的胺基酸序列(第7B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第7A圖)。
第8圖係說明將序列對齊分析vero-15，vero-16和 NIBRG-14的流感病毒間質蛋白(M)，的胺基酸序列(第8B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第8A圖)。
第9圖係說明將序列對齊分析vero-15，vero-16和NIBRG-14的流感病毒聚合酶蛋白(PA)，的胺基酸序列(第9B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第9A圖)。
第10圖係說明將序列對齊分析vero-15，vero-16和NIBRG-14的流感病毒非結構蛋白(NS)，的胺基酸序列(第10B圖)和其相對應的核苷酸(NT)序列(第10A圖)。
<110> 財團法人國家衛生研究院
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 16

Claims (17)

  1. 一種分離的馴化A型流感病毒株，包括：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，係將NIBRG-14病毒株之PB1蛋白(序列識別號：1)的195位置處取代為白胺酸基；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，係將NIBRG-14病毒株之PB2蛋白(序列識別號：3)的359位置處取代為酪胺酸基；(c)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，係將NIBRG-14病毒株之PA蛋白(序列識別號：9)的465位置取代為組胺酸基、或494位置處取代為甘胺酸基；以及(d)一修飾流感非結構蛋白(NS)，包括(i)將NIBRG-14病毒株之PB1蛋白(序列識別號：11)的90和110位置處取代為脯胺酸基；或(ii)將NIBRG-14病毒株之PB1蛋白(序列識別號：11)的122處取代為停止密碼；其中，與NIBRG-14病毒株相較，該馴化A型流感病毒株在非洲綠猴腎細胞中的產量增加。
  2. 根據專利申請範圍第1項的流感病毒株，進一步包括：一修飾流感核蛋白(NP)，係將NIBRG-14病毒株之NP蛋白(序列識別號：5)的255位置處取代為天冬胺酸基，及410和446位置處取代為苯丙胺酸基。
  3. 根據專利申請範圍第1項的流感病毒株，進一步包括：一修飾流感間質蛋白(M)，係將NIBRG-14病毒株之M蛋白(序列識別號：7)的236位置處取代為苯丙胺酸基。
  4. 根據專利申請範圍第1項的流感病毒株，進一步包括與NIBRG-14病毒株相同之流感血凝素蛋白(HA)(序列識別號：13)與流感核蛋白(序列識別號：15)。
  5. 根據專利申請範圍第1項的流感病毒株，其基因係包括：(a)一修飾流感PB1基因，係將NIBRG-14病毒株之PB1基 因核苷酸序列(序列識別號：2)的583，584和1257處分別取代為三個胸腺嘧啶，且在1737處取代為腺嘌呤；(b)一修飾流感PB2基因，係將NIBRG-14病毒株之PB2基因核苷酸序列(序列識別號：4)的1077處取代為腺嘌呤；(c)一修飾流感PA基因，係將NIBRG-14病毒株之PA基因核苷酸序列(序列識別號：10)的1482處取代為鳥嘌呤、或在895，1054和1394處分別取代為三個胞嘧啶；以及(d)一修飾流感NS基因，係將NIBRG-14病毒株之NS基因核苷酸序列(序列識別號：12)的271，331和335處分別取代為三個胞嘧啶、或在365處刪除核酸。
  6. 根據專利申請範圍第5項的流感病毒株，進一步包括：一修飾流感NP基因，係將NIBRG-14病毒株之NP基因核苷酸序列(序列識別號：6)的763處取代為鳥嘌呤，且在921，1229，1337和1413處分別取代為四個胸腺嘧啶。
  7. 根據專利申請範圍第5項的馴化流感病毒株，進一步包括：一修飾流感M基因，係將NIBRG-14病毒株之M基因核苷酸序列(序列識別號：8)的694和706處分別取代為二個胸腺嘧啶。
  8. 根據專利申請範圍第5項的流感病毒株，進一步包括：(a)一與NIBRG-14病毒株相同的流感HA基因核苷酸序列(序列識別號14)；以及(b)一與NIBRG-14病毒株相同的流感NA基因核苷酸序列(序列識別號16)。
  9. 一種分離的馴化A型流感病毒株，包括：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，係將NIBRG-14病毒株之PB1蛋白(序列識別號：1)的195處取代為白胺酸；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，係將NIBRG-14病毒株之PB2蛋白(序列識別號：3)的359處取代為酪胺酸；(c)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，係將NIBRG-14病毒株之PA蛋白(序列識別號：9)的494處取代為甘胺酸；以及 (d)一修飾流感非結構蛋白(NS)，係將NIBRG-14病毒株之NS蛋白(序列識別號：11)的90和110處取代為脯胺酸。
  10. 根據專利申請範圍第9項的流感病毒株，進一步包括與NIBRG-14病毒株相同之流感核蛋白(NP)之胺基酸序列(序列識別號：5)、流感間質蛋白(M)之胺基酸序列(序列識別號：7)、流感血凝素蛋白(HA)之胺基酸序列(序列識別號：13)、以及流感神經氨酸酶蛋白(NA)之胺基酸序列(序列識別號：15)。
  11. 根據專利申請範圍第10項的流感病毒株，其基因組成包括下列核苷酸序列：與NIBRG-14病毒株相同之NP基因(序列識別號：6)、M基因(序列識別號：8)、HA基因(序列識別號：14)、和NA基因(序列識別號：16)；NIBRG-14病毒株之PB1基因(序列識別號：2)，在583、584和1257處分別取代為胸腺嘧啶，及在1737處取代為腺嘌呤；NIBRG-14病毒株之PB2基因(序列識別號：4)，在1077處取代為腺嘌呤；NIBRG-14病毒株之PA基因(序列識別號：10)，在1482處取代為鳥嘌呤；以及NIBRG-14病毒株之NS基因(序列識別號：12)，在271、331和335處分別取代為胞嘧啶。
  12. 一種分離的馴化A型流感病毒株，包括：(a)一修飾流感聚合酶蛋白(PB1)，係將NIBRG-14病毒株之PB1蛋白(序列識別號：1)的195處取代為白胺酸；(b)一修飾流感聚合酶蛋白(PB2)，係將NIBRG-14病毒株之PB2蛋白(序列識別號：3)的359處取代為酪胺酸；(c)一修飾流感核蛋白(NP)，係將NIBRG-14病毒株之NP蛋白(序列識別號：5)的255處取代為天冬胺酸，及410和446處取代為苯丙胺酸； (d)一修飾流感間質蛋白(M)，係將NIBRG-14病毒株之M蛋白(序列識別號：7)的236處取代為苯丙胺酸；(e)一修飾流感聚合酶蛋白(PA)，係將NIBRG-14病毒株之PA蛋白(序列識別號：9)的494處取代為組胺酸；以及(f)一修飾流感非結構蛋白(NS)，係將NIBRG-14病毒株之NS蛋白(序列識別號：11)的122處取代為停止密碼。
  13. 根據專利申請範圍第12項的流感病毒株，進一步包括與NIBRG-14病毒株相同之流感血凝素蛋白(HA)之胺基酸序列(序列識別號：13)以及流感神經氨酸酶蛋白(NA)之胺基酸序列(序列識別號：15)。
  14. 根據專利申請範圍第13項的流感病毒株，其基因組成包括下列核苷酸序列：與NIBRG-14病毒株相同之HA基因(序列識別號：14)和NA基因(序列識別號：16)；NIBRG-14病毒株之PB1基因(序列識別號：2)，在583、584和1257處分別取代為胸腺嘧啶，及在1737處取代為腺嘌呤；NIBRG-14病毒株之PB2基因(序列識別號：4)，在1077處取代為腺嘌呤；NIBRG-14病毒株之NP基因(序列識別號：6)，在763處取代為鳥嘌呤，及在921、1229、1337和1413處分別取代為胸腺嘧啶；NIBRG-14病毒株之M基因(序列識別號：8)，在694和706處分別取代為胸腺嘧啶；NIBRG-14病毒株之PA基因(序列識別號：10)，在895、1054和1394處分別取代為三個胞嘧啶；以及NIBRG-14病毒株之NS基因(序列識別號：12)，在365處刪除核苷酸。
  15. 一種流感疫苗，包括根據專利申請範圍第1項的馴化A型流感病毒株和藥劑可接受的載體。
  16. 一種流感疫苗，包括根據專利申請範圍第9項的馴化A型流感病毒株和藥劑可接受的載體。
  17. 一種流感疫苗，包括根據專利申請範圍第12項的馴化A型流感病毒株和藥劑可接受的載體。
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