KR20000048628A - 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 감쇠를 책임지는 3' 게놈프로모터 영역 및 폴리머라제 유전자 돌연변이 - Google Patents

모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 감쇠를 책임지는 3' 게놈프로모터 영역 및 폴리머라제 유전자 돌연변이 Download PDF

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윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그
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Abstract

3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는 모노네가비랄레스 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스가 기재되어 있다. 이러한 바이러스와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이 제형된다. 백신은 모노네가비랄레스 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스를 유도하기 위해서 개인을 면역시키는 데에 사용된다.

Description

모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 감쇠를 책임지는 3' 게놈 프로모터 영역 및 폴리머라제 유전자 돌연변이{3' GENOMIC PROMOTER REGION AND POLYMERASE GENE MUTATIONS RESPONSIBLE FOR ATTENUATION IN VIRUSES OF THE ORDER DESIGNATED MONONEGAVIRALES}
엔벨롭핑 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스는 독특하게 조직되고 발현된다. 네가티브-센스 일본쇄 바이러스의 게놈 RNA는 뉴클레오캡시드의 맥락에서 메신저 RNA (mRNA) 합성을 위한 주형으로서 및 안티게놈 (+) 본쇄 합성을 위한 주형으로서 두 주형 기능을 제공한다. 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스는 그 자신의 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 암호화하고 패키징한다. 일단 바이러스가 감염된 세포에서 피복이 벗겨지면 비로서 메신저 RNA가 합성된다. 바이러스 복제는 mRNA 합성 후 일어나고 바이러스 단백질의 연속적인 합성을 요한다. 새로 합성된 안티게놈 (+) 본쇄는 (-) 본쇄 게놈 RNA의 추가의 카피를 생성하기 위한 주형으로서 제공된다.
폴리머라제 복합체는 게놈의 3' 말단, 특히 프로모터 영역에서 시스-작용 시그널을 작용시킴으로써 전사 및 복제를 가동시키고 달성한다. 바이러스 유전자는 게놈 주형으로부터 3' 말단에서 5' 말단으로 일방향으로 전사된다. 상류 인접 유전자 (예를 들면, 핵단백질 유전자 (N))에 대하여 하류 유전자 (예를 들면, 폴리머라제 유전자 (L))로부터 제조된 더 적은 mRNA가 존재한다. 그러므로, 항상 게놈의 3'말단에 대한 유전자의 위치에 따라서 풍부한 mRNA 구배가 존재한다.
1993년에 바이러스 분류학에 대한 국제 위원회에 의한 개정된 재분류를 기초로 하여, 모노네가비랄레스 (Mononegavirales)로 명명된 목이 확립되었다. 이 목은 음극성 (네가티브-센스)의 일본쇄, 비단편화 RNA 게놈을 갖는 엔벨롭핑 바이러스 3 과를 함유한다. 이들 과는 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae), 라브도비리대 (Rhabdoviridae) 및 필로비리대 (Filoviridae)이다. 파라믹소비리대 과는 또한 파라믹소비리내 (Paramyxovirinae)와 뉴모비리내 (Pneumovirinae)의 두 아과로 세분된다. 파라믹소비리내 아과는 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus), 루불라바이러스 (Rubulavirus) 및 모르빌리바이러스 (Morbillivirus)의 3 속을 포함한다. 뉴모비리내 아과는 뉴모바이러스 (Pneumovirus) 속을 포함한다.
신분류는 형태학적 기준, 바이러스 게놈의 조직, 생물학적 활성 및 단백질의 서열 관계를 기초로 한다. 파라믹소비리내 아과에 대한 엔벨롭핑 바이러스 간의 형태학적 식별 특성은 좌선형 나선 대칭을 지닌 뉴클레오캡시드의 크기 및 형태이다 (직경 18 mm, 길이 1mm, 피치 5.5 nm). 생물학적 기준은 1) 속 멤버간 항원 교차-반응성 및 2) 파라믹소바이러스 속, 루불라바이러스 속에 있어서의 뉴라미니다제 활성의 존재 및 모르빌리바이러스 속에 있어서의 부재이다. 또한, 루불라바이러스에서의 잉여 유전자 (SH)의 존재와 같이 P 유전자의 암호화 포텐셜에 있어서의 변이가 고려된다.
뉴모바이러스는 이들이 협소한 뉴클레오캡시드를 함유하므로 형태학적으로 파라믹소비리내와 구별될 수 있다. 또한, 뉴모바이러스는 단백질-암호화 시스트론 (뉴모바이러스 10 개 대 파라믹소비리내 6 개)의 수에 있어서 주요 차이를 지니고 파라믹소비리내의 부착 단백질과 매우 상이한 부착 단백질을 지닌다. 비록 파라믹소바이러스와 뉴모바이러스가 기능에 있어 상응하는 것으로 보이는 6 개의 단백질 (N, P, M, G/H/HN, F 및 L)을 지니고 있지만, 나중 2 개만이 두 아과 사이 현저한 서열 연관도를 나타낸다. 여러 뉴모바이러스 단백질은 대부분의 파라믹소바이러스에 있어 카운터파트, 즉, 비구조적 단백질 NS1과 NS2, 작은 소수성 단백질 SH 및 제 2 단백질 M2가 결여되어 있다. 일부 파라믹소바이러스 단백질, 즉, C 및 V는 뉴모바이러스에 있어서의 카운터파트가 결여되어 있다. 그러나, 뉴모바이러스와 파라믹소바이러스의 기본적인 게놈 조직은 동일하다. 라브도바이러스와 필로바이러스에서도 이와 같다. 표 1은 각 속의 예와 함께 이들 바이러스의 현재 분류학적 분류를 제시한다.
모노네가비랄레스 목의 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 분류
과 파라믹소비리대
아과 파라믹소비리내
속 파라믹소바이러스
센다이 바이러스 (마우스 파라인플루엔자 바이러스 유형 1)
인간 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 유형 1 및 3
소 파라인플루엔자 바이러스 (BPV) 유형 3
속 루불라바이러스
원숭이 바이러스 5 (SV) (개 파라인플루엔자 바이러스 유형 2)
멈프스 바이러스
뉴캐슬병 바이러스 (NDV) (조류 파라믹소바이러스 1)
인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 2, 4a 및 4b
속 모르빌리바이러스
홍역 바이러스 (MV)
돌고래 모르빌리바이러스
개 디스템퍼 바이러스 (CDV)
페스테-데스-페티츠-반추동물 바이러스
돼지 디스템퍼 바이러스
우역 바이러스
아과 뉴모비리내
속 뉴모바이러스
인간 호흡 신시셜 바이러스 (RSV)
소 호흡 신시셜 바이러스
마우스의 폐렴 바이러스
칠면조 비강기관염 바이러스
과 라브도비리대
속 리싸바이러스
공수병 바이러스
속 베지큘로바이러스
소포성 구내염 바이러스
속 에페메로바이러스
소 일과열 바이러스
과 필로비르대
속 필로바이러스
마르부르크 바이러스
다수의 이들 바이러스에 대해서, 어떤 종류의 백신도 사용할 수 없다. 따라서, 이러한 인간 및 동물 병원체에 대한 백신을 개발하는 것이 필요하다. 이러한 백신은 수용자에서 보호 면역 반응을 도출해야 한다. 이러한 유리한 반응의 정성적 및 정량적 특성은 일반적으로 감염 후 약간의 상당한 기간 동안 동일하거나 매우 관련있는 바이러스에 의한 재감염으로부터 보호되는 천연 바이러스 감염의 생존자에서 나타나는 것들로부터 추정된다.
(1) 정제된 개별 바이러스 단백질 백신 (서브유닛 백신); (2) 불활성화된 전체 바이러스 제제; 및 (3) 감쇠된 생바이러스의 사용을 포함하여 다양한 접근법이 이러한 백신을 개발하고자 고려될 수 있다.
서브유닛 백신은 순수하고 한정가능하며 재조합 DNA 발현 방법을 포함하여 다수의 방법에 의해서 풍부하게 상대적으로 쉽게 생성되는 바람직한 특성을 지닌다. 오늘날까지, B형 간염 표면 항원에서는 주목할만한 예외가 있지만, 바이러스 서브유닛 백신은 일반적으로, 특히 투약을 받은 적이 없는 수용자에 있어서, 단-수명이고/이거나 부적절한 면역성만을 도출할 따름이다.
폴리오 (IPO) 및 A형 간염의 포르말린 불활성화 전체 바이러스 제제가 안전하고 효능이 있는 것으로 입증되었다. 대조적으로, 호흡 신시셜 바이러스 및 홍역 바이러스 백신과 같은 유사하게 불활성화된 전체 바이러스로의 면역은 후속적으로 천연 또는 "야생형" 바이러스와 직면시 백신수용자에게 과대시되거나 이상한 질병의 소지를 만드는 불리한 면역 반응 및/또는 반응 프로필을 도출한다.
Early는 비경구 투여된 포르말린-불활성화 RSV 백신을 사용하여 소아를 예방접종하고자 시도하였다 (1966). 불행하게도, 이러한 백신의 여러 분야 시도가 심각한 역효과 -- RSV로의 후속적인 자연 감염에 따른 이상한 특성을 갖는 심각한 질환의 발생을 나타내었다 [참조문헌 1,2]. 이러한 포르말린화 RSV 항원이 백신수용자에게 RSV 질병 [3,4]의 소지를 만드는 비정상 또는 불균형 면역 반응 프로필을 도출하는 것으로 제시되었다.
이후 감쇠된 RSV 생백신 후보가 저온 계대접종 또는 화학적 돌연변이 유발에 의해서 생성되었다. 이들 RSV 균주는 혈청반응 양성의 성인에 있어서 감소된 병독성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 불행하게도, 이들은 혈청반응 음성의 유아에게 부여시 과잉 또는 과소-감쇠되는 것으로 입증되었고; 일부 경우에, 이들은 또한 유전적 안정성이 부족한 것으로 밝혀졌다 [5,6]. 생바이러스의 비경구 투여를 사용한 다른 예방접종 접근은 무효하고, 이러한 류를 따른 노력은 중단되었다 [7]. 주목할만하게도, 이들 RSV 생백신은 상기의 포르말린-불활성화 RSV 백신으로 관찰된 바와 같이 질병 개선과 결코 관련되지 않는다. 일반적으로, 비록 임상적인 시도가 현재 A2 및 B-1으로 명명된 RSV의 저온-계대접종된 화학적 돌연변이화 균주로 진행중이지만, 인간으로의 투여에 승인된 RSV 백신은 존재하지 않는다.
야생형 바이러스의 적절히 감쇠된 생유도체는 백신 후보로서 뚜렷한 장점을 제공한다. 생복제제로서, 이들은 바이러스 유전자 산물이 백신 접종자의 특정 MHC 클래스 I 및 II 분자의 맥락에서 발현되고 프로세싱되며 제시되는 동안 수용자에서 감염을 개시하여, 체액성 및 세포-매개 면역 반응 및 자연 감염 생존자의 보호 면역 프로필과 유사한 대등한 시토카인 패턴을 도출한다.
이들 유리한 면역 반응 패턴은 불활성화 또는 서브유닛 백신에 의해서 도출된, 전형적으로 대부분 체액성 면역 감독 아암에 국한되는 한계가 정해진 반응과 대조를 이룬다. 또한, 일부 포르말린 불활성화 전체 바이러스 백신, 예를 들면, 1960년대에 개발된 홍역 및 호흡 신시셜 바이러스 백신에 의해서 도출된 면역 반응 프로필은 지속되는 보호를 제공하지 못했고, 백신 수용자가 나중에 야생형 바이러스와 직면시 사실상 이상하고 과대시된, 심지어는 치명적인 질환으로의 경향으로 유도하였다.
감쇠된 생바이러스는 백신 후보로서 매우 바람직한 특성을 지니지만, 이들은 개발하기 어려운 것으로 입증되었다. 난점의 요점은 질병-생성 포텐셜 (즉, 병독성)을 소실했지만, 적당히 풍부하게 수용자를 감염시키고 바람직한 면역 반응 프로필을 도출시키기에 충분한 복제 능력을 보유하는 야생형 바이러스의 유도체를 분리할 필요에 있다.
역사적으로, 병독성과 감쇠간의 이러한 정밀한 균형이 생장 조건 (예를 들면, 온도)을 달리하면서 상이한 숙주 조직 또는 세포를 통한 야생형 바이러스 분리체의 연속 계대접종에 의해서 달성되었다. 이러한 과정이 아마도 일부가 감쇠의 유리한 특성을 갖는 바이러스 변이체 (돌연변이체)의 생장을 부여한다. 종종, 추가의 감쇠가 또한 화학적 돌연변이유발을 통하여 달성된다.
이러한 증식/계대접종 계획은 전형적으로 온도 민감성, 저온-적응 및/또는 이의 숙주 범위가 변경된 -- 이들 중 하나 또는 모두가 야생형 질병-유발 바이러스로부터의 변화이다 -- 바이러스 유도체, 즉, 감쇠와 수반될 수 있는 변화의 출현을 이끈다.
홍역과 멈프스 (파라믹소바이러스)의 예방을 위한 것 및 폴리오 및 루벨라 (포지티브 본쇄 RNA 바이러스)에 대한 예방을 위한 것을 포함하여 여러 생바이러스 백신이 이러한 접근에 의해서 생성되었고 전 세계에 걸쳐서 현재 어린이 면역 양생의 대들보를 제공한다.
그럼에도 불구하고, 감쇠된 생바이러스 백신 후보를 생성하기 위한 이러한 수단은 장황하고 기껏해야 예측불가능하며 대개 바람직한 감쇠 특성을 갖는 게놈 돌연변이체를 무작위로 발생시키는 것들의 선택적 파생물에 의존한다. 생성된 바이러스는 시험관내에서 바람직한 표현형을 지닐 수 있고, 심지어 동물 모델에서 감쇠되는 것으로 보인다. 그러나, 모두 너무 종종 이들은 이들이 백신 후보로서 의도되는 인간 또는 동물 숙주에서 과소- 또는 과잉감쇠를 유지한다.
사용중인 현재의 백신에 대해서도, 더욱 효능있는 백신에 대한 필요가 존재한다. 예를 들면, 현재 홍역 백신은 적합하게 양호한 예방을 제공한다. 그러나, 최근 홍역 유행병은 현 백신의 효능에 있어 결핍을 제시한다. 모체 면역에도 불구하고, 고 비율의 급성 홍역 감염이 1 세 이하의 어린이에서 발생하며, 이는 야생형 홍역 감염에 따라 발생된 것에 필적할 만한 항-홍역 항체 수준을 유도하기 위한 백신의 무능력을 반영한다 [8, 9, 10]. 결과적으로, 백신-면역된 모체는 신생아를 생후 최초 서너 달 이상을 보호하기에 충분한 경태반-유도 수동성 항체를 유아에 제공할 수 없다.
이전에 면역된 청년 및 젊은 성인에 있어 급성 홍역 감염은 추가의 문제를 지적한다. 이러한 2차 백신 실패는 풍부하고 장-수명인 항바이러스 보호를 유도하고 유지시키는 현 백신의 능력에 있어 한계를 표시한다 [11, 12, 13]. 최근에, 또다른 잠재적인 문제가 드러났다. 과거 15 년에 걸쳐서 분리된 야생형 홍역의 헤마글루티닌 단백질은 백신 균주와 거리가 점점 멀어지고 있음을 보여주었다 [14]. 이러한 "항원 연속변이 (drift)"는 백신 균주가 최적 보호를 제공하기 위해서 요구되는 이상적인 항원 레퍼터리를 함유할 수 없다는 이론적인 우려를 일으킨다. 따라서, 개선된 백신이 필요하다.
적당한 백신 디자인은 이들 바이러스의 더 나은 이해에 의해서, 특히, 병독소의 바이러스 암호화 결정자의 동정 및 감쇠를 책임지는 게놈의 변화에 의해서 보조된다.
따라서, 본 발명의 목적은 돌연변이가 바이러스의 감쇠를 유발하는 모노네가비랄레스 목의 RNA 바이러스 게놈의 영역을 동정하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이의 게놈에 이러한 감쇠 돌연변이를 혼입시키는 재조합-생성 바이러스를 생성하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 이러한 감쇠 바이러스를 함유하는 백신을 제형하는 것이다.
하기에 논의된 바와 같은 본 발명의 이들 및 기타 목적은 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는 모노네가비랄레스 목의 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 생성 및 분리에 의해서 달성된다.
홍역 바이러스의 경우에, 3' 게놈 프로모터 영역에서의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 뉴클레오티드 26 (A → T), 뉴클레오티드 42 (A → T 또는 A → C) 및 뉴클레오티드 96 (G → A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는데, 이들 뉴클레오티드 및 본 출원에서 기술된 다른 것들은 (달리 언급되지 않을 경우) 포지티브 본쇄, 안티게놈, 즉, 메시지 (암호화) 센스에 제시되며, RNA 폴리머라제 유전자에 있어서 적어도 하나의 감쇠 돌연변이는 잔기 331 (이소류신 → 트레오닌), 1409 (알라닌 → 트레오닌), 1624 (트레오닌 → 알라닌), 1649 (아르기닌 → 메티오닌), 1717 (아스파틱산 → 알라닌), 1936 (히스티딘 → 티로신), 2074 (글루타민 → 아르기닌) 및 2114 (아르기닌 → 라이신)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 경우에, 3' 게놈 프로모터 영역의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이는 뉴클레오티드 23 (T → C), 뉴클레오티드 24 (C → T), 뉴클레오티드 28 (G → T) 및 뉴클레오티드 45 (T → A)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, RNA 폴리머라제 유전자내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이는 잔기 942 (티로신 → 히스티딘), 992 (류신 → 페닐알라닌), 1292 (류신 → 페닐알라닌) 및 1558 (트레오닌 → 이소류신)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에서 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
인간 호흡 신시셜 바이러스 서브그룹 B의 경우에, 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이는 뉴클레오티드 4 (C → G) 및 뉴클레오티드 6 → 11에서 A'의 신장시 추가 A의 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, RNA 폴리머라제 유전자내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이는 잔기 353 (아르기닌 → 라이신), 451 (라이신 → 아르기닌), 1229 (아스파틱산 → 아스파라긴), 2029 (트레오닌 → 이소류신) 및 2050 (아스파라긴 → 아스파틱산)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에서 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서, 감쇠 바이러스는 야생형 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 도출하는 백신을 제조하기 위해서 사용된다.
본 발명의 다른 양태에서, 완전한 바이러스 뉴클레오티드 서열 (야생형 또는 비-재조합 수단에 의해서 감쇠된 바이러스의 것)을 갖는 분리된, 포지티브 본쇄, 안티게놈 메시지 센스 핵산 분자 (또는 분리된, 네가티브 본쇄 게놈 센스 핵산 분자)가 분리된, 재조합-생성 감쇠 바이러스를 생성하기 위해서 본원에 기재된 하나 이상의 감쇠 돌연변이를 도입함으로써 제조된다. 이어서 이러한 바이러스는 야생형 바이러스에 대한 보호성 면역 반응을 도출하는 백신을 제조하기 위해서 사용된다.
본 발명의 다른 양태에서, 이러한 완전한 야생형 또는 백신 바이러스 뉴클레오티드 서열은 (1) 샘플내 상응하는 바이러스의 존재를 검출하기 위해서 PCR 분석시 사용하기 위한 PCR 프라이머를 고안하기 위해서; 또는 (2) 샘플내 상응하는 바이러스의 존재를 검출하기 위해서 ELISA에 사용하기 위한 펩티드를 고안하고 선택하기 위해서 사용된다.
본 발명은 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 지니고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 지니는 모노네가비랄레스 (Mononegavirales)로 명명된 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 퍼블릭 헬쓰 서비스 (Public Health Service)에 의해서 수여된 승인 하에서 정부 지원으로 달성되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 지닌다.
도 1은 Edmonston 홍역 바이러스의 경과 내역을 도시한다 [15]. 약어는 하기의 의미를 지닌다: HK - 인간 신장; HA - 인간 양막; CE (am) - 병아리 배; CEF - 병아리 배 섬유아세포; DK - 개 신장; WI-38 - 인간 이배체 세포; SK - 양 신장; * - 플라크 클로닝. 각 약어 뒤의 수는 경과의 수를 나타낸다.
도 2는 게놈 및 안티게놈 말단 및 그 주위의 추정의 시스-작용 조절 요소를 예시하는 홍역 바이러스의 지도를 도시한다. 상단 - 3' 말단에서 52 개의 뉴클레오티드의 리더 서열 (1)로 시작하고 5' 말단에서 37 개의 뉴클레오티드의 트레일러 서열 (t)로 끝나는 홍역 바이러스 게놈의 개략도. 유전자 경계가 수직 바에 의해서 표시되고; 아래의 각 유전자는 시스트론 뉴클레오티드의 수이다. 하단 - 2 개의 매우 보존된 도메인 A 및 B의 위치 및 서열을 도시하는 게놈 및 안티게놈의 3' 신장된 게놈 프로모터 영역의 확장된 개략도. 방해하는 유전자간 트리뉴클레오티드가 웰로서 표시된다. A'에서 B' 영역을 포함하는 초기의 5' RNA는 N 단백질 캡시드화가 개시되는 조절 서열을 함유하는 것으로 추정된다.
도 3은 RSV 서브그룹 B 야생형 균주 지정 2B 및 18537 (상단 부분), 이들 균주의 유전자간 서열 (중간 부분) 및 M2와 L 유전자간 68 개의 뉴클레오티드 중복부 (하단 부분)의 유전자 지도를 도시한다. RSV 2B 균주는 18537 균주에 비하여 G 유전자에 6 개 이하의 뉴클레오티드를 갖고 G 단백질에 2 개 이하의 아미노산 잔기를 암호화한다. 2B 균주는 18537 균주내 149 개의 뉴클레오티드에 비하여 5' 트레일러 영역에 145 개의 뉴클레오티드를 갖는다. 2B 균주는 18537 균주에 비하여 NS-1, NS-2 및 N 유전자 각각에 하나 이상의 뉴클레오티드를, M 및 F 유전자 각각에 하나 이하의 뉴클레오티드를 지닌다.
네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스 게놈의 전사 및 복제는 리보핵단백질 코어 (뉴클레오캡시드)에 작용하는 다량체 단백질의 효소 활성을 통하여 달성된다. 네이키드 게놈 RNA는 주형으로서 작용할 수 없다. 대신에, 이들 게놈 서열은 N 단백질에 의해서 뉴클레오캡시드 구조로 완전히 캡시드화될 경우에만 인식된다. 그러한 정황에서만 게놈 및 안티게놈 말단 프로모터 서열이 전사 또는 복제 경로를 개시하기 위해서 인식된다.
모든 파라믹소바이러스는 이들 폴리머라제 경로가 진행되기 위해서 두 바이러스 단백질 L 및 P를 요한다. RSV를 포함하여 뉴모바이러스 또한 전사 경로가 효율적으로 진행되기 위해서는 신장인자 M2를 요한다. 아마도 바이러스-암호화 NS1 및 NS2 단백질과 아마도 숙주-세포 암호화 단백질을 포함하여 추가의 조인자가 또한 소정의 역할을 할 수 있다.
그러나, 상당량의 증거는 이것이 리보뉴클레오티드 중합의 개시와 종결, mRNA 전사체의 캡핑과 폴리아데닐화 및 P 단백질의 메틸화와 아마도 특정한 인산화를 포함하여 전사 및 복제와 연관된 모두는 아니지만 대부분의 효소학적 공정을 수행하는 L 단백질임을 나타낸다. 게놈 전사 및 복제에 있어서 L 단백질의 중요한 역할은 큰 크기, 돌연변이에 대한 민감성 및 전사 활성 바이러스 복합체내 충분한 촉매 수준에 의해서 지지된다 [16].
이러한 고려사항은 L 단백질이 결부된 구조가 개별 기능을 통합하는 도메인의 선형 배열로 이루어져 있다는 제안을 유도한다. 사실상, 네가티브-센스 바이러스 L 단백질내의 3 가지 이러한 한계가 정해진 분리된 요소가 기타의 잘-특성화된 단백질의 규정된 작용성 도메인과의 연관도를 토대로 하여 동정되었다. 이들은 (1) 추정 RNA 주형 기능 인식 및/또는 포스포디에스테르 결합 형성 도메인; (2) RNA 결합 요소; 및 (3) ATP 결합 도메인을 포함한다. 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 L 단백질에 대한 모든 선행 연구는 이러한 추정 기능성 요소를 밝혀내었다 [17].
하기에 의해서 구속됨이 없이, 이러한 비-단백질 암호화, 프로모터 및 기타 시스-작용 게놈 조절 도메인이 홍역 바이러스 (MV) 및 모노네가비랄레스 목의 기타 바이러스에 의한 전사 및 복제가 L-단백질과 연계되어 실현되는 효율의 중요한 결정자이고, 따라서 이들이 또한 이들 바이러스에 대한 병독성 결정 요소일 수 있음을 추정함이 합당하다.
요컨대, 본 발명은 바이러스의 충분한 복제능을 유지하면서 바이러스의 감쇠를 유발하는 시스-작용 조절 시그널 (3'게놈 프로모터 영역)과 폴리머라제 유전자 (L)간 변화의 대등한 세트를 포함하는 것으로 여겨진다. 감쇠는 복제 효능의 바람직한 균형을 제공하는 3' 게놈 프로모터 영역과 폴리머라제 유전자의 합리적 돌연변이에 의해서 최적화되어: 바이러스 백신은 바람직한 면역 반응의 완전한 스펙트럼 및 프로필을 도출하는 충분히 풍부한 유전자 산물을 발현시키고 도출된 면역 반응의 풍족을 최대화하기 위해 충분히 재생하고 산포시키기 위해서 더이상 질병을 생성할 수 없지만, 백신수용자의 세포를 감염시키는 능력을 보유한다.
하기에 의해서 구속됨이 없이, 신장된 프로모터내 (3' 게놈 프로모터 영역) 및 폴리머라제 유전자내 감쇠 돌연변이는 시스-작용 시그널의 표시와 이들 시그널을 사용하는 폴리머라제 복합체의 형태에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 캡시드화될 경우, 프로모터 RNA는 나선 배열로 코일링된다. 프로모터 서열의 변화는 보존된 시그널이 서로에 대하여 표시되는 상대적인 위치에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로 말해서, 홍역 야생형 3' 게놈 프로모터 영역은 위치 26 및 42에 피리미딘 (우라실)을 갖는다 (안티게놈 메시지 센스 서열은 퓨린 아데닌을 갖는다). 백신 균주는 이러한 위치에 퓨린을 갖는다 (안티게놈 메시지 센스 서열은 상응하는 피리미딘을 갖는다; 하기의 실시예 1의 표 3 참조). 더 큰 퓨린은 프로모터의 보존된 도메인 (예를 들면, 홍역 바이러스에서 위치 1 내지 11 및 87 내지 98)간 거리 및/또는 각 표시를 변화시킬 수 있어, 시스-작용 시그널 대 폴리머라제의 변경된 공간 제시가 일어난다.
동물 연구는 질환을 피하기에는 충분하지만 바람직한 면역 반응을 도출시키기에는 적절한 바이러스 복제에 있어서의 감소를 입증한다. 이것은 또한 전사 감소, 바이러스 암호화 단백질의 유전자 발현 감소, 안티센스 주형의 감소, 및 따라서 더 적은 신규 게놈의 생성을 나타낸다. 생성된 감쇠 바이러스는 야생형보다 현저하게 덜 병독성이다.
본원에 기재된 감쇠 돌연변이는 두 방법에 의해서 바이러스 균주로 도입될 수 있다:
(1) 화학 돌연변이원이 첨가되는 세포 배양액내 바이러스 생장 도중 화학 돌연변이 유발, 온도 민감성 및/또는 저온 적응된 돌연변이를 선별하기 위해서 최적 이하 온도에서 계대접종에 투입된 바이러스의 선별, 세포 배양물에 작은 플라크를 생성하는 돌연변이체 바이러스의 동정 및 숙주 범위 돌연변이를 선별하기 위한 이종 숙주를 통한 계대접종과 같은 통상적인 수단. 이어서 이들 바이러스를 동물 모델에서의 생물학적 활성의 감쇠를 위해 스크리닝한다. 감쇠 돌연변이 부위를 위치선정하기 위해서 3' 게놈 프로모터 영역 및 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 서열화에 감쇠 바이러스를 투입한다. 일단 이것이 수행되면, 이어서 방법 (2)를 수행한다.
(2) 감쇠 돌연변이를 도입하는 바람직한 수단은 부위-지향성 돌연변이유발을 사용하여 예정된 돌연변이 제조를 포함한다. 이들 돌연변이는 방법 (1)에 의해서 또는 감쇠 돌연변이가 이미 알려져 있는 밀접하게-연관된 바이러스의 참조에 의해서 동정된다. 하나 이상의 돌연변이가 각각의 3' 게놈 프로모터 영역과 폴리머라제 유전자로 도입된다. 암호화 및 비-코딩 변화의 상이한 조합의 누적 효과가 또한 평가될 수 있다.
3' 게놈 프로모터 영역 및 폴리머라제로의 돌연변이가 표준 재조합 DNA 방법에 의해서 바이러스 게놈의 DNA 카피로 도입된다. 이것은 야생형 또는 변형된 바이러스 게놈 백그라운드 (예를 들면, 방법 (1)에 의해서 변형된 바이러스)일 수 있고, 이로 인해 신규 바이러스가 생성된다. 이들 감쇠 돌연변이를 함유하는 감염성 클론 또는 입자가 센다이 바이러스 [18]; 홍역 바이러스 [19]; 호흡 신시셜 바이러스 [20]; 공수병 [21]; 소포성 구내염 바이러스 (VSV) [15]; 및 우역 바이러스 [23] (이들 참조문헌이 본원에 참조로 인용됨)를 포함하여 다양한 바이러스에 적용된 cDNA "구제" 시스템을 사용하여 생성된다. 홍역 바이러스 구제를 위해서, 미국을 지정하는 공개된 국제 특허 출원 WO 97/06270 [24]; PIV-3 구제를 위해서, 미국 임시 특허 출원 60/047575 [25]; RSV 구제를 위해서, 미국을 지정하는 공개된 국제 특허 출원 WO 97/12032 [24]을 참조한다 (이들 출원은 본원에 참조로 인용됨).
간단하게 말해서, 모든 모노네가비랄레스 구제 시스템이 하기와 같이 요약될 수 있다: 각각은 적합한 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 프로모터 (예를 들면, T7 RNA 폴리머라제 프로모터)와 증식가능한 세균 플라스미드로 삽입되는 자가-분해 리보자임 서열 (예를 들면, 델타형 간염 리보자임) 사이에 배치된 완전한 바이러스 게놈의 클로닝된 DNA 등가물을 요한다. 이러한 전사 벡터는 RNA 폴리머라제 (예를 들면, T7 RNA 폴리머라제)가 정확한 또는 거의 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 바이러스 안티게놈 (또는 게놈)의 일본쇄 RNA 카피를 충실하게 전사시킬 수 있는 쉽게 조작할 수 있는 DNA 주형을 제공한다. 바이러스 게놈 DNA 카피와 플랭킹 프로모터 및 리보자임 서열의 배향이 안티게놈 또는 게놈 RNA 등가물이 전사되는지 여부를 결정한다. 또한 신규 바이러스 자손의 구제를 위해 네이키드, 일본쇄 바이러스 안티게놈 또는 게놈 RNA 전사체를 기능성 뉴클레오티드 주형으로 캡시드화하기 위해서 필요한 바이러스-특이성 트랜스-작용 단백질: 바이러스 뉴클레오티드 (N 또는 NP) 단백질, 폴리머라제-수반 인단백질 (P) 및 폴리머라제 (L) 단백질이 요구된다. 이들 단백질은 전사 및 복제를 달성하기 위해서 이러한 뉴클레오캡시드 주형을 사용해야 하는 활성 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다.
홍역 바이러스 구제를 위해서 요구되는 트랜스-작용 단백질은 캡시드화 단백질 N과 폴리머라제 복합체 단백질 P 및 L이다. PIV-3에 있어서, 캡시드화 단백질이 NP로 표시되고, 폴리머라제 복합체 단백질은 또한 P 및 L로서 언급된다. RSV에 있어서, 바이러스-특이성 트랜스-작용 단백질에는 N, P 및 L 외에도 추가의 단백질 M2, RSV-암호화 전사 신장 인자가 포함된다.
전형적으로, 이러한 바이러스 트랜스-작용 단백질은 비록 일부 또는 모든 요구되는 트랜스-작용 단백질이 적합한 형질전환체로서 이들 바이러스-특이성 유전자 및 유전자 산물을 함유하고 발현하도록 공학처리된 포유동물 세포 내에서 생성될 수 있지만, 요구되는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 플라스미드 발현으로부터 생성된다.
구제를 위한 전형적인 (비록 반드시 그런 것은 아니지만) 환경에는 T7 폴리머라제가 바이러스 게놈 cDNA-함유 전사 벡터로부터 안티게놈 (또는 게놈) 일본쇄 RNA의 전사를 도출하기 위해서 존재하는 적합한 포유동물 세포 환경이 포함된다. 그런 다음 공전사성으로 또는 짧게, 이러한 바이러스 안티게놈 (또는 게놈) RNA 전사체는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해서 기능성 주형으로 캡시드화되고 요구되는 바이러스-특이성 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 공형질감염된 발현 플라스미드로부터 동시에 생성된 요구된 폴리머라제 성분에 의해서 사용된다. 이들 사건 및 과정은 바이러스 mRNA의 필수적 전사, 신규 게놈의 복제 및 증식, 및 이로 인한 신규한 바이러스 자손의 생성, 즉, 구제를 유발한다.
공수병, VSV 및 센다이의 구제를 위해서, T7 폴리머라제가 재조합 우두 바이러스 VTF-3에 의해서 제공된다. 그러나, 이들 시스템은 구제된 바이러스가 물리적 또는 생화학적 수단에 의해서 또는 폭스바이러스에 대해서 양호한 숙주가 아닌 세포 또는 조직내 반복 계대접종에 의해서 우두 바이러스로부터 분리될 것을 요한다. MV cDNA 구제를 위해서, 이러한 요구사항이 T7 폴리머라제 및 바이러스 N 및 P 단백질을 발현시키는 세포주를 생성시킴으로써 회피된다. 구제가 게놈 발현 벡터 및 L 유전자 발현 벡터를 헬퍼 세포주로 형질감염시킴으로써 달성된다. T7 RNA 폴리머라제를 발현시키지만 포유동물 세포에서 복제되지 않는 우두 바이러스 MVA-T7의 숙주-범위 돌연변이체의 장점이 RSV, 우역 바이러스 및 MV를 구제하기 위해서 개발된다. 필수적인 캡시드화 단백질의 동시 발현 후, 합성 전체 길이 안티게놈 바이러스 RNA가 캡시드화되고 복제된 게놈이 감염 바이러스로 패키징된다. 이러한 안티게놈 외에도, 게놈 동족체는 본 발명에 이르러 센다이 및 PIV-3에 대해 성공적으로 구제되었다 [25,27].
따라서, 구제 시스템은 캡시드화, 전사 및 복제에 필수적인 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터 (예를 들면, 홍역 바이러스에 있어서 N, P 및 L; PIV-3에 있어서 P 및 L; RSV에 있어서 N, P, L 및 M2)와 함께 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는 모노네가비랄레스 목의 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 이어서 숙주 세포가 기재된 적어도 두 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된다. 숙주 세포는 감염성 감쇠 바이러스를 생성하기 위해서 이들 벡터의 공-발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다.
이어서 감소된 감염성 바이러스를 먼저 시험관내 수단에 의해서 이의 바람직한 표현형 (온도 민감성, 저온 적응, 플라크 형태, 및 전사 및 복제 감쇠)에 대해서 시험한다. 시스-작용 3' 게놈 프로모터 영역의 돌연변이는 요구되는 트랜스-작용 캡시드화 및 폴리머라제 활성이 야생형 또는 백신 헬퍼 바이러스에 의해서 또는 유전자-특이성 감쇠 돌연변이를 숨겨주는 N, P 및 상이한 L 유전자를 발현시키는 플라스미드에 의해서 제공되는 미니레플리콘 시스템을 사용하여 시험한다 [19, 28].
구제된 바이러스의 감쇠 표현형이 존재할 경우, 도전 시험이 적합한 동물 모델로 수행된다. 비-인간 영장류는 동물 질병의 병인에 대한 바람직한 동물 모델을 제공한다. 이들 영장류는 먼저 감쇠된 재조합-생성된 바이러스로 면역시킨 후 야생형 바이러스로 도전시킨다. 원숭이는 비내, 기관내 또는 피하 경로의 접종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 경로에 의해서 감염된다 [29]. 실험적으로 감염된 붉은털 원숭이 및 사이노몰거스 마카크스 (cynomolgus macaques)가 또한 홍역에 대한 백신-유도 보호의 연구를 위한 동물 모델로서 제공되었다 (30). 보호는 질병 징후 및 증상, 생존, 바이러스 쉐딩 및 항체 역가와 같은 기준에 의해서 측정된다. 원하는 기준이 충족되는 경우, 감쇠된 재조합으로-생성된 바이러스가 인간에게 시험하기 위한 실행가능한 백신 후보로 고려된다. 또한 감쇠 돌연변이를 포함하는 자손 및 후대 바이러스인 "구제된" 바이러스는 "재조합으로-생성되는" 것으로 생각된다.
"구제된 바이러스" 가 백신 용도에 대한 최적 수준에 대해서 과소감쇠되거나 과잉감소되더라도, 이것은 이러한 최적 균주를 개발하는 데에 귀중한 정보이다.
최적으로, 감쇠 점 돌연변이를 함유하는 코돈은 감쇠 점 돌연변이만을 함유하는 코돈에 의해서 암호화된 아미노산을 변화시키지 않으면서 코돈에 제 2 또는 제 2 외에도 제 3 돌연변이를 도입시킴으로써 안정화될 수 있다. 감쇠 및 안정화 돌연변이를 함유하는 감염성 바이러스 클론이 또한 상기의 cDNA "구제" 시스템을 사용하여 생성된다.
홍역 바이러스는 서열 데이터가 질병-유발 야생형 바이러스에 대해서 및 효능의 입증된 역사를 지닌 질병-예방 백신에 대해서 본원에 기재된 바와 같이 이용가능하므로 이러한 발명을 위한 유용한 모델로서 제공된다.
홍역 바이러스는 먼저 David Edmonston이라는 감염 환자로부터 1954에 조직 배양물에서 분리되었다 [31]. 홍역의 이러한 Edmonston 균주는 미국 (AttenuvaxTM; 미국 펜실베니아 웨스트 포인트 Merck Sharp & Dohme)의 현 백신인 Moraten을 포함하는 다수의 감쇠 홍역 생백신에 대한 원대가 되었고 1968 년도에 허가되었고 효능이 있는 것으로 입증되었다.
1960년대 중반 내지 후반에 제기된 적극적인 면역 프로그램은 보고된 홍역 건에 있어서의 1965 년에 약 70,000에서 1983 년에 1500으로의 급강하를 초래한다. 동시에, 기타 백신 균주도 또한 Edmonston 균주 (도 1 참조), Schwarz (프랑스 리용 Institut Merieux), Zagreb (유고슬라비아 자그레브) 및 AIK-C (일본)로부터 개발된다. 이들 기타 백신 또한 효능이 있는 것으로 입증되었고 광범위하게 사용되었다. 초기의 반응원성 유전자 과소감쇠 백신 균주 (RubeovaxTM: Merck Sharp & Dohme)는 어린이에게 홍역과 유사한 질환을 생성시켰고 이에 따라 사용이 중단되었다. 그러나, 이것은 성공적으로 추가로 감쇠되어 Moraten 백신 균주를 생성시킨다 (도 1 참조) [32]. 홍역 바이러스 생백신은 효능있는 백신 개발의 성공담을 제공하고 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스 중에서 바이러스 백신 감쇠의 분자적 메커니즘을 이해하기 위한 모델을 제공한다.
인간 이환율 및 사망율의 주요인으로서의 중요성으로 인하여, 홍역 바이러스 (MV)는 매우 광범위하게 연구되었다. MV는 크고 상대적으로 구형이며, 각각 뚜렷한 생물학적 기능을 갖는 두 구획, 지단백질 막 및 리보핵단백질 입자 코어로 이루어진 엔벨로핑 입자이다 [33]. 비리온 엔벨롭은 3 가지 바이러스-특이화 단백질에 의해서 변형된 숙주 세포-유도 원형질 막이고: 헤마글루티닌 (H; 약 80 킬로달톤 (kD) 및 융합 당단백질 (F1,2; 약 60 kD)이 비리온 표면 상에서 돌출하고 숙주 세포 부착 및 바이러스 입자로의 유입 능력을 부여한다 [16]. H 및/또는 F에 대한 항체는 이들이 감염을 개시하는 바이러스의 능력을 중화하므로 보호성인 것으로 여겨진다 [34, 35, 36]. 매트릭스 (M; 약 37 kD) 단백질은 비리온 형태형성을 결집시키고 이에 따라 바이러스 재생을 완성하는 것으로 생각되는 막의 내면을 라이닝하는 양극성 단백질이다 [37]. 비리온 코어는 주형 활성이 약 60 kD 뉴클레오캡시드 (N) 단백질의 약 2600 분자와의 밀접한 연계에 의해서 수여되는 15,894 개 뉴클레오티드 길이의 게놈 RNA를 함유한다 [38, 39, 40]. 폴리머라제 조인자 (P; 약 70 kD)와 다른 바이러스-특이화 및 숙주-암호화 단백질과 제휴하여 MV 게놈 서열을 전사하고 복제하는 바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 (L; 약 240 kD)의 효소 수준이 이러한 약 1 마이크론 길이의 나선 리보핵단백질 입자와 느슨하게 연계되어 있다 [41].
현재까지, 뉴클레오티드 전 서열 (단지 엔드몬스톤 B 실험실 균주 및 AIK-C 백신 균주에 대해서만), 암호화 포텐셜 및 MV 게놈의 조직화가 보고되었다 [33]. 6 개의 비리온 구조 단백질은 하기와 같이 배열되는 인접하는 비-중복 유전자가 배열된다: 3'-N-P-M-F-H-L-5'. 불특정 기능으로서의 두 추가의 MV 유전자 산물은 또한 동정되지 않았다. C (약 20 kD) 및 V (약 45 kD)로서 공지된 이들 두 비구조 단백질이 P 유전자에 의해서 암호화되는데 전자는 P mRNA내 제 2 판독 프레임에 의해서; 후자는 P의 아미노 말단 서열과 신규한 아연 손가락형 시스테인-풍부 카복시 말단 도메인을 갖는 하이브리드 단백질을 암호화하는 공전사성으로 편집된 P-유전자 유도 mRNA에 의해서 암호화된다 [16].
바이러스-특이화 단백질을 암호화하는 서열 외에도, MV 게놈은 연관된 바이러스의 전사 및 복제 경로를 인도하는 것들과 닮은 특유의 비-단백질 암호화 도메인을 함유한다 [16,42]. 이들 조절 시그널은 MV 게놈의 3' 및 5' 말단 및 각각의 시스트론간 경계를 스패닝하는 짧은 내부 영역에 존재한다. 전자는 게놈 전사, 게놈과 안티게놈 캡시드화 및 복제를 지시하는 추정 프로모터 및/또는 조절 서열 요소를 암호화한다. 후자는 시그널 전사 종결 및 각 모노시스트론 바이러스 mRNA의 폴리아데닐화에 이은 다음 유전자의 전사의 재개시를 수행한다. 일반적으로, MV 폴리머라제 복합체는 기타 비-단편화 네가티브 본쇄 RNA 바이러스의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 만큼 이들 시그널에 반응하는 것 같다 [16, 42, 43, 44].
전사는 MV 게놈의 3' 말단에서 또는 주위에서 개시된 다음 모노시스트론 mRNA를 생성하면서 5' 방향으로 진행된다 [40, 42, 45]. 폴리머라제가 MV 게놈 주형을 횡단함에 따라, 이것은 3'에서 5' 순서로 각각의 모노시스트론 RNA가 완료되는 반-보존적 전사 종결/폴리아데닐화 시그널 (N이 4가지 염기 중의 하나일 수 있는 A/G U/C UA A/U NN A4); 비-전사 유전자간 트리뉴클레오티드 구두점 마크 (CUU; CGU인 H:L 경계를 제외하고); 및 다음 유전자의 전사 개시를 위한 반보존 개시 시그널 (N이 4가지 염기 중의 하나일 수 있는 AGG A/G NN C/A A A/G G A/U)인 추정 종결/개시 시그널과 마주친다 [45,46]. 약간의 폴리머라제 복합체가 재개시에 실패하므로, 풍부한 각각의 MV mRNA는 게놈 3' 말단으로부터 암호화 유전자의 거리와 평행하게 감소된다. 이들 mRNA 농도는 상대적인 풍부한 각각의 바이러스-특이화 단백질에 직접 상응한다. 이것은 MV 단백질 발현이 전사 수준에서 최종적으로 조절됨을 나타낸다 [44].
3' 및 5' MV 게놈 말단은 VSV의 영역을 암호화하는 리더 및 트레일러 RNA에 정확히 평행하게 비-단백질 암호화 서열을 함유한다 [42]. 뉴클레오티드 1 내지 55는 게놈 3' 말단과 N 유전자의 개시부 간 영역을 한정하고 동시에 37 개의 추가의 뉴클레오티드는 L 유전자의 말단과 게놈의 5' 말단 사이에서 발견될 수 있다. 그러나, VSV 또는 심지어 파라믹소바이러스 센다이 및 NDV와 달리, MV는 이들 말단 영역을 짧은 비변형 (+) 또는 (-) 센스 리더 RNA로 전사하지 않는다 [47, 48, 49]. 사실상, 전 길이 폴리아데닐화 리더:N, 리더:N:P, 리더:N:P:M 및 물론 전길이 안티게놈 MV RNA를 포함하여 통독 전사체가 전사된다 [48, 49]. 따라서, 짧은 리더 전사체, VSV 일본쇄, 음극성 게놈 [50, 51, 52]의 전사로부터 복제로의 전환을 결정하는 중요한 작동 요소는 MV에 부재하는 것으로 보인다. 이것은 이러한 중대한 재생 사건에 대한 다른 모델의 고려 및 탐구를 유발시킨다 [42].
홍역 바이러스, 및 라브도바이러스를 제외하고는 모든 다른 모노네가비랄레스는 서열을 암호화하는 리더 및 트레일러의 영역을 초월하여 연장된 말단 조절 도메인을 지니는 것으로 보인다 [42]. 홍역 바이러스에 있어서, 이들 영역은 107 3' 게놈 뉴클레오티드 (리더 영역에 이어서 3 개의 유전자간 뉴클레오티드를 암호화하는 52 개의 뉴클레오티드 및 N mRNA의 5' 비해독 영역을 암호화하는 52 개의 뉴클레오티드를 포함하는 "연장된 프로모터"라고도 언급되는 "3 게놈 프로모터 영역") 및 109 5' 말단 뉴클레오티드 (L mRNA의 3' 비해독 영역을 암호화하는 69, 유전자간 트리뉴클레오티드 및 트레일러를 암호화하는 37 개의 뉴클레오티드)를 포함한다. 게놈 및 안티게놈의 이들 3' 말단 약 100 뉴클레오티드 내에 두 짧은 영역의 공유된 뉴클레오티드 서열이 존재한다: 게놈 및 안티게놈의 절대 3' 말단의 16개 뉴클레오티드 중의 4 개가 동일하다. 이들 말단의 내부에 절대적인 서열 동질성의 12 개 뉴클레오티드의 추가 영역이 배치되었다. MV 게놈의 전사가 개시되고 안티게놈의 복제가 개시되어야 하는 부위 및 그 주위에서 이들의 위치는 이러한 짧은 특유한 서열 도메인이 연장된 프로모터 영역을 포함함을 제시한다.
이들 분리된 서열 요소는 다른 부위의 전사 개시를 명령할 수 있다 -- N 유전자 개시 부위를 명령하는 내부 도메인 및 안티게놈 생성을 인도하는 3' 말단 도메인 [42, 48, 53]. 전사 및 복제의 시스-작용 결정자로서의 조절 역할 외에도, 이들 3' 연장된 게놈 및 안티게놈 프로모터 영역은 각각 안티게놈 및 게놈 RNA의 초기 5' 말단을 암호화한다. 이들 초기 RNA 잔기 내에 N 단백질 핵형성을 위한 미확인 시그널이 존재하므로, 다른 주요 조절 요소는 뉴클레오캡시드 주형 형성 및 이어서 전사 및 복제의 증폭을 요한다. 도 2는 이들 고도로 보존된, 추정 시스-작용 조절 도메인의 위치 및 서열을 개략적으로 예시한다.
비록 절대 말단 뉴클레오티드 8 내지 11 개만이 MV에 의해서 공유되지만, 위치, 크기 및 스페이싱에 있어 유사한 말단 비-단백질 암호화 영역이 파라믹소비리대 속의 기타 멤버의 게놈에 존재한다 [42, 54]. 모르빌리바이러스 개 디스템퍼 바이러스 (CDV)의 게놈 말단은 MV 친척과 더욱 고도의 상동성을 나타낸다: 절대 3' 말단의 18 개 중에서 16 개와 5' 말단 18 개 중에서 17 개를 포함하여 이들 두 바이러스의 리더 및 트레일러 서열의 73 %가 동일하다 [55]. MV 신장된 프로모터의 것에의 부속 내부 CDV 게놈 도메인-공유 상동성은 발견되지 않았다. 그러나, 20 개의 뉴클레오티드 중의 15 개가 상보적인 CDV 게놈 뉴클레오티드 85와 104간 및 15,587과 15,606 간에 존재하는 20 개의 뉴클레오티드 길이 스트렛치가 있다 (Gene Bank 수탁 번호 AF 14953). 이것은 CDV가 MV와 같이 중요한 시스-작용 프로모터 및/또는 조절 시그널을 제공할 수 있는 비-암호화 3' 게놈 및 안티게놈 말단 내에 추가의 영역을 함유함을 나타낸다 [55].
또한, 3' 리더 영역 (55 개의 뉴클레오티드)의 정확한 길이는 파라믹소비리대 과의 여러 멤버들 (MV, CDV, PIV-3, BPV-3, SV 및 NDV) 사이에서 동일하다. 이러한 신장된, 비-단백질 암호화 영역의 중요성의 추가의 증거는 아급성의 경화 파넨세팔리티스 (SSPE) 뇌 조직으로부터 최근에 클로닝된 대다수의 뚜렷한 카피-백 결함성 방해 바이러스 (DI)의 분석으로부터 유래한다. 95 5' 말단 게놈 뉴클레오티드보다 더 짧은 스템을 갖는 DI는 발견되지 않는다. 이것은 MV DI RNA 복제 및 캡시드화에 필요한 최소 시그널이 추가의 내부 추정 조절 도메인을 포함하기 위해서 37 개 뉴클레오티드 길이의 트레일러 서열 이상으로 잘 신장됨을 나타낸다 [56].
홍역 바이러스에 의해서 부분적으로 예시된 바와 같이, 본 발명은 중요한 병독성/감쇠 결정자가 바이러스 게놈 비-단백질 암호화 조절 영역내 및 시스-작용 요소가 상호작용해야 하는 트랜스작용 전사/복제 효소 복합체내에 존재한다는 개념으로 인도된다. 시스-작용 도메인은 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 6 개의 인접하는 유전자를 플랭킹하는 MV 게놈의 3' 및 5' 말단에서; MV 게놈 내에서 내부 유전자간 영역을 포함하는 짧은 영역으로서 발견된다. 전자는 게놈 전사, 게놈 및 안티게놈 캡시드화 및 복제의 중대한 과정을 인도하는 추정 프로모터 및/또는 조절 서열 요소를 암호화한다. 후자는 시그널 전사 말단 및 각 모노시스트론 바이러스 mRNA의 폴리아데닐화와 이어서 다음 유전자의 전사 재개시를 수행한다. 전사/복제 효소인 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 분자는 전사 및/또는 복제 효능을 조절하고 이로 인해 풍부한 바이러스 유전자 산물 및/또는 비리온 자손을 결정할 수 있다.
홍역 바이러스에 대한 본 발명의 개념의 증거는 원대 Edmonston 야생형 MV 분리체의 L-유전자의 비-암호화 조절 영역 (3' 게놈 프로모터 영역) 및 암호화 영역 (예상된 아미노산 서열)의 뉴클레오티드 서열을 먼저 이 분리체로부터 유도된 이용가능한 홍역 백신 균주로 측정함으로서 수득된다 (도 1 참조). 독립적 기타 야생형 분리체가 또한 비교 목적으로 조사된다.
4 가지의 야생형 및 5 가지의 백신 홍역 균주의 뉴클레오티드 서열 (포지티브 본쇄, 안티게놈 메시지 센스에서) 및 이들 홍역 바이러스의 RNA 폴리머라제 (L 단백질)의 추론된 아미노산 서열이 본원에 포함된 적합한 서열번호에 대한 참조와 함께 하기에 기재되어 있다.
바이러스 뉴클레오티드 서열 L. 단백질 서열
야생형
Edmonston 서열번호 1 서열번호 2
1977 서열번호 3 서열번호 4
1983 서열번호 5 서열번호 6
Montefiore 서열번호 7 서열번호 8
백신
RubeovaxTM 서열번호 9 서열번호 10
Moraten 서열번호 11 서열번호 12
Zagreb 서열번호 13 서열번호 14
AIK-C 서열번호 15 서열번호 16
상기에 수록된 각각의 홍역 바이러스 게놈은 15,894 뉴클레오티드 길이이다. L 유전자의 해독은 뉴클레오티드 9234 내지 9236에서 개시하고; 해독 종결 코돈은 뉴클레오티드 15783 내지 15785이다. 해독된 L 단백질은 2,183 아미노산 길이이다.
1983 야생형 홍역 바이러스의 뉴클레오티드 2499가 서열번호 5의 "G"로서 표시됨을 주지한다. 사실상, 염기는 사실 "G"와 "C"의 혼합물이다. 또한 RubeovaxTM백신 바이러스는 서열번호 9의 "T"로서 표시된다. 9 개의 클론화된 서열에서, 이 염기는 "T"가 7, "C"가 2이고; 따라서 이 염기는 "T" 또는 "C"일 수 있다.
또한, Schwarz 백신 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 4917과 4924에서 Schwarz가 "T" 대신에 "C"를 갖는 것을 제외하고는 Moraten 백신 바이러스 게놈 (서열번호 11)의 것과 동일하다.
이어서, Edmonston 야생형 분리체, 백신 균주 및 기타 독립적으로 분리된 야생형 바이러스의 3' 게놈 프로모터 영역과 뉴클레오티드를 구별하는 뉴클레오티드 차이 및 L 유전자와 L 단백질 서열을 구별하는 아미노산 차이가 비교되고 정렬되어 있다 (하기 실시에 1의 표 3 내지 5 참조).
표 3에 예시된 바와 같이, 원대 야생형 MV 분리체와 유도체 백신 균주의 3' 게놈 프로모터 영역 (안티게놈, 메시지 게놈에서)으로부터 3 개의 돌연변이가 존재한다: 뉴클레오티드 위치 26에서, "A"로부터 "T"까지; 위치 42에서, "A"로부터 "C"까지 또는 "A"로부터 "T"까지; Zagreb의 경우에만 위치 96에서, "G"로부터 "A"까지. 또한, 다른 조사된 야생형 분리체는 "G" 대신에 "A"를 지님으로써 위치 50에서 원대 야생형 분리체 및 백신과 다르다.
홍역 백신 균주 (RubeovaxTM, Moraten, Schwarz, AIK-C 및 Zagreb)의 L 유전자의 예상된 아미노산 서열 및 야생형 분리체는 2183 아미노산 길이 개방 판독 프레임에서 원대 균주 (Edmonston)와 다르다 (하기 실시예 1의 표 4 및 5 참조).
이들 아미노산 차이는 4가지 범주로 세분될 수 있다:
(1) 한 백신 균주가 원대, 기타 백신 및 야생형 균주와 다른, 잠재적 감쇠 부위를 제시하는 위치.
(2) 또한 중요한 감쇠 부위를 구성할 수 있는 모든 야생형 및 모든 백신 서열 간의 특이한 차이.
(3) 연대상 더욱 새로운 야생형이 더 오래된 야생형과 다른, 유전적 연속변이로 감쇠될 수 있는 위치.
(4) 하나 이상의 백신 균주 및/또는 야생형 균주가 통상적인 아미노산을 갖고 모든 기타 균주와 다른 위치 (이러한 변화는 각각 백신 균주내 혈통-특이적, 잠재적 감쇠성 변화 및 야생형 분리체간 연관도를 나타낼 수 있다).
한 백신이 다른 백신 및 야생형 균주와 다른 (1) 4 범주의 변화가 있다. 이들 중 둘이 Moraten과 Schwarz (아미노산 331과 2114)에 있고 둘이 AIK-C (1624 및 2074)에 있다. 이들 돌연변이는 이들 바이러스 모두가 양호한 백신이므로 특별히 해당된다. 따라서, 이들 위치는 감쇠를 위한 위치이다.
하나의 위치 1717 만이 모든 야생형이 아스파틱산을 갖고 모든 백신이 알라닌을 갖는 범주에 일치한다. 흥미롭게도, 이 위치는 홍역 및 개 디스템퍼 바이러스 (매우 상동성)의 L 유전자가 예외적인 보존을 나타내지 않는 두 영역 중에 하나에 존재한다. 이 차이는 1717이 홍역내 감쇠 돌연변이를 위한 중요한 위치라는 점을 좀더 그럴듯하게 한다.
연대상 더 새로운 야생형 (1983 및 Montefiore)은 더 오래된 야생형 (Edmonston 및 1977)과 다르고, 따라서 범주 (3)에 일치되는 5 위치 149, 636, 720, 2017 및 2119이 존재한다. 이러한 차이는 감쇠 돌연변이 부위를 표시하기 보다는 유전적 연속변이를 제시한다. 이를 통틀어 Montefiore (1989 분리체)가 나머지와 다른 16 위치가 포함되지 않는다 (표 5 참조). 이들은 유전적 연속변이 (범주 (3))이거나 임의 변화 (범주 (4))일 수 있다. 나머지 23 위치는 하나 이상의 바이러스가 컨센서스와 다른 범주 (4)이다.
이들 위치 중의 셋 (1409, 1649, 1936)이 잠재적으로 감쇠 범주 (4) 돌연변이이다. 이들은 두 백신 균주가 원대 야생형과 다른 변화를 지니는 변화이다. 이들 변화는 RubeovaxTM및 Moraten 백신으로 이끌어내는 백신 혈통과 연관될 수 있다 (도 1).
본 출원인은 AIK-C 백신 균주 뉴클레오티드 서열이 하나의 삽입과 하나의 결실을 포함하여 21 위치에서 공표된 서열과 다르다 [33]는 것을 밝혀 내었다. 여러 이러한 차이는 L 유전자에서 둘 (아미노산 1477 및 2088)을 포함하여 암호화 변화를 초래한다.
따라서, 홍역 원대 균주로서 L 유전자 서열내에서 발생된 추가 변화는 생백신에 대해서 최적화된 복제 능력을 달성하기 위해서 점진적으로 감쇠되고, 목적은 강요되고 제한되는 것으로 보인다. 아마도, L 유전자 수 및 위치에 있어서 이러한 제한된 내성은 폴리머라제의 다기능성 능력을 보존할 필요에 의해서 및 전개되는 L 단백질이 전사 및 복제를 달성하기 위해서 상호작용해야 하는 예비존재 3' 프로모터 변화에 의해서 부과된다. 다시 말해서, 최적 바이러스 감쇠는 폴리머라제 단백질 및 이것이 작동시 시스-작용 조절 요소의 대등한 (예를 들면, 결합된) 변화를 요한다.
3' 리더는 뉴클레오티드 위치 26 (항상 "A"로부터 "T"로의 변화) 및 위치 42 ("A"로부터 "C"로 또는 "A"로부터 "T"로의 변화)에서 (안티게놈 메시지 센스에서) 감쇠 과정 동안 고도로 선택된 변화를 허용하는 변화에 대한 최소한의 내성을 나타낸다. Zagreb의 경우에만, Zagreb L 유전자-특이성 변화에 조합시 중요할 수 있는 위치 96에서 "G"로부터 "A"로의 단일의 추가 변화가 존재한다. 3'-리더 영역은 위치 50에서 "G"의 "A"로의 변화와 함께 1954 이래로 유전적 연속변이의 한 예를 수행하는 것으로 보인다 (표 3 참조).
감쇠 과정 동안 3' 게놈 프로모터 영역에서의 네트 변화는 모든 MV 백신 균주내 게놈 센스에 있어서 두 퓨린에 의한 두 피리미딘의 치환이다. 이 감쇠 과정 동안 L 유전자의 공-전개는 상이한 숙주 세포내 바이러스의 재생을 선호하는 민감한 변화의 선택을 반영하는 것으로 여겨진다. 모든 백신 균주는 병아리 배 (CE) 또는 병아리 배 섬유아세포 (CEF)에서 감쇠 과정 동안 생장된다 (도 1). 또한, 일부 백신 균주는 고유의 숙주 세포에 노출되고; 즉, Zagreb 백신은 개 신장 세포와 인간 이배체 세포에서 생장되고, 반면에 AIK-C 백신은 양 신장 세포에 적응된다. Moraten 및 RubeovaxTM은 오로지 CE와 CEF에서 생성된다.
일부 혈통-특이적 L 유전자 변화 (RubeovaxTM, Moraten 및 Schwarz 백신의 위치 1649 및 모든 백신의 위치 1717에서의 변화)는 백신 감쇠를 위한 전사/복제를 조정하기 위해서 L 유전자의 3'-리더로의 적응의 서브셋을 나타낸다. 또한, 개별 백신-특이적 변화 (범주 (1))는 각 백신 균주에 대해서 추가의 미세한 상태 조정을 제공할 수 있다.
표 3 및 전술된 기재를 기초로 하여, MV 3' 게놈 프로모터 영역에 대한 주요 감쇠 돌연변이는 뉴클레오티드 26 (A→T), 뉴클레오티드 42 (A→T 또는 A→C) 및 뉴클레오티드 96 (G→A)이다 (안티게놈, 메시지 센스).
표 4 및 전술된 기재를 기초로 하여, L 단백질에 대한 주요 감쇠 부위는 하기와 같다: 아미노산 잔기 331 (이소류신 → 트레오닌), 1409 (알라닌 → 트레오닌), 1624 (트레오닌 → 알라닌), 1649 (아르기닌 → 메티오닌), 1717 (아스파틱산 → 알라닌), 1936 (히스티딘 → 티로신), 2074 (글루타민 → 아르기닌) 및 2114 (아르기닌 → 라이신). 이들 아미노산 변화를 책임지는 뉴클레오티드 변화는 하기 실시예 1의 표 4에 기재된 것들에 제한되지 않는 것으로 이해된다: 이들 아미노산으로 해독되는 코돈을 유발하는 뉴클레오티드에 있어서 모든 변화가 본 발명의 범주에 포함된다.
인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 (HPIV-3)은 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 엔벨롭핑 RNA 바이러스이다. HPIV-3은 파라믹소비리대 과에 속한다 (표 1 참조). HIPV-3의 게놈은 15,462 뉴클레오티드 길이이고 6 개의 비-중복 단백질-암호화 유전자를 암호화한다 [57]. 5 개의 유전자는 각각 지정된 NP (MV의 N 단백질에 상응), M, F, HN (헤마글루티닌-뉴라미니다제) 및 L인 단일 비리온 구조 단백질을 암호화한다. 6번째 mRNA는 P 단백질을 암호화하고, 중복된 5' 인접 개방 판독 프레임 (ORF)에 의해서 C 단백질을 암호화하며, RNA 편집 메커니즘에 의해서 또한 D 단백질을 암호화한다.
MV와 같이, HPIV-3은 55 뉴클레오티드의 3'-비단백질 암호화 리더 영역으로 이루어지지만, 홍역 (37 뉴클레오티드)과는 달리, 44 뉴클레오티드 길이 5'-트레일러 영역을 지닌다. 폴리머라제는 RNA 주형내 전사 시그널에 의해서 인도되는 선형, 연속적, 개시-종결 방식으로 게놈을 전사한다.
야생형 바이러스 JS 균주를 최적 이하의 온도에서 세포 배양액을 통하여 계대접종시킴으로써 감쇠 HPIV-3 생백신을 개발하고자 하는 시도가 전망있는 결과를 생성하였다 [7, 57]. 여러 "저온 계대접종" (cP) 돌연변이체는 평가를 위해 JS 균주의 상이한 계대접종 수준으로부터 분리된다. 하나의 이러한 돌연변이체가 45 연속 계대접종으로부터 생성되고 cp45로 표시된다.
이러한 바이러스는 3가지 흥미로운 성질을 나타낸다: (1) 저온 적응 (ca): 20 ℃의 최적 이하 온도에서 효율적으로 복제하는 능력; (2) 온도 민감성 (ts): 시험관내 39 ℃ 이상의 온도에서 복제에 대한 무능력; 및 (3) 작은 플라크 형태. 이러한 돌연변이체는 (a) 이의 ca, ts 및 작은 플라크 형태가 세포 배양액내 계대접종 후 안정하고; (b) 이의 복제는 햄스터의 상부 및 하부 호흡기에 제한되며; (c) 야생형 HPIV-3으로의 후속 도전에 대해서 햄스터내 현저한 보호를 유도하므로 전망있는 백신 후보인 것으로 보인다 [58, 59].
붉은털 원숭이내 이 균주의 평가는 cp45의 감쇠 돌연변이가 ts 및 비-ts 돌연변이의 조합임을 예시한다 [60]. 침팬지에 있어서의 후속 평가는 cp45가 만족스럽게 감쇠되는 것으로 보이고 동시에 야생형 바이러스 도전에 대해서 높은 수준의 보호를 유도할 수 있음을 나타낸다. 나중에 혈청음성 유아 및 소아에 있어 cp45의 예비 임상 평가는 이러한 후보 백신 균주가 적합하게 감염성이고 감쇠성이며 적절히 면역원성임을 제시한다 [61].
cp 45 균주는 태 붉은털 원숭이 폐 (FRhL) 및 Vero 세포에 있어서 하기와 같이 생장되었다: FRhL 세포에서 생장된 PIV-3 cp45 바이러스가 융합성 FRhL 세포 단층을 MOI 0.1 내지 1.0에서 조직 배양 플라스크에 접종시킴으로써 제조된다. 감염된 세포 배양액을 EMEM 배지로 공급하고 32 ℃에서 접종시킨다. 약 7 일 후, 최대 세포병원성 효과 (synctyia)가 관찰될 때, 배양액을 1 회의 동결-해동 사이클에투입하고 유체를 수집한 후 바이러스를 -70 ℃에 저장함으로써 바이러스가 생성된다.
Vero 세포에서 생장된 PIV-3 cp45 바이러스는 바이러스와 함께 동시에 교반된 마이크로캐리어 상에서 Vero 세포의 융합성 단층의 생체반응기 배양액을 접종시킴으로써 제조된다. 바이러스는 신시셜 CPE가 관찰된 4 내지 5 일 후 수득된다. 바이러스를 함유하는 배양액 유체를 -70 ℃에서 저장한다.
HPIV-3 JS 야생형 균주 [89]와 FRhL 및 Vero 세포에서 생장된 cp45 백신 균주, 및 이들 HPIV-3 바이러스의 RNA 폴리머라제 (L 단백질)의 추론된 아미노산의 뉴클레오티드 서열 (포지티브 본쇄, 안티게놈 메시지 센스에서)이 본원에 포함된 적합한 서열번호에 대하여 하기와 같이 기재된다:
바이러스 뉴클레오티드 서열 L 단백질 서열
야생형
JS 서열번호 17 서열번호 18
백신
FRhL cp45 서열번호 19 서열번호 20
Vero cp45 서열번호 21 서열번호 22
상기에 수록된 각각의 PIV-3 바이러스 게놈은 15,462 뉴클레오티드 길이이다. L 유전자의 해독은 뉴클레오티드 8646 내지 8648의 코돈에서 개시하고; 해독 종결 코돈은 뉴클레오티드 15345 내지 15347이다. 해독된 L 단백질은 2,233 아미노산 길이이다.
본원의 하기에서 실시예 2 및 표 6에 기재된 바와 같이, 야생형 JS 균주와 FRhL-생장 cp 45 돌연변이체 백신 균주간 차이를 기초로 하여, HPIV-3 3' 게놈 프로모터 영역에 대한 주요 감쇠 돌연변이는 뉴클레오티드 23 (T→C), 뉴클레오티드 24 (C→T ), 뉴클레오티드 28 (G→T) 및 뉴클레오티드 45 (T→A) (안티게놈 메시지 센스)이다. 본원의 하기에서 실시예 2 및 표 6에 기재된 바와 같이, HPIV-3의 L 단백질에 대한 주요 감쇠 부위는 하기를 포함한다: 아미노산 잔기 (티로신→히스티딘), 992 (류신→페닐알라닌) 및 1558 (트레오닌→이소류신).
또한, Vero-생장 cp45 돌연변이체 백신 균주는 L 유전자 암호화 변화로부터 아미노산 잔기 1292 (류신 → 페닐알라닌)에 생성된 추가의 돌연변이를 함유한다.
이러한 아미노산 변화를 책임지는 뉴클레오티드 변화는 하기의 실시예 2에 기재된 것에 제한되지 않는 것으로 이해되고; 이들 아미노산으로 해독되는 코돈을 생성하는 뉴클레오티드에 있어서의 모든 변화가 본 발명의 범주에 포함된다.
인간 호흡 신시셜 바이러스 (RSV)는 다른 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄엔벨롭핑 RNA 바이러스이다. RSV는 뉴모비리내 아과와 뉴모바이러스속에 속한다 (표 1 참조).
A 및 B로 표시되는 인간 RSV의 두 주요 서브그룹은 모노클론 항체를 갖는 F 및 G 표면 당단백질의 반응도를 기준으로 동정되었다 [62]. 좀더 최근에, RSV 균주의 A 및 B 혈통이 서열 분석에 의해서 확인되었다 [63,64]. 이 바이러스의 소, 양 및 염소 균주가 또한 동정되었다. 바이러스의 숙주 특이성은 인간 및/또는 소/양 균주 사이에서 매우 분기하는 G 부착 단백질과 가장 명확히 연계되어 있고, 적어도 부분적으로 수용체 결합에 의해서 영향받을 수 있다.
RSV는 유아 및 영아의 심각한 바이러스 폐렴 및 기관지염의 주원인이다. 심각한 질환, 예를 들면, 하부 호흡기 질환 (LRD)은 대부분 6 개월 이하의 유아에게 만연된다. 이것은 대부분 보통 비면역 유아의 RSV로의 최초 노출에서 발생된다. RSV는 또한 천식 및 고반응성 기도와 연계되어 있고 기관지폐 형성장애 및 선천적 심장 질병 (CHD)을 앓는 "고 위험" 어린이 치사의 중요한 요인이다. 이것은 또한 어린이의 중이염의 소인이 되는 통상의 바이러스 호흡기 감염 중의 하나이다. 성인에 있어서, RSV는 일반적으로 복잡하지 않은 상부 호흡기 질환으로서 제시되고; 그러나, 노령자에게서 이것은 심각한 LRD, 특히 세균 기관지염 및 폐렴의 발생에 소인이 되는 인자로서 인플루엔자와 경쟁한다. 질병은 심하게 면역타협되는 것을 제외하고는 항상 다른 기관으로의 분포가 일어날 수 있는 호흡기에 한정된다. 바이러스는 바이러스-함유 호흡 분비물로 오염된 매개물에 의해서 다른 것으로 분산되고, 감염은 코, 구강 또는 결막 점액을 통하여 개시된다.
RSV 질병은 계절성이고 바이러스는 보통 남부 지방에서 11 월부터 4 월 까지 겨울철에만 분리된다. 바이러스는 편재성이고 어린이의 90 % 이상이 2 세까지 적어도 1 회 감염되었다. 다수의 균주가 함께 순환한다. 항원 연속변이의 직접적 증거 (인플루엔자 A 바이러스와 함께 보여지는 것)는 없지만, G 단백질 및 SH 단백질의 고 가변 영역내 아미노산 변화의 축적을 설명하는 서열 연구는 면역 압력이 바이러스 진화를 추진할 수 있음을 제안한다.
마우스 및 코튼 래트 모델에서, RSV의 R 및 G 단백질 모두 중화 항체를 도출하고 이들 단백질 만으로의 면역이 재감염에 대한 장기 보호를 제공한다 [67, 68].
인간에서, RSV로의 완전한 면역성이 전개되지 않고 재감염이 전 생명에 걸쳐서 발생하며 [69,70]; 그러나, 면역 인자가 심각한 질병에 대해서 보호할 것이라는 증거가 존재한다. 질병의 심각성에 있어서의 감소는 둘 이상의 선행 감염과 연계되어 있고, 두 주요 RSV 서브그룹 중의 하나로 감염된 어린이가 다소 상동성 아그룹으로의 재감염에 대해서 보호될 수 있으며 [71], 감쇠 바이러스 생백신이 심각한 이환율 및 치사율을 억제하기에 충분한 보호를 제공할 수 있다는 증거가 존재한다. RSV로의 감염은 항체와 세포 매개 면역성을 도출한다. F 및 G 단백질로의 혈청 중화 항체는 비록 상부 호흡기 질환 (URD)에 있어서의 감소가 설명되지 않았지만, 일부 연구에서 LRD로부터의 보호와 연계되어 있었다. 유아에 있어서의 높은 수준의 혈청 항체는 LRD에 대한 보호와 연계되어 있고, 높은 RSV 중화 항체 역가로의 정맥내 이뮤노글로불린 투여는 고 위험 어린이의 심각한 질병에 대해서 보호하는 것으로 나타났다 [70, 72, 73]. 국부 면역성의 역할 및 비내 항체가 특히 연구되고 있다.
RSV 비리온은 지단백질 엔벨롭 내에 함유된 리보핵단백질로 이루어진다. 뉴모바이러스의 비리온은 크기 및 형태에 있어서 모든 다른 파라믹소바이러스의 것들과 유사하다. 네가티브 염색과 전자 현미경에 의해서 가시화될 경우, 비리온은 형태 및 범위에 있어서 불규칙하고 150 내지 300 nm의 직경이다 (74). 이 바이러스의 뉴클레오캡시드는 나선 직경이 18 nm라기 보다는 12 내지 15 nm임을 제외하고는 기타 파라믹소바이러스의 것과 유사한 대칭 나선이다. 엔벨롭은 숙주 막으로부터 유도된 지질 이중층으로 이루어지고 바이러스 암호화된 트랜스막 표면 당단백질을 포함한다. 바이러스 당단백질은 부착을 매개하고 침투는 비리온 스파이크와 개별적으로 조직화된다. 파라믹소바이러스 아과의 모든 멤버는 혈구응집 활성을 지니지만, 이 기능은 뉴모바이러스에 대해 한정된 특성은 아니며, RSV에 부재하지만 PVM에 존재한다 [75]. 뉴라미니다제 활성은 파라믹소바이러스, 루불라바이러스 속의 멤버에 존재하고 마우스의 모르빌리바이러스 및 뉴모바이러스에 부재한다 [75].
RSV는 A 및 B로 명명된 두개의 서브그룹을 소유한다. 야생형 RSV(균주 2B) 게놈은 10개의 주요 서브게놈 mRNA로 전사되는 15,218 뉴클레오티드(서열 번호: 23)의 네가티브-센스 RNA의 일본쇄이다. 열개의 각 mRNA는 주요 폴리펩티드 체인을 암호화한다: 세개는 트랜스막 표면 단백질(G, F 및 SH)이고; 세개는 바이러스 뉴클레오캡시드를 형성하기 위해 게놈 RNA를 수반하는 단백질(N, P 및 L)이며; 둘은 감염 세포에 축적되지만 또한 비리온에 소량 존재하여 전사 및 복제를 조절하는 역할을 할 수 있는 비구조 단백질(NS1 및 NS2)이며; 하나는 비글리코실화된 비리온 매트릭스 단백질(M)이며; 나머지는 M2, 최근 RSV-특정 전사 신장 인자로 표현된 또다른 비글리코실화 단백질이다(도 3 참조). 이들 10개의 바이러스 단백질은 거의 모두 바이러스 암호화 능력에 책임이 있다.
바이러스 게놈은 주요 뉴클레오캡시드 단백질(N)로 캡시드화되고, 인단백질(P), 및 큰(L) 폴리머라제 단백질을 수반한다. 이들 세 단백질은 cDNA로 암호화된 RSV 미니게놈의 RNA 복제를 지시하는데 필요하고 충분한 것으로 나타났다[76]. 추가적인 연구는 완전한 프로세싱과 함께 전사를 진행시키기 위해서는, M2 단백질(ORF 1)이 필요함을 나타내고 있다[74]. M2 단백질이 손실되면, 절단 전사체가 우세하고, 완전한 길이의 게놈 구제가 일어나지 않는다[74].
M(매트릭스 단백질)과 M2 단백질은 모두 뉴클레오캡시드 구조에 존재하지 않는 내부 비리온-수반 단백질이다. 기타 비단편화 네가티브-본쇄 RNA 바이러스와 의 유사점으로 인해, M 단백질은 패킹 이전에 전사적으로 불활성인 뉴클레오캡시드를 만들고 바이러스 패키징과 관련된 일을 중재하는 것으로 여겨진다. NS1 및 NS2 단백질은 정제된 비리온에서 매우 소량 검출되고, 동시에 비-구조적인 것으로 간주된다. 이들의 기능은 불확실하지만, 이들은 전사 및 복제의 조정자일 수 있다. 세가지 트랜스막 표면 당단백질이 비리온에 존재한다: G, F 및 SH. G 및 F(융합)는 숙주 세포로 바이러스의 부착 및 침투를 중재하는 것으로 알려진 외피 당단백질이다. 또한, 이들 당단백질은 주요 독립 면역원을 나타낸다[77]. SH 단백질의 기능은 알려져있지 않지만, 최근 보고서는 바이러스의 융합 작용과 관련된 것으로 암시되고 있다[78].
두가지 야생형 RSV 서브그룹 B 균주의 게놈(2B 및 18537)이 현재 완전히 서열화되어있다(하기에 논의된 서열 번호:23 및 25 참조). 게놈 RNA는 캡핑되거나 폴리아데닐화되지 않는다[79]. 비리온 및 세포내 모두에서, 게놈 RNA는 N 단백질과 단단히 결합하고 있다.
게놈 RNA의 3' 말단은 주된 바이러스 프로모터를 함유하는 것으로 여겨지는 44-뉴클레오티드 외부유전자 리더영역으로 구성된다(도 3). 3' 게놈 프로모터 영역에 이어 10개의 바이러스 유전자가 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' 순서로 존재한다(도 3). L 유전자 다음에는 145-149 뉴클레오티드 외부유전자 트레일러 영역이 따른다(도 3 참조). 각 유전자는 보존된 9-뉴클레오티드 유전자 개시 시그널 3'-GGGGCAAAU(3'-GGGACAAAAU인 L 유전자의 10-뉴클레오티드 유전자 개시 시그널 제외, 밑줄 친 것이 상이함)로 시작한다. 각 유전자의 경우, 전사는 시그널의 첫번째 뉴클레오티드에서 시작한다. 각 유전자는 전사 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 반-보존된 12-14 뉴클레오티드 유전자 말단(3'-A G U/G U/A ANNN U/A A3-5)(N은 4개의 염기 중 임의의 하나일 수 있음)으로 종결된다. 처음 9 유전자는 비-중복성이고 RSV B 균주의 경우 크기가 3 내지 56개의 뉴클레오티드 범위인 유전자간 영역에 의해 분리된다(도 3). 유전자간 영역은 보존된 모티프 또는 2차 구조의 분명한 특징을 함유하지 않고 미니레플리콘 시스템에서 사전 및 사후 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 도시되고 있다(도 3). 마지막 두 RSV 유전자는 68개의 뉴클레오티드가 중복된다(도 3). L 유전자의 시작 시그널은 M2 유전자의 뒤라기 보다는, 이 옆에 위치한다. 이 68개 뉴클레오티드 중복 서열은 M2 mRNA의 마지막 68 뉴클레오티드(폴리-A 테일 제외), 및 L mRNA의 최초 68 뉴클레오티드를 암호화한다.
10개의 상이한 서브게놈 폴리아데닐화 mRNA 종 및 다수의 폴리시스트론 폴리아데닐화 해독 전사체는 게놈 전사의 산물이다[74]. UV광 매개 게놈 비활성화를 이용한 전사 지도 연구는 RSV 유전자가 3' 말단 근처의 단일 프로모터로부터 3'에서 5'순서로 전사됨을 보여준다[80]. 따라서, RSV 합성은 모든 모노네가바이러스의 경우에 제안된 단일 유입, 순차적 전사 모델을 따르는 것으로 여겨진다[16,81]. 이 모델에 따르면, 폴리머라제(L)는 3' 게놈 프로모터 영역에서 뉴클레오캡시드 형태의 게놈 RNA와 접촉하고 최초의 뉴클레오티드에서 전사를 개시한다. RSV mRNA는 동일-류의 유전자 카피본으로, 이는 mRNA 편집 또는 스플라이싱의 증거는 아니다.
세포내 RSV mRNA의 서열 분석은 각 전사체의 합성이 유전자 개시 시그널의 최초 뉴클레오티드에서 개시함을 보여준다[74]. mRNA의 5' 말단은 구조 m7G(5')ppp(5')Gp(밑줄친 G는 mRNA의 최초 주형 뉴클레오티드임)로 캡핑되고 mRNA는 이들의 3' 말단에서 폴리아데닐화된다[82]. 이들 두가지 변형은 바이러스 폴리머라제에 의해 공-전사적으로 이루어지는 것으로 생각된다. RSV 3' 게놈 프로모터의 3 영역은 시스 작용 요소로 중요함이 밝혀졌다[83]. 이들 영역은 첫번째 10 뉴클레오티드(프로모터로 작용할 것으로 여겨짐), 뉴클레오티드 21-25, 및 뉴클레오티드 45-53에 위치한 유전자 개시 시그널이다[83]. 홍역, 센다이 및 PIV-3와 같은 기타 파라믹소비리내와는 달리, RSV의 NS1 유전자의 나머지 리더및 비-암호 영역은 삽입, 결실 및 치환에 매우 허용적임이 밝혀졌다[83].
추가로, 3' 게놈 프로모터 영역의 첫번째 12 뉴클레오티드내의 포화 돌연변이 유발(각 염기는 각각의 나머지 3 염기에 의해 독립적으로 치환되고 해독 및 복제 효율을 위해 비교됨)에 의해, 뉴클레오티드 6-10에 위치한 U-구역은 치환에 매우 방해적인 것으로 나타났다[83]. 반면, 최초의 5 뉴클레오티드는 다수의 치환에 비교적 관대하고 위치 4 곳 중 두 곳은 상부-조절 돌연변이로, 이는 RSV-CAT RNA 복제 및 전사를 4 내지 20배 증가시킨다. 비-시스트론 미니레플리콘 시스템을 이용하면, 유전자-출발 및 유전자-말단 모티프가 mRNA 합성에 대한 시그널로 나타나고 자체 함유되고 이웃한 서열의 특성과 대부분 독립적인 것으로 여겨진다[84].
L 유전자 개시 시그널은 M2 유전자-말단 시그널의 상류 68 뉴클레오티드에 놓이고, 이는 유전자의 중복을 야기한다(도 3)[74]. L 유전자 내부의 M2 유전자-말단 시그널의 존재는 L 유전자 전사체의 높은 빈도의 미성숙 종결을 야기한다. 완전한 길이의 L mRNA는 덜 풍부하고 폴리머라제가 M2 유전자-말단 모티프를 인식하지 못할 경우에 만들어진다. 이는 L mRNA의 보다 낮은 전사를 야기한다. 유전자 중복은 일련의 순차적 전사 모델과는 부합하지 않는 것 같다. M2 유전자가 존재하는 폴리머라제가 L 유전자-개시 시그널을 위해 뒤로 점프하는 것인지 L 유전자 전사를 위한 두번째, 내부 프로모터인지 여부에 관해서는 알려져 있지 않다[74]. L 유전자가 M2 유전자-개시 시그널에서 전사를 개시하지 못하고 L 유전자-개시 시그널을 위해 M2 유전자를 아래로 슬라이딩하는 폴리머라제의 소 분획에 의해 접근될 가능성도 존재한다.
각 RSV mRNA의 상대적 풍부성은 프로모터로부터 유전자의 거리에 따라 감소하는데, 이는 가정하건데 순차적인 전사동안 폴리머라제가 이탈되기 때문이다[80]. 유전자 중복은 완전한 길이의 L mRNA의 합성을 감소시키는 2차 메커니즘이다. 또한, 특정 mRNA는 해독의 효율을 감소시키는 특성을 가진다. SH mRNA에 대한 개시 코돈은 서브옵티말 Kozak 서열에 포함되지만, G ORF는 mRNA 중의 제 2 메티오닐 코돈에서 시작한다.
RSV RNA 복제는 소포성 구내염 바이러스 및 센다이 바이러스[16,81]를 이용한 연구에서 제안된 모델을 따르는 것으로 여겨진다[74]. 이는 mRNA 합성의 중단-개시 양식에서 항종결제 해독 양식으로의 전환과 관련된다. 이는 게놈 RNA의 정확한 상보적 카피본인 포지티브 센스 복제-중간체(RI) RNA의 합성을 야기한다. 이는 교대로 자손 게놈의 합성을 위한 주형으로 작용한다. 이 메커니즘은 항종결제 양식으로의 전환이 N 단백질에 의해 미성숙 RNA의 공전사 캡시드화를 수반하는 것으로 제안됨과 관련된다[16,81]. 기타 비단편화 네가티브-본쇄 RNA 바이러스와 같이 RSV에서의 RNA 복제는 앞으로의 단백질 합성에 좌우된다[85]. RI RNA는 표준 및 미니게놈 시스템 모두에 대해 자손 게놈에서보다 세포내에서 10-20배 덜 풍부하다. 각종 야생형, 백신 및 복귀체 RSV 균주의 뉴클레오티드 서열(포지티브 본쇄, 항게놈, 메시지 센스), 및 이들 RSV 바이러스의 RNA 폴리머라제(L 단백질)의 추론된 아미노산 서열에 관해서는 본원에 기재된 적절한 서열 번호를 참고로 하기에서 설명하고 있다:
바이러스 뉴클레오티드 서열 L 단백질 서열
야생형
2B 서열 번호:23 서열 번호:24
18537 서열 번호:25 서열 번호:26
백신
2B33F 서열 번호:27 서열 번호:28
2B20L 서열 번호:29 서열 번호:30
복귀체
2B33F TS(+) 서열 번호:31 서열 번호:32
2B20L TS(+) 서열 번호:33 서열 번호:34
각 RSV 바이러스 게놈은 2,166 아미노산 길이인 L 단백질을 암호화한다. 게놈 길이 및 기타 뉴클레오티드 정보는 하기와 같다:
바이러스 게놈
야생형 길이 L 개시 코돈 L 종결 코돈
2B 15218 8502-8504 15000-15002
18537 15229 8509-8511 15007-15009
백신
2B33F 15219 8503-8505 15001-15003
2B20L 15219 8503-8505 15001-15003
복귀체
2B33F TS(+) 15219 8503-8505 15001-15003
2B20L TS(+) 15219 8503-8505 15001-15003
하기 실시예 3(특히 표 7 및 8)에서 설명하듯이, RSV 서브그룹 B 3' 게놈 프로모터 영역에 대한 중요한 감소 돌연변이는 뉴클레오티드 4(C → G), 및 뉴클레오티드 6-11(항게놈 메시지 센스)에서 A'의 신장시 추가 A의 삽입이다. 또한 하기 실시예 3에서 설명하듯이, RSV의 L 단백질에 대한 중요한 잠재적 감소 부위는 하기와 같다: 아미노산 잔기 353(아르기닌 → 라이신), 451(라이신 → 아르기닌), 1229(아스파틱산 → 아스파라긴), 2029(트레오닌 → 이소류신), 및 2050(아스파라긴 → 아스파틱산). 이들 아미노산의 변화를 책임지는 뉴클레오티드의 변화는 하기 실시예 3에 기술된 것으로 한정되지 않고; 이들 아미노산으로 해독되는 코돈을 생성하는 뉴클레오티드에서의 모든 변화가 본 발명의 범위 내인 것으로 해석된다.
본 발명의 감소된 바이러스는 인간과 동물 숙주를 감염시키는 야생형 바이러스에 비해 상당히 감소된 독성을 나타낸다. 감소 정도는 감염 증상이 대부분의 면역된 개체에서 나타나지 않지만, 바이러스는 백신 처리된 사람에 있어 감염성이고 원하는 면역 반응 프로필을 제거할 정도의 충분한 복제 수용능력을 보유하는 정도이다.
본 발명의 감소된 바이러스를 사용하여 백신을 제형할 수 있다. 이를 위해, 감소된 바이러스는 적절한 농도로 조정되고 적당한 백신 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 제형된다. 생리학적으로 수용 가능한 매질을 담체로 사용할 수 있다. 이들은 적절한 등장성 매질, 포스페이트로 완충된 염수 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적당한 보조제는 MPLTM(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 미국 몬태나 해밀턴의 RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 및 IL-12(미국 매사추세츠 캠브리지의 Genetics Institute)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 감소된 바이러스를 포함한 제형은 백신과 같은 용도로 이용된다. 감소된 바이러스는 저온보호 첨가제 또는 안정제 예를 들면 단백질(예: 알부민, 젤라틴), 당(예: 수크로스, 락토스, 솔비톨), 아미노산(예: 나트륨 글루타메이트), 염수, 또는 기타 보호제와 혼합될 수 있다. 이 혼합물은 액체 상태로 유지되거나, 운반 또는 저장을 위해 건조 또는 동결건조되고 투여 직전에 바로 물과 혼합된다.
본 발명의 감소된 바이러스를 포함하는 제형은 감소된 바이러스의 야생형 대응물의 감염에 대한 보호를 유도하기 위해 인간 또는 동물을 면역시키는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 추가로 상기 본원에서 기술된 바이러스의 감소된 버젼을 혼입하는 유효 면역 양의 백신 제형을 대상물에 투여시켜 모노네가바이러스 목의 RNA 바이러스에 의한 감염에 대해 보호를 유도하도록 대상체를 면역화시키는 방법을 제공한다.
적절한 횟수의 투여량에서 충분한 백신의 양을 대상체에 투여하여 면역 반응을 유도할 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 이러한 양과 투약량을 쉽게 결정할 수 있다. 투여는 기존의 효과적인 형태, 예를 들면 비내, 비경구, 경구, 또는 국부적으로 비내, 경구, 눈, 질 또는 직장 표면과 같은 점막 표면에, 예를 들어 에어로졸 분무에 의해 적용될 수 있다. 바람직한 투여방법은 비내 투여이다.
본 발명의 또다른 양태에서는, 본원에 기재된 야생형 바이러스 또는 백신 바이러스의 완전한 바이러스 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자를 사용하여 올리고뉴클레오티드 탐침(포지티브 본쇄 항게놈 메시지 센스 및 네가티브 본쇄 상보성 게놈 센스)을 생성하고 체액 및 조직 샘플에서 야생형 바이러스 및/또는 백신 균주의 존재를 검출하는데 사용되는 펩티드(단지 포지티브 본쇄 항게놈 메시지 센스로부터)를 발현시킨다. 뉴클레오티드 서열을 사용하여 샘플에서 바이러스의 존재를 검출하기 위해 고도로 특이적이면서 민감한 진단 시험을 고안한다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머는 본원에 기재된 바이러스 야생형 또는 백신 서열에 기초한 서열을 이용하여 합성된다. 시험 샘플은 RNA의 역 전사에 이어, 정해진 바이러스 균주와 구분되는 뉴클레오티드를 가진 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 선택된 cDNA 영역의 PCR 증폭이 행해진다. 증폭된 PCR 산물은 겔로 동정되고 이들의 특이성은 특정 뉴클레오티드 탐침을 이용한 하이브리드화에 의해 확인된다.
ELISA 시험을 사용하여 야생형 또는 백신 바이러스 균주의 항원의 존재를 검출한다. 본원에 기재된 야생형 또는 백신 서열에 기초한 하나 이상의 뚜렷한 잔기를 내포하도록 펩타이드를 고안하고 선택한다. 이들 펩티드는 햅텐(예: 키호울 림펫 헤모사이아닌(KLH))과 결합되고 단일특이성 폴리클론 항체의 생성을 위한 동물(예: 토끼)의 면역에 이용된다. 이들 폴리클론 항체의 선택, 또는 폴리클론 및 모노클론 항체의 조합을 "포착 ELISA"에 이용하여 이들 바이러스에 의해 생성된 항원을 검출할 수 있다.
출원인은 Moraten 홍역 바이러스 백신 균주의 샘플을 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 의해("부다페스트 조약"), 미국 메릴랜드 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 American Type Culture Collection에 기탁하였고 이에 ATCC 기탁 번호 VR2587이 부여되었다. 출원인은 HPIV-3 바이러스 Vero-생장 cp45 백신 균주의 샘플을 부다페스트 조약에 따라, 미국 메릴랜드 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 American Type Culture Collection에 기탁하였고 이에 ATCC 기탁 번호 VR2588이 부여되었다. 출원인은 2B 야생형 RSV 바이러스 샘플을 부다페스트 조약에 따라, 미국 메릴랜드 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 American Type Culture Collection에 기탁하였고 이에 ATCC 기탁 번호 VR2586이 부여되었다.
이들 세가지 기탁 균주 및 본원에 제공된 여러 균주에 대한 서열 정보를 제공받아, 본 출원인은 부위-지향성 돌연변이 유발 및 본원에 기재된 보호 기법을 이용하여 본원에 기술된 모든 균주의 돌연변이를 도입하고(또는 야생형 유전자형을 회복하고), 이들 균주를 취해 하기 표 3,4 및 6-8에 설명된 돌연변이의 패널로부터 추가 돌연변이를 만들 수 있다.
본 발명을 좀더 잘 이해하기 위해, 하기 실시예를 설명하고 있다. 이들 실시예는 단지 설명을 목적으로 하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 말아야 한다.
Sambrook 등이 기술한 프로토콜에 따라 표준 분자 생물학 기법을 이용한다[86].
실시예 1
홍역
AttenuvaxTM백신 바이러스(Lot #0716B)로부터 직접 Moraten MV 백신 바이러스를 1회 생장시키고, Schwarz 백신 바이러스를 1회 생장시키며(Lot 96G04/M179 G41D), 이 동안 Zagreb 및 RubeovaxTM백신 바이러스를 RNA 서열 분석 이전에 Vero 세포에서 각각 2회 생장시킨다. MV 야생형 분리체 Montefiore[56]를 RNA 물질의 추출 이전에 Vero 세포에서 5-6회 계대접종시키고 유사하게는, MV 야생형 분리체 1977, 1988[14]을 분석용 물질의 추출 이전에 5-7회 생장시킨다. Dr.J.Beeler(CBER)로부터 받은 Edmonston 야생형 분리체(도 1 참조)는 이미 수용 직전에 인간 신장 세포에서 7회, Vero 세포에서 3회 계대접종되고 서열 분석에 이용되기 전에 추가로 Vero 세포에서 1회 계대접종된 원래 Edmonston 분리체이다.
0.1 내지 1.0의 감염 중복도(m.o.i.)에서 Vero 세포를 감염시켜 RNA를 제조하고 수거하기 이전에 최대 세포병리에 이르게끔한다. TrizolTM(Gibco-BRL)을 이용하여 홍역 바이러스-감염된 세포의 전 RNA를 추출한다.
3' 및 5' 프로모터 영역을 포함하는 홍역(Edmonston B 균주[19]) 특이성 프라이머 쌍 및 바이러스 게놈의 L 유전자를 이용하여 역 전사효소-PCR(Perkin-Elmer/Cetus) 과정에 의해 Vero 세포 계대접종 물질로부터 분리된 총 RNA를 증폭시킨다. 표 2는 이들 프라이머 서열을 나타낸다. 서열 번호:35-54, 74, 77 및 78의 프라이머는 항게놈 메시지 센스에 있다. 서열 번호:55-73, 75, 76 및 79의 프라이머는 게놈 네가티브-센스에 있다.
표 2
PCR용 프라이머 및 MV L 유전자 및 게놈 종결의 서열화
9047CATATCACTCACTCTGGGATGGAG9070(서열 번호:35)
9371TCAGAACATCAAGCACCGCC9390(서열 번호:36)
9741ACAGTCAAGACTGAGATGAG9760(서열 번호: 37)
10001AAGAGTCAGATACATGTGGA10020(서열 번호:38)
10351ACATGAATCAGCCTAAAGTC10370(서열 번호:39)
10674CCGAAAGAGTTCCTGCGTTACGACC10698(서열 번호:40)
11083CAGTCCACACAAGTACCAGG11102(서열 번호:41)
11461GTCAGAAGCTGTGGACCATC11480(서열 번호:42)
11841AATATTGCTACAACAATGGC11860(서열 번호:43)
12196ACTCTTCATTCCTAGACTGG12215(서열 번호:44)
12542GTCCAATTATGACTATGAAC12561(서열 번호:45)
12891AGAACAGACATGAAGCTTGC12910(서열 번호:46)
13232CCAACAAGGAATGCTTCTAG13251(서열 번호:47)
13551ACAGCACTATCTATGATTGACCTGG13575(서열 번호:48)
13930GCAACATGGTTTACACATGC13949(서열 번호:49)
14280AGATTGAGAGTTGATCCAGG14299(서열 번호:50)
14629AGGAGATACTTAAACTAAGC14648(서열 번호:51)
14981TAAGCTTATGCCTTTCAGCG15000(서열 번호:52)
15337TTAACGGACCTAAGCTGTGC15356(서열 번호:53)
15671GAAACAGATTATTATGACGG15690(서열 번호:54)
9290CGGGCTATCTAGGTGAACTTCAGG9267(서열 번호:55)
9500ATTTGGATATGGAATATGAG9481(서열 번호:56)
9840ACTCAACTGAACTACCAGTG9821(서열 번호:57)
10181AAGAACATCATGTATTTCAG10162(서열 번호:58)
10549TTATCAACGCACTGCTCATG10530(서열 번호:59)
10919ATTTTCAGCAATCACTTGGCATGCC10895(서열 번호:60)
11280GCCTCTGTGCAAACAAGCTG11261(서열 번호:61)
11638TCTCTAGTTACTCTAGCAGC11619(서열 번호:62)
12010AGGTCGTTGTTTGTGAGGAG11991(서열 번호:63)
12361TCGTCCTCTTCTTTACTGTC12342(서열 번호:64)
12689CCGTCCTCGAGCTAGCCTCG12670(서열 번호:65)
13052CTCCTCCAGGCTCACATTGG13033(서열 번호:66)
13420GGGTTGGTACATAGCTCTGC13401(서열 번호:67)
13767CACCCATCTGATATTTCCCTGATGG13743(서열 번호:68)
14099TGGTTGACAGTACAAATCTG14080(서열 번호:69)
14460CTGAAATGGGAAGATTGTGC14441(서열 번호:70)
14820AGCAATCTACACTGCCTACC14801(서열 번호:71)
15180TCACAGATGATTCAATTATC15161(서열 번호:72)
15530GATCCTAGATATAAGTTCTC15511(서열 번호:73)
1ACCAAACAAAGTTGGGTAAGG21(서열 번호:74)
GGGGGATCC100ATCCCTAATCCTGCTCTTGTCCC78(서열 번호:75)
200GATTCCTCTGATGGCTCCAC181(서열 번호:76)
15721TAACAGTCAAGGAGACCAAAG1(서열 번호:77)
GGGAAGCTT15801AACCCTAATCCTGCCCTAGGTGG15823(서열 번호:78)
15894ACCAGACAAAGCTGGGAATAGA15873(서열 번호:79)
완전한 바이러스 게놈 중 중복되는 PCR 단편을 두 본쇄 모두를 이용하는 디데옥시 종결제 사이클 서열화법에 의해, 컨센서스 서열을 이루도록 클로닝함이 없이 직접 서열화한다(ABI PRISM 377 서열분석기 및 ABI PRISM 서열화 키트). 절대 종결에서 서열을 결정하기 위해, 앞서 기술된 연결 과정이 사용된다[55].
이 가정을 시험하기 위해, 비-단백질 암호화 조절 영역 및 원래 Edomonston 야생형 MV 분리체의 L 유전자, 이들 분리체에서 유래된 유용한 백신 균주, 및 기타 야생형 균주에 대한 뉴클레오티드를 결정한다. 뉴클레오티드(항게놈, 메시지 센스) 및 아미노산간의 차이를 비교하여 표 3-5(차이는 이탤릭체로 표시)에 설명과 동시에 기재하고 있다:
MV 3' 게놈 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열의 차이점
뉴클레오티드 번호:
바이러스 26 42 50 96
Edmonston w-t A A G G
백신:
RubeovaxTM T C G G
Moraten T C G G
Schwarz T C G G
Zagreb T T G A
AIK-C T C G G
야생형:
1977 A A A G
1983 A A A G
Montefiore A A A G
Edmonston 야생형과 백신 균주간의 MV L 뉴클레오티드 및 아미노산의 차이점
331 1409 1624 1649 1717 1887 1936 2074 2114
Edmonston w-t ATT GCA ACC AGG GAT AAC CAT CAA AGA
돌연변이 ACT ACA GCC ATG GCT GAC TAT CGA AAA
Edmonston w-t I A T R D N H Q R
RubeovaxTM백신 I A T M A D H Q R
Moraten 백신 T A T M A D H Q K
Schwarz 백신 T A T M A D H Q K
Zagreb 백신 I T T R A N H Q R
AIK-C 백신 I T A R A N Y R R
야생형 균주간의 MV L 뉴클레오티드 및 아미노산의 차이점
81 122 149 252 331 441 447 500 513 570 613
Edmonston w-t GCC GAT GTT ACA ATT AAA AAA GAT GTG AAA TAC
돌연변이 ACC AAT ATT GCA GTT AGA AGA AAT ATG AAT CAC
Edmonston w-t A D V T I K K D V K Y
1977 w-t A N V T V K K D M K Y
1983 w-t T D I T I K K N M N H
Montefiore w-t A D I A I R R D M K Y
618 621 623 626 628 632 636 637 641 645 650
Edomonston w-t GTC AGT AGG AGA GCA ATA CAA GTA GAC GAT ATG
돌연변이 GCC AAT AAG AAA GAA GTA CAT ATA AAT AAT ATA
Edmonston w-t V S R R A I Q V D D M
1977 w-t A N R R A I Q I D N M
1983 w-t V S K R A I H V D D M
Montefiore w-t V S R K E V H V N D I
야생형 균주간의 MV L 뉴클레오티드 및 아미노산의 차이점
652 720 723 794 914 970 1044 1294 1569 1705 1745
Edmonston w-t GCT ATC TAT CGG CGG GCC GGA AGC GTT ATC AAT
돌연변이 ACC GTC TGC TGG CAG TCA AGA ACC ATT GTC AGT
Edmonston w-t A I Y R R A G S V I N
1977 w-t A I C W Q A G S V I N
1983 w-t A V C R R S G T I I N
Montefiore w-t T V C R R A R S V V S
1860 1865 1936 2007 2013 2017 2030 2096 2119 2165
Edomonston w-t GTA TTC CAT GAC GAT ACT AAT ATA AAG GTC
돌연변이 ATA TAC TAT GGC GGT ATT AGT GTA CGG ATC
Edmonston w-t V F H D D T N I K V
1977 w-t V Y H D D T N I K V
1983 w-t V F Y D G I N I R I
Montefiore w-t I F H G D I S V R V
실시예 2
PIV-3
PIV-3 바이러스의 친주 야생형 JS 균주 및 cp45 돌연변이체의 FRhL-생장과 Vero-생장 형태의 서열(항게놈 메시지 센스에서)을 비교한 것이 표 6에 설명되고 있다. 코돈 변화가 아미노산을 변화시키지 않을 경우에, 표 6에서는 "none"으로 명기하고, 뒤에 변하지 않은 아미노산의 명칭이 따른다.
Vero- 및 FRhL-생장 cp45와 JS 균주간의 서열 비교
유전자영역 뉴클레오티드 위치 JS FRhLcp45 Verocp45 코돈 변화 아미노산 변화(L 번호)
3' 리더 23 T C C
24 C T T
28 G T T
45 T A A
NP UTR 62 A T T
NP 암호화 397 T C C GTC → GCC Val → Ala
1275 T G G TCT → GCT Ser → Ala
P 암호화 2080 T C C AAT → AAC none/Asn
M 암호화 4347 C A A CCC → ACC Pro → Thr
F 암호화 5536 C T T AAC → AAT none/Asn
6329 A G G ATA → GTA Ile → Val
6419 G A A GCA → ACA Ala → Thr
HN 암호화 6847 T C C GGT → GGC none/Gly
7956 T C C GTT → GCT Val → Ala
L 암호화 9323 T C C TAT → TAC none/Tyr(226)
9971 A G G GAA → GAG none/Glu(442)
11469 T C C TAC → CAC Tyr → His(942)
11621 G T T TTG → TTT Leu → Phe (992)
12521 A A T* TTA → TTT Leu → Phe (1292)
12581 C T T TTC → TTT none/Phe(1312)
13318 C T T ACT → ATT Thr → Ile (1558)
돌연변이 횟수 20 21
PIV-3 바이러스의 친주 야생형 JS 균주 및 FRhL-생장 cp45 돌연변이체의 서열 분석은 후자가 20 뉴클레오티드 변화를 내포함을 보여주고 있다. 4가지 변화는 뉴클레오티드 위치 23(T → C), 24(C → T), 28(G → T) 및 45(T → A)의 비암호화 3'-리더영역에 존재한다(항게놈, 메시지 센스). 게놈의, 네가티브 센스에서 고려할 경우, 위치 28에서 보다 작은 피리미딘("C")에서 보다 큰 퓨린("A")으로의 변화는 3' 게놈 프로모터 영역의 보존된 영역에 의해 플랭킹된 영역의 크기를 변화시켜, 폴리머라제에 시스-작용 시그널의 변형된 공간적 노출을 야기한다.
9개의 변화는 NP, M, F, HN 및 L 유전자에서의 암호화 변화이다. 나머지 7개의 변화는 NP, P, F, HN 및 L 유전자 또는 NP 비해독 영역(UTR)에서의 비-암호 또는 사일런트 변화이다. cp45 돌연변이체는 ts 표현형으로 인해 비-허용 온도에서 약한 전사 활성을 가지는 것으로 입증되었다[87]. 이 ts 표현형은 현재 바이러스 L 유전자상에 위치하고 있다[88]. cp45 바이러스는 일반적으로 HN 및 F 당단백질에서 돌연변이와 관련된 기능을 하는 것으로 보여지기 때문에[87], 이는 3'-리더및 L 유전자에서의 돌연변이가 이 바이러스의 감소 표현형에 기인한 것이라는 암시를 뒷받침한다.
따라서, FRhL-생장 cp45에서의 4개의 3' 리더 특이적 변화 및 아미노산 위치 945(Tyr → His), 992(Leu → Phe) 및 1558(Thr → Ile)중의 L 유전자에서의 3가지 암호화 변화는 후보 cp45 백신 균주의 감소 표현형에 상당히 기여한다.
더구나, Vero-생장 cp45 돌연변이체 백신 균주는 아미노산 잔기 1292 중의 L 유전자(표 6에서 별표로 표시되어있음)에서의 암호화 변화에 기인한 추가 돌연변이를 함유한다(류신 → 페닐알라닌).
L 유전자에서의 최초 두개의 아미노산(위치 942 및 992) 변화는 모든 파라믹소바이러스 L 유전자 사이에 하나의 고도로 보존된 영역에 위치한다. 제 4 아미노산 변화(위치 1558)는 MV 백신 균주의 아미노산 1717에서의 변화에 상응하는 두개의 보존된 블록을 잇는 영역에 위치한다.
공개 문헌[89]은 JS 및 FRhL-생장 cp45 균주의 항게놈 메시지 센스 서열간에 단지 18개의 변화에 관해 기술하고 있다. 이들 변화 중 16개는 본 출원인 이 발견했다.
공개 문헌은 본 출원인에 의해 발견된 4개의 변화에 관해서는 보고하고 있지 않다: 뉴클레오티드 45(T → A)에서의 3' 선도, 뉴클레오티드 62(A → T)에서 NP UTR, 또는 뉴클레오티드 397에서의 변화(T → C)로 인해, 아미노산 변화(Val → Ala) 및 뉴클레오티드 1275(T → G)를 야기하고, 아미노산 변화(Ser → Ala)를 야기(항게놈, 메시지 센스에서 뉴클레오티드 변화)시키는 NP 단백질에서 아미노산의 변화. 어떠한 공개 문헌도 뉴클레오티드 12521에서의 변화(A → T)로 인해, 아미노산 1292에서 변화(Leu → Phe)를 야기하는 Vero-생장 cp45 균주에서 출원인에 의해 발견된 L 단백질에서의 추가 잠재 감소 돌연변이에 관해서는 보고하고 있지 않다.
실시예 3
RSV 서브그룹 B
온도-민감성(ts) 표현형이 생체 내에서 감소를 강하게 수반하고; 또한, 몇몇 비-ts 돌연변이도 또한 감소가 일어날 수 있다. ts 및 비-ts 감소 돌연변이의 동정은 ts, 저온-적응(ca), 및 생체 내에서 생장된 RSV 돌연변이체 및 복귀체의 표현형의 서열 분석 및 평가로 달성된다.
하기 5개의 RSV 2B 균주의 게놈이 현재 완전히 서열화되었다: 2B 친주, 2B33F, 2B20F TS(+)로 명명된 하나의 복귀체, 2B20L 및 2B20L TS(+)로 명명된 하나의 복귀체. 2B33F 및 2B20L 균주는 ts 및 ca이고 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 제08/059,444에 기술되고 있다[90]. 2B33F 및 2B20L 중의 돌연변이가 위치한 영역을 동정한 후, 39℃에서 시험관 내 계대접종시키고 아프리카 그린 원숭이 또는 침팬지에서 생체내 계대접종시켜 수득된 9개의 추가 2B33F "복귀체"의 분리체, 및 시험관내에서 39℃에 계대접종시켜 수득된 9개의 추가 2B20L "복귀체"의 분리체가 이들 영역에서 서열화되었다. 다수의 이들 복귀체의 ts, ca, 및 감소 표현형이 현재 특징화되고 평가되었다. 표현형 ts, 백신 감소와 서열 변화간의 상관관계가 확인되고 있다.
표 7-12에서 결과의 요약을 나타내고 있다.
RSV 2B와 2B33F 균주간의 서열 비교
뉴클레오티드위치 † 뉴클레오티드 변화
유전자/영역 vRNA의3'말단 RSV 2B RSV 2B33F RSV 2B33F TS(+), 5a 복귀체 아미노산 변화
게놈프로모터 4 C G G 비-암호화
6 - 여분의 A 여분의 A 비-암호화
M 4175 T C C 비-암호화
4199 T C C 비-암호화
SH 4329 T C C Phe-Leu (10)
4409 T C C none Ile (36)
4420 T C C Ile-Thr (40)
4442 T C C none His (47)
4454 T C C none Cys (51)
4484 T C C none Tyr (61)
4497 T C C Stop-Gln (66)
4505 T C C none Ser (68)
4525 T C C Ile-Thr(75)
4526 T C C Ile-Thr(75)
4542 T C C Stop-Gln (81)
4561 T C C Leu-Pro(87)
4575 T C C Trp-Arg(92)
4598 T C C none Thr(99)
L 9559 G A A Arg-Lys(353)
9853* A G A Lys-Arg(451)*
12186 G A A Asp-Asn(1229)
14587 C T T Thr-Ile(2029)
15071 A G G 비-암호화
† 2B33F 및 2B33F TS(+)의 경우, 뉴클레오티드의 위치 번호는 M, SH & L 유전자의 경우 2B에 비해 하나 크다.* 위치 9853에서, Lys-Arg 변화는 2B33F TS(+) 균주에서 Lys으로 복귀되었다.
RSV 2B와 2B20L 균주간의 서열 비교
뉴클레오티드위치 † 뉴클레오티드 변화
유전자/영역 vRNA의 3' 말단 RSV 2B RSV 2B20L RSV 2B20L TS(+),R1 복귀체 아미노산 변화
게놈프로모터 4 C G G 비-암호화*
6 - 여분의 A 여분의 A 비-암호화*
L 8963 C T T none Thr (154)
13347 A A G Asn-Asp (1616)
14587 C T T Thr-Ile(2029)*
14649 A G G Asn-Asp (2050)
14650 A A T Asn-Asp-Val(2050)**
† 2B20L 및 2B20L TS(+)의 경우, 뉴클레오티드 위치 번호가 L 유전자의 경우에 2B보다 하나 크다.* 돌연변이는 2B33F 및 2B20L 균주에서 공통됨.** 위치 14650에서, 돌연변이는 2B20L TS(+) 복귀체에서 ts 표현형을 억제한다.
RSV 2B, ts 및 복귀체 균주
샘플 기원 시험관내 표현형ts ca 생체내 생장*코튼랫 AGM
39/32℃ EOP 플라크 형태 20/32℃ 수율 코갑개골 폐 코 세척 기관지세척
RSV 2B 야생형 친주균 0.7(wt) 0.0001 5.5a3.9b(4/4) 5.8a5.2b(4/4) 5.8e(4/4) 4.7e(4/4)
RSV 2B33F 2B 저온-계대접종된 x 33에서 분리된 ca, ts돌연변이 0.00007(sp/int/wt) 0.04 ≤1.6a<1.9b(1/4) <1.5a<1.2b(0/4) 3.0e(4/4) <0.9e(0/4)
RSV 2B33F-5a TS(+) 2B33F 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.5(wt) 0.03 ≤1.7a(1/4) 3.5a(4/4) 4.2e(4/4) 4.0e(4/4)
RSV 2B33F-4a TS(+) 2B33F 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.7(wt) 0.01 ≤1.7a(3/4) 3.8a(4/4) ND ND
RSV 2B33F-3b TS(+) 2B33F 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.5(wt) 0.04 ≤2.5a(3/4) 2.9a(4/4) ND ND
AGM pp2 2B33F-감염된 AGM#A2,d7 코 세척32℃에서 선택된플라크 0.3(sp,int) 0.00002 ≤2.0b(1/4) 1.6b(4/4) ND ND
RSV 2B, ts 및 복귀체 균주
샘플 기원 시험관내 표현형ts ca 생체내 생장*코튼랫 AGM
39/32℃ EOP 플라크 형태 20/32℃ 수율 코갑개골 폐 코 세척 기관지세척
AGM pp4 2B33F-감염된 AGM#A2,d7 코 세척32℃에서 선택된플라크 0.1(sp, int) 0.008 <1.6b(0/4) 1.2b(4/4) ND ND
AGM pp6 2B33F-감염된 AGM#A4,d12 코 세척32℃에서 선택된플라크 0.000004(wt) ≤0.00005 ≤1.5b(1/4) <1.1b(0/4) ND ND
AGM pp7 2B33F-감염된 AGM#A4,d12 코 세척32℃에서 선택된플라크 0.000004(sp/int/wt) 0.007 ≤1.4b(1/4) <1.0b(0/4) ND ND
Chimp pp1A 2B33F-감염된 Chimp#1552, 32℃에서 선택된 d4 기관 세척 플라크 0.5(wt) ND ND ND ND ND
Chimp pp3A 2B33F-감염된 Chimp#1560, 32℃에서 선택된 d6 기관 세척 플라크 0.7(wt) ND 2.4c(4/4) ≤3.0c(3/4) ND ND
Chimp pp5A 2B33F-감염된 Chimp#1563, 32℃에서 선택된 d10 코 세척 플라크 0.7(wt) ND ≤2.3c(3/4) 3.0c(4/4) ND ND
RSV 2B, ts 및 복귀체 균주
샘플 기원 시험관내 표현형ts ca 생체내 생장*코튼랫 AGM
39/32℃ EOP 플라크 형태 20/32℃ 수율 코갑개골 폐 코 세척 기관지세척
RSV 2B20L 2B 저온-계대접종된 x 20에서 분리된 ca, ts돌연변이체 0.0002(int/wt) 0.02 <1.9d(0/4) <1.3d(0/4) <0.7f(0/2) <0.7f(0/2)
RSV 2B20L R1 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.6(wt) ND 2.3c(4/4) 3.5c(4/4) ND ND
RSV 2B20L R2 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.6(wt) ND ≤2.5c(3/4) 2.7c(4/4) ND ND
RSV 2B20L R9 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.8(wt) ND ≤2.2c(3/4) 4.0c(4/4) ND ND
RSV 2B20L R10 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종,39℃에서 선택된플라크 0.7(wt) ND 2.6c(4/4) 3.2c(4/4) ND ND
* log10평균 바이러스 역가(감염 #/총 #)로 측정된 생체내 생장.ND = 행해지지 않음 wt = 야생형 플라크 크기 sp=작은 플라크 크기int = 중간체 플라크 크기aDose = 106.7PFU INbDose = 105.6PFU INcDose = 106.3PFU INdDose = 105.9PFU INeDose = 106.6PFU IN+ITfDose = 106.0PFU IN+IT
2B33F 복귀체
생체내 ts(+)5a 4a 3b AGMpp2 pp4 pp6 pp7 Chimp1A 3A 5A
염기 번호 †
M4176, 4200 S S S S S S S S S S
SH14 염기* S S S S S S S S S S
L95609854121871458815072 S S S2B 2B 2BS S SS S SS S S S S S S2B S S SS S S SS S S SS S S S S S SND 2B 2BS S SND S SS S S
표현형
tsca감소 2B 2B 2BS S Sr r r r r S S2B S 2B S(r) (r) S S 2B 2B 2BND ND NDND r r
† 이들 2B33F 복귀체 염기 번호는 M, SH 및 L 유전자의 경우 2B에 비해 하나 크다.* 염기 4330, 4410, 4421, 4443, 4455, 4485, 4498, 4506, 4526, 4527, 4543, 4562, 4576, 4599.S = 2B33F와 동일한 염기2B = 2B 염기로의 복귀 또는 표현형에서 완전한 복귀r = 표현형에서 중간 복귀(r) = 표현형에서 약간의 복귀ND = 행해지지 않음.
2B20L 복귀체
TS(+) 시험관내 분리체
염기 번호 † R1 R2 R3A R4A R5A R6A R7AR8A R9A R10A
L896413348145881465014651 S S S S S S S S S SC* S ND S S ND S S S SS S S S S S S S S SS S 2B S 2B 2B S S 2B 2BA* A* S A* S S A* A* S S
표현형
ts감소 2B 2B ND ND ND ND ND ND 2B 2Br r ND ND ND ND ND ND r r
† 이들 2B20L 복귀체 염기 수는 L 유전자의 경우 2B의 경우보다 하나 크다.S = 2B20L과 동일한 염기2B = 2B 염기로 복귀r = 표현형에서 중간 정도 보귀* = 염기 변화, 2B 또는 2B20L과 상이ND = 행해지지 않음
RSV 2B, ts 및 복귀체 균주: 표현형 요약
바이러스 분리체 기원 시험관내표현형ts ca 생체내 감소코튼랫 AGM
RSV 2B 야생형 친주균 - - - -
RSV 2B33F 2B, 저온-계대접종된 x 33에서 분리된ca, ts 돌연변이체 ++++ ++ ++++ +++
RSV 2B33F -5a TS(+) 2B33F 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ++ ++ +
RSV 2B33F -4a TS(+) 2B33F 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ++ ++ ND
RSV 2B33F -3b TS(+) 2B33F 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ++ ++ ND
AGM pp2 2B33F 스피너 계대접종32℃에서 선택된 플라크 + - +++ ND
AGM pp4 2B33F-감염된 AGM A2, 32℃에서 선택된 d7 코 세척 플라크 + ++ +++ ND
AGM pp6 2B33F-감염된 AGM A4, 32℃에서 선택된 d12 코 세척 플라크 ++++ - ++++ ND
AGM pp7 2B33F-감염된 AGM A4, 32℃에서 선택된 d12 코 세척 플라크 ++++ ++ ++++ ND
Chimp pp1A 2B33F-감염된 chimp #1552, d4 기관 세척, 32℃에서 선택된 플라크 - ND ND ND
Chimp pp3A 2B33F-감염된 chimp #1560, d6 기관 세척, 32℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
Chimp pp5A 2B33F-감염된 chimp #1563, d10 기관 세척, 32℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
RSV 2B, ts 및 복귀체 균주: 표현형 요약
바이러스 분리체 기원 시험관내표현형ts ca 생체내 감소코튼랫 AGM
RSV 2B20L 2B, 저온-계대접종된 x 33에서 분리된ca, ts 돌연변이체 ++++ ++ ++++ ++++
RSV 2B20LR1 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
RSV 2B20LR2 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
RSV 2B20LR9 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
RSV 2B20LR10 TS(+) 2B20L 스피너 계대접종39℃에서 선택된 플라크 - ND ++ ND
ND = 행하지 않음- = 야생형 표현형, 즉, 온도 비-민감성, 저온에 비적응, 비감소+ 내지 ++++ = 증가된 수준의 온도 감성, 저온-적응 또는 감소
이들 자료로부터 여러 중요한 관측결과를 추론할 수 있다:
a. 표 7(2B33F) 및 8(2B20L)에서 알 수 있듯이, 두개의 돌연변이체 균주에서 동정된 서열 변화는 비교적 거의 없다: RSV 2B33F는 3' 게놈 프로모터 영역에서 두개의 변화, M 유전자의 비-암호화 5'-말단에서 두개의 변화, 및 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 암호화 L 유전자에서 4개의 암호화 변화 및 하나의 비-암호화(폴리(A) 모티프) 변화에 의해 친주 RSV 2B와는 상이하다. 또한, 14 변화는 SH 유전자에만 위치한다. RSV 2B20L은 7개의 뉴클레오티드 위치에서만이 친주 RSV 2B와 상이하고, 이들 중 세곳은 2B33F 바이러스와 공통되고, 이는 3' 게놈 프로모터에서 두개의 변화 및 L 유전자에서 하나의 암호화 변화를 포함한다. 2B20L 바이러스의 두개의 추가적인 독특한 변화는 L 유전자의 암호화 영역에 위치한다. 비-암호화 3' 게놈 프로모터 영역 및 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 유전자에서 잠재적 감소 돌연변이가 확인되었다.
b. 두개의 ts 돌연변이가 감소된 바이러스 균주 2B33F 및 2B20L의 L 유전자에서 확인될 수 있다.
(i) 2B33F에서, 아미노산 451(Lys → Arg)에서 L 단백질 중의 코드 변화를 야기하는 뉴클레오티드 위치 9853(A → G)에서의 돌연변이는 명확히는 ts 및 감소 표현형을 수반한다. 단지 2B33F TS(+) 5a 균주중의 이 위치에서의 복귀는 39℃에서 완전한 생장 회복(표 9) 및 동물에서 감소중의 부분 복귀에 책임이 있다. ts 및 감소 표현형과의 이러한 관련성은 또한 세포 배양물 및 chimps에서 분리된 6개의 추가 "전 TS 복귀체"(4a, 3b, pp2, 3A, 5a, 5A로 명명)의 부분적 서열 분석에 의해 지지되고, 이 중 단지 뉴클레오티드 9853 돌연변이만이 복귀된다(표 10-12)(ts 표현형에서 단지 부분적으로 복귀된 9853에서 복귀된 하나의 AGM(아프리카 그린 원숭이) 분리체 주목). 이 아미노산 451 돌연변이(Lys → Arg)는 코돈을 안정화시키기 위해 제 2 돌연변이를 삽입시켜, Lys로 복귀될 가능성을 감소시켜, cDNA 감염성 클론 작제물에서 쉽게 안정화된다.
(ii) 2B20L에서, L 단백질(아미노산 위치 2,050, Asn → Asp)에서 코드 변화를 야기하는 염기 14,649(A → G)에서의 돌연변이는 ts 및 감소 표현형과 관련되는 것으로 나타난다. 아미노산 2050에서의 이 아스파틱산은 TS(+) 복귀체에서 고정적으로 복귀(Asp → Asn)되거나 위치 14,650에서 뉴클레오티드 치환(A → T)에 의해 상이한 아미노산으로 변화(Asp → Val)한다(표 8,11). 상기 관측결과는 TS(+) 복귀체 R1상의 완전한 서열 분석 및 선택된 영역에서 몇가지 추가 TS(+) 복귀체(R2,R4A, R7A, R8A)의 부분 서열에 근거한다(표 11). 상기 복귀를 수반하는 뉴클레오티드 위치 13,347(아미노산 1616, Asn → Asp)에서 추가 돌연변이가 R1 복귀체에서 관측된다. 그러나, ts 표현형에 대한 이러한 돌연변이의 효과는 알려져 있지 않고; 기타 복귀체의 L 유전자는 완전히 서열화되지 않았다.
c. 세개의 염기 변화는 바이러스 2B33F 및 2B20L 균주에 공통된다.
(i) 아미노산 2029에서 상응하는 변화(Thr → Ile)를 지닌 위치 14,587에서의 변화(C → T)는 2B33F 및 2B20L 모두에 존재한다(표 7,8). 이 뉴클레오티드 "T" 치환은 원 RSV2B 균주 집단의 10%에 존재하는 것으로 밝혀졌고 이는 감소 과정동안 바람직할 수 있다. 야생형 염기 "C"는 2B33F 및 2B20L 바이러스에서 발견되지 않는다.
(ii) 2B33F 및 2B20L 3' 게놈 프로모터 영역에서 두개의 돌연변이가 관측된다: 뉴클레오티드 4(C → G) 및 위치 6-11(항게놈, 메시지 센스)에서 A'의 나열에서 여분의 A의 삽입. 선택된 TS(+) 복귀체 서열을 분석하면, 이들 돌연변이가 2B33F TS(+)5a(표 7) 및 2B20L TS(+)R1(표 8) 복귀체에 보유되고 있음이 관측된다. 이들 비-암호화, 시스-작용 돌연변이는 부분적인 바이러스 감소를 수반하여 존재한다.
이들 시스-작용 변화의 분석을 위한 미니레플리콘 RSV-CAT 시스템을 이용한 발현은 2B 원 바이러스 또는 2B33F 또는 2B33F TS(+) 중 하나가 헬퍼 L 유전자 기능(N, P 및 M2 유전자는 이들 바이러스에서 일치함)을 제공할 경우 3' 게놈 프로모터 뉴클레오티드 4(C → G) 변화가 이러한 시험관내 시스템에서 전사/복제를 T상부조절시키는 것으로 나타났다.
원 RSV2B 바이러스에 의해 제공된 2B33F 3' 게놈 프로모터 및 헬퍼 기능기 또는 이 RSV-CAT 미니레플리콘 시스템에 의한 2B33F 및 2B33F TS(+) 바이러스의 상보성 분석도 또한 행해진다. 모든 세가지 바이러스는 두가지 2B 및 2B33F 3' 게놈 프로모터에 의해 매개된 전사/복제 기능을 지지한다. 그러나, 2B33F 및 2B33F TS(+) 바이러스는 2B333F 3' 게놈 프로모터를 택하고 있다. 이러한 분석은 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 유전자와 함께, 백신 감소 공정동안 3' 게놈 프로모터의 공-진화를 명확히 보여준다. 서열 분석에 의해 단일 L 단백질 아미노산 451(Arg → Lys)의 복귀에 의한 2B33F 돌연변이체 5a에서 ts 표현형의 복귀는 37℃에서 RSV-CAT 미니레플리콘의 전사/복제 기능의 지지에 의해 명확히 입증된다. 2B33F 바이러스는 37℃에서 헬퍼 기능을 RSV-CAT 미니레플리콘(2B 또는 2B33F 3' 게놈 프로모터를 지닌)에 제공하지 않는다.
d. 2B33F에서 보여진 엇갈린 SH의 과돌연변이는 표현형에 상관없이, 모든 2B33F 복귀체에 존재하고, ts, ca이고 감소된 2B20L에서는 보이지 않는다. 따라서, 이 시점에 이러한 돌연변이와 생물적 표현형과 관련된 자료는 존재하지 않는다.
18537로 명명된 또다른 야생형 RSV도 또한 서열화되고 야생형 RSV 2B 균주의 서열과 비교된다. 한가지 예외로, 상기 기술된 모든 중요한 잔기에서, 두개의 야생형 균주는 동일하다. 2B의 경우, 뉴클레오티드 14586-14588에서의 코돈 ACA는 L 단백질의 아미노산 2029의 Thr을 암호화하지만, 18537의 경우, 뉴클레오티드 14593-14595에서의 코돈 ATT는 아미노산 2029의 Ile를 암호화한다(L 유전자의 개시 코돈은 18537에서 뉴클레오티드 8509-8511에 있고, 이는 2B에서 8502-8504에 대비됨).
실시예 4
홍역 바이러스를 검출하기 위한 PCR 분석
3주간 진행성 무효 기침, 급박한 호흡, 및 발열의 병력을 지닌 21세의 환자를 병원에 수용한다. 그의 증상은 7일 동안 클래리트로마이신을 이용한 하기 치유 또는 애토바콘을 이용한 유사한 치료 과정을 개선시키지 못했다. 오른쪽 위쪽 상한 복부 상처의 부수적인 병은 오메프라졸 및 안트라시드에 불응성임을 증명한다. 관련된 과거 병력은 이러한 병원 입회 3-4년 이전에 진단된 인자 VIII 결핍 및 HIV 감염을 포함한다. 1년 전, 그는 대학 등록 무렵에 홍역-멈프-루벨라(MMR) 백신의 부스터 면역이 생겼다.
병원에 입원한 후 이틀 째에 행해진 기관지폐포성 세척 및 트랜스브론치알 생체 검사는 최소한의 만성 염증을 지닌 반응성 하이퍼플라시아 및 알베올라 주 세포 박리를 나타낸다. 어떠한 미생물도 그램, 메텐아민 은, 또는 PAS 균주에 의해 드러나지 않는다. 가슴의 CT 촬영은 왼쪽 폐 기주에 다수의, 분명치 않은, 응집 혹을 보여준다. 일반적으로 진행성 HIV 병의 폐동맥 합병증에 책임이 있는 기회성 박테리아, 마이코박테리아, 및 진균 병원균에 대한 경험적 항생제의 투여에도 불구하고, 환자는 39℃로 열병을 앓는다. 좌측 복수개의 유출물이 생기고; 진단 흉강천자술은 이것이 분출적이지만 오히려 증상이 없음을 보여준다. 3주 후에 수행된 기관지폐포성 세척은 단지 폐포성 조직구를 입증하고, 이 중 몇몇은 헤모시데린 레덴, 몇몇 림프구, 및 호중구이다. FITE, AFB, 및 메탄아민 은 염색도 또한 네가티브이다.
2주 후, CT-가이드 미니흉강절개술을 통해 왼쪽 폐의 웨지 절제를 수행한다. 다수의 피부 절개는 괴사 및 섬유증 영역과 함께 급성 및 만성 염증의 결절 부위를 나타낸다. 다수의 다핵성 거대 세포가 존재하고, 이 중 몇몇은 홍역 바이러스 거대 세포 폐렴을 암시하는 세포질내 및 핵내 내용물 모두를 함유한다. 특정 박테리아, 진균, P.carinii, 및 항산성 유기체 균주도 또한 음성적 결과를 제공한다. 이러한 폐 생체 검사 부위의 전자 현미경 실험은 홍역 바이러스와 같은 파라믹소바이러스와 형태학적으로 일치하는 입자를 보여준다. 고체 상 반흡착 분석법에 의해 측정된 혈청 항-홍역 IgM 역가는 음성적이고, 이는 차후 IgM 포착 면역분석에 근거한다.
2주 후, 환자의 폐 생체 검사 물질로 접종된 붉은털 원숭이 신장(RMK) 조직 배양 세포는 홍역 바이러스 감염의 특징적인 세포병리적 변화를 보인다. 홍역 바이러스로 향한 모노클론 항체를 이용한 면역형광 분석에 의해 확신이 얻어진다. 이러한 진단에 근거하여, 14일 동안 경구 리바비린 1000 ㎎ B.I.D.가 제공된다. 공교롭게도, 환자는 점차 약해지고, 결국 2달 후 사망한다.
환자에 존재하는 홍역 바이러스의 특성을 알아보기 위해, 감염된 조직에서 얻어진 바이러스의 역 전사 및 PCR 증폭에 이어, 서열 분석을 수행한다. 이 환자의 폐 생체 검사로부터 조직을 접종시킨 붉은털 원숭이 신장 세포로부터 분리된 홍역 바이러스는 연속 Vero(원숭이 신장) 조직 배양 세포주에서 2회의 연속 계대접종에 의해 전파된다. 총 감염된 세포 RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시제(Life Technologies, 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재)를 이용하여 제 2 Vero 세포 계대접종에서 추출된다. 총 RNA는 환자의 폐 생체 검사 물질에서 유사하게 추출된다. 3가 MMR 백신 성분으로 미국에서 현재 사용된 홍역 바이러스 백신 균주(Moraten)는 1가 형태(AttenuvaxTM, Merck, Sharpe, & Dohme)로 얻어진다. 이 바이러스는 Vero 세포를 1회 계대접종하고 총 백신 감염된 세포 RNA는 상술한 바와 같이 추출된다.
각각의 이들 RNA 제조물은 임의 6량체 프라이머 및 Maloney 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소(Perkin-Elmer/Cetus RT-PCR 키트 시제, Perkin-Elmer-Cetus, 미국 뉴저지 브랜치버그에 소재)를 이용하여 cDNA로 역 전사(RT)된다. cDNA는 디자인이 상술된 Edmonston 홍역 바이러스 서열에 근거한 홍역 바이러스-특이 올리고데옥시뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭된다. 이들 PCR 산물은 전체 15,894 뉴클레오티드 길이의 홍역 게놈을 포함하는 한 세트의 중복 DNA 단편을 포함한다. 컨센서스 게놈 서열은 클로닝없이, 제조자에 의해 확립된 디데옥시 종결제 원형-서열화법(ABI PRISM 377 서열분석기 및 ABI PRISM DNA 서열화 키트; Perkin-Elmer/Cetus, 미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재)을 이용하여 각 PCR 산물의 직접적인 분석에 의해 확립된다. PCR-증폭된 DNA 산물의 두 본쇄를 분석하여 가능한 애매한 서열화를 제거한다.
환자의 바이러스 분리체, 및 병든 폐 조직에 존재하는 홍역 바이러스 게놈의 선택된 영역의 뉴클레오티드 서열은 Moraten 백신 바이러스,, 및 기타 홍역 바이러스 야생형 및 백신 균주의 뉴클레오티드 서열과 비교된다. 이 서열 분석은 과거 또는 현재 원형화 야생형 바이러스 또는 기타 홍역 백신 균주와의 관련성을 입증하기보다 Moraten 백신 균주에 대한 신원을 나타낸다.
실시예 5
RSV 검출을 위한 ELISA
ELISA 시험을 사용하여 RSV의 존재를 검출한다. 펩티드를 디자인하고 앞서 기술된 모든 서브그룹 B 균주, 또는 개개 야생형, 백신 또는 복귀체 RSV 서브그룹 B 균주에 특이적이도록 본원에 기술된 RSV 서열과 상동성에 근거하도록 선택한다. 이들 펩티드를 KLH에 커플링하고 이를 이용하여 단일특이적 폴리클론 항체의 생성을 위해 토끼를 면역시킨다. 이들 폴리클론 항체의 선택, 또는 폴리클론 및 모노클론 항체의 배합을 "포착 ELISA"로 이용하여 RSV 항원의 존재를 검출한다.
3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 지니고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 지니는 모노네가비랄레스로 명명된 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스가 제공된다.
참고 문헌
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Claims (46)

  1. 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는 모노네가비랄레스 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 바이러스가 파라믹소비리대 과 계통인 바이러스.
  3. 제 2 항에 있어서, 바이러스가 파라믹소비리내 아과 계통인 바이러스.
  4. 제 3 항에 있어서, 바이러스가 모르빌리바이러스 속 계통인 바이러스.
  5. 제 4 항에 있어서, 바이러스가 홍역 바이러스인 바이러스.
  6. 제 5 항에 있어서,
    (a) 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 포지티브 본쇄 안티게놈, 메시지 센스에 제시되는 뉴클레오티드 26 (A → T), 뉴클레오티드 42 (A → T 또는 A → C) 및 뉴클레오티드 96 (G → A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    (b) RNA 폴리머라제 유전자내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 잔기 331 (이소류신 → 트레오닌), 1409 (알라닌 → 트레오닌), 1624 (트레오닌 → 알라닌), 1649 (아르기닌 → 메티오닌), 1717 (아스파틱산 → 알라닌), 1936 (히스티딘 → 티로신), 2074 (글루타민 → 아르기닌) 및 2114 (아르기닌 → 라이신)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에서의 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 홍역 바이러스.
  7. 제 3 항에 있어서, 바이러스가 파라믹소바이러스 속 계통인 바이러스.
  8. 제 7 항에 있어서, 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 (PIV-3)인 바이러스.
  9. 제 8 항에 있어서,
    (a) 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 포지티브 본쇄 안티게놈, 메시지 센스에 제시되는 뉴클레오티드 23 (T → C), 뉴클레오티드 24 (C → T), 뉴클레오티드 28 (G → T) 및 뉴클레오티드 45 (T → A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    (b) RNA 폴리머라제 유전자내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 잔기 942 (티로신 → 히스티딘), 992 (류신 → 페닐알라닌), 1292 (류신 → 페닐알라닌) 및 1558 (트레오닌 → 이소류신)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에서의 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 PIV-3.
  10. 제 3 항에 있어서, 바이러스가 루불라바이러스 속 계통인 바이러스.
  11. 제 2 항에 있어서, 바이러스가 뉴모비리내 아과 계통인 바이러스.
  12. 제 11 항에 있어서, 바이러스가 뉴모바이러스 속 계통인 바이러스.
  13. 제 12 항에 있어서, 바이러스가 인간 호흡기 신시셜 바이러스 (RSV) 서브그룹 B인 바이러스.
  14. 제 13 항에 있어서,
    (a) 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 포지티브 본쇄 안티게놈, 메시지 센스에 제시되는 뉴클레오티드 4 (C → G), 뉴클레오티드 6 내지 11에서 A'의 스트렛치내 추가 A의 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    (b) RNA 폴리머라제 유전자내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이가 잔기 353 (아르기닌 → 라이신), 451 (라이신 → 아르기닌), 1229 (아스파틱산 → 아스파라긴), 2029 (트레오닌 → 이소류신) 및 2050 (아스파라긴 → 아스파틱산)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에서의 변화를 일으키는 뉴클레오티드 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스.
  15. 제 1 항에 있어서, 바이러스가 라브도비리대 과 계통인 바이러스.
  16. 제 1 항에 있어서, 바이러스가 필로비리대 과 계통인 바이러스.
  17. 제 1 항에 따른 모노네가비랄레스 목의 분리되고, 재조합-생성되고, 감쇠되고, 비단편화된, 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  18. 제 17 항에 있어서, 제 5 항에 따른 홍역 바이러스와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  19. 제 18 항에 있어서, 제 6 항에 따른 홍역 바이러스와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  20. 제 17 항에 있어서, 제 8 항에 따른 PIV-3와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  21. 제 20 항에 있어서, 제 9 항에 따른 PIV-3와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  22. 제 17 항에 있어서, 제 13 항에 따른 RSV 서브그룹 B와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  23. 제 22 항에 있어서, 제 14 항에 따른 RSV 서브그룹 B와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  24. 개체에 제 17 항의 백신을 투여함을 포함하는, 모노네가비랄레스 목의 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스에 대한 보호를 유도하기 위해서 개체를 면역시키는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 백신이 제 18 항의 백신인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 백신이 제 19 항의 백신인 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 백신이 제 20 항의 백신인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 백신이 제 21 항의 백신인 방법.
  29. 제 24 항에 있어서, 백신이 제 22 항의 백신인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 백신이 제 23 항의 백신인 방법.
  31. 1977 야생형 균주 (서열번호 3), 뉴클레오티드 2499가 G 또는 C인 1983 야생형 균주 (서열번호 5), Montefiore 야생형 균주 (서열번호 7), 뉴클레오티드 2143이 T 또는 C인 RubeovaxTM백신 균주 (서열번호 9), Moraten 벡신 균주 (서열번호 11), 뉴클레오티드 4917이 C이고 뉴클레오티드 4924가 C인 Schwarz 백신 균주 (서열번호 11) 및 Zagreb 백신 균주 (서열번호 13)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 포지티브 본쇄 안티게놈 메시지 센스내 홍역 바이러스 서열과 이의 상보적인 게놈 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  32. 태 붉은털 원숭이 폐 세포에서 생장시킨 cp45 백신 균주 (서열번호 19)와 Vero 세포에서 생장시킨 cp45 백신 균주로 이루어진 그룹 중에서 선택된 포지티브 본쇄 안티게놈 메시지 센스내 PIV-3 서열과 이의 상보적인 게놈 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  33. 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하고 이로 인해 발현시 감염성 감쇠 바이러스가 생성되는 적어도 하나의 발현 벡터와 함께, 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖고 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는 모노네가비랄레스 목의 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자로 이루어진 전사 벡터를 포함하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 전사 벡터가 제 5 항에 따른 홍역 바이러스를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하고 적어도 하나의 발현 벡터가 트랜스-작용 단백질 N, P 및 L을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서, 전사 벡터가 제 6 항에 따른 홍역 바이러스를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서, 전사 벡터가 제 8 항에 따른 PIV-3을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하고 적어도 하나의 발현 벡터가 트랜스-작용 단백질 NP, P 및 L을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 전사 벡터가 제 9 항에 따른 PIV-3을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  38. 제 33 항에 있어서, 전사 벡터가 제 13 항에 따른 RSV 서브그룹 B를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하고 적어도 하나의 발현 벡터가 트랜스-작용 단백질 N, P, L 및 M2를 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 전사 벡터가 제 14 항에 따른 RSV 서브그룹 B를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  40. 숙주 세포를 제 33 항에 따른 적어도 두 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시키고, 벡터의 공발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양시켜 감염성 감쇠 바이러스를 생성함을 포함하는 모노네가비랄레스 목의 감염성의 감쇠되고 비단편화된 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 제조방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 바이러스가 제 5 항의 홍역 바이러스인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 바이러스가 제 6 항의 홍역 바이러스인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 바이러스가 제 8 항의 PIV-3인 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 바이러스가 제 9 항의 PIV-3인 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 바이러스가 제 13 항의 RSV 서브그룹 B인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 바이러스가 제 14 항의 RSV 서브그룹 B인 방법.
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