ES2427139T3 - Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna - Google Patents

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna Download PDF

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Abstract

Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno deun retrovirus determinado, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia denucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARNantigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula deADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidosheteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuestainmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra los ambos, el MV y dicho retrovirus, yen el que dicha molécula de ADNc comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 alnucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11.

Description

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
[0001] La invención se refiere a virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de retrovirus y a su uso para la preparación de composiciones de vacuna.
[0002] El virus del sarampión es un miembro del orden mononegavirales, es decir, virus con un genoma ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV del inglés "measles virus") tiene una polaridad antimensaje que produce un ARN genómico que no se traduce in vivo o in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.
[0003] Se ha estudiado la transcripción y replicación de virus ARN de cadena (-) no segmentada y su ensamblaje como partículas virales y se ha presentado especialmente en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott -Raven publishers - Fields BN et al.). La transcripción y replicación del virus del sarampión no implican el núcleo de las células infectadas sino que en cambio tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales a partir de los seis genes (denominados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales a partir del gen P. El orden de los genes es el siguiente: 3'-I, N, P (incluyendo C y V), M, F, H, y la proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende adicionalmente regiones no codificantes en la región intergénica IWF; esta región no codificante contiene aproximadamente 1000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I), las proteínas de la nucleocápsida del virus, es decir, la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico para proporcionar la nucleocápsida. Los otros genes codifican las proteínas de la envuelta viral incluyendo las proteínas hemaglutinina (H), de fusión (F) y de matriz (M).
[0004] Se ha aislado el virus del sarampión y se han obtenido vacunas vivas atenuadas del aislado del MV Edmonston en 1954 (Enders, J. F., y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.), por pases en serie en células renales o amnióticas humanas primarias. Las cepas usadas después se adaptaron para fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) para producir semillas Edmonston A y B (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia). Edmonston B se autorizó en 1963 como la primera vacuna contra el MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en FEP produjeron los virus Schwarz y Moraten más atenuados (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha demostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920). Como la vacuna Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se remplazó por la vacuna Schwarz/Moraten que es actualmente la vacuna contra el sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine. 20: 651-665). También se usan otras varias cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia, y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no se obtuvieron de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en FEP. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI38).
[0005] La vacuna viva atenuada obtenida de la cepa Schwarz está comercializada por Aventis Pasteur (Lyon Francia) con el nombre comercial Rouvax®.
[0006] En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y sus colegas clonaron el ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético original y eficaz para recuperar el virus correspondiente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen, y M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y documento WO 97/06270. Desarrollaron un vector Edmonston para la expresión de genes extraños (Radecke, F., y M. Billeter. 1997. Reverse genetics meets the nonsegmented negative-strand RNA viruses. Reviews in Medical Virology. 7:49-63.) y demostraron su gran capacidad de inserción (hasta 5 kb) y su alta estabilidad en la expresión de transgenes (Singh, M., y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing biologically active human interleukin-12. J. Gen.Virol. 80:101-106; Singh, M., R. Cattaneo, y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol. 73:4823-4828; Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter, y H. Nairn. 1998. Chimeric measles viruses with a foreign envelope. J. Virol. 72:2150-2159); Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter, y H. Nairn. 2001. Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps and simian immunodeficiency viruses. Vaccine. 19:2329-2336. Este vector se clonó a partir de la cepa Edmonston B del MV propagado en células HeLa (Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S. A.
Udem, y M. A. Billeter. 1990. Infectious measles virus from cloned cDNA. Embo J. 9:379-384). [0007] Además, se ha producido virus recombinante del sarampión que expresa el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y ha demostrado inducir respuestas inmunitarias humorales en ratones genéticamente modificados (Singh M. R. et al., 1999, J. virol. 73: 4823-4828).
[0008] A partir de la observación de que las propiedades del virus del sarampión, y específicamente su capacidad para provocar altas titulaciones de anticuerpos neutralizantes in vivo y su propiedad de ser un fuerte inductor de respuesta inmunitaria celular permanente, los inventores han propuesto que puede ser un buen candidato para la preparación de composiciones que comprenden virus infecciosos recombinantes que expresan péptidos o polipéptidos antigénicos de retrovirus, para inducir anticuerpos neutralizantes contra dichos retrovirus que pueden ser preferentemente adecuados para conseguir al menos algún grado de protección contra dichos retrovirus, en animales y más preferentemente en hospedadores humanos. Entre los retrovirus de interés, los inventores han seleccionado los retrovirus del SIDA, incluyendo el HIV-1.
[0009] Entre los flavivirus, el Virus de la Fiebre Amarilla (YFV) y el Virus del Nilo Occidental (WNV) son importantes patógenos humanos.
[0010] El YFV y el WNV pertenecen a la familia Flaviviridae descrita en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al.).
[0011] Por tanto, la invención proporciona virus recombinantes del sarampión que pueden expresar antígenos y especialmente epítopos derivados de antígenos de retrovirus. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, especialmente a construcciones de ácido nucleico que expresan el virus recombinante del sarampión y que con el mismo expresan antígenos o epítopos de antígenos de retrovirus.
[0012] La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de dichos virus recombinantes del sarampión y especialmente se refiere a la producción de dicho MV recombinante en sistemas de recuperación.
[0013] La invención también se refiere a composiciones que comprenden dichos virus recombinantes del sarampión como principios activos para la protección de hospedadores, especialmente hospedadores humanos, contra enfermedades relacionadas con infecciones ocasionadas por dichos retrovirus, especialmente por retrovirus del SIDA.
[0014] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión capaces de expresar antígenos y especialmente epítopos derivados de antígenos de virus de ARN incluyendo flavivirus.
[0015] La solicitud también describe construcciones de ácido nucleico recombinante que expresan los virus recombinantes del sarampión y que con los mismos expresan antígenos o epítopos de antígenos de flavivirus.
[0016] La solicitud también describe procedimientos para la preparación de dichos virus recombinantes del sarampión y especialmente describe la producción de dicho MV recombinante en sistemas de recuperación.
[0017] La solicitud también describe composiciones que comprenden dichos virus recombinantes del sarampión como principios activos para la protección de hospedadores, especialmente hospedadores humanos, contra enfermedades relacionadas con infecciones por dichos flavivirus, especialmente el Virus de la Fiebre Amarilla o el Virus del Nilo Occidental.
[0018] Se han descrito secuencias de ácido nucleico del Virus del Sarampión en la solicitud de patente internacional WO 98/13501, especialmente una secuencia de ADN de 15.894 nucleótidos correspondiente a una copia de ADN del ARN mensajero con sentido de cadena positiva (antigenómico) de diversas cepas de tipo silvestre de sarampión para vacunas, incluyendo la cepa de tipo silvestre Edmonston, la cepa Moraten y la cepa Schwarz que es idéntica a la capa Moraten excepto por las posiciones de los nucleótidos 4917 y 4924 en que la cepa Schwarz tiene una « C » en lugar de una « T ».
[0019] Para producir virus recombinantes del sarampión, se ha desarrollado un sistema de recuperación para la cepa Edmonston del MV y se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 97/06270. Se hace referencia especialmente a los ejemplos de esta solicitud internacional, incluyendo los ejemplos referidos a células y virus, a la generación de la línea celular 293-3-46, a construcciones plasmídicas, a la transfección de plásmidos y a la recogida de productos génicos indicadores, a la configuración experimental para recuperar el MV, a células auxiliares que expresan de forma estable las proteínas N y P del MV así como a la ARN polimerasa T7, a la recuperación del MV usando células auxiliares 293-3-46 y a la caracterización del MV recuperado.
[0020] El sistema de recuperación descrito en el documento WO 97/06270 se ha desarrollado adicionalmente para incluir una etapa de choque térmico descrita en Parks C. L. et al., 1999, J. virol. 73: 3560-3566.
[0021] La invención por tanto se refiere a un virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga derivada de un antígeno de un determinado retrovirus, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula de ADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra el MV y contra dicho retrovirus, y en el que dicha molécula de ADNc comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11 o que comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I-2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena del ARN(+) antigenómico de longitud completa del MV.
[0022] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión que expresan una secuencia de aminoácidos heteróloga derivada de un antígeno de un determinado virus ARN, especialmente de un retrovirus o flavivirus, donde dicho virus recombinante del sarampión es capaz de provocar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus o tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus.
[0023] La expresión « secuencia de aminoácidos heteróloga » se refiere a una secuencia de aminoácidos que no se obtiene de los antígenos del virus del sarampión, obteniéndose, por consiguiente, dicha secuencia de aminoácidos heteróloga de un virus ARN, especialmente de un retrovirus o flavivirus de interés para establecer una respuesta inmunitaria en un hospedador, especialmente en un ser humano y preferiblemente para establecer protección contra una infección por dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus.
[0024] La secuencia de aminoácidos heteróloga expresada en los virus recombinantes del sarampión descritos en la solicitud es tal que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un hospedador determinado, contra el virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus a partir de los cuales se ha originado. Por consiguiente, esta secuencia de aminoácidos es una que comprende al menos un epítopo de un antígeno, especialmente un epítopo conservado, estando expuesto dicho epítopo de forma natural en el antígeno u obteniéndose o exponiéndose como resultado de una mutación o modificación o combinación de antígenos.
[0025] Los antígenos usados para la preparación del virus recombinante del sarampión descritos en el presente documento son especialmente antígenos de envuelta de virus de ARN tales como retrovirus o flavivirus, especialmente de envueltas de virus del SIDA incluyendo el HIV-1 o de envueltas del Virus de la Fiebre Amarilla o envueltas del Virus del Nilo Occidental. Sin embargo, otros antígenos retrovirales o flavivirales pueden usarse ventajosamente para obtener virus recombinantes del sarampión capaces de provocar anticuerpos contra dichos retrovirus o flavivirus, y la invención se refiere en una realización particular a antígenos a partir de los cuales pueden obtenerse secuencias de aminoácidos que provoquen la producción de anticuerpos neutralizantes contra los retrovirus. De acuerdo con otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de estos antígenos, de manera alternativa o adicional, también provoca una respuesta inmunitaria celular contra los retrovirus.
[0026] Ventajosamente, los virus recombinantes del sarampión de la invención también provocan una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el virus del sarampión. Sin embargo, esta respuesta no es obligatoria siempre que por supuesto se obtenga la respuesta inmunitaria contra el retrovirus.
[0027] De acuerdo con una realización preferida de la invención, el virus recombinante del sarampión de la invención se obtiene dentro de un sistema de recuperación para la preparación de virus infecciosos del sarampión. Por consiguiente, el virus recombinante del sarampión es un virus infeccioso del sarampión recuperado de un sistema de recuperación.
[0028] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión obtenido de la cepa Edmonston del virus del sarampión.
[0029] El virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención se obtiene de la cepa Schwarz y especialmente de una cepa Schwarz de vacuna aprobada tal como la producida con el nombre comercial Rouvax®, disponible en Aventis Pasteur (Francia).
[0030] Por tanto, la invención proporciona un virus recombinante del sarampión que se recupera de células auxiliares transfectadas con un ADNc que codifica el ARN antigenómico (cadena (+)) del virus del sarampión, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos heteróloga retroviral.
[0031] La expresión « codificante » en la definición anterior abarca la capacidad del ADNc de permitir la transcripción de un ARN antigenómico (+) de longitud completa, actuando dicho ADNc especialmente como molde para la transcripción. Por consiguiente, cuando el ADNc es una molécula bicatenaria, una de las cadenas tiene la
misma secuencia de nucleótidos que el ARN antigenómico de cadena (+) del virus del sarampión, excepto en que los nucleótidos « U » están sustituidos por « T » en el ADNc. Dicho ADNc es, por ejemplo, el inserto correspondiente al virus del sarampión, contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado con el Nº I.2889 en el CNCM París, Francia) el 12 de junio de 2002. Este plásmido está representado en la figura 2A.
[0032] De acuerdo con una realización particular, el virus recombinante del sarampión de la invención se caracteriza porque la molécula de ADNc se selecciona entre las siguientes secuencias:
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15977 de la figura 11;
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la figura 11;
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la figura 11;
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 15977 de la figura 11;
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la figura 11;
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 15977 de la figura 11; y
-
la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la figura 11.
[0033] La expresión "ADNc" usada para la descripción de la secuencia de nucleótidos de la molécula de la invención simplemente se refiere al hecho de que originalmente dicha molécula se obtiene por transcripción inversa del genoma ARN genómico (-) de longitud completa de partículas virales del virus del sarampión.
[0034] Esto no debería considerarse como una limitación de los métodos usados para su preparación. La invención por tanto abarca, dentro de la expresión "ADNc", todos los ADN con la condición de que tenga la secuencia de nucleótidos definida anteriormente. Por tanto están incluidos ácidos nucleicos purificados, incluyendo ADN, dentro del significado de ADNc de acuerdo con la invención, con la condición de que dicho ácido nucleico, especialmente ADN cumpla las definiciones dadas anteriormente.
[0035] Las células auxiliares de acuerdo con el sistema de recuperación se transfectan con un vector de transcripción que comprende el ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, cuando dicho ADNc se ha recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos heteróloga de interés (secuencia de nucleótidos heteróloga) y dichas células auxiliares se transfectan adicionalmente con un vector de expresión o varios vectores de expresión que proporcionan las funciones auxiliares que incluyen aquellas que posibilitan la expresión de proteínas de acción en trans del virus del sarampión, es decir, las proteínas N, P y L y proporcionan la expresión de una ARN polimerasa para posibilitar la transcripción del ADNc recombinante y la replicación del ARN viral correspondiente.
[0036] La invención se refiere en particular a la preparación del virus recombinante del sarampión que contiene epítopos de antígenos de retrovirus del HIV. Esto incluye especialmente un virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga que se obtiene de un antígeno de envuelta del HIV y que especialmente se obtiene de una proteína o glicoproteína de envuelta del HIV-1.
[0037] Los antígenos de interés a este respecto son especialmente gp160, gp120 y gp41 de HIV-1 o gp140 de HIV
1.
[0038] En una realización particular de la invención, la secuencia de aminoácidos heteróloga se obtiene de una gp160, gp120 recombinante del HIV-1 o gp140 del HIV-1.
[0039] La invención se refiere en particular a un virus recombinante del sarampión en el que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 se delecionan, o se delecionan en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados se exponen sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.
[0040] Los bucles V1, V2 y V3 del antígeno gp120 del HIV-1 se han descrito especialmente en Fields virology (Fields
B. N. et al. - Lippincott Raven publishers 1996, pág. 1953-1977).
[0041] De acuerdo con otra realización de la invención, el virus recombinante del sarampión es tal que este expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga obtenida del antígeno gp120 del HIV-1, en la que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 se sustituyen, o se sustituyen en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados se exponen sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.
[0042] De acuerdo con otra realización particular, el virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia de ADN heteróloga obtenida de un antígeno de envuelta del HIV-1 se obtiene del antígeno gp120 de tal manera que los bucles V1 y V2 están delecionados y el bucle V3 está sustituido por la secuencia AAELDKWASAA.
[0043] De acuerdo con otra realización particular de la invención, el virus recombinante del sarampión es uno que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga seleccionada entre gp160ΔV3, gp160ΔV1V2, gp160ΔV1V2V3, gp140ΔV3, gp140ΔV1V2, gp140ΔV1V2V3, cuyas secuencias de aminoácidos heterólogas se representan esquemáticamente en la figura 1.
[0044] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión como se define de acuerdo con las afirmaciones anteriores, donde la secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno del virus de la Fiebre Amarilla seleccionado entre las proteínas de envuelta (Env) o NS1 o mutantes inmunogénicos de las mismas.
[0045] La solicitud también describe virus recombinantes de sarampión como se define de acuerdo con las afirmaciones anteriores, donde la secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno del virus del Nilo Occidental seleccionado entre envuelta (E), premembrana (preM) o mutantes inmunogénicos de las mismas.
[0046] La invención también se refiere a virus recombinantes del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las definiciones anteriores, en el que el ADNc necesario para la expresión de las partículas virales, que está comprendido dentro del vector pTM-MVSchw está recombinado con la secuencia ATU de la figura 8, estando dicha ATU insertada en una posición del vector pTM-MVSchw beneficiándose del gradiente del genoma viral que permite que diversos niveles de expresión de la secuencia transgénica codifiquen la secuencia de aminoácidos heteróloga insertada en dicha ATU. La invención permite ventajosamente la inserción de dichas secuencias de ADN heterólogas en una secuencia que se denomina Unidad Transcripcional Adicional (ATU) especialmente una ATU como describen Billeter et al en el documento WO 97/06270.
[0047] Las propiedades inmunológicas ventajosas de los virus recombinantes del sarampión de acuerdo con la invención pueden mostrarse en un modelo animal que se elige entre animales susceptibles a los virus del sarampión y donde se determina la respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el antígeno heterólogo y/o contra el virus del sarampión.
[0048] Entre dichos animales adecuados a usar como modelo para la caracterización de la respuesta inmunitaria, los especialistas en la técnica pueden usar especialmente ratones y especialmente ratones recombinantes susceptibles a los virus del sarampión, o en monos.
[0049] En una realización preferida de la invención, el virus recombinante del sarampión de la invención es adecuado para provocar anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un modelo animal de mamífero susceptible al virus del sarampión. Especialmente, esta respuesta inmunitaria que comprende provocar anticuerpos neutralizantes puede buscarse en ratones o monos recombinantes.
[0050] De acuerdo con otra realización particular de la invención, especialmente cuando la secuencia de aminoácidos heteróloga obtenida de una de las proteínas de envuelta del HIV-1 y cuando esta provoca anticuerpos capaces de neutralizar un aislado primario del HIV, la respuesta se ensaya ventajosamente sobre células indicadoras tales como células P4-CCR5 disponibles en el NIH (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program). (Charneau P. et al -1994 - J. Mol. Biol. 241: 651-662).
[0051] De acuerdo con otra realización preferida, el virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un mamífero, con un título de al menos 1/40000 cuando se mide en un ensayo ELISA, y un título neutralizante de al menos 1/20.
[0052] La invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos del virus recombinante del sarampión que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión unida operativamente a (ii) una secuencia de control de expresión y (iii) una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga determinada de un retrovirus, estando dicha secuencia de ADN heteróloga clonada en dicho replicón en condiciones que permitan su expresión y en condiciones que no interfieran con la transcripción y replicación de dicha secuencia de ADNc, teniendo dicho replicón un número total de nucleótidos que es un múltiplo de seis, en el que la secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigénico del MV es una molécula de ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11 o que comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I-2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV.
[0053] El ADNc de la cepa Schwarz representado en la figura 11 puede obtenerse a partir del pTM-MVSchw.
[0054] El pTM-MVSchw es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión, la cepa de vacuna Schwarz, bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7. Su tamaño es de 18967 nt.
[0055] La solicitud también describe una secuencia de nucleótidos del virus recombinante del sarampión que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión unida operativamente a (ii) una secuencia de control de expresión y (iii) una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga determinada, estando dicha secuencia de ADN heteróloga clonada en dicho replicón en condiciones que permitan su expresión y en condiciones
que no interfieran con la transcripción y replicación de dicha secuencia de ADNc, teniendo dicho replicón un número total de nucleótidos que es un múltiplo de seis.
[0056] La invención también se refiere a un vector del virus recombinante del sarampión que comprende la secuencia de nucleótidos del virus recombinante del sarampión de la invención.
[0057] La « regla de seis » se expresa en el hecho de que la cantidad total de nucleótidos presentes en el ADNc recombinante resultante de la recombinación de la secuencia de ADNc obtenida de la transcripción inversa del ARN antigenómico del virus del sarampión, y la secuencia de ADN heteróloga finalmente suman una cantidad total de nucleótidos que es un múltiplo de seis, una regla que permite la replicación eficaz del ARN genómico del virus del sarampión.
[0058] Un vector del virus recombinante del sarampión preferido de acuerdo con la definición anterior es tal que el vector viral de ADN heterólogo donde la secuencia de ADN heteróloga está clonada dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc correspondiente al ARN antigenómico del virus del sarampión.
[0059] La unidad de transcripción adicional (ATU) se describe en la figura 2A; puede modificarse con la condición de que finalmente posibilite que el replicón obtenido en el vector cumpla la regla de seis.
[0060] La localización de la ATU dentro del ADNc obtenido del ARN antigenómico del virus del sarampión puede variar a lo largo de dicho ADNc. Sin embargo está localizado en tal sitio que se beneficiará del gradiente de expresión del virus del sarampión.
[0061] Este gradiente corresponde con la abundancia de ARNm de acuerdo con la posición del gen relativa al extremo 3' del molde. Por consiguiente, cuando la polimerasa opera sobre el molde (el ARN genómico y antigenómico o los ADNc correspondientes), sintetiza más ARN creado a partir de genes corriente arriba que de genes corriente abajo. Este gradiente de abundancia de ARNm es, sin embargo, relativamente suave para el virus del sarampión. Por lo tanto, la ATU o cualquier sitio de inserción adecuado para clonar la secuencia de ADN heteróloga puede propagarse a lo largo del ADNc, con una realización preferida para un sitio de inserción y especialmente en una ATU, presente en la parte N-terminal de la secuencia y especialmente dentro de la región corriente arriba del gen L del virus del sarampión y ventajosamente corriente arriba del gen M de dicho virus y más preferiblemente corriente arriba del gen N de dicho virus.
[0062] Dependiendo del sitio de expresión y el control de la expresión del ADN heterólogo, el vector de la invención permite la expresión de la secuencia de aminoácidos heteróloga como una proteína de fusión con una de las proteínas del virus del sarampión.
[0063] Como alternativa, el sitio de inserción de la secuencia de ADN en el ADNc del virus del sarampión puede elegirse de tal modo que el ADN heterólogo exprese la secuencia de aminoácidos heteróloga en una forma que no sea una proteína de fusión con una de las proteínas del virus del sarampión.
[0064] Como un ejemplo, esta secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno de un retrovirus seleccionado entre retrovirus del HIV.
[0065] En una realización particular de la invención, la secuencia de aminoácidos heteróloga codificada por el vector del virus recombinante del sarampión se obtiene de un antígeno de envuelta de un retrovirus HIV, especialmente del HIV-1.
[0066] En una realización preferida, esta secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN heteróloga se selecciona entre la gp160, la gp120 o la gp41 del HIV-1, o la gp140 del HIV-1, o una versión mutada de dichos antígenos.
[0067] Como el resultado de lo que se espera expresando el vector del virus recombinante del sarampión de la invención es la producción de una respuesta inmunitaria, especialmente una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, contra la secuencia de aminoácidos heteróloga codificada por el vector, se prefiere que la secuencia de ADN heteróloga usada sea una que codifique un antígeno o un antígeno mutado que posibilite la exposición de epítopos neutralizantes sobre el producto de expresión producido de dicho vector.
[0068] En una realización particular, la secuencia de aminoácidos heteróloga expresada, puede exponer epítopos que no son accesibles o no se forman en el antígeno nativo del que deriva la secuencia de aminoácidos heteróloga.
[0069] En una realización preferida de la invención, la secuencia de ADN heteróloga codifica gp160fV3, gp160fV1V2, gp160fV1V2V3, gp140fV3, gp140fV1V2, gp140fV1V2V3.
[0070] Se describen secuencias de aminoácidos heterólogas especialmente en la figura 1 y pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos partiendo de secuencias de antígenos o secuencias de ADN correspondientes
de dichos antígenos obtenidos de diversos aislados de HIV-1.
[0071] De acuerdo con una realización preferida de la invención, el vector del virus recombinante del sarampión se diseña de tal manera que las partículas producidas en las células auxiliares transfectadas o transformadas con dicho vector que contiene el ADN que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, originado de una cepa del virus del sarampión adaptada para la vacunación, permite la producción de partículas virales para su uso en composiciones inmunogénicas, preferentemente composiciones protectoras o incluso vacunas.
[0072] Entre las cepas del virus del sarampión adaptadas para vacunación, pueden citarse la cepa Edmonston B. y la cepa Schwarz, prefiriéndose la última y la distribuye la compañía Aventis Pasteur (Lyon Francia) como una cepa de vacunación autorizada del virus del sarampión.
[0073] Las secuencias de nucleótidos de la cepa Edmonston B. y de la cepa Schwarz, se han descrito en el documento WO 98/13505.
[0074] Para preparar el vector del virus recombinante del sarampión de la invención, los inventores han diseñado el plásmido pTM-MVSchw que contiene el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigenómico del virus del sarampión y una secuencia de control de la expresión adaptada que incluye un promotor y un terminador para la polimerasa T7.
[0075] El vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención es preferiblemente un plásmido.
[0076] La solicitud también describe los vectores depositados el 12 de junio del 2002:
pMV2(EdB)gp160[delta] CNCMI-2883 3HIV89.6P pMV2(EdB)gp160HIV89.6P CNCM I-2884 pMV2(EdB)gp140HIV89.6P CNCM I-2885 pMV3(EdB)gp140[delta] CNCM I-2886 V3HIV89.6P pMV2(EdB)-NS1YFV17D CNCM I-2887 pMV2(EdB)-EnvYFV17D CNCM I-2888.
[0077] I-2883 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp160fV3 + ELDKWAS de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21264 nt.
[0078] I-2884 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp160 de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21658 nt.
[0079] I-2885 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp140 de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21094 nt.
[0080] I-2886 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp140fV3(ELDKWAS) de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21058 nt.
[0081] I-2887 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen NS1 del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 20163 nt.
[0082] I-2888 es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen Env del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 20505 nt.
[0083] En una realización particular de la invención, el replicón contenido en el vector del virus recombinante del sarampión se diseña de acuerdo con el mapa de la figura 2 en el que « inserto » representa la secuencia de ADN heteróloga.
[0084] La solicitud también describe un vector del virus recombinante del sarampión en el que está presente una secuencia de ADN heteróloga obtenida del Virus de la Fiebre Amarilla (YFV), y ventajosamente seleccionada entre YFV 17D 204 comercializada por Aventis Pasteur con la marca comercial Stamaril®.
[0085] La solicitud también describe un vector del virus recombinante del sarampión en el que está presente una secuencia de ADN heteróloga obtenida del Virus del Nilo Occidental (WNV), y ventajosamente seleccionada entre la cepa neurovirulenta IS 98-ST1.
[0086] La invención también se refiere a un sistema de recuperación para el conjunto de virus recombinantes del sarampión que expresan una secuencia de aminoácidos heteróloga, que comprende una célula auxiliar determinada recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del virus del sarampión transfectadas con un vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención.
[0087] Aparecerán diversos aspectos de la invención en los siguientes ejemplos y en los dibujos.
Leyenda de las figuras
[0088] Figura 1. Construcciones de la glicoproteína Env del HIV1. (A) Construcciones de gp160 de longitud completa y mutantes fV3 -AAELDK-WASAA, fV1V2 y fV1V2V3 (de la parte superior a la inferior). Los sitios de restricción BbsI y MfeI usados para introducir la deleción fV3 en las otras construcciones están indicados. (B) Construcciones de gp140 que son iguales que gp160 excepto en que se han delecionado las regiones intracitoplasmática y transmembrana de gp41. Figura 2A. Mapa esquemático del plásmido pTM-MV Schw. Para construir la secuencia completa, se generaron los seis fragmentos representados en la parte superior y se recombinaron paso a paso usando los sitios de restricción únicos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima en cabeza de martillo; hfv = ribozima de la hepatitis delta; T7t = terminador de la ARN polimerasa T7. Figura 2B. Vectores MV usados para insertar las construcciones Env del HIV. Se indican las 3 posiciones de inserción diferentes en el genoma del MV. Figura 3. Expresión de glicoproteínas de envuelta del HIV-1 en el MV recombinante. Células vero se infectaron con virus recombinantes HIV-1/MV durante 48 horas y la expresión de las glicoproteínas del HIV y N del MV se determinó por transferencia de western. Se redisolvieron 50 μg de cada lisado celular en SDS-PAGE al 4-12%, se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa y se exploraron con anticuerpos (A) anti-HIV gp120 (Chessie 1339.1, NIH) y (B) anti-MV N (MAB 8906, Chemicon) monoclonales de ratón. Después, las proteínas se detectaron usando un kit de detección ECL. La estabilidad de la expresión transgénica en los rMV se determinó después de pases en serie en células Vero. La expresión de las proteínas del HIV y MV se comparó entre virus de los pases 2 y
4. Carril 1: rMV que contiene HIV-1 gp140 en posición 2; Carril 2: rMV que contiene HIV-1 gp160 en posición 2; Carril 3: rMV que contiene HIV-1 gp140ΔV3 en posición 3; Carril 4: rMv que contiene HIV-1 gp160ΔV3 en posición 2. Figura 4. Cinética de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV recombinantes en células Vero. Se infectaron células en placas de 35 mm con virus recombinantes a diferentes MOI (indicadas). En cada momento puntual, las células se recogieron y se determinaron los títulos de virus asociados a células usando el método de DICT50 en células Vero.
(A) Infecciones con MV EdB-tag y diferentes virus recombinantes MV-HIV a MOI = 0,0001. (B) Infecciones con MV2gp160HIV a dos diferentes MOI (0,0001 y 0,01). Figura 5. Respuestas inmunitarias humorales anti-HIV y anti-MV en ratones inoculados con virus recombinantes MVEdB-EnvHIV . Cuatro grupos de 3 ratones se inmunizaron con 107 DICT50 de cada virus MV-HIV recombinante. Los títulos de los anticuerpos contra el MV (A) y el HIV Env (B) se determinaron por ELISA en sueros recogidos 28 días después de la inoculación. Figura 6. Actividades neutralizantes contra Bx08 de sueros de ratones inmunizados con virus MV2gp140HIV89.6 y MV2-gp160HIV89.6. Se proporcionó aislado primario Bx08 por C. Moog (Estrasburgo, Francia) y se propagó una vez en PBMC estimuladas con PHA para obtener soluciones madre virales. Se incubaron 2 ng de virus durante 30 min. a 37ºC con 25μl de cada suero de ratón (recogido un mes después de la infección) antes de la infección de células P4R5 en una placa de 96 pocillos. Las células después se cultivaron en DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10% hasta 2 días después de la infección, momento en el cual se midió la actividad β Galactosidasa con un ensayo de quimioluminiscencia (Roche, Alemania). Carril 1: suero de un ratón inmunizado con MVEdB-Tag; Carril 2: suero de un ratón inmunizado con MV2-gp140HIV-1; Carril 3: suero de un ratón inmunizado con MV2-gp160HIV-1; Carril 4: células no infectadas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Figura 7. La vacuna candidata Edm-HIV Env estimula linfocitos específicos de env in vivo. Se inocularon dos grupos de 3 ratones con 107 DICT50 de virus MV2-gp160HIV, y se sacrificaron por eutanasia 7 días y 1 mes después de la inoculación. (A) Ensayos ELISpot realizados con esplenocitos de ratones inmunizados. Estimulación con proteína purificada HIV-gp120 (negro) o BSA irrelevante (blanco). (B) Los esplenocitos recogidos 7 días después de la inmunización se estimularon con medio solo (panel de la izquierda), gp120 de HIV (panel medio) o virus EdB-tag
(panel de la derecha). La citofluorometría de tres colores detectó linfocitos tanto CD8+ (panel superior) como CD4+ (panel inferior) productores de γ-IFN después de estimulación con gp120 de HIV y virus del sarampión. Los porcentajes se dan de acuerdo con las entradas totales de linfocitos CD8+ (panel superior) y CD4+ (panel inferior) respectivamente. Figura 8. Representación esquemática de la unidad de transcripción adicional (ATU) y el plásmido del vector de MV Schwarz. (A) Elementos de acción en cis de la ATU insertada en la posición 2 entre las fases de lectura abierta de MV de fosfoproteína (P) y matriz (M). (B). Representación de las tres posiciones de inserción de ATU en el plásmido del vector de MV Schwarz. Figura 9. Expresión de proteínas YFV por MV recombinante. Se infectaron células Vero por MV recombinantes EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV a una MOI de 0,01. La inmunofluorescencia se realizó usando un suero de ratón policlonal anti-YFV y un anticuerpo secundario Cy3 anti-IgG de ratón. Todos los sincitios observados en células Vero infectadas fueron positivos. Figura 10. Exposición con YFV. Se inocularon seis ratones de 4 semanas de edad con una mezcla de virus EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV (107 DICT50) y se inocularon 6 ratones de control con la misma dosis de virus EdB-tag convencional. Después de 1 mes, se determinaron las serologías anti-MV y se observó un nivel similar de anticuerpos en los dos grupos. Se expuso a los ratones y se observó la mortalidad. Figura 11. Secuencia completa de nucleótidos del plásmido pTM-MVSchw (CNCM I-2889). La secuencia puede describirse del siguiente modo con referencia a la posición de los nucleótidos:
-
1-8 sitio de restricción NotI
-
9-28 promotor T7
-
29-82 ribozima en cabeza de martillo
-
83-15976 antigenoma de MV Schwarz
-
15977-16202 ribozima del HDV y terminador T7
-
16203-16210 sitio de restricción NotI
-
16211-16216 sitio de restricción ApaI
-
16220-16226 sitio de restricción KpnI
-
16226-18967 plásmido pBluescript KS(+) (Stratagene)
Figura 12: Las secuencias flavivirales que se han expresado en MV son las siguientes: Figura 12A: sec YFV Env: Es la secuencia Env YFV 17D204 clonada por los inventores. pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 51 péptido señal de Env pos 52 a 1455 secuencia de Env pos 1456 a 1458 codón PARADA
Los codones de parada e inicio se han añadido. Figura 12B: sec YFV NS1: Es la secuencia NS1 YFV 17D204 clonada por los inventores pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 78 péptido señal de NS1 pos 79 a 1110 secuencia de NS1 pos 1111 a 1113 codón PARADA
Los codones parada e inicio se han añadido. Figura 12C: sec WNV Env: Es la secuencia Env WNV clonada por los inventores. pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 51 péptido señal de env pos 52 a 1485 secuencia de Env pos 1486 a 1488 codón PARADA
Los codones parada e inicio se han añadido. Figura 12D: sec WNV NS1: Es la secuencia NS1 WNV clonada por los inventores. pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 78 péptido señal de NS1 pos 79 a 1104 secuencia de NS1 pos 1105 a 1107 codón PARADA pos 1108 a 1110 codón PARADA (se añade un segundo para respetar la regla de seis.) Los codones parada e inicio se han añadido.
Ejemplo I: Los virus recombinantes del sarampión que expresan la glicoproteína de envuelta nativa de HIV1 subtipo B, o envueltas con bucles variables delecionados, inducen respuestas inmunitarias humorales y celulares [0089] La preparación de una vacuna contra el HIV con su formidable capacidad de evadir las respuestas inmunitarias del hospedador es ciertamente una tarea desalentadora. Sin embargo, lo que hemos aprendido acerca de la inmunopatogénesis de la infección y los resultados ya obtenidos con modelos animales indican que puede ser posible (Mascola, J. R., y G. J. Nabel. 2001. Vaccines for prevention of HIV-1 disease. Immunology. 13:489-495). De forma ideal, una inmunización preventiva debería inducir 1) anticuerpos que neutralicen aislados primarios, evitando
de este modo la entrada en células hospedadoras, y 2) CTL que eliminen las células que no obstante se infectaron. Los anticuerpos y CTL deberían estar dirigidos a epítopos conservados que son críticos para la entrada del virus y la replicación en células hospedadoras.
[0090] Varios estudios, en particular con diversas vacunas candidatas, muestran que una buena respuesta inmunitaria celular podría ser capaz de controlar la carga viral, aunque no de eliminar el agente (Mascola, J. R., y G.
J. Nabel. 2001. Vaccines for prevention of HIV-1 disease. Immunology. 13:489-495). Por otro lado, las respuestas inmunitarias humorales inducidas hasta ahora por vacunas de subunidad han sido decepcionantes, principalmente porque los anticuerpos inducidos no neutralizaron los aislados primarios de HIV. Por ejemplo, vacunas recombinantes que expresaba Env de SIV fueron capaces de proteger a macacos contra una exposición homóloga, pero no heteróloga (Hu, S., et al 1996. Recombinant subunit vaccines as an approach to study correlates of protection against primate lentivirus infection. Immunology Letters. 51:115-119). La inmunización con ADN combinada con refuerzo con gp recombinante soluble podría proteger a macacos contra una exposición heteróloga pero solamente contra una cepa de SIV genéticamente relacionada con la vacuna (Boyer, J. et al 1997. Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination. Nature Medicine. 3:526-532). Más recientemente, diversos regímenes « sensibilización-refuerzo », usando combinaciones de ADN desnudo y vectores virales tales como MVA (Amara, R. et al. 2001. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science. 292:69-74) o adenovirus (Shiver, J. W., et al 2002. Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity. Nature. 415:331-335), dieron protección razonable contra una exposición con SHIV89.6P patogénico. La « sensibilización-refuerzo» podría no ser un requisito absoluto ya que el uso de vacuna atenuada viva recombinante contra el poliovirus protegió a macacos contra una exposición con SIV251 (Crotty, S., et al 2001. Protection against simian immunodeficiency virus vaginal challenge by using Sabin poliovirus vectors. J Virol. 75:7435-7452). Es interesante observar que en todos estos experimentos, incluso cuando los animales no estuvieron protegidos contra la infección, la inmunización retrasó, o incluso anuló, la enfermedad clínica.
[0091] Como se muestra por cristalografía, los bucles V1 y V2 de gp120 enmascaran el sitio de unión a CD4 y el bucle V3 enmascara los sitios de unión para los co-receptores CXCR4 y CCR5 (Kwong, P. D., et al. 2000. Structures of HIV-1 gp120 envelope glicoproteins from laboratory-adapted and primary isolates. Structure Fold Des. 8:13291339; Kwong, P. D. et al. 1998. Structure of an HIV gp120 envelope glicoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature. 393:648-659; Kwong, P. D., et al. 2000. Oligomeric modeling and electrostatic analysis of the gp120 envelope glicoprotein of human immunodeficiency virus. J Virol. 74:1961-1972). A pesar de esto, están presentes anticuerpos contra el sitio de unión a CD4 de gp120 en los sueros de individuos seropositivos para HIV y son capaces de neutralizar varios aislados de HIV-1 en ensayos in vitro (Burton, D. 1997. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94:10018-10023; Hoffman, T. L et al., 1999. Stable exposure of the coreceptor-binding site in a CD4-independent HIV-1 envelope protein. Proc Natl Acad Sci USA. 96:6359-6364). Además, algunos epítopos que están ocultos en la estructura 3-D de la glicoproteína pero llegan a exponerse después de unirse al co-receptor, pueden inducir anticuerpos altamente neutralizantes (Muster, T., et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J Virol. 67:6642-6647). Además, se han obtenido anticuerpos monoclonales neutralizantes de células B de pacientes (Parren, P. W., et al. 1997. Relevance of the antibody response against human immunodeficiency virus type 1 envelope to vaccine design: Immunol Lett. 57:105-112). Están dirigidos a los epítopos lineales gp41 (2F5) (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J Virol. 67:6642-6647), o a los epítopos conformacionales gp120 (2G12, 17b, 48db12) (Thali, M., et al. 1993, Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J Virol. 67:3978-3988; Trkola, A., et al. 1996. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glicoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 70:1100-1108). Usados en sinergia pueden neutralizar varios aislados primarios in vitro (Mascola, J. R. et al. 1997. Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary isolates by hiperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12, J Virol. 71:7198-7206) y proteger a macacos contra una exposición en la mucosa con SHIV (Baba, T. W. et al. 2000. Human neutralizing monoclonal antibodies of the IgG 1 subtype protect against mucosal simian-human immunodeficiency virus infection. Nat Med. 6:200-206; Mascola, J. R., et al. 1999. Protection of Macaques against pathogenic simian/human immunodeficiency virus 89.6PD by passive transfer of neutralizing antibodies. J Virol. 73:4009-4018; Mascola, J. R., et al. 2000. Protection of macaques against vaginal transmission of a pathogenic HIV-1/SIV chimeric virus by passive infusion of neutralizing antibodies. Nat Med. 6:207-210). Sin embrago, en personas infectadas, todos estos anticuerpos están presentes en cantidades muy bajas, diluidos en grandes cantidades de anticuerpos no neutralizantes dirigidos principalmente a los bucles V1, V2 y V3 de gp120 antigénicamente variables. Por lo tanto, es de esperar que si se pudieran inducir elevados niveles de dichos anticuerpos de neutralización cruzada podría conseguirse al menos algún grado de protección. Un objetivo principal es diseñar un vector que favorezca la producción de dichos anticuerpos neutralizantes.
[0092] Por esta razón, diseñamos por ingeniería genética gp160 (anclada) y gp140 (soluble) mutantes delecionando los bucles hipervariables V1, V2 y V3 individualmente o en combinación para exponer los epítopos conservados e inducir anticuerpos capaces de neutralizar aislados primarios. En algunas de las construcciones, también remplazamos el bucle V3 por la secuencia AAELDKWASAA, especialmente la secuencia ELDKWAS flanqueada en
ambos lados por dos alaninas para mantener la conformación de este epítopo conservado gp41 normalmente oculto en la proteína nativa pero capaz de inducir anticuerpos neutralizantes de amplio espectro (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 67:6642-6647; Binley, J. M., et al. 2000. A recombinant human immunodeficiency virus type 1 envelope glicoprotein complex stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp 120 and gp41 subunits is an antigenic mimic of the trimeric virionassociated structure. J Virol. 74:627-643; Sanders, R. W., et al. 2000. Variable-loop-deleted variants of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glicoprotein can be stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp120 and gp41 subunits. J Virol. 74:5091-5100). La estructura alfa helicoidal normal de este péptido debe conservarse cuando se expone en nuestras construcciones en el extremo de un bucle V3 delecionado. Estas construcciones, en las que los "señuelos inmunológicos" se han eliminado y se han expuesto los epítopos neutralizantes, deberían ser buenos candidatos para la inducción de fuertes respuestas de anticuerpos neutralizantes.
[0093] Las construcciones de gp de HIV se introdujeron en un vector de vacuna contra el sarampión porque induce títulos muy elevados (1/80.000) de anticuerpos neutralizantes anti-sarampión. (Esto es probablemente porque se replica en una gran cantidad de células de diferentes tipos.) Se puede esperar, por lo tanto, que la respuesta de anticuerpos contra las gp de HIV diseñadas por ingeniería genética también sea potente. Además, la vacuna contra el sarampión también es un potente inductor de respuestas celulares de larga duración.
Construcción de glicoproteínas de envuelta mutantes de HIV-1.
[0094] Las glicoproteínas de envuelta usadas en este estudio (Figura 1) se obtuvieron de SHIV89.6P, un virus quimérico de la inmunodeficiencia de simios/humana que contiene los genes tat, rev, vpu y env de HIV1 en un transfondo SIVmac239 (Reimann, K. A., et al. 1996. A chimeric simian/human immunodeficiency virus expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate env causes an AIDS- like disease after in vivo passage in rhesus monkeys. J Virol. 70:6922-6928). El gen env se obtiene de un aislado primario citopático de HIV1, 89.6, que tiene tropismo tanto por macrófagos como por células T (Collman, R., et al. 1992. An infectious molecular clone of an unusual macrophage-tropic and highly cytopathic strain of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 66:7517-7521). La secuencia de env se amplificó a partir del plásmido pSHIV-KB9 (NIH) que se clonó previamente después de pases in vivo del virus original (Karlsson, G. B., et al. 1997. Characterization of molecularly cloned simian-human immunodeficiency viruses causing rapid CD4+ lymphocyte depletion in rhesus monkeys. J Virol. 71:4218-4225). La env de longitud completa (gp160) se amplificó por PCR (polimerasa Pfu) usando cebadores que contienen los sitios BsiWI y BssHII únicos para la posterior clonación en el vector del sarampión: 160E5 (5'-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3') y 160E3 (5'ATAGCGCGCATCACAAGAGAGTGAGCTCAA-3'). La secuencia env correspondiente a la forma secretada (gp140) se amplificó usando los cebadores 160E5 y 140E3 (5'-TATGCGCGCTTATCTTATATACCACAGCCAGT-3'). Se añadieron un codón de inicio y un codón de parada en ambos extremos de los genes así como varios nucleótidos después del codón de parada para respetar la "regla de seis", que estimula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser un múltiplo de 6 (Calain, P., y L. Roux. 1993. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J Virol. 67:4822-4830; Schneider, H., et al. 1997. Recombinant measles viruses defective for RNA editing and V protein synthesis are viable in cultured cells. Virology. 227:314-322). Ambos fragmentos gp160 y gp140 de env se clonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron para comprobar que no se habían introducido mutaciones.
[0095] Se generaron mutantes con deleciones de bucles por amplificación por PCR de dos fragmentos solapantes que flanqueaban la secuencia a delecionar e hibridando estos fragmentos por PCR. Para remplazar la secuencia V3 por la secuencia AAELDKWASAA que contenía el epítopo gp41 (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 67:6642-6647), se diseñaron cuatro cebadores en ambos lados de los sitios BbsI y MfeI que abarcan la secuencia V3: fV3A1 (5'-ATAAGACATTCAATGGATCAGGAC3'), fV3A2 (5'TGCCCATTTATCCAATTCTGCAGC-ATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATT-3'), fV3B1 (5'-GATAAATGGGCAAGTGCTGCAAGA-CAAGCACATTGTAACATTGT-3'), y fV3B2 (5'-CTACTCCTATTGGTTCAATTCTTA-3'). Las secuencias subrayadas en fV3A2 y fV3B1 corresponden al epítopo AAELDKWASAA con un solapamiento de 12 nucleótidos. Las amplificaciones por PCR con los pares de cebadores fV3A1/fV3A2 y fV3B1/fV3B2 produjeron dos fragmentos de 218 y 499 pb respectivamente. Después de purificación en gel, estos fragmentos se hibridaron juntos por 15 ciclos de PCR sin cebadores y se amplificaron con los cebadores fV3A1/fV3B2. El fragmento resultante de 705 pb se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO y se secuenció. Después de digestión por BbsI y MfeI, se purificó el fragmento que carecía de la secuencia que codifica el bucle V3 (fV3-AAELDKWASAA) y se introdujo en lugar del fragmento correspondiente en la gp160 y gp140 en plásmidos pCR2.1-TOPO.
[0096] Los mutantes fV1V2 se produjeron usando el mismo procedimiento. Se amplificaron dos fragmentos en ambos lados del bucle V1 V2 usando los siguientes cebadores: 160E5 (5'-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3'), fV1V2A1 (5'-ATTTAAAGTAACAC-AGAGTGGGGTTAATTT-3'), fV1V2B1 (5'-GTTACTTTAAATTGTAACACCTCAGTC-ATTACACAGGCCTGT-3'), fV1V2B2 (5'-TTGCATAAAATGCTCTCCCTGGTCCTATAG-3'). Las secuencias subrayadas en fV1V2A1 y fV1V2B1 corresponden a un solapamiento de 12 nucleótidos generado entre los dos fragmentos. Las amplificaciones por PCR
con los pares de cebadores 160E5/fV1V2A1 y fV1V2B1/fV1V2B2 produjeron dos fragmentos de 400 y 366 pb respectivamente. Después de purificación en gel, estos fragmentos se hibridaron juntos por ciclos de 15 PCR son cebadores y se amplificaron con los cebadores 160E5/fV1V2B2. El fragmento de 766 pb resultante se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO y se secuenció. Después de digestión con BsiWI (en el cebador 160E5) y BbsI, se purificó el fragmento que carecía de la secuencia que codifica el bucle V1V2 y se introdujo en lugar del fragmento correspondiente en la gp160 y gp140 en plásmidos pCR2.1-TOPO.
[0097] Para obtener los mutantes fV1V2V3, se introdujo el fragmento BsiWI/Bbsl que carece de la secuencia que codifica el bucle V1V2 en lugar del fragmento correspondiente en los plásmidos pCR2.1-TOPO-gp140fV3 y pCR2.1TOPO-gp160fV3.
[0098] Después de digestión con BsiWI/BssHII de los diferentes plásmidos pCR2.1-TOPO, se clonaron las secuencias nativa y mutante de gp160 y gp140 en el vector EdB-tag en la posición de ATU 2 y la posición de ATU 3 (Figura 2B).
Recuperación de virus MVEdB-EnvHIV89.6 recombinante.
[0099] Para recuperar los virus MVEdB-HIV recombinantes de los plásmidos, se usaron los diferentes plásmidos EdB-HIV Env para transfectar células auxiliares 293-3-46.
[0100] Para recuperar el virus del sarampión del ADNc de los plásmidos EdB-HIV-Env, se usó el sistema de recuperación basado en células auxiliares descrito por Radecke et al. (Radecke, F., et al. 1995. Rescue of measles virases from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y modificado por Parks et al. (Parks, C. L, et al. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J Virol. 73:3560-3566). Se cotransfectaron células auxiliares humanas que expresaban de forma estable la ARN polimerasa T7 y las proteínas N y P del sarampión (células 293-3-46, descritas por Radecke et al.) usando el procedimiento de fosfato cálcico con los plásmidos EdB-HIV-Env (5 μg) y un plásmido que expresaba el gen L de la polimerasa de MV (pEMC-La, 20 ng, descrito por Radecke et al.). El virus se recuperó después de co-cultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37ºC con células Vero de primate (riñón de mono verde africano). En este caso, aparecieron sincitios sistemáticamente en todas las transfecciones después de 2 días de cocultivo.
Expresión de glicoproteínas Env de HIV1 por MV recombinante.
[0101] Los virus recombinantes recuperados MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140fV3 y MV2-gp160fV3 se propagaron en células Vero y se analizó la expresión de las glicoproteínas Env de HIV por transferencia de western (Figura 3) e inmunofluorescencia. La infección de células Vero por virus MV2 recombinantes (con la inserción de transgén en la posición 2) mostró una elevada expresión de las Env gp160 y gp140 de HIV (Fig. 3A, carriles 1, 2,4). También se detectó la proteína Env recombinante escindida (gp120) (Fig. 3A, carriles 2,4). El virus MV3 (con inserción de transgén en la posición 3) expresó niveles inferiores de transgén, como se esperaba debido al gradiente de transcripción observado en la expresión de MV (Fig. 3A, carril 3). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la glicoproteína Env de HIV1 y el mutante fV3 se expresan de forma eficaz por los MV recombinantes.
Capacidad de crecimiento de los virus recombinantes MVEdB-EnvHIV89.6.
[0102] Para analizar la capacidad de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV89.6, se infectaron células Vero a diferentes MOI (0,01 y 0,0001), se incubaron a 37ºC, y se recogieron en diferentes momentos puntuales. Se determinaron los títulos de virus asociados a células para cada muestra usando el método de DICT50 en células Vero. La Figura 4 muestra que usando una MOI de 0,0001, se retardaba la cinética de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV89.6, en comparación con MVEdB-tag convencional. Sin embargo, usando una MOI de 0,01, la producción de virus recombinantes era comparable con la de virus convencionales, y se obtenían fácilmente títulos máximos de 107 DICT50/ml o incluso mayores.
Inmunizaciones de ratones
[0103] Se obtuvieron ratones susceptibles a infección por MV como se ha descrito previamente (21). Se cruzaron ratones FVB transgénicos heterocigóticos para CD46 (32), el receptor para las cepas de vacuna de MV (24), con ratones 129sv IFN-a/�R-/- que carecían del receptor de interferón tipo I (22). La descendencia F1 se exploró por PCR y los animales CD46 +/- se cruzaron de nuevo con ratones 129sv IFN-a/�R-/-. Los animales IFN-a/�R-/- CD46+/-se seleccionaron y usaron para experimentos de inmunización. Ya se ha demostrado que el mismo tipo de ratones es susceptible a infección por MV (20, 21).
[0104] Se inocularon ratones hembra CD46+/-IFN-a/�R-/-de seis semanas de edad por vía intraperitoneal con 107DICT50 de virus recombinantes MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140fV3 o MV2-gp160fV3 preparados y titulados como se ha descrito anteriormente. Los ratones se sacrificaron por eutanasia 7 días y 1 mes después de la infección. Se recogieron los bazos y la sangre completa. Se extrajeron los esplenocitos de los bazos y se mantuvieron congelados en nitrógeno líquido hasta su uso. Se decantaron los sueros y se analizó la serología por
ELISA para MV (Trinity Biotech, EEUU) y HIV (Sanofi Diagnostics, Francia).
Respuesta inmunitaria humoral contra virus recombinantes recuperados
[0105] Las respuestas inmunitarias humorales contra el MV y la Env del HIV se analizaron por ELISA en sueros recogidos 1 mes después de la inmunización de los ratones. Los títulos se determinaron por diluciones limitantes. Los resultados presentados en la Figura 5 demuestran que todos los ratones vacunados respondieron al sarampión con altos títulos de anticuerpos (1/50000 a 1/80000) y a la Env del HIV Env con títulos entre 1/1000 y 1/5000 dependiendo de la secuencia insertada. Los títulos de anticuerpo entre MV y HIV no pudieron compararse porque el ELISA usado no tenía la misma sensibilidad. El ELISA del MV (Trinity Biotech, Estados Unidos) detectó la respuesta completa contra todas las proteínas del MV, mientras que el ELISA del HIV (Sanofi Diagnostics) solo detectó los anticuerpos anti-Env del HIV. La capacidad de estos sueros para neutralizar un aislado primario del HIV subtipo B se ensayó usando células indicadoras, P4R5, que expresaban beta-galactosidasa cuando se infectaban con HIV (células HeLa-CD4-CXCR4-CCR5-HIV LTR-LacZ). En experimentos preliminares, se ensayaron sueros de ratones inmunizados con virus MV-HIV recombinantes que expresaban glicoproteínas de envuelta nativas (MV-gp160HIV-1 o MVEdB-gp140HIV89,6). Los resultados mostraron que estos sueros tenían una actividad neutralizante del 70-50% contra un aislado primario, Bx08, cuando se usaban a una dilución de 1/20 (Figura 6). La actividad neutralizante de los sueros producidos contra las moléculas Env modificadas por ingeniería genética está actualmente en estudio.
Respuestas inmunitarias celulares contra virus recombinantes recuperados. [0106] Se ensayó la capacidad de esplenocitos de ratones vacunados de secretar γ-IFN después de estimulación in vitro por citometría de flujo y ensayos ELISpot. Se descongelaron células de ratones inmunizados 18 h antes de los ensayos funcionales y se incubaron en medio RPMI complementado con FCS al 10% calentado a 56ºC (Gibco) y 10 U de rh-IL2 (Boehringer Mannheim). La viabilidad celular se evaluó por exclusión de azul de tripano.
[0107] Para realizar el ensayo ELISpot de γ-IFN, se recubrieron placas multiscreen-HA de 96 pocillos con anticuerpo de captura anti-γ-IFN de ratón (R4-6A2, Pharmingen) en solución de PBS (6 μg/ml). Después de incubación durante una noche a 4ºC, los pocillos se lavaron 4 veces con PBS. Los sitios de unión a proteína restantes se bloquearon incubando los pocillos con 100 μl de RPMI/FCS al 10% durante 1 h a 37ºC. El medio se retiró justo antes de la adición de las suspensiones celulares (100 μl) y los agentes de estimulación (100 μl). Los esplenocitos de ratones inmunizados se sembraron en placas a 5.105 células por pocillo por duplicado en RPMI. Se usó concanavalina A (5 μg/ml, Sigma) como control positivo, y RPMI/IL2 (10 U/ml) como control negativo. Las células se estimularon con 1 μg/ml de gp120 de HIV1, 1 μg/ml de albúmina sérica bovina (Sigma), o virus Edm-Tag (MOI = 1). Después de incubación durante 2 h a 37ºC para la adsorción viral, se añadió FCS calentado (10 μl) en cada pocillo (concentración final del 10%) y las placas se incubaron durante 24-36 h a 37ºC. Para retirar las células, las placas se lavaron dos veces con PBS, 4 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (Sigma), y 2 veces de nuevo con PBS. Para la detección, se añadió un anticuerpo biotinilado anti-γ-IFN de ratón (XMG1.2, Pharmingen) a cada pocillo (100 μl, 4 μg/ml en PBS-FCS al 0,1%). Después de incubación durante 2 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron 4 veces con PBS-tween 20 al 0,1% y dos veces con PBS. Se añadió conjugado estreptavidinafosfatasa alcalina (AP del inglés Alkaline Phosphatase) (Roche) (100 μl, dilución 1/2000 en PBS) y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La enzima se retiró por 4 lavados con PBS-Tween 20 al 0,1% y 2 lavados con PBS. Las manchas después se revelaron con sustrato de color BCIP/NBT (Promega) preparado en tampón AP pH 9,5 (Tris 1 M, NaCl 1,5 M, MgCl2 0,05 M). Los pocillos se controlaron para la formación de manchas a simple vista: después de una incubación de 15-30 minutos, la reacción se detuvo por lavado bajo un chorro de agua corriente. Después de secar al menos durante una noche a temperatura ambiente, las manchas coloreadas se contaron usando un sistema de análisis de imágenes automatizado ELISpot Reader (Bio-Sys).
[0108] Para ensayos de citometría de flujo, se estimularon 5 105 esplenocitos (diluidos en 100 μl de RPMI) en placas de 96 pocillos con fondo en V con 1 μg/ml de proteína gp120 de HIV1 (AbCys) en RPMI/IL2 (10 U/ml), o virus EdBtag (MOI = 1) diluido en 100 μl de RPMI/IL2. Las células de control no estimuladas se incubaron con RPMI/IL2 (10 U/ml). Después de incubación durante 2 h a 37ºC para la adsorción viral, se añadieron 10 μl de FCS en cada pocillo (concentración final del 10%) y las placas se incubaron durante una noche a 37ºC. El medio después se remplazó por 150 μl de RPMI-FCS al 10% que contenía 10 U de rh-IL2 y 10 μg/ml de Brefeldina A (Sigma). Las células se incubaron durante 4 horas a 37ºC, se recogieron, se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 de ratón-APC (Pharmingen) y anticuerpo anti-CD4 de ratón-CyCr (Pharmingen) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS-BSA (0,5%), después se fijaron durante 5 minutos a 37ºC en CytoFix (Pharmingen). Después del lavado, las células se resuspendieron en 100 μl de PBS-BSA (0,5%) que contenía saponina al 0,1% (Sigma) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo anti-γ-IFN de ratón-PE (Pharmingen). Las células se lavaron de nuevo y se analizaron las muestras usando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson). Los datos se analizaron usando el software Cell Quest.
[0109] Los resultados de estos experimentos realizados con esplenocitos de ratones inmunizados con virus MV2gp160HIV (Figura 7) demostraron que una única inmunización con virus MV2-gp160HIV fue capaz de sensibilizar linfocitos específicos de Env de HIV in vivo. El ensayo ELISpot de γ-IFN es un método sensible para el recuento de células específicas de antígeno en células frescas después de inmunización in vivo. Este ensayo se usó para
determinar si podía detectarse células secretoras de γ-IFN específicas de Env de HIV después de una única inmunización con el virus MV2-gp160HIV. La Figura 7A muestra que estaba presente una cantidad significativa de células específicas de Env en 2/3 de los ratones ensayados, 7 días así como 1 mes después de la inmunización. (Para un ratón en cada grupo la cantidad de manchas fue la misma después de estimulación con BSA o gp120). La cantidad de manchas específicas de HIV detectadas (hasta 600/106 células) representa el 15-20% de las manchas específicas de MV detectadas en los mismos ratones (no mostrado), lo que indica que el MV recombinante es capaz de inmunizar de forma eficaz contra el gen extraño expresado.
[0110] Para evaluar el fenotipo de estas células específicas de Env, se realizaron experimentos de citofluorometría de 3 colores en ratones sacrificados por eutanasia 7 días después de la inmunización, en un máximo teórico de proliferación de células efectoras. Se muestra un resultado representativo en la Figura 7B. En nivel de fondo y de producción de γ-IFN para linfocitos tanto CD4+ como CD8+ se muestra en el panel de la izquierda. Para este animal, el 0,09% de los linfocitos CD8+ (media calculada para 3 ratones: 0,31%) y el 0,25% de los linfocitos CD4+ (media: 0,41%) eran espontáneamente productores de γ-IFN. Las frecuencias de células T contra HIV-gp120 (panel medio) en los subconjuntos CD8+ y CD4+ fueron del 1,76% (media: 1,69%) y el 0,92% (media: 0,76%) respectivamente. Es interesante tener en cuenta que en el mismo ratón inmunizado, las frecuencias de células específicas del sarampión en los subconjuntos CD8+ y CD4+ fueron del 7,63% (media: 7,03%) y el 4,11% (media: 3,50%) respectivamente. De hecho, el virus recombinante MV2-gp160HIV expresa 6 proteínas del sarampión más una proteína extraña gp160. Por tanto, las frecuencias de linfocitos específicos de antígeno siguieron las proporciones de genes recombinantes. Como conclusión, la citofluorometría de 3 colores realizada 7 días después de la vacunación con virus MV2gp160HIV mostró que se sensibilizaban linfocitos tanto CD8+ (Fig. 7B, panel superior) como CD4+ (Fig. 7B, panel inferior) específicos de gp120 de HIV y virus del sarampión in vivo.
[0111] En conclusión, se demostró que los virus recombinantes MV-EnvHIV eran capaces de inducir buenos niveles de respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares contra la Env del HIV en ratones susceptibles a infección por MV. Datos preliminares indican que estos anticuerpos eran neutralizantes para un aislado primario del HIV subtipo B. En el futuro, estos virus recombinantes se someterán a ensayo en macacos que son mucho más susceptibles al MV que los ratones transgénicos y que pueden desarrollar, por lo tanto, buenas respuestas inmunitarias usando dosis más bajas de vacunas. Usando la cepa Schwarz clonada como un vector pueden prepararse los mismos recombinantes. Esto provocaría aún más su inmunogenicidad.
Ejemplo II: Virus recombinantes del sarampión que expresan diferentes transgenes virales
[0112] Para demostrar las capacidades inmunizantes y protectoras de MV como vector pediátrico de vacunación, se construyó y estudió una serie de virus recombinantes del sarampión que expresaban diferentes transgenes virales (enumerados a continuación) a partir de otros virus. Los resultados presentados aquí se obtuvieron con el antiguo vector EdB-tag. Sin embargo, hemos demostrado que EdBtag era 100 veces menos inmunogénico que la vacuna Schwarz. Por tanto, se inocularon virus recombinantes MVEdB a dosis más elevadas. Todas las secuencias insertadas con buenos registros inmunológicos pueden insertarse obviamente en el vector Schwarz.
Genes virales que ya se han insertado en los virus recombinantes del sarampión:
[0113]
HIV subtipo B89.6P
gp160 gp140
gp160fV3
gp140fV3
gp160fV1V2
gp140fV1V2
gp160fV1V2V3
gp140fV1V2V3
tat
Gag de codones optimizados consenso de HIV subtipo B (p17-p249)
[0114]
SIV Mac 239 Nef NeffMyr Nef29-236 Tat
HTLV-I Env Gag (P19-p24) Tax
Ejemplo III: Virus recombinantes del sarampión que expresan Env y NS1 del virus de la fiebre amarilla tienen capacidad inmunitaria (ejemplo comparativo)
[0115] Como una vacuna bivalente pediátrica contra el sarampión y la fiebre amarilla debe ser útil, construimos MV recombinante que expresaba las proteínas Env y NS1 del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D204, cepa de vacuna Pasteur) y ensayamos su capacidad de proteger a ratones contra una exposición letal con YFV.
Construcción de plásmidos recombinantes MV-YFV.
[0116] El gen env se amplificó por PCR con la polimerasa Pfu usando cebadores que contienen sitios BsiWI y BssHII únicos para la posterior clonación en vector de MV: MV-YFVEnvS (5'-TATCGTACGATGCGAGTCGTGATTG CCCTACTG-3') y MV-YFVEnv3 (5'-ATAGCGCGCT-TATGTGTTGATGCCAACCCA-3'). La proteína Env generada de este modo (aminoácidos 270-753 en la poliproteína de YFV) contenía el péptido señal en el extremo N-terminal y una parte de la región transmembrana en el extremo C-terminal. La secuencia de NS1 se amplificó por PCR del mismo modo con la polimerasa Pfu usando los cebadores: MVYFVNS5 (5'-TATCGTACGATGAGAAACATGACAATG TCC-3') y MVYFVNS3 (5'- ATAGCGCGC-TTAATGGCTTTCATGCGTTTTCC-3'). La proteína NS1 (aminoácidos 7541122 en la poliproteína de YFV) contenía su secuencia del péptido señal. Se añadieron un codón de inicio y uno de parada en ambos extremos de los genes así como varios nucleótidos después del codón de parada para respetar la "regla de seis", que estipula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser un múltiplo de 6 (7). Ambos fragmentos env y NS1 se clonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron para comprobar que no se habían introducido mutaciones. Después de digestión con BsiWI/BssHII de los plásmidos pCR2.1-TOPO, se clonaron las secuencias de env y NS1 en el vector EdBtag en la posición ATU 2 dando los plásmidos: EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV.
Recuperación de los virus EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV recombinantes.
[0117] Se usaron los plásmidos EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV para transfectar células auxiliares 293-3-46 como se ha descrito anteriormente, y los virus recombinantes se recuperaron de las células transfectadas cocultivadas con célula Vero. Los virus recombinantes se pasaron dos veces en células Vero y se ensayaron para la expresión de transgenes.
Expresión de proteínas de YFV por MV recombinante.
[0118] Los virus recombinantes recuperados MV2-EnvYFV y MV2-NS1YFV se propagaron en células Vero y se analizó la expresión de proteínas de YFV por inmunofluorescencia. La Figura 9 muestra que sincitios de células Vero infectadas por virus recombinantes MV2-YFV mostraron una elevada expresión de las proteínas Env y NS1 de YFV detectadas con un suero policlonal de ratón anti-YFV. Para determinar si la expresión de los genes de YFV era estable, los virus recombinantes recuperados se pasaron en serie en células Vero. Después de 10 pases, todos los sincitios observados en células infectadas eran positivos para YFV (no mostrado). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las proteínas Env y NS1 de YFV se expresan de forma eficaz y estable durante varios pases por los MVs recombinantes.
Inmunización de ratones con virus recombinantes MV-YFV.
[0119] Se inoculó una mezcla de ambos virus MV2-EnvYFV y MV2-NS1YFV (107 DICT50) por vía intraperitoneal a seis ratones CD46+/-IFN-α/βR-/- como se ha descrito anteriormente (véanse los experimentos de MV-HIV gp). Como control, otros seis ratones recibieron la misma dosis de vacuna convencional contra el sarampión. Después de un mes, los ratones se expusieron por vía intracraneal con YFV 17D204 (10 DL50 determinada en ratones FVB). La Figura 10 muestra que el 65% de los animales inmunizados con MV-YFV estuvieron completamente protegidos contra la exposición, mientras que todos los animales vacunados con MV convencional murieron entre 6 y 7 días después de la exposición. Además, se observó un retardo de 4 días en la mortalidad en ratones inmunizados con MV-YFV, y estos ratones no murieron con los mismos síntomas clínicos encefálicos que los ratones vacunados con la vacuna convencional contra MV. La enfermedad se atenuó y constó de parálisis de las extremidades. Debe apreciarse que los ratones IFN-α/βR-/-son mucho más sensibles a infecciones virales que ratones inmunocompetentes (102-104 veces). Por esta razón, la dosis letal determinada en ratones inmunocompetentes fue probablemente demasiado elevada para ratones IFN-α/βR-/-. El mismo experimento está en marcha usando varias dosis decrecientes de virus de exposición YFV.
[0120] En conclusión, este experimento preliminar muestra que las respuestas inmunitarias inducidas por MV recombinante contra proteínas de YFV son capaces de proteger a ratones contra una exposición letal.
[0121] Las construcciones anteriores se crearon usando las secuencias descritas en la Figura 12A y 12B.
[0122] Se aplicarían los mismos principios para la preparación de construcciones con secuencias descritas en la Figura 12C y 12D.
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Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula de ADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra los ambos, el MV y dicho retrovirus, y en el que dicha molécula de ADNc comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11.
  2. 2.
    Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula de ADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra ambos, el MV y dicho retrovirus, y en el que dicha molécula de ADNc comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I-2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV.
  3. 3.
    MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se recupera de células auxiliares transfectadas con una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga retroviral, y cumpliendo dicha secuencia de nucleótidos recombinante la regla de seis.
  4. 4.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula de ADNc se selecciona entre las siguientes secuencias:
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15977 de la figura 11;
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la figura 11;
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la figura 11;
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 15977 de la figura 11;
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la figura 11;
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 15977 de la figura 11; y
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la figura 11.
  5. 5.
    MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es de un antígeno de envuelta del retrovirus del HIV.
  6. 6.
    MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es un antígeno gp160 recombinante o de gp120 recombinante del HIV-1.
  7. 7.
    MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 están delecionados, o delecionados en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados están expuestos sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.
  8. 8.
    MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 están sustituidos, o sustituidos en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados están expuestos sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.
  9. 9.
    MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el bucle V3 está sustituido por un epítopo gp41 tal como AAELDKWASAA.
  10. 10.
    MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga se selecciona entre:
    -
    un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp160ΔV3),
    -
    un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp160ΔV1V2),
    -
    un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp160ΔV1V2V3),
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp140ΔV3),
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp140ΔV1V2) y
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp140ΔV1V2V3).
  11. 11.
    MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que provoca una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un modelo animal susceptible al MV.
  12. 12.
    MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un modelo animal de mamífero susceptible al MV.
  13. 13.
    MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es de una proteína de envuelta del HIV-1 y que provoca anticuerpos capaces de neutralizar un aislado primario del HIV cuando se somete a ensayo en células indicadoras tales como células P4-CCR5.
  14. 14.
    MV recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un mamífero, con un título de al menos 1/40 000 cuando se mide en un ELISA.
  15. 15.
    Vector del virus recombinante del sarampión (MV) que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV unida operativamente a (ii) secuencias de control de expresión y (iii) una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga determinada de un retrovirus, estando dicha secuencia de ADN heteróloga clonada en dicho replicón en condiciones que permitan su expresión y teniendo dicho replicón un número total de nucleótidos que cumple con la regla de seis, en el que la secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigénico del MV es una molécula de ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11
    o que comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV.
  16. 16.
    Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia de ADN heteróloga está clonada dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc correspondiente al ARN antigenómico del MV.
  17. 17.
    Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU se selecciona corriente arriba desde el gen N del MV.
  18. 18.
    Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU se selecciona entre los genes P y M del MV.
  19. 19.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU está entre los genes H y L del MV.
  20. 20.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que la secuencia de ADN heteróloga se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas del MV.
  21. 21.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que la secuencia de ADN heteróloga no se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas del MV.
  22. 22.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácidos retroviral de un antígeno de un retrovirus seleccionado entre el retrovirus del HIV.
  23. 23.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácidos retroviral de un antígeno de envuelta de un retrovirus del HIV.
  24. 24.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácido retroviral seleccionada entre la gp160, la gp120 o la gp41 del HIV-1, o la gp140 del HIV-1.
  25. 25.
    Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica:
    -
    un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp160ΔV3),
    -
    un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp160ΔV1V2),
    5 - un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp160ΔV1V2V3),
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp140ΔV3),
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados 10 (gp140ΔV1V2) y
    -
    un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA(gp140ΔV1V2V3),
  26. 26. Vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que el ADNc que
    15 codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV y la secuencia de control de expresión son del pTM-MVSchw depositado en el CNCM con el Nº I-2889.
  27. 27. Vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, que es un plásmido.
    20 28. Un sistema de recuperación para el conjunto del virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga, que comprende una célula determinada transfectada con un vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 28, y una célula auxiliar determinada recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del MV.
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