JP7048482B2 - Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ欠失変異体、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ欠失変異体をコードする非酵母ベクター、及びそれらの使用 - Google Patents

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Description

関連する出願の相互参照
本特許出願は、参照により取り込まれる米国仮特許出願番号第62/200,438号（2015年8月3日に出願）の利益を主張する。
配列表
本明細書と同時に提出されたヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
発明の背景
Brachyury遺伝子は、中胚葉形成の阻止を特徴とするマウス発生変異体から、最初にクローニングされ (Hermannら、Nature 1990; 343:617-22)、原腸形成中の中胚葉発生において重要な遺伝子として認識されている。Brachyuryは、T-box転写因子と呼ばれる転写因子ファミリーのメンバーである；これらの因子は、保存されたDNA結合ドメインによって特徴づけられる (Papaioannouら、Bioessays 1998;20:9-19)。これらの転写因子は、脊椎動物における中胚葉の形成及びオーガナイゼーションにおいて、重要な役割を果たす （例えば、Edwardsら、Genome Res 1996;6:226-33を参照)。発生過程の調節におけるT-boxタンパク質の重要な役割に加えて、本ファミリーの幾つかのメンバーは、がんにおいて脱調節される。例えば、ヒトTbx2遺伝子は、膵臓がん細胞株において増幅されることが報告されており (Mahlamakiら、Genes Chromosomes Cancer 2002;35:353-8)、BRCA-1及びBRCA-2に変異を有する乳がんにおいて過剰に発現される (Sinclairら、Cancer Res 2002;62:3587-91)。加えて、Tbx3発現が、あるヒト乳がん細胞株において増強されることが示されている (Fanら、Cancer Res 2004;64:5132-9)。Brachyuryの発現はまた、ヒト奇形がん細胞株（胚細胞腫瘍のサブセット）（奇形がんは中胚葉分化能を有する胚性がん細胞である (Gokhaleら、Cell Growth Differ 2000;11:157-62)）、及び脊索腫においても確認されている (例えば、Vojovicら、J Pathol 2006;209:157-65を参照)。Brachyuryはまた、とりわけ乳房、肺、結腸、前立腺及び肝細胞のがん、及びＢ細胞起源の悪性腫瘍、例えば慢性リンパ性白血病 (CLL)、Ｂ細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫等を含む、多様なヒトがんにおいて過剰発現される。
がんに対する免疫療法的介入は、宿主に腫瘍細胞に対する免疫応答を起こすことができるがん抗原の特定に依存する。良好な標的は、悪性細胞によって選択的に発現される分子であり、それはまた悪性形質転換及び／又は腫瘍の進行のために重要な分子である。CD4及びCD8Ｔ細胞応答を含む、がんに対する効果的な免疫応答を誘導する剤についてのニーズが残っている。
本発明はBrachyury欠失変異体ポリペプチドを提供し、特に本発明は配列番号3のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチドを提供する。
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸、核酸を含む非酵母ベクター、細胞、及びその組成物、並びに使用の方法を提供する。
特に、本発明は、Brachyuryに対する免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の該ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、細胞又はその組成の組成物（composition the composition）を対象に投与することを含み、それにより該免疫応答を誘導し、該免疫応答がBrachyury特異的CD4+Ｔ細胞応答を含む、方法を提供する。
本発明は、対象におけるがんを治療又は予防するための方法であって、有効量の該ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、細胞又はその組成の組成物（composition the composition）を対象に投与することを含む、それにより該対象におけるがんを治療又は予防する、方法を提供する。
本発明はまた、対象におけるがん細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法が特異的抗原提示細胞を産生するよう、樹状細胞をポリペプチドと接触させること；及び対象に該特異的抗原提示細胞を投与することを含む、それにより免疫応答を誘導し、がん細胞の増殖を阻害する、方法を提供する。
図面の様々な視点の簡単な説明
図1A及び1Bは、マウスをAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1、Tri-Ad5及びAd5 [E1-, E2b-]-nullでワクチン接種後に、IFN-γ及びIL-2を発現する脾細胞の分析をそれぞれ示すグラフである。C57Bl/6マウス (n=5／群)を、1010VP（ウイルス粒子）のAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury (白バー)、Ad5 [E1-,E2b-]-CEA (灰色バー)、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 (黒バー)又はTri-Ad5（各々1010VPのAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1の1:1:1の混合物）(対角斜線バー)で、2週間間隔で、3回ワクチン接種した。対照には、3×1010 VPのAdeno-nullを接種した (水平ストライプバー)。最後のワクチン接種14日後、脾細胞を回収し、ELISPOTアッセイによってIFN-γ分泌細胞(A)又はIL-2分泌細胞 (B)を評価した。陽性対照に関しては、脾細胞をコンカナバリンA (Con A)に曝露した。データは、106脾細胞あたりのスポット形成細胞（SPF）の数で報告した。エラーバーは、SEMを示す。列間の有意差（p<0.05）はp値で報告される。有意差なし=ns。 図2A～Dは、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1、Tri-Ad5及びAd5 [E1-, E2b-]-nullでワクチン接種後の、CD8+及びCD4+及び多機能細胞集団の分析を示すグラフである。C57Bl/6マウス (n=5／群)を1010VP (ウイルス粒子)のAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury (白バー)、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (灰色バー)、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 (黒バー)又はTri-Ad5（各々1010VP (ウイルス粒子)のAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1の1:1:1の混合物) (対角斜線バー)で、2週間間隔で、3回ワクチン接種した。対照には、3×1010VPのAd5 [E1-, E2b-]-nullを接種した (水平ストライプバー)。最後のワクチン接種後、14日で、脾細胞を回収し、CD8α+ (A)及びCD4+ (B)のIFN-γ発現細胞、又はIFN-γ及びTNF-αを分泌するCD8α+ (C)及びCD4+ (D)細胞について、FACSで評価した。陽性対照として、脾細胞をコンカナバリンＡ (Con A)に曝露した（exposedto）。エラーバーは、SEMを示す。列間の有意差（p<0.05）はp値で報告される。有意差なし=ns。 図3A及び3Bは、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA又はTri-Ad5でワクチン接種したマウス由来の血清のCEA 抗体活性を示すグラフである。1010 VP (ウイルス粒子)のAd5 [E1-, E2b-]-CEA (灰色バー)、Tri-Ad5 (対角斜線バー)又は3×1010 VPのAd5 [E1-, E2b-]-null (水平ストライプバー)で、3回ワクチン接種したマウスにおけるCEA IgGレベルを、ELISAによって決定した (A)。MC38-CEA2細胞に対する補体依存性細胞傷害 (CDC)を行った (B)。エラーバーは、SEMを示す。列間の有意差（p<0.05）はp値で報告される。有意差なし=ns。 図4は、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1とTri-Ad5との比較を用いた、MUC1発現腫瘍の免疫治療の比較を示すグラフである。C57Bl/6マウス (n=7／群)の左脇の皮下に、106 MC-38-MUC1細胞を接種した。マウスに、1010VP (ウイルス粒子)のAd5 [E1-, E2b-]-MUC1又はTri-Ad5 (各々1010VPのAd5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1及びAd5 [E1-, E2b-]-Brachyuryの1:1:1の混合物、合計3×1010VP)を投与した。マウスの対照群には、3×1010 VPのAd5 [E1-, E2b-]-null（導入遺伝子なし）を接種した。腫瘍増殖を測定し、体積を計算した。(*)は、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1処置マウスが、対照マウスよりも有意に小さい (p < 0.05)腫瘍を有していた日を示し、(^)は、Tri-Ad5処置マウスが対照マウスよりも有意に小さい (p < 0.05)腫瘍を有していた日を示す。いずれの時点においても、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1とTri-Ad5処置マウスとの間で、有意差 (p>0.1)はなかった。エラーバーは、SEMを表わす。
Brachyury (「T-タンパク質」としても知られる)は、中胚葉で転写されるタンパク質である。全長Brachyuryタンパク質は配列番号1のアミノ酸配列を有する (GENBANK（登録商標）アクセッション番号NP_003172及びGENBANK（登録商標）アクセッション番号NM_003181もまた参照)。アゴニストエピトープを有する全長Brachyuryタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
本発明は、Brachyuryタンパク質のDNA結合活性が、変異 (例えば、Brachyuryタンパク質の天然のDNA結合活性を低減又は無くすために十分である、BrachyuryのDNA結合領域の欠失、置換、挿入又は他の修飾による)によって、低減又は破壊されている改変を含む、改変されたBrachyuryポリペプチドを提供する。
一実施形態においては、本発明は、該配列がDNA結合に関与する25アミノ酸の断片 (DNA結合ドメイン)を欠失するように改変されている、Brachyury欠失変異体を提供する。該DNA結合ドメインは、配列番号1及び配列番号2の残基198～222に対応する。
本発明の一実施形態においては、該Brachyury欠失変異体は、配列番号3のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチドであり、残基229はLeu、Ser又はValであり得る。配列番号3のポリペプチドは、Brachyury欠失変異体の一例であり、該アミノ酸配列は、配列番号1のヒトBrachyuryタンパク質のアミノ酸配列とは、198～222位の欠失で異なっている(すなわち、配列番号1又は2の198～222位は、配列番号3にない)。配列番号3の残基229がLeu又はValのポリペプチドは、それぞれ配列番号1又は2の223～435位に、直接的に融合させた1～197位からなるポリペプチドである。本Brachyury欠失変異体は、全長Brachyuryタンパク質と比べて、DNA結合能が破壊されている。

幾つかの実施形態においては、該Brachyury欠失変異体ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列と、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態においては、該Brachyury欠失変異体ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列、Ｎ末端のメチオニンを含まない配列番号3のアミノ酸配列、及び／又は177位(それぞれ、Asp対Gly)、343位 (それぞれ、Thr対Ser)及び384位 (それぞれ、Asn対Asp)が置換されている配列番号3のアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。
ポリペプチドは、任意の方法、例えばポリペプチドを合成すること、又は細胞中で適したアミノ酸配列をコードする核酸を発現させ、該細胞から該ポリペプチドを回収すること等、によって調製され得る。そのような方法の組合せをまた、使用し得る。ポリペプチドをデノボ合成する方法及びポリペプチドを組換え産生する方法は、当該技術分野において公知である （例えば、Chanら、Fmoc Solid Phase polypeptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005；polypeptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000；Epitope Mapping, ed. Westwoodら、Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001；及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照)。
ポリペプチドは融合タンパク質(例えば、ポリペプチド及び１以上の追加的な活性薬剤及び／又はタグを含む融合タンパク質)の形態であり得る。該ポリペプチドはまた、担体に結合され得る。一般的に、担体は、抗原性分子が結合され得る免疫原性マクロ分子である。担体に結合されるとき、結合ポリペプチドは、より免疫原性となる。担体は、結合分子の免疫原性を増加するよう、並びに／又は分析的に（diagnostically）、分析的に（analytically）及び／若しくは治療的に有益な担体に対する抗体のより高いタイターを引き出すよう選択される。担体に対する分子の共有結合は、促進された免疫原性及びＴ細胞依存度を与え得る (Pozsgayら、PNAS 96:5194-97, 1999；Leeら、J. Immunol. 116:1711-18, 1976；Dintzisら、PNAS 73:3671-75, 1976を参照)。有用な担体としては、反応成分が結合され得る１以上の官能基を含有する、天然 (例えば、細菌又はウイルス由来のポリサッカライド、ポリペプチド又はタンパク質)、半合成又は合成された材料であり得るポリマー担体が挙げられる。細菌の産物及びウイルスタンパク質 (例えばB型肝炎表面抗原及びコア抗原等)はまた、高等生物由来のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン、エデスチン、哺乳動物の血清アルブミン、及び哺乳動物の免疫グロブリン等と同様、担体として使用し得る。好適な担体としては、B型肝炎小外膜タンパク質（hepatitis B small envelope protein）HBsAgが挙げられるが、それに限定されない。本タンパク質は、自己会合して集合する性質を有し、ウイルス様粒子を形成し得る。HBsAgの製剤は、良く実証されている。例えば、欧州特許出願公開番号第EP-A-0 226 846号、欧州特許出願公開番号第EP-A-0 299 108号及びPCT公開番号第WO 01/117554号、及び例えば、Tiollaisら（Nature, 317: 489, 1985）、及び欧州特許出願公開番号第EP-A-0 278 940号及びPCT公開番号第WO 91/14703号に開示されるアミノ酸配列を参照。
本発明はまた、ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸を提供する。該核酸は、DNA、cDNA及び／又はRNAを含み得、一本鎖又は二本鎖であり得、及び天然で生じた、合成された及び／又は組換え体であり得る。更に、該核酸は、ヌクレオチド類似体又は誘導体 (例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド等)を含み得る。コード配列におけるサイレント変異は、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）から生じ、それにより、1超のコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る。それゆえ、例えば、ロイシンはCTT、CTC、CTA、CTG、TTA又はTTGによってコードされ得る；セリンはTCT、TCC、TCA、TCG、AGT又はAGCによってコードされ得る；アスパラギンは、AAT又はAACによってコードされ得る；アスパラギン酸は、GAT又はGACによってコードされ得る；システインは、TGT又はTGCによってコードされ得る；アラニンは、GCT、GCC、GCA又はGCGによってコードされ得る；グルタミンは、CAA又はCAGによってコードされ得る；チロシンは、TAT又はTACによってコードされ得る；及びイソロイシンはATT、ATC又はATAによってコードされ得る。標準的な遺伝暗号を示す表は、様々なソース (例えば、L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3.sup.rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NY)において見出し得る。
核酸は、ポリペプチド単独又は融合タンパク質の一部としてのポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドをコードする核酸は、核酸及び細胞に該核酸を送達でき、及び／又は細胞において核酸を発現できる要素を含むコンストラクトの一部として提供され得る。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現調節配列に作動可能に連結され得る。コード配列に作動可能に連結された発現調節配列は、該コード配列の発現が発現調節配列と適合する条件下で達成されるように連結される。発現調節配列としては、適したプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン(すなわち、ATG)、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を許容するための、その遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、及び終止コドンが挙げられるが、それらに限定されない。好適なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトCMV即時初期Iプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、30Kプロモーター、I3プロモーター、sE/Lプロモーター、7.5Kプロモーター、40Kプロモーター及びC1プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。T DNAワクチンは、それぞれ参照により本明細書に取り込まれる米国特許番号第5,589,466号；米国特許番号第5,973,972号に記載されている。それらの出願に記載された送達プロトコールに加え、DNAを送達する代替的な方法が、米国特許番号第4,945,050号及び第5,036,006号に記載されている。
ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸は、in vitroの方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、リガーゼ連鎖反応 (LCR)、転写ベース増幅システム (TAS)、自己維持配列複製システム (3SR)及びQβレプリカーゼ増幅システム (QB)等によって、クローン化又は増幅され得る。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、該分子のDNA配列に基づくプライマーを使用して、cDNAのポリメラーゼ連鎖反応によって単離され得る。多様なクローニング及びin vitro増幅方法論は、当業者に周知である。PCR法は、例えば、米国特許番号第4,683,195号；Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987；及びErlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)に記載されている。ポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されるプローブを用いて、ゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、単離され得る。
本発明は、核酸を含む非酵母ベクターを更に提供する。好適なベクターの例としては、プラスミド (例えば、DNAプラスミド)、細菌ベクター、及びウイルスベクター、例えばポックスウイルス等、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス及びシンドビスウイルス等が挙げられる。ベクターがプラスミド (例えば、DNAプラスミド)である場合、該プラスミドはキトサンと複合体化され得る。
細菌のベクター：ベクターは、例えばリステリア（Listeria）又はサルモネラ（Salmonella）ベクター等の細菌のベクターであり得る。リステリアはグラム陽性桿菌である。リステリア属は、現在7種を含有している：L．グレイ（L. grayi）、L．イノキュア（L. innocua）、L．イバノビイ（L. ivanovii,）、L．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、L．ムレイ（L. murrayi）、L．セリゲリ（L. seeligeri,）、及びL．ウェルシメリ（L. welshimeri）。L．モノサイトゲネスは、in vitroで遺伝子を送達するためのベクターとして使用されている細胞内細菌である。
サルモネラは、桿菌様、グラム陰性、胞子形成しない、主に運動性の腸内細菌の属であり、直径約0.7～1.5μm、長さ2～5μmで、鞭毛が全ての方向に向いている（すなわち周毛性）。それらは化学有機栄養であり、有機源を用いた酸化及び還元反応からエネルギーを得ており、通性嫌気性菌である。サルモネラは、プラスミド、例えばtetA遺伝子をトランケートしたものを含むもの等を含めることによって、宿主細胞において治療タンパク質の送達ベクターとして使用し得る。弱毒化S．ティフィリウム（S. typhimirium）は、DNAプラスミド、例えば、それらに限定されないが、pIRES (Invitrogen)で形質転換され得、及びポリペプチド及びタンパク質の送達のための担体として使用し得る。
ポックスウイルス：ベクターは、オルトポックス（orthopox）、アビポックス（avipox）、鶏痘（fowlpox）、アライグマポックス（raccoon pox）、ウサギポックス（rabbit pox）、カプリポックス（capripox）（例えば、ヤギポックス及びヒツジポックス）、レポリポックス（leporipox）及びスイポックス（suipox）（例えば、豚痘）からなる群から選択されるポックスウイルスであり得る。アビポックスウイルスの例としては、鶏痘、ハト痘（pigeonpox）、及び例えばALVAC等のカナリアポックス（canarypox）が挙げられる。オルトポックスウイルスの例としては、ワクシニア（vaccinia）、改変ワクシニアアンカラ（Ankara）（MVA）、ワイエス（Wyeth）、NYVAC、TROYVAC、Dry-Vax、POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation)、及びその誘導体が挙げられる。例えば、ワイエス（Wyeth）株の誘導体としては、機能的K1L遺伝子を欠く誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
発現のための例示的なポックスウイルスベクターは、例えば、米国特許番号第6,165,460号に記載されている。ワクシニアウイルスゲノムは、当該技術分野において公知である。それは、HIND F13L領域、TK領域及びHA領域からなる。組換えワクシニアウイルスは、外来遺伝子産物の発現のための外来遺伝子を取り込むために使用されている（例えば、Perkusら Science 229:981-984, 1985；Kaufmanら Int. J. Cancer 48:900-907, 1991；Moss Science 252:1662, 1991を参照)。Baxby及びPaoletti (Vaccine 10:8-9, 1992)は、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、その他の鳥類における種（avian species）を含む非複製ポックスウイルスの、ベクターとしての構築及び使用を開示する。Sutter及びMoss (Proc. Nat'l. Acad. Sci U.S.A. 89:10847-10851, 1992)、並びにSutterら (Virology 1994)は、ベクターとしての構築及び使用、該構築及びベクターの使用における非複製組換えアンカラウイルス (MVA、改変ワクシニアアンカラ)を開示する。
プラスミド：プラスミドは、多くの目標、例えば細菌内で制御された高コピー数を獲得すること及びプラスミド不安定性の潜在的な要因を排除すること、並びにヒト治療用途に適合するプラスミド選択のための方法を提供することを念頭において設計されている。遺伝子治療プラスミドの二重の要件に、特に注意が払われている。第一に、大量のDNAが産生及び精製され得るように、それらは大腸菌において維持及び発酵のために好適である。第二に、それらはヒト患者及び動物における使用のために安全で好適である。第一の要件は、細菌の発酵の間、選択され得、安定して比較的容易に維持され得る高コピー数のプラスミドを要求する。第二の要件は、例えば選択マーカー及び他のコード配列等の要素に対する配慮を要求する。幾つかの実施形態においては、ポリペプチドをコードするプラスミドは、(1)高コピー数複製起点、(2)選択マーカー、例えばそれには限定されないが、カナマイシンでの抗生物質選択のためのneo遺伝子、(3)転写終結配列、及び(4)様々な核酸カセットの取り込みのためのマルチクローニングサイト；及び(5)ポリペプチドをコードする核酸配列からなる。
ポリペプチドをコードする核酸を誘導するために、当該技術分野において公知である無数のプラスミドベクターがある。これらとしては、米国特許番号第6,103,470号；米国特許番号第7,598,364号；米国特許番号第7,989,425号；及び米国特許番号第6,416,998号に開示されるベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
アデノウイルスベクター：本明細書に開示される方法において、Brachyuryタンパク質又はBrachyuryポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター (Ad)ベクターが産生され得、使用される。本明細書に開示される方法において、その複製能がある、複製能がない、弱化型及びアデノ随伴ウイルス (AAV)ベクターを含むこれらのベクターが使用される。理論に縛られることはないが、アデノウイルスベクターは、in vitroにおける強い発現、優れたタイター、及びin vivoにおいて分裂細胞及び非分裂細胞を形質導入する能力を示すことが知られる (Hittら、Adv in Virus Res 55:479-505, 2000)。in vivoにおいて使用されるとき、これらのベクターは、ベクターの主鎖に対して起こされた免疫応答のために、強いが一時的である遺伝子発現を導く。
アデノウイルスベクターは、しばしば、必須のウイルス配列、例えばアデノウイルスのE1領域において見られるもの等の代わりに、又はその真ん中にBrachyuryタンパク質をコードする核酸の挿入によって構築される (Berkner, BioTechniques, 6:616-629, 1988；Grahamら、Methods in Molecular Biology, 7:109-128, Ed: Murcy, The Human Press Inc., 1991)。例えば、欠失又は挿入による必須のウイルス遺伝子の不活性化は、アデノウイルスの複製能力を無力にする。細胞培養中で、そのようなベクターを増殖するために、該欠失遺伝子が、in transで提供されなければならない (例えば、E1欠失ベクターのケースではE1A及びE1Bタンパク質)。ウイルスゲノムから欠失させた遺伝的要素のサブセットを発現させることによって、複製能がないウイルスを補完するように設計されたパッケージング細胞において、これらの複製欠損アデノウイルスは産生される。組換えアデノウイルスベクターにおいて、例えばBrachyuryタンパク質をコードする核酸等の目的の核酸の挿入のために見込みのある部位としては、限定されないが、E1、E2、E3及びE4領域が挙げられる。幾つかの実施形態においては、E1領域が欠失し、Brachyuryタンパク質又はBrachyuryポリペプチドをコードする核酸で置換されているヒトアデノウイルスから、組換えアデノウイルスベクターが産生される。結果として得られた、１以上の不活性化された必須の遺伝子を有するウイルスベクターは複製欠損である (Statford-Perricaudetら、Human Gene Therapy, 1:241-256, 1990)。
組換えアデノウイルスベクターは：(1)ベクターを複製欠損Adウイルス粒子に取り込むことができるようにするパッケージング部位；及び(2)ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。感染性ウイルス粒子に取り込むために使用される他の要素としては、5'及び3' Ad ITRsが挙げられる；E2及びE3遺伝子は、該ベクターに含まれ得る。幾つかの実施形態においては、ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスゲノムの欠失したE1A、E1B又はE3領域において、アデノウイルスに挿入される。幾つかの実施形態においては、アデノウイルスベクターは、１以上の野生型アデノウイルス遺伝子産物、例えばE1a、E1b、E2、E3、E4等を発現しない。幾つかの限定されない例においては、ウイルス粒子は典型的には、E1、E2A、E4及び任意でE3遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞株と共に使用される（例えば、米国特許番号第5,872,005号、5,994,106号、6,133,028号及び6,127,175号を参照)。一実施形態においては、実施例に記載された、早期1 (E1)、早期2 (E2b)及び早期3 (E3)遺伝子の領域が欠失している、アデノウイルス血清型5 (Ad5)ベクター遺伝子送達プラットフォーム (Ad5 [E1-, E2b-])が使用され得る。アデノウイルスベクターは、当該技術分野において公知である技術を用いて、精製及び製剤化され得る。
幾つかの実施形態においては、パッケージング細胞株、例えばヒト胚性腎293 (「HEK-293」又は「293」)細胞株 (Grahamら、J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977)又はヒト胚性網膜芽細胞(「HER-911」又は「911」)細胞株 (Fallauxら、Hum. Gene Ther., 7:215-222, 1996)等は、欠失又は改変されたアデノウイルスベクターがそのような細胞内で複製し得るように、例えばE1領域等の失われている領域をin transで提供する。好適なアデノウイルスベクターは、例えば参照により本明細書に取り込まれる米国特許公開番号第20080193484号において開示される。組換えアデノウイルスベクターを内包している複製欠損アデノウイルス・ウイルス粒子は、パッケージング細胞及びパッケージング技術を用いて、当該技術分野において公知である標準的な技術によって作製され得る。これらの方法の例は、例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許番号第5,872,005号において見出され得る。
アデノ随伴ベクター (AAV)：組換えAAVベクターは、標的細胞内で、選択された導入遺伝子産物の発現及び産生を行わせることができるという点で特徴づけられる。それゆえ、組換えベクターは、少なくともキャプシドに内包されるために必須なAAVの配列及び標的細胞の感染のための物理的構造の全てを含む。
組換えAAV (rAAV)ウイルス粒子は、転写の方向で作動可能に連結された構成要素として、転写開始及び終結配列を含む調節配列及びポリペプチドをコードする核酸を含むように構築され得る。これらの構成要素は、機能的なAAV逆末端反復 (ITR)配列によって、5'及び3'末端に結合される。「機能的なAAV ITR配列」は、該ITR配列が、AAVウイルス粒子のレスキュー、複製及びパッケージングのために意図したように機能することを意味する。そのため、該ベクターにおける使用のためのAAV ITRは、それらが機能的であれば、野生型ヌクレオチド配列を有する必要がなく、ヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換によって改変され得、又は該AAV ITRは、幾つかのAAV血清型のいずれかに由来し得る。AAVベクターは、限定されないAAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8等を含むアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。幾つかの実施形態においては、AAVベクターは、全体又は部分で欠失した野生型REP及びCAP遺伝子を有するが、機能的な隣接のITR配列を保持する。これらのベクターは全て、限定されることはないが、Brachyuryタンパク質の発現のために使用され得る。
アルファウイルス：ポリペプチドをコードするアルファウイルスは、本明細書に開示される方法において提供され、使用される。アルファウイルスは、トガウイルス科の一連の血清学的に関連する節足動物媒介性のウイルスである。赤血球凝集阻害 (HI)アッセイを利用して、アルファウイルス属の中で、26の既知のウイルス及びウイルスサブタイプが分類されている。簡易には、HIテストが、26のアルファウイルスを3つの主要な複合体：ベネズエラ脳炎（VE）複合体、セムリキ・フォレスト（SF）複合体及び西部脳炎（WE）複合体に分ける。加えて、4つの追加的なウイルス、東部脳炎（EE）、バーマー・フォレスト（Barmah Forest）、ミドルバーグ（Middelburg）及びヌドゥムゥ（Ndumu）が、HI血清学的アッセイに基づいて、個々の分類を受ける。好適なアルファウイルスの代表的な例としては、オーラ（Aura）（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC VR-368））、ベバールウイルス（Bebaru virus）（ATCC VR-600、ATCC VR-1240）、カバソウ（Cabassou）（ATCC VR-922）、チクングンヤウイルス（Chikungunya virus）(ATCC VR-64, ATCC VR-1241)、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（Eastern equine encephalomyelitis virus）（ATCC VR-65、ATCC VR-1242）、フォートモーガン（Fort Morgan）（ATCC VR-924）、ゲタウイルス（Getah virus）（ATCC VR-369、ATCC VR-1243）、キジラガッハ（Kyzylagach）(ATCC VR-927)、マヤロ（Mayaro）(ATCC VR-66)、マヤロウイルス (ATCC VR-1277)、ミドルバーグ (ATCC VR-370)、ムカンボウイルス（Mucambo virus） (ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、ヌドゥムゥ (ATCC VR-371)、ピクスナ（Pixuna）ウイルス (ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、ロスリバーウイルス（Ross River virus）（ATCC VR-373、ATCC VR-1246）、セムリキ・フォレスト（Semliki Forest） (ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、シンドビスウイルス（Sindbis virus） (ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、トネート（Tonate）（ATCC VR-925）、トリニティ（Triniti）（ATCC VR-469）、ウナ（Una）（ATCC VR-374）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（Venezuelan equine encephalomyelitis）(ATCC VR-69)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Venezuelan equine encephalomyelitis virus）(ATCC VR-923、ATCC VR-1250 ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西部ウマ脳脊髄炎（Western equine encephalomyelitis）(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、ワタロア（Whataroa）(ATCC VR-926)及びY-62-33 (ATCC VR-375)が挙げられる。参照により本明細書に取り込まれる米国特許第5,843,723号を参照。
幾つかの実施形態においては、及びアルファウイルスベクターは、シンビス（Sinbis）ウイルスである。幾つかの実施形態においては、アルファウイルスの転写を開始することができる5'配列、アルファウイルス 非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノム断片のウイルス転写が妨げられるように不活性化されているウイルスジャンクション領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、及び該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えアルファウイルスベクターコンストラクトが、利用される。ウイルスジャンクション領域を不活性化しているアルファウイルスベクターコンストラクトは、サブゲノム断片を転写せず、それにより多様な用途のために好適なものとなる。
幾つかの実施形態においては、cDNAからのin vitroでのウイルスRNAの合成を開始することができる5'プロモーターを含有する、例えばシンビスウイルス等のアルファウイルス・コンストラクトが提供される。5'プロモーターとしては、真核及び原核プロモーターの両方、例えば、βガラクトシダーゼプロモーター、trpEプロモーター、lacZプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、SV40プロモーター、CMVプロモーター及びMoMLV LTR等が挙げられる。そのような配列の代表的な例としては、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド1～60、及びより少ない程度でヌクレオチド150～210、tRNAアスパラギンのためのヌクレオチド10～75 (Schlesingerら、米国特許番号第5,091,309号)、及び転写を開始する他のトガウイルス由来の5'配列が挙げられる。
アルファウイルスベクターは、アルファウイルス非構造タンパク質 (NSP)をコードする配列を含有し得る。一例として、シンドビスウイルスについては、4つの非構造タンパク質、NSP1、NSP2、NSP3及びNSP4があり、ウイルスの自己複製を可能にするタンパク質をコードする。非構造タンパク質1～3 (NSP1～NSP3)は、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド60～5750によってコードされる。これらのタンパク質は、ポリタンパク質として産生され、後に非構造タンパク質NSP1、NSP2、及びNSP3に切断される。NSP4。アルファウイルスベクターコンストラクトはまた、サブゲノム断片のウイルス転写が妨げられるように、不活性化されているウイルスジャンクション領域を含み得る。簡易には、アルファウイルスウイルスジャンクション領域は、通常、サブゲノムmRNAの転写開始を調節する。シンドビスウイルスのケースにおいては、通常のウイルスジャンクション領域は典型的には、およそヌクレオチド番号7579で始まり、少なくともヌクレオチド番号7612 (及びおそらくそれを超える)まで続く。その完全な配列については、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第5,843,723号を参照。
アルファウイルス属の幾つかのメンバーは、「レプリコン」発現ベクターとして使用され得る。レプリコンベクターは、DNAベクターコンストラクト、RNAレプリコンベクター及び組換えレプリコン粒子を含む、幾つかの形態のいずれかにおいて利用され得る（以下を参照）。これらとしては、例えば、SIN (Xiongら、Science 243:1188-1191, 1989；Dubenskyら、J. Virol. 70:508-519, 1996；Hariharanら、J. Virol. 72:950-958, 1998；Poloら、PNAS 96:4598-4603, 1999)、セムリキフォレストウイルス (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361,1991；Berglundら、Nat. Biotech. 16:562-565, 1998)、VEE (Pushkoら Virology 239:389-401, 1997)及び複数のアルファウイルスのキメラ (米国特許番号第6,376,236号；PCT公開番号第WO2002099035号；Perriら、J. Virol. 77:10394-10403, 2003)が挙げられる。
アルファウイルスベクターコンストラクトはまた、米国特許番号第5,789,245号；米国特許番号第5,843,723号；米国特許番号第5,814,482号；及び米国特許番号第6,015,694号；PCT公開番号第WO00/61772号；及びPCT公開番号第WO02/99035号に開示される。一般的に、これらのベクターは、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、隣接する異種性の核酸配列を発現するようにするウイルスサブゲノムジャンクション領域プロモーター、RNAポリメラーゼ認識配列及びポリアデニレート・トラクト（tract）を含む。
アルファウイルスは、自己複製するアルファウイルスベクター又は「レプリコン」核酸を含有するウイルス様粒子であるレプリコン (組換えアルファウイルス粒子)として使用され得る。パッケージングのために必要な１以上の構造タンパク質をコードする遺伝子が欠失しているので、レプリコン粒子そのものは、一般的に、複製能がない又は「欠損」しており、宿主細胞をレプリコン粒子で感染させるとき、子孫のレプリコン粒子が生じないと考えられる。
アルファウイルスベクターは、RNAとして、in vivoで、投与するために直接的に使用され得る、又はプラスミドベースのcDNAとして送達され得るが (例えば、Eukaryotic Layered Vector Initiation System)、しばしば、in vivoワクチン及び治療用途のために、該アルファウイルスRNAレプリコンベクター又はレプリコンRNAが、アルファウイルス構造タンパク質 (例えば、キャプシドタンパク質及び外膜糖タンパク質)を含むウイルス様粒子に最初にパッケージされる。使用するアルファウイルス及びレプリコンは、例えば、参照により本明細書に取り込まれる米国特許出願公開番号第20110002958号に開示される。それらの構造のために、ベクターレプリコンは、組換えアルファウイルスレプリコン粒子にパッケージングするために必要なこれらのアルファウイルス構造タンパク質を発現しない。それゆえ、レプリコン粒子を生成するために、構造タンパク質はin transで提供されなければならない。
パッケージングは、一時的なアプローチ、例えば、in vitroで転写されたレプリコン及び欠損ヘルパーRNA (複数可)の共トランスフェクション (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361, 1991；Bredenbeekら、I Virol. 67:6439-6446, 1993；Frolovら、J. Virol. 71:2819-2829, 1997；Pushkoら、Virology 239:389-401, 1997；米国特許番号第5,789,245号及び米国特許番号第5,842,723号)、又はプラスミドDNAベースのレプリコン及び欠損ヘルパーコンストラクトの共トランスフェクション (Dubenskyら、J. Virol. 70:508-519, 1996)、並びにアルファウイルスレプリコンの安定なパッケージング細胞株 (PCL)への導入 (Poloら、PNAS 96:4598-4603, 1999；米国特許番号第5,789,245号；米国特許番号第5,842,723号；米国特許番号第6,015,694号)を含む多様な方法によって達成され得る。
トランスパッケージングの方法論は、１以上の構造タンパク質遺伝子の改変を可能にし(例えば、アルファウイルス変異体、例えば弱毒化変異体等の配列を取り込むために、米国特許番号第5,789,245号；米国特許番号第5,842,723号；米国特許番号第6,015,694号を参照)、その後、最終的なレプリコン粒子に改変した構造タンパク質が続けて取り込まれる。加えて、そのようなパッケージングは、ベクターコンストラクトの構造タンパク質とは異なる、第二のアルファウイルスに由来する構造タンパク質を用いて、第一のアルファウイルスに由来するベクターコンストラクト又はRNAレプリコンをパッケージングすることによって、アルファウイルスレプリコン粒子の全体的な改変を許可する。
麻疹ウイルス：ポリペプチドをコードする麻疹ウイルスが提供され、本明細書に開示される方法において使用される。麻疹ウイルスの核酸配列は、エドモンストン（Edmonston）野生株、モラテン（Moraten）株及びシュワルツ（Schwarz）株を含む多様な野生型の麻疹ワクチン株のポジティブ鎖（アンチゲノム）メッセージ・センスRNAのDNAコピーの配列を提供する、PCT公開番号第WO98/13501号に開示される。参照により本明細書に取り込まれるPCT公開番号第WO97/06270号は、組換え麻疹ベクターの産生を開示する。
麻疹ウイルスの弱毒化株はまた、ポリペプチドを送達するために使用され得る。ウイルスのモラテン弱毒化形態は、ワクチンとして世界中で使用されており、優れた安全性の記録を有する (Hillemanら、J. Am. Med. Assoc. 206: 587-590, 1968)。従って、一実施形態においては、モラテン株が用いられる。モラテンワクチンは、MERCK（登録商標）から市販されており、バイアル中で凍結乾燥して提供され、0.5mlに再構成する時に103pfu/mlを含む。
更なる実施形態においては、麻疹ウイルスのエドモンストンBワクチン株 (MV-Edm)が使用される (Enders and Peebles, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286, 1954)。MV-Edmは、腫瘍細胞において効率的に増殖するが、増殖はヒト末梢血単核細胞、通常の真皮線維芽細胞及び血管平滑筋細胞の初代培養において厳しく制限される。エンダーズ（Enders）の弱毒化エドモンストン株の形態は、メルクから市販されている(ATTENUVAX（登録商標）)。他の弱毒化麻疹ウイルス株、例えばレニングラード-16、及びモスクワ-5株 (Sinitsynaら、Res. Virol. 141(5): 517-31, 1990)、シュワルツ株 (Fourrierら、Pediatrie 24(1): 97-8, 1969)、9301B株 (Takedaら J. VIROL. 72/11: 8690-8696)、AIK-C株 (Takeharaら、Virus Res 26 (2): 167-75, 1992)、及びSchneider-Shauliesら（PNAS 92(2): 3943-7, 1995）に記載されたもの等がまた、利用され得る。
幾つかの実施形態においては、組換え麻疹ウイルスヌクレオチド配列は、6の倍数でヌクレオチドの総数を有するレプリコンを含む。「6の法則」は、組換えcDNAに存在するヌクレオチドの総数が、最終的に6の倍数であるヌクレオチドの総数になるという事実において現れ、麻疹ウイルスのゲノムRNAの効率的な複製を可能にする法則である。
追加的な実施形態においては、異種性のDNA、例えばBrachyuryタンパク質をコードする核酸等は、麻疹ウイルスに、麻疹ウイルスのアンチゲノムRNAに対応しているcDNAに挿入された追加転写ユニット（Additional Transcription Unit (ATU)）内でクローン化される。ATUの位置は、cDNAに沿って変化し得る：しかしそれは、麻疹ウイルスの発現の勾配に由来する利益を得るような部位内に位置する。それゆえ、ATUはcDNAに沿って広がり得る。一実施形態においては、該ATUは、配列のＮ末端部分、特に麻疹ウイルスのL遺伝子より上流の領域内及び該ウイルスのM遺伝子より上流の領域内に挿入される。他の実施形態においては、該ATUは、該ウイルスのN遺伝子より上流に挿入される。参照により本明細書に取り込まれる米国特許出願公開番号第2011/0129493号を参照。麻疹ウイルスゲノムにおける特定のシストロンは、その発現が弱毒化に関連する遺伝子を改変するために、標的とされ得る（can targeted）(Schneider-Shauliesら、PNAS 92(2): 3943-7, 1995；Takedaら J. Virol. 72/11: 8690-8696, 1998)。それゆえ、一実施形態においては、Hタンパク質、Vタンパク質、Cタンパク質及びそれらの組合せのいずれかにおけるポリペプチドをコードする組換え麻疹ウイルス株が生成される。
組換え麻疹ウイルスベクターは、麻疹ウイルスのアンチゲノム RNAの逆転写から生じるcDNAを含有するプラスミドpTM-MVSchw及びT7ポリメラーゼのプロモーター及びターミネーターを含む適合した発現調節配列を含む。ベクターはまた、例えば、米国特許出願公開番号第2006/0013826号に開示される。これらのベクターは、本明細書に開示される方法において、使用される。
ポリペプチドを発現する、麻疹ウイルスの追加的な弱毒化株が産生され得る。免疫原性であるが、病原性がないウイルスが特定されるまで、ウイルスの弱毒化株は、細胞培養 (例えば、非ヒト細胞内)におけるウイルスの連続継代によって得られる。野生型ウイルスが、マーモセットの致命的な感染を起こす一方で、ワクチン 株はそれを起こさない。弱毒化麻疹ウイルスワクチンを接種した個体は、標準的な麻疹の症状を示さない。弱毒化は、低下したウイルス複製 (in vivoにおいて、サルに、麻疹を起こすことができないことによって測定される)、ウイルス血症の減少、及び組織における細胞病理学的効果（例えば、細胞同士の融合、多核細胞）の誘導の失敗と関連する。米国特許番号第7,393,527号を参照。
一実施形態においては、ポリペプチドをコードする弱毒化麻疹ウイルスの有効投与量は、麻疹ウイルスの弱毒化モラテン株を含むストックの接種（若しくはMMRストックの接種）、又はMV-Edm株若しくは上記の他の株のいずれかを含むストックの接種を開始することで、初代細胞又は継代細胞株を感染させ、及び連続継代後のウイルスを増殖させることによって産生される。細胞又は細胞株としては、サル腎臓又は精巣細胞又はサル細胞株 (例えば、Vero、KB、CV-1、BSC-1等)が挙げられるが、それらに限定されない。細胞同士の融合及び合胞体の形成として、細胞におけるウイルス複製が観察される。
標準的な細胞培養培地において所望の投与濃度が得られるまで、弱毒化麻疹ウイルスが増幅される。一実施形態においては、治療有効投与濃度は約103～1012 pfuである。本発明の別の実施形態においては、該濃度は約105～108 pfuである。ウイルスタイターは、培養ディッシュ (例えば、35mmディッシュ等)内で、細胞 (例えば、Vero細胞)を接種することによってアッセイされ得る。2～3時間のウイルス吸着後、接種物は除かれ、細胞培養培地及びアガロース又はメチルセルロースの混合物（例えば、5% FCS及び1%シープラークアガロースを含有する2 ml DMEM）と共に、細胞が重層される。約3～約5日後、培養液は約1時間、1 mlの10%トリフルオロ酢酸で固定され、次いで、30分間UVクロスリンクされる。アガロースの重層を除去した後、ウイルスタイターを決定するために、単層の細胞をクリスタルバイオレットで染色し、プラークを計数する。ディッシュから細胞を掻き集め、それらを凍結／解凍（例えば、約2回）、及び遠心分離に供することで、細胞合胞体からウイルスが回収される。クリアな上清は、「プラーク精製された」ウイルスを表わす。
ウイルスストックは、単層細胞の感染 (例えば、37℃で約1.5時間の吸着)、続けて感染した細胞を好適な培地 (例えば、Opti-MEM、Gibco-BRL)に掻き入れること、及び凍結／解凍による溶解（例えば、約2回）によって産生される。ウイルスストックは等分され、凍結され、70℃～80℃で保存され、治療有効量より高い濃度で保存され得る。一実施形態においては、ウイルスストックは安定化溶液に保管される。安定化溶液は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許番号第4,985,244号及び米国特許番号第4,500,512号を参照。
ポリオウイルス：ポリペプチドをコードするポリオウイルスが提供され、本明細書に開示される方法において使用される。ポリオウイルスゲノム全体がクローン化され、シーケンスされ、該ウイルスタンパク質が特定されている。ウイルスの更なる遺伝的な操作が可能となっている、感染性ポリオウイルスcDNAがまた利用できる (Racaniello V Rら、Science 214(4542) 916-919, 1981)。野生型ゲノムRNA分子は7433ヌクレオチド長で、3'末端がポリアデニル化され、5'末端に共有結合した小さいウイルスタンパク質 (VPg)を有する (Kitamura Nら、Nature 291:547-553 1981；Racaniello V Rら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4887-4891, 1981)。ポリオウイルスゲノムの発現が、単一のタンパク質（ポリタンパク質）の翻訳を介して起こり、該タンパク質が、続いてウイルスにコードされたプロテアーゼ（2A及び3C）によってプロセッシングされ、成熟構造（キャプシド）及び非構造タンパク質が提供される (Kitamura Nら、Nature 291:547-553, 1981；Koch Fら、The Molecular Biology of Poliovirus, Springer-Verlag, Vienna, 1985)。相補的なRNA分子を与えるようにゲノムRNAをコピーする、ウイルスにコードされたRNA依存性RNAポリメラーゼによって、ポリオウイルス複製が触媒され、次いで、更なるRNA産生のための鋳型として働く (Koch Fら、上記；Kuhn R Jら、in D J Rowlandsら (ed.) Molecular Biology of Positive Strand RNA viruses, Academic Press Ltd., London, 1987)。ポリオウイルスのポリタンパク質の翻訳及びタンパク質プロセッシングは、Nicklin M J Hら（Bio/Technology 4:33-42, 1986）に記載されている。
ウイルスRNAゲノムは、新しい子孫RNAの生成、並びに新しいRNAゲノムのキャプシドへの内包のために必要とされる必要なタンパク質をコードする。in vitroにおいて、ポリオウイルスは溶解性で、許容細胞の完全な破壊をもたらす。ウイルス複製サイクルは、DNA中間体を何ら含まないので、ウイルスDNAが宿主染色体DNAに組み込まれる可能性はない。
初期研究は、抗体に対する反応性に基づき、3つのポリオウイルスの型を特定した (Koch Fら、上記、1985)。I型、II型及びIII型と命名される、これらの3つの血清型は、非コード領域及びタンパク質コード領域の両方における無数のヌクレオチドの相違を有するものとして、更に区別されている。3株は全て、異種性のタンパク質を送達することにおける使用のために好適である。加えて、ポリオウイルスの3株全ての、弱毒化型もまた利用できる。
レプリコンは、デオキシリボ核酸 (DNA)又はリボ核酸 (RNA)を含み得る。レプリコンは、ウイルスのキャプシドへの内包のために必要である野生型ポリオウイルス核酸を欠く、ポリオウイルスベースのポリヌクレオチドである。結果として、失われている核酸が存在しない、最初の細胞の進入の後、新しくキャプシドに内包されたレプリコンは、産生され得ない。欠失、挿入及び置換を含む、ポリペプチドをコードする核酸の挿入を含むがそれらに限定されない、野生型ポリオウイルス核酸の任意の改変の結果として、レプリコンはこの核酸を欠き得る。幾つかの実施形態においては、ポリオウイルスレプリコンは、キャプシドへの内包のために必要とされる、タンパク質の少なくとも1部分をコードする野生型ポリオウイルス核酸を欠く。レプリコンのキャプシドへの内包のために必要とされるタンパク質は、キャプシド構造の部分であるタンパク質を含む。そのようなタンパク質の例は、ポリオウイルスP1キャプシド前駆体領域のVP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子によってコードされるもの、Vpgタンパク質、及びキャプシド構造の構造タンパク質の適正なプロセッシングのために必要であるタンパク質、例えばウイルスポリタンパク質を切断するために必要であるプロテアーゼ等である。それゆえ、幾つかの実施形態においては、該ポリオウイルスベクターは、ポリオウイルスP1キャプシド前駆体領域のVP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子の１以上をコードする核酸配列、Vpgタンパク質を欠き、及びBrachyuryタンパク質又はBrachyuryポリペプチドをコードする。
レプリコンは典型的には、RNA形態で細胞に導入される。キャプシドに内包されたレプリコンは、キャプシドタンパク質とポリオウイルス受容体との相互作用を介して細胞に進入することができる。レプリコンは、レプリコンゲノム全体の発現が起こることによって、細胞への導入時にRNA複製（増幅）及び単一のポリタンパク質の正しいリーディングフレームでの翻訳が完全に可能である。レプリコン配列の翻訳は、一時的であり得、大抵は約24～48時間しか続かない。高レベルのレプリコンにコードされたタンパク質が、翻訳期間の間、蓄積し得る。キャプシドに内包されたレプリコンは、キャプシドタンパク質とhPVRタンパク質との相互作用を介して細胞に進入することができる。
幾つかの実施形態においては、レプリコンは、Brachyuryタンパク質をコードする配列を含むRNAを含み、キャプシドに内包される。幾つかの例においては、該レプリコンは、キャプシド (P1)遺伝子の欠損を有し、ポリオウイルス1型、2型、3型又はそれらの組合せのRNAゲノムに由来する。更に、Brachyuryタンパク質又はBrachyuryポリペプチドをコードする核酸は、残っているキャプシド (P1)遺伝子の部分は、もしあったとしても、in vivoでのキャプシドへの内包をサポートするには不十分であるように、キャプシド (P1)遺伝子の一部又は全部と置換され得る。一般的に、用語「P1レプリコン」は、この核酸によって普通にコードされるタンパク質が、発現されない又は機能的でない形態で発現されるように、P1キャプシド前駆体タンパク質をコードする核酸全体が、欠失又は改変されているレプリコンを指す。ポリオウイルスゲノムのP1キャプシド前駆体領域によって普通にコードされるタンパク質としては、VP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。それゆえ、P1レプリコンは、VP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子を欠く、又はVP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子の発現できない若しくは機能的でない形態を含む。P1レプリコンは、VP1、VP2、VP3及びVP4遺伝子と置き換えたBrachyuryタンパク質又はBrachyuryポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
幾つかの実施形態においては、レプリコン、及び宿主細胞にin transでキャプシドへの内包のために必要である失われている核酸を提供する補完的発現ベクターの両方を導入することによって、キャプシドに内包されたレプリコンは産生され得る。「レプリコンをキャプシドに内包するベクター」は、レプリコンをキャプシドに内包するために必要とされる核酸を含む、非ポリオウイルスベースのベクターを指し、in transで、必要とされる核酸 (又はコードされたタンパク質)を提供する。レプリコンの導入前、導入と同時、又は導入後に、レプリコンをキャプシドに内包するベクターは、宿主細胞に導入され得る。キャプシドへの内包のための好適な方法は、本明細書に参照により取り込まれる米国特許番号第6,680,169号に開示される。キャプシドに内包されたレプリコンを調製するために使用され得る方法は、Porter D Cら、J. Virol. 67:3712-3719, 1993；Porter D Cら、1995, J. Virol. 69:1548-1555, 1995；PCT公開番号第WO96/25173号；米国特許番号第 5,614,413号；米国特許番号第5,817,512号；米国特許番号第6,063,384号；及び米国特許番号第6,680,169号に記載されている。
例えば筋肉細胞に対する、例えば直接注射によって（例えば、Acsadi Gら、Nature 352(6338):815-818, 1991；Wolff J Aら、Science 247:1465-1468, 1990を参照)、又は電気穿孔法、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション、DEAE-デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、又は受容体が媒介する核酸の取り込み (例えば、Wu Gら、J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988；Wilson J Mら、J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992；及び米国特許番号第5,166,320号を参照)、又は標的細胞に裸の（naked）核酸を送達する他の方法によって、キャプシドに内包されていないレプリコンは、標的細胞に直接的に送達され得る。
レトロウイルスベクター：本明細書に開示される方法において、ポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターが提供され、使用される。広範囲の標的細胞のゲノムDNAへの、目的の多様な遺伝子の安定的な導入のために、レトロウイルスベクターはテストされ、好適な送達ビヒクルであることが見出されている。理論に縛られることはないが、再編成されていない単一コピーの導入遺伝子を細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの能力によって、レトロウイルスベクターは細胞に遺伝子を導入するのに良く適したものとなる。更に、レトロウイルスは、宿主細胞上の特異的な細胞表面受容体に対する、レトロウイルス外膜糖タンパク質の結合によって、宿主細胞に進入する。結果として、コードされたネイティブ外膜タンパク質が、ネイティブ外膜タンパク質とは異なる細胞特異性を有する異種性の外膜タンパク質 (例えば、ネイティブ外膜タンパク質と比べて、異なる細胞表面受容体に結合する)によって置換される、偽型レトロウイルスベクターがまた使用され得る。
一般的に、レトロウイルスは重要なウイルス粒子タンパク質をコードする3つの主要なコーディング・ドメイン、gag、pol、envを含有する。gag、pol及び／又はenvが存在しないか又は機能的でないレトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスベクターは、例えば米国特許出願公開番号第20060286634号に開示される。
それゆえ、例えばポリペプチドをコードする核酸を含むレトロウイルス導入ベクター及び１以上のパッケージング要素を含むレトロウイルスパッケージングベクターを含む、レトロウイルスベクターが提供される。幾つかの実施形態においては、偽型レトロウイルスを産生するために、異種性又は機能的に改変された外膜タンパク質をコードする偽型レトロウイルスベクターが提供される。
多くのレトロウイルスがあり、例としては以下が挙げられる：マウス白血病ウイルス (MLV)、例えばヒト免疫不全ウイルス (HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス (EIAV)等のレンチウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス (MMTV)、ラウス肉腫ウイルス (RSV)、藤波肉腫ウイルス (FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス (Mo-MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス (FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス (Mo-MSV)、アベルソンマウス白血病ウイルス (A-MLV)、鳥骨髄球腫ウイルス-29 (MC29)及び鳥赤芽球症ウイルス (AEV)。使用のために好適な他のレトロウイルスとしては、鶏白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。レトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、B、C及びD型レトロウイルス、並びにスプマウイルス及びレンチウイルスを含む、多種多様のレトロウイルスに由来し得る (RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985を参照)。本明細書に開示される組成物及び方法における使用のために好適なレトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられるが、それに限定されない。
レンチウイルスの1つは、例えば1型又は2型のヒト免疫不全ウイルス (HIV)（すなわち、HIV-1又はHIV-2）である。他のレンチウイルスベクターとしては、ヒツジ・ビスナ／マエディ（Visna/maedi）ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス (FIV)、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス (SIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス (EIAV)及びヤギ関節炎・脳脊髄炎ウイルス (CAEV)が挙げられる。
レンチウイルスは、env遺伝子によってコードされる外膜糖タンパク質SU (gp120)及びTM (gp41)；gag遺伝子によってコードされるCA (p24)、MA (p117)及びNC (p7-11)；pol遺伝子によってコードされるRT、PR及びINを含む幾つかの構造ウイルス粒子タンパク質を共通して有する。HIV-1及びHIV-2は、ウイルスRNAの合成及びプロセッシングの制御並びに他の複製機能に関与する、アクセサリー及び他のタンパク質を含有する。vif、vpr、vpu/vpx及びnef遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質は、組換えシステムから除外（又は不活性化）され得る。加えて、tat及びrevは、例えば突然変異又は欠失等によって、除外又は不活性化され得る。
理論に縛られることはないが、レンチウイルスベースの遺伝子導入技術の使用は、一般的に、高度に欠失したウイルスゲノムを有し、例えばポリペプチドをコードする核酸等の目的の遺伝子が収容される組換えレンチウイルス粒子をin vitroで作製することに依存する。特に、許容細胞株における、(1) パッケージングコンストラクト、すなわち、Revと共にGag-Pol前駆体を発現するベクター(in transで代替的に発現される)；(2) 一般的に、異種性の性質の外膜受容体を発現するベクター；及び(3) 全てのオープンリーディングフレームが欠けているウイルスcDNAで構成されるが、発現される配列が挿入される、複製、キャプシド化及び発現のために必要な配列を維持する導入ベクター、のin transでの共発現を介して、該組換えレンチウイルスは回収される。一実施形態においては、ポリペプチドを発現させるために、Lu, X.ら（Journal of gene medicine 6:963-973, 2004）に記載されたレンチゲン（lentigen）のレンチウイルスベクターが使用される。好適なレンチウイルスベクターはまた、例えば米国特許出願公開番号第20100062524号に開示される。
レトロウイルスを産生する産生細胞及び産生細胞株を生成するためのレトロウイルスパッケージングシステム、及びそのようなパッケージングシステムを作製する方法は、当該技術分野において公知である。一般的に、レトロウイルスパッケージングシステムとしては、少なくとも2つのパッケージングベクター：gag、pol、又はgag及びpol遺伝子を含む第一のヌクレオチド配列を含む、第一のパッケージングベクター；及び異種又は機能的に改変された外膜遺伝子を含む第二のヌクレオチド配列を含む、第二のパッケージングベクター、が挙げられる。幾つかの実施形態においては、レトロウイルス要素は、例えばHIV等のレンチウイルスに由来する。これらのベクターは、機能的なtat遺伝子及び／又は機能的なアクセサリー遺伝子 (vif、vpr、vpu、vpx、nef)を欠き得る。他の実施形態においては、該システムは更に、rev遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む、第三のパッケージングベクターを含む。該パッケージングシステムは、第一、第二、及び任意で第三のヌクレオチド配列を含有するパッケージング細胞の形態で提供され得る。
第一世代のレンチウイルスベクターパッケージングシステムは、gag/pol及びenvについて別個のパッケージングコンストラクトを提供し、典型的には、安全性の理由のために異種又は機能的に改変された外膜タンパク質を使用する。第二世代のレンチウイルスベクターシステムにおいては、アクセサリー遺伝子、vif、vpr、vpu及びnefが欠失又は不活性化される。第三世代のレンチウイルスベクターシステムは、tat遺伝子が欠失、又はそうでなければ不活性化しているものである (例えば、突然変異によって)。通常、tatによって提供される転写の制御のための補償は、強い構成的プロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス即時初期 (HCMV-IE)エンハンサー/プロモーター等の使用によって提供され得る。他のプロモーター/エンハンサーは、当該技術分野において理解されているように、標的組織に対する構成的プロモーター活性の強さ、特異性 (例えば、肝臓特異的プロモーター)、又は所望の過剰発現調節に関連する他の因子に基づいて選択され得る。例えば、幾つかの実施形態においては、例えばtet等の誘導性プロモーターが、調節された発現を達成するために使用され得る。Revをコードする遺伝子は、典型的な第三世代レンチウイルスベクターシステムが4つのプラスミド：gagpol、rev、外膜及び導入ベクターについて各1ずつを含むように、別個の発現コンストラクトに提供され得る。使用されるパッケージングシステムの世代に関わらず、gag及びpolは単一のコンストラクト又は別個のコンストラクトに提供され得る。
典型的には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入又は感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入又は感染の方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルスベクターは、産生細胞又は細胞株を生成するために、トランスフェクション、形質導入又は感染によってパッケージング細胞株に導入され得る。パッケージングベクターは、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション又は電気穿孔法を含む標準的な方法によって、ヒト細胞又は細胞株に導入され得る。幾つかの実施形態においては、例えばneo、DHFR、Glnシンテターゼ又はADA等の優性選択マーカーと共に、パッケージングベクターが細胞に導入され、その後適した薬剤の存在下で選択され、クローンが単離される。選択可能なマーカー遺伝子は、パッケージングベクターにコードされる遺伝子に物理的に結合され得る。
パッケージング機能が、好適なパッケージング細胞によって発現されるように構成される安定な細胞株は公知である。例えば、パッケージング細胞について記載する米国特許番号第5,686,279号；及びOryら（Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11400-11406, 1996）を参照。Zuffereyら（Nature Biotechnology 15:871-875, 1997）は、HIV-1外膜遺伝子を含むpolの3'配列が欠失したレンチウイルスパッケージングプラスミドについて開示する。該コンストラクトは、tat及びrev配列を含有し、その3' LTRがポリA配列で置換されている。5' LTR及びpsi配列が、例えば誘導性であるもの等の、別のプロモーターによって置換されている。例えば、CMVプロモーターが使用され得る。
パッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質の発現を促進し、安全性を高めるためにパッケージング機能に追加的な変更を含み得る。例えば、gag上流のHIV配列の全てが除去され得る。また、外膜の下流配列が除去され得る。更に、RNAのスプライシング及び翻訳を促進するために、ベクターを改変するための工程を取り得る。
例えば、Zuffereyら（J. Virology 72(12):9873-9880, 1998）に記載されるように、HIV-1の長い末端反復 (LTR)の欠失によって、ベクターのバイオセイフティーを改善する自己不活性化ベクター (SIN)が使用され得る。誘導性ベクターはまた、例えばtet誘導性LTRを介して使用され得る。
非酵母ベクターが、宿主 (例えば、ヒト)に対する投与のためであるとき、該非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルス)は、好ましくは、標的細胞における低い複製効率を有する (例えば、1細胞当たり約1以下の子孫、又はより好ましくは1細胞当たり0.1以下の子孫が産生される)。複製効率は、標的細胞の感染後にウイルスタイターを決定することによって、実験的に容易に決定され得る。
ポリペプチドをコードする核酸に加えて、非酵母ベクターはまた、１以上の免疫賦活／制御分子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、サイトカイン、又は免疫応答を促進し得る他の分子 (例えば、追加の腫瘍関連抗原、例えば前立腺特異的抗原 (PSA)、がん胎児性抗原 (CEA)又はその改変型、例えばCEA-6D等、及びムチン (MUC)及びその改変型)をコードするポリヌクレオチド (複数可)／遺伝子 (複数可)を含み得る。任意の他の外来遺伝子(複数可)と同様、ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、結果として得られる組換えウイルスのウイルス生存に影響しないベクター (例えば、ポックスウイルス)における部位又は領域(挿入領域)に挿入される。組換えウイルスのウイルス生存に深刻な影響を与えることなく、組換え体形成を可能にする領域について、ウイルスDNAの断片をテストすることによって、そのような領域が容易に特定され得る。
チミジンキナーゼ (TK)遺伝子は、容易に使用され得る挿入領域であり、多くのウイルスに存在する。特に、TK遺伝子は、全ての試験されたポックスウイルスゲノムにおいて見いだされている。追加的な好適な挿入部位は、国際特許出願公開第WO2005/048957号に記載されている。例えば、鶏痘においては、挿入領域としては、BamHI J断片、EcoRI-HindIII断片、BamHI断片、EcoRV-HindIII断片、長い特有な（long unique）配列 (LUS)挿入部位 (例えば、FPV006/FPV007及びFPV254/FPV255)、FP14挿入部位 (FPV060/FPV061)、及び43K挿入部位 (FPV107/FPV108)が挙げられるが、それらに限定されない。ワクシニアにおいては、挿入部位としては、44/45、49/50及び124/125が挙げられるが、それらに限定されない。
非酵母ベクターが、ポリペプチドをコードする核酸及び／又は他の外来遺伝子(複数可) (例えば、1以上の免疫賦活／制御分子をコードする)を含む組換え鶏痘ウイルスであるとき、ポリペプチドをコードする核酸は1領域 (例えば、FP14領域)に挿入され得、外来遺伝子(複数可)はもう1つの領域 (例えば、BamHI J領域)に挿入され得る。
非酵母ベクターは、好適なプロモーター及び制御要素、例えば転写制御要素又はエンハンサー等を含み得る。ベクターがポックスウイルスベクターであるとき、ワクシニア7.5Kプロモーター、ワクシニア30Kプロモーター、ワクシニア40Kプロモーター、ワクシニアI3プロモーター、合成初期／後期(sE/L)プロモーター、7.5プロモーター、HHプロモーター、11Kプロモーター及びPiプロモーターを含むが、それらに限定されないポックスウイルスプロモーターが使用され得る。プロモーターは、典型的には構成的プロモーターである一方で、誘導性プロモーターはまた、本発明のベクターにおいて使用され得る。そのような誘導性システムは、遺伝子発現の制御を可能にする。
ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸又はオンイースト（on-yeast）ベクターを含む非酵母細胞がまた、本明細書において提供される。好適な細胞としては、原核及び真核細胞、例えば哺乳動物細胞、非酵母菌類及び細菌（例えば大腸菌、サルモネラ(例えば、S．ティフィリウム)又はリステリア (例えば、L．モノサイトゲネス)等）が挙げられる。非酵母細胞は研究用又はポリペプチドの産生用に有用であるためin vitroであり得、又は非酵母細胞はin vivoであり得る。非酵母細胞はポリペプチドでパルスされた抗原提示細胞であり得る。好適な抗原提示細胞としては、樹状細胞、Bリンパ球、単球、マクロファージ等が挙げられるが、それらに限定されない。
一実施形態においては、非酵母細胞は樹状細胞である。様々な成熟段階の樹状細胞が、細胞表面発現マーカーに基づいて単離され得る。例えば、成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捕捉することができにくいが、休止T細胞が増殖し分化するのを刺激する上ではるかに優れている。それゆえ、成熟樹状細胞は重要であり得る。成熟樹状細胞は形態における変化及び様々なマーカーの存在によって特定され得る。そのようなマーカーとしては、細胞表面マーカー、例えばB7.2、CD40、CD11及びMHCクラスII等が挙げられるが、それらに限定されない。代替的に、成熟は炎症性サイトカインの産生を観察又は測定することによって特定され得る。
樹状細胞は、典型的な細胞蛍光法及び細胞選別技術、並びに装置、例えば蛍光活性化細胞選別装置 (FACS)等を用いて、回収及び分析され得る。樹状細胞成熟の様々な段階の細胞表面抗原に特異的である抗体は市販されている。
培養における、哺乳動物細胞の増殖のための技術は周知である（Jakoby and Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y.を参照)。例えば、より高い発現の望ましいグリコシル化パターン、又は他の特徴を提供するように設計された細胞等の細胞株が使用され得るが、一般的に使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、VERO及びHeLa細胞、CHO細胞、及びWI38、BHK、及びCOS細胞株である。
当業者に周知であるように、組換えDNAでの宿主細胞の形質転換は従来技術によって実行され得る。宿主が原核、例えば限定されないが大腸菌等である場合、DNAを取り込むことができるコンピテント細胞は、当該技術分野において周知である手順を用いて、対数増殖期の後に回収された細胞から調製され得、その後、CaCl2法によって処理され得る。代替的に、MgCl2又はRbClが使用され得る。形質転換はまた、非酵母宿主細胞のプロトプラストを形成した後、必要に応じて、電気穿孔法によって実行され得る。
細胞が真核である場合、例えばリン酸カルシウム共沈殿、例えばマイクロインジェクション等の従来の機械的な手順、電気穿孔法、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、又はウイルスベクターでの感染等の、DNAのトランスフェクションの方法が使用され得る。真核細胞はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び選択可能な表現型、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等をコードする第二の外来DNA分子で共形質転換され得る。非酵母真核細胞を形質転換するために、ウイルスベクターを使用する方法は公知である (例えば、Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982を参照)。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又は非酵母細胞が単離され得る。本明細書において用いられる場合、用語「単離された」は、生物的環境 (例えば、細胞、組織、培養培地、体液、等)から取り出されているか、又はそうでなければ任意の程度にまで純度において増加している (例えば、合成培地から単離された)、化合物又は組成物を包含する。それゆえ、単離された化合物及び組成物は合成又は天然で産生され得る。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又は非酵母細胞は、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又は非酵母細胞及び担体 (例えば、医薬的又は生理学的に許容される担体)を含む組成物 (例えば、医薬組成物)として製剤化され得る。更に、本発明のポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又は組成物は、本明細書に記載される方法において、単独で又は医薬製剤の一部として使用され得る。
組成物 (例えば、医薬組成物)は、本発明の1より多くのポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、又は非酵母細胞又は組成物を含み得る。代替的に、又は追加的に、該組成物は１以上の他の医薬的な活性薬剤又は薬物を含み得る。医薬組成物における使用に好適であり得る、そのような他の医薬的な活性薬剤又は薬剤の例としては、抗がん剤 (例えば、化学療法薬)、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロホスファミド及びそれらの組合せが挙げられる。好適な抗がん剤としては、当該技術分野において公知である、限定されない、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、葉酸アンタゴニスト、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、ポドフィロトキシン、ニトロソウレア（nitrosoureas）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、インターフェロン、アスパラギナーゼ（asparginase）、タモキシフェン（tamoxifen）、ロイプロリド（leuprolide）、フルタミド（flutamide）、メゲストロール（megestrol）、マイトマイシン（mitomycin）、ブレオマイシン（bleomycin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、イリノテカン（irinotecan）、タキソール（taxol）、ゲルダナマイシン（geldanamycin） (例えば、17-AAG)及び様々な抗がんポリペプチド及び抗生物質が挙げられる。
担体は、従来使用されているもののいずれかであり得、例えば溶解性及び活性化合物 (複数可)との反応性の欠如などの生理化学的考察、並びに投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載される医薬的に許容される担体、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。医薬的に許容される担体は、活性薬剤 (複数可)に対して化学的に不活性であるものであり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
担体の選択は、本発明の特定のポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物及び使用される他の活性薬剤又は薬物によって、並びに同様にポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。
組成物は、追加的に又は代替的に、１以上の免疫賦活／制御分子を含み得る。任意の好適な免疫賦活／制御分子、例えばインターロイキン (IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、インターフェロン (IFN)-γ、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、抗CTLA-4、及びそれらの組合せ等が使用され得る。好ましくは、組成物はB7.1、ICAM-1及びLFA-3 (TRICOMとしてもまた参照される)の組合せを含む。１以上の免疫賦活／制御分子は、１以上の免疫賦活／制御分子をコードする核酸を含むベクター (例えば、組換えウイルスベクター、例えばポックスウイルスベクター等)の形態で投与され得る。例えば、１以上の免疫賦活／制御分子 (例えば、IL-12)は、キトサンを有する又は有しないDNAプラスミドの形態で投与され得る。代替的に、１以上の免疫賦活／制御分子は、例えばキトサンと混合されたタンパク質 (例えば、組換えIL-12)等のタンパク質 (例えば、組換えタンパク質)として投与され得る。
Brachyuryタンパク質は無数のヒトがん、例えば、小腸、胃、腎臓 膀胱、子宮、卵巣、精巣、肺、結腸、前立腺、気管支のがん、慢性リンパ性白血病 (CLL)、他のB細胞ベースの悪性腫瘍、及び例えば乳房の浸潤性腺管がん等の乳がんにおいて発現される。ポリペプチドの投与は、これらのがんを治療又は予防するために使用され得る。特異的な限定されない例においては、乳がんは、エストロゲン受容体陰性及びプロゲステロン受容体陰性の乳がんである。追加的な限定されない例においては、がんは、放射線耐性及び／又は化学療法抵抗性である任意のがんである。該がんは、Brachyuryを発現し得るか、又はBrachyuryを発現する能力を有する。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又は非酵母細胞の投与は、CD4+Brachyury特異的T細胞及び／又はCD8+T細胞を誘導するために使用され得る。それゆえ、CD4+Brachyury特異的T細胞及び／又はCD8+T細胞を誘導するための方法が提供され、該方法はCD4+Brachyury特異的T細胞の産生を誘導するために、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又は非酵母細胞 (例えば、樹状細胞)の使用を含む。
本発明はまた、がん、例えばそれには限定されないが、小腸、胃、腎臓 膀胱、子宮、卵巣、精巣、肺、結腸、前立腺、気管支のがん、慢性リンパ性白血病 (CLL)、他のB細胞ベースの悪性腫瘍、又は乳がん、例えば浸潤性腺管がん若しくはエストロゲン受容体陰性及びプロゲステロン受容体陰性の乳がん等を有する対象を治療するための方法を提供する。これらのがんのいずれかは、化学療法抵抗性及び／又は放射線耐性であり得る。該がんは、Brachyuryを発現し得るか、又はBrachyuryを発現する能力を有する。特異的な限定されない例においては、該がんは、高悪性度の前立腺上皮内新生物、家族性腺腫様ポリープ症又は乳房の異型である。これらのがんを予防するための方法がまた開示される。
これらの方法は、CD4+Brachyury特異的T細胞を誘導することを含む。該方法はまた、CD8+Brachyury特異的T細胞を誘導することを含み得る。ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター及び非酵母細胞は単独で、又は例えば放射線治療及び／若しくは化学療法等の第二の剤と共にのいずれかで、対象に投与され得る。
追加的な実施形態においては、対象におけるがん細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。これらの方法は、樹状細胞をポリペプチド又はポリペプチドを発現している宿主細胞と接触させることを含み、それによって特異的抗原提示細胞を調製する。これらの方法はまた、対象に抗原提示細胞を投与することを含み、それによって免疫応答を誘導し、がん細胞の増殖を阻害する。
該方法は、治療を必要とする対象、例えばBrachyuryを発現するがん又はBrachyuryを発現する能力があるがんを有する対象等を選択することを含み得る。幾つかの例においては、該方法は、がんがBrachyuryを発現するか又はBrachyuryを発現する能力がある、小腸、胃、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、精巣 肺、結腸、前立腺のがん、B細胞起源の腫瘍（例えば慢性リンパ性白血病 (CLL)、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫又はホジキン・リンパ腫等）又は乳がんを有する対象を選択することを含む。幾つかの限定されない例においては、例、がんは放射線耐性及び／又は化学療法抵抗性である。追加的な限定されない例においては、対象は乳がん、例えば腺管がん等、例えば浸潤性腺管がん、又はエストロゲン受容体陰性及びプロゲステロン受容体陰性の乳がんを有する。更なる例においては、対象は高悪性度の前立腺上皮内新生物、家族性腺腫様ポリープ症又は乳房の異型を有する。
例示的な用途においては、Brachyury発現細胞に対する免疫応答、例えばCD4+Ｔ細胞応答等を惹起するために十分な量で、組成物が対象に投与される。Brachyury特異的CD8+Ｔ細胞応答はまた、本明細書に開示される方法を用いて誘導され得る。投与によって十分な免疫応答が誘導され、Brachyury発現細胞の増殖が遅くなる、又はそれらの増殖が阻害される、又はがんの兆候若しくは症状が低減される、又はがんが予防される。この使用のための有効量は、疾患の重症度、患者の健康状態の一般的な状態及び患者の免疫システムの頑健性に依存する。一例においては、組成物の治療有効量は、主観的な症状 (複数可)の緩和、又は臨床医若しくはその他の資格を有する観察者によって指摘される客観的に特定できる改善のいずれかを提供するものである。
組成物は当業者に公知である任意の方法によって投与され得る。それゆえ、組成物は、例えば筋肉内、皮下、腹腔内若しくは静脈内注射等によるが、経口、経鼻、経皮若しくは肛門投与でさえも考えられる、局所的又は全身的のいずれかで投与され得る。一実施形態においては、投与は皮下又は筋肉内注射によるものである。
ポリペプチドは、インプラントとして、油性注射、リポソーム内で、又は微粒子系として提供され得る。微粒子系は、マイクロ粒子、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノカプセル又は類似の粒子であり得る。合成ポリマーベースの微粒子担体は、調節された放出を提供することに加え、免疫応答を促進するアジュバントとして作用することが示されている。アジュバントはまた、例えば、キトサン、アルミニウム塩、免疫賦活オリゴデオキシヌクレオチド、リポソーム及び／又は１以上のサイトカイン等を含むタンパク質との組合せで使用され得る。該ポリペプチドは、リポソームで投与され得る。
一つの特異的な限定されない例においては、免疫応答を液性（抗体）応答よりも、細胞性応答（すなわち、Brachyury特異的CD4+応答及び／又はCD8+応答)に向かわせる様式で、ポリペプチドが投与される。該ポリペプチドは、Brachyury特異的CD4+Ｔ細胞応答及びBrachyury特異的CD8+Ｔ細胞応答の両方を誘導し得る。CD4+及びCD8+Ｔ細胞応答を測定するための方法は、当該技術分野において公知であり、生物学的アッセイ、ELISPOTアッセイ及び蛍光活性化細胞選別が挙げられる。Brachyury特異的CD4+Ｔ細胞を測定するための例示的なアッセイは、以下の実施例において開示される。
一つの特異的な限定されない例においては、静脈内投与のための医薬組成物は、1患者1日当たり、約0.1μg～10 mgのポリペプチドを含む。特に薬剤が、循環系又はリンパ系にではなく、隔離された部位、例えば体腔内又は器官の管腔内等に投与される場合、1患者1日当たり0.1μg～約100 mgまでの投与量が使用され得る。投与できる組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか又は明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995等の刊行物においてより詳細に記載されている。
任意で、１以上の免疫賦活分子、例えばIL-2、IL-6、IL-12、LFA (例えば、LFA-1、LFA-2及び／又はLFA-3)、CD72、RANTES、G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、B7-1、B7-2、他のB7関連分子、OX-40L及び／若しくは（or or）、41BBL、又はこれらの分子の組合せ等は、生物学的アジュバントとして使用され得る（例えば、Salgallerら、1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38；Lotzeら、2000, Cancer J Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6；Caoら、1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60；Kuiperら、2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90を参照）。これらの分子は宿主に対して全身的に（又は局所的に）投与され得る。幾つかの例においては、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、B7-1 B7-2、OX-40L、41 BBL及び／又はICAM-1が投与される。IL-15又はIL-15/IL-15受容体複合体が投与され得る。
in vitro及びin vivoの両方で、細胞性応答を誘導するための多くの方法が公知である。様々な抗原に対して、in vivoでT細胞をプライミングすることを助けることができる剤として、脂質が特定されている。例えば、米国特許番号第5,662,907号に記載されるように、パルミチン酸残基がリジン残基のα及びεアミノ基に結合され得、次いで、免疫原性ポリペプチド又はタンパク質に対して結合され得る（例えば、1以上の結合残基、例えばグリシン、グリシン－グリシン、セリン又はセリン－セリン等を介して)。脂質化されたポリペプチドは、次いで、ミセル形態で直接注射され得、リポソームに取り込まれ得、又はアジュバント中で乳化され得る。他の例としては、大腸菌リポタンパク質、例えばトリパルミトイル-S-グリセリルシステニルセリル-セリン（tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine）等が、適したポリペプチド又はタンパク質に共有結合された場合に、腫瘍特異的なT細胞をプライムするために使用され得る（Deresら、Nature 342:561, 1989を参照)。更に、中和抗体の誘導がまた、適したエピトープを提示するタンパク質に対して複合体化された、同じ分子でプライムされ得るので、2つの組成物が、望ましいと思われる場合には、液性及び細胞媒介応答の両方を起こすように組み合わされ得る。
一実施形態においては、ポリペプチドは、2以上の安定化界面活性剤、ミセル形成剤、及び油を含有するアジュバントと混合される。好適な安定化界面活性剤、ミセル形成剤、及び油は、米国特許番号第5,585,103号；米国特許番号第5,709,860号；米国特許番号第5,270,202号；及び米国特許番号第5,695,770号に詳細に記載されている。安定化界面活性剤は、エマルジョンの構成成分が安定なエマルジョンとして維持することができるようにする、任意の界面活性剤である。そのような界面活性剤としては、ポリソルベート、80（TWEEN）（ソルビタン-モノ-9-オクタデセン酸-ポリ(オキシ-1,2-エタンジイル)；ICI Americas製、Wilmington、DE)、TWEEN 40TM、TWEEN 20TM、TWEEN 60TM、ZwittergentTM 3-12、TEEPOL HB7TM及びSPAN 85TMが挙げられる。これらの界面活性剤は、たいてい、約0.05～0.5%、例えば約0.2%等の量で提供される。ミセル形成剤は、ミセル様構造が形成されるように、他の構成要素で形成されたエマルジョンを安定化することができる剤である。そのような剤は、一般的に、細胞性応答を促進するようマクロファージを補充するために、注射部位で幾らかの刺激を起こす。そのような剤の例としては、BASF Wyandotte出版物、例えば、Schmolka（J. Am. Oil. Chem. Soc. 54:110, 1977）及びHunterら（J. Immunol 129:1244, 1981）に記載されたポリマー界面活性剤、PLURONICTM L62LF、L101、及びL64、PEG1000、及びTETRONICTM 1501、150R1、701、901、1301、及び130R1が挙げられる。そのような剤の化学構造は当該技術分野において周知である。一実施形態においては、Hunter及びBennett（J. Immun. 133:3167, 1984）によって定義されるように、0～2の間で親水性-親油性バランス (HLB)を有するように、剤が選択される。該剤は、有効量、例えば0.5～10%の間又は1.25～5%の間の量で提供され得る。
組成物に含まれる油は、例えば所望の抗原にビヒクルを提供するため等、水中油型エマルジョンにおける抗原の保持を促進するよう選択され、好ましくは、エマルジョンが室温（約20℃～25℃）、又はエマルジョンの温度が室温まで低下する時点のいずれかで形成されるように、65℃より低い融点を有する。そのような油の例としてはスクアレン、スクワラン、EICOSANETM、テトラテトラコンタン（tetratetracontane）、グリセロール、及びピーナッツ油又は他の植物油が挙げられる。一つの特異的な限定されない例においては、油は、1～10%の間又は2.5～5%の間の量で提供される。体が該油を経時的に分解し得るように、及び油の使用の際に、例えば肉芽腫等の悪影響がはっきり表れないように、該油は生分解性及び生体適合性の両方でなければならない。
一実施形態においては、アジュバントはPROVAX（登録商標）(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)の名称で入手できる安定化界面活性剤、ミセル形成剤及び油の混合物である。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物は、任意の方法によって宿主に投与され得る。例えば、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸 (例えば、非酵母ベクターとして)は、様々な技術のいずれかによって、例えば本明細書に記載されるように、細胞を、核酸の送達と発現を可能にするポリペプチド、核酸、又はコンストラクトの一部としての核酸を含む組成物と接触させること等、によって（例えば、宿主中の）細胞に導入され得る。細胞において核酸を導入し発現させるための具体的なプロトコールは、当該技術分野において公知である（例えば、Sambrookら (eds.)、上記；及びAusubelら、上記を参照)。
宿主（対象）に、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞及び組成物を投与する好適な方法は、当該技術分野において公知である。宿主（対象）は、任意の好適な宿主、例えば哺乳動物（例、例えばマウス、ラット、ハムスター又はモルモット等のげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類又はヒト）等であり得る。
例えば、ポリペプチド、核酸又は非酵母ベクター (例えば、組換えポックスウイルス)は、ex vivoで腫瘍細胞をポリペプチド、核酸又は非酵母ベクターに曝露することによって、又は宿主にポリペプチド、核酸又は非酵母ベクターを注射することによって、宿主に投与され得る。ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター (例えば、組換えポックスウイルス)、又は非酵母ベクター、非酵母細胞及び組成物の組合せが、がん性の病変又は腫瘍への直接注射によって、又は局所適用によって (例えば、医薬的に許容される担体を用いて)、直接的に投与 (例えば、局所投与)され得る。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物は、単独で、又はリポソームに取り込まれたアジュバント (例えば、米国特許番号第5,643,599号、5,464,630号、5,059,421号及び4,885,172号に記載のように)と、サイトカインと、生物学的応答修飾物質（例えば、インターフェロン、インターロイキン-2 (IL-2)及びコロニー刺激因子 (CSF、GM-CSF及びG-CSF)）と、若しくは免疫応答を促進することが知られる当該技術分野における他の剤との組合せで投与され得る。
好適なアジュバントの例としてはミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム（aluminum silica）、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、QS21、MLP-A及びRIBI DETOXTMが挙げられる。
本発明における使用のために、特に好ましいアジュバントはサイトカイン、GM-CSFである。樹状細胞による抗原のプロセッシング及び提示を促進するので、GM-CSFは効果的なワクチンアジュバントであることが示されている。実験的及び臨床的研究は、組換えGM-CSFが多様な免疫原に対する宿主の免疫をブーストし得ることを示唆する。
GM-CSFは、医薬製剤内で、ウイルスベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)を用いて又は単離されたタンパク質として投与され得る。GM-CSFは、宿主における抗原特異的免疫応答を促進するために、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、細胞又はその組成物の最初の投与の前、その期間中又はその後、宿主に投与され得る。例えば、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、細胞、又はその組成物でのワクチン接種の各々の日、及びその後の3日の間毎日（すなわち、合計4日）、組換えGM-CSFタンパク質が宿主に投与され得る。GM-CSFの任意の好適な投与量が使用され得る。例えば、1日当たり50～500μg（例えば、100μg、200μg、300μg、400μg、及びそれらの範囲）の組換えGM-CSFが投与され得る。該GM-CSFは、任意の好適な方法 (例えば、皮下)によって投与され得、好ましくはポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、細胞又はその組成物での宿主のワクチン接種の部位又はその近傍に投与される。
一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの免疫原性を促進するように、ヘルパーペプチド又は大きい担体分子に複合体化され得る。これらの分子としては、インフルエンザペプチド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドCD4エピトープ、シュードモナス外毒素A、ポリ-L-リジン、脂質尾部、小胞体（ER）シグナル配列等が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明のポリペプチドはまた、技術に適合した方法を用いて、免疫グロブリン分子に複合体化され得る。免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞に存在するが、通常の細胞においては存在しないか、又はかなり少ない量である表面受容体に特異的であり得る。該免疫グロブリンはまた、特異的な組織 (例えば、乳房、卵巣、結腸又は前立腺組織)に特異的であり得る。そのようなポリペプチド-免疫グロブリン複合体は、特異的な組織及び／又は細胞に対して、ペプチドの標的化を可能にする。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、又は細胞又はその組成物の任意の好適な投与量が、宿主に投与され得る。適した投与量は、例えば宿主の年齢、重量、体長、性別、一般的な病状、以前の病歴、疾患の進行及び腫瘍負担等の要因に依存して変化し、臨床医によって決定され得る。例えば、ペプチドが、宿主 (例えば、例えばヒト等の哺乳動物)のワクチン接種毎に、約0.05 mg～約10 mg (例えば、0.1 mg、0.5 mg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、及びそれらの範囲）の投与量で投与され得、好ましくはワクチン接種毎に約0.1 mg～約5 mgで投与され得る。何回かの投与 (例えば、1、2、3、4、5、6又はそれ以上)が提供され得る (例えば、数週又は数月に亘る期間で)。一実施形態においては、投与は3ヶ月の間、毎月提供される。
非酵母ベクターがウイルスベクターである場合、好適な投与量としては、約1×105～約1×1012 (例えば、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、及びそれらの範囲）プラーク形成ユニット (pfu)を含み得るが、より低い又はより高い投与量を宿主に投与し得る。例えば、約2×108pfuが投与され得る (例えば、約0.5mLの体積で)。
本発明の細胞 (例えば、細胞傷害性T細胞)は1注入当たり、約1×105～2×1011 (例えば、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、及びそれらの範囲）細胞の投与量で、宿主に投与され得る。細胞は、例えば1～3 (例えば2)注入で投与され得る。細胞の投与に加えて、宿主は、例えばインターロイキン2 (IL-2)等の生物学的応答修飾物質が投与され得る。投与される細胞が細胞傷害性T細胞である場合、in vivoでT細胞数を更に増幅するように細胞傷害性T細胞をプライムするために、細胞傷害性T細胞の投与の後に、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター又はその組成物の投与が続けられ得る。
投与される細胞が樹状細胞である場合、対象に投与される樹状細胞の量は、対象の状態によって異なり、施術者によって全ての適した要因を考慮して決定されるべきである。好ましくは、約1×106～約1×1012 (例えば、約1×107、約1×108、約1×109、約1×1010又は約1×1011(本明細書に記載される細胞数のいずれかの範囲を含む))樹状細胞が成人に対して利用される。これらの量は対象の年齢、重量、サイズ、状態、性別、治療される腫瘍の型、投与の経路、治療が局所的か全身的か、及び他の因子によって異なる。当業者は、対象の特定の状況及びニーズに適合するよう、適した投与量及び投与のスケジュールを容易に導くことができるはずである。
本発明はプライム及びブーストプロトコールを含む。特に、該プロトコールは、本発明のポリペプチドをコードする１以上の組換え非酵母ベクター、及び任意で１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープを含む組成物で、最初に「プライム」し、それに続けて、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドをコードする１以上の非酵母ベクター、及び任意で1以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープを含有する組成物で、1又は好ましくは複数回の「ブースト」することを含む。
最初のプライミングワクチン接種は、１以上の非酵母ベクターを含み得る。一実施形態においては、単一の非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)が、本発明のポリペプチド、及び任意で１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は 他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープの送達のために使用される。別の実施形態においては、2以上の非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)はプライミングワクチン接種を含み、単一の注射で同時に投与される。
ブースティングワクチン接種はまた、1以上の非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)を含み得る。一実施形態においては、単一の非酵母ベクターが、本発明のポリペプチド、及び任意でブースティングワクチン接種の1以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープの送達のために使用される。別の実施形態においては、２以上の非酵母ベクターはプライミングワクチン接種を含み、単一の注射で同時に投与される。
様々な時間間隔での接種のために、治療分子の様々なセットを運ぶベクターを用いて、同じでないプライム／ブーストプロトコールを提供するために、様々な非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)が使用され得る。例えば、1つの同じでないプライム／ブーストの組合せにおいては、第一のオルトポックスベクター組成物がプライムのために使用され、第二のアビポックスベクター組成物がブーストのために使用される。
非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)の投与のスケジュールは、典型的には、ブースティングベクターの繰り返し投与を含む。ブースティングベクターは、任意の好適な時間の長さ (例えば、少なくとも合計5～15のブースティングワクチン接種のための、6～12週間)で、任意の好適な時間周期 (例えば、2～4週間毎)で、1～3回 (例えば、1、2又は3回)投与され得る。例えば、一次ワクチン接種は、組換えワクシニア又はMVAベクターを含み得、それに続けてアビポックスベクターで複数回の追加免疫ワクチン接種が行われる。特定の実施形態においては、宿主は、プライミングベクターで1回のワクチン接種を受け、6回のブーストのためにブースティングベクターでその後2週間毎に受け、ブースティングベクターでその後4週間毎に受け、及び疾患の進行に依存する期間で、ブースティングベクターで受ける。
本発明は、医薬的に許容される担体中で、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、ゲノム又はその一部に組み込んでいる第一の組換え非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)を少なくとも有するキットを更に提供する。該第一の組換え非酵母ベクター (例えば、ポックスウイルスベクター)はまた、１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープをコードする１以上の核酸を含み得る。第一の組換え非酵母ベクターに加えて、キットは、医薬的に許容される担体中で、１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープをコードする１以上の核酸を含む、第二の組換え非酵母ベクターを有し得る。更に、キットは、容器、注射針、及びキットの使用方法に関する説明書を提供する。別の実施形態においては、更に該キットは、キットの構成要素と共に、例えばGM-CSF等のアジュバント、及び／又は市販されているアジュバントの使用に関する説明書を提供する。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内及び腫瘍内を含むがそれらに限定されない様々な経路によって宿主に投与され得る。複数回の投与が為されるとき、該投与は宿主における1以上の部位で為され得る。
ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物の投与は、「予防的」又は「治療的」であり得る。予防的に提供される場合、宿主の免疫システムが、宿主が発症しやすい腫瘍と闘うことができるように、腫瘍形成に先立って、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物が提供される。例えば、遺伝性の発がん感受性を有する宿主が、そのような予防的な免疫で治療される患者の好ましいグループである。ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物の予防的投与は、がんを予防、改善又は遅延させる。治療的に提供される場合、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物は、がんの診断時又は後に提供される。
宿主が、既にがん又は転移性のがんと診断されている場合、例えば化学療法又は放射線療法等の他の治療的な処置と共に、ポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物が投与され得る。
好ましい実施形態においては、宿主に対するポリペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又はその組成物の投与により、本発明のポリペプチド、及び任意で１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型及び共投与されたその免疫原性エピトープを発現している宿主細胞がもたらされる。本発明のポリペプチドは、感染させた宿主細胞の細胞表面で発現され得る。１以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原 (例えば、CEA、MUC)、その改変型並びにその免疫原性エピトープは、細胞表面で発現され得るか、又は宿主細胞によって活発に分泌され得る。エピトープ及び免疫賦活／制御分子の両方の発現は、抗原特異的T細胞の抗原認識及び増殖又はクローン増幅を助けるよう、特異的T細胞に対して必要なMHC拘束性ペプチド及び適したシグナルをT細胞に提供する。全体的な結果としては、免疫システムの上方制御である。好ましくは、免疫応答の上方制御は、がん (例えば、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん又は前立腺がん)細胞を殺す又は増殖を阻害することができる、抗原特異的Tヘルパーリンパ球及び／又は細胞傷害性リンパ球の増加である。
本発明の方法のための、医薬組成物の多様な好適な製剤がある。非経口、皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内投与のための以下の製剤は例示的であり、決して限定的でない。当業者は、本発明のペプチド、核酸、非酵母ベクター、非酵母細胞又は組成物を投与するこれらの経路が公知であること、及び特定の化合物を投与するために2以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答を提供し得ることを理解する。
注射可能な製剤は、本発明によれば、好ましい製剤に含まれる。注射可能な組成物のための効果的な医薬担体に求められる要件は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238250 (1982)、及びASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)を参照）。
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。ペプチド、核酸、ベクター、細胞又はその組成物は、医薬的に許容される、例えば石鹸若しくは洗剤等の界面活性剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロース等の懸濁化剤、又は乳化剤及び他の医薬的アジュバントの添加あり又はなしで、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液を含む滅菌液又は混合液、例えばエタノール、イソプロパノール若しくはヘキサデシルアルコール等のアルコール、例えばプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール、ジメチルスルホキシド、例えば2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノール等のグリセロールケタール、例えばポリ（エチレングリコール）400等のエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化された脂肪酸グリセリド等の医薬担体中の生理学的に許容される希釈剤中で投与され得る。
非経口製剤において使用され得る油としては、石油、動物油、植物油及び合成油が挙げられる。油の具体的な例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ペトロラタム（petrolatum）及びミネラルが挙げられる。非経口製剤における使用のために好適な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
非経口製剤における使用のために好適な石鹸としては、脂肪族アルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な界面活性剤としては、(a)陽イオン界面活性剤、例、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド等、(b)陰イオン界面活性剤、例、例えばアルキル、アリール、及びオレフィンのスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドの硫酸塩、及びスルホコハク酸塩等、(c)非イオン性界面活性剤、例、例えば脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン・コポリマー等、(d)両性界面活性剤、例、例えばアルキル-b-アミノプロピオン酸塩、及び2-アルキル-イミダゾリン第4級アンモニウム塩等、並びに(e)その混合物が挙げられる。
防腐剤及び緩衝剤が使用され得る。注射部位での炎症を最小限に抑える又は排除するために、そのような組成物は、約12～約17の親水性-親油性バランス (HLB)を有する、１以上の非イオン性界面活性剤を含有し得る。そのような製剤における界面活性剤の量は、典型的には、約5重量%～約15重量%の範囲である。好適な界面活性剤としては、例えばソルビタンモノオレエート及びエチレンオキシドの、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基との高分子量付加物等のポリエチレン・ソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。
非経口製剤は、単位用量又は複数用量で、例えばアンプル及びバイアル等の密封容器中に存在し得、注射用として使用の直前に、例えば水等の滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥された）状態で保管され得る。即時注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
更に、以下の実施例は本発明について説明するが、もちろん、決して発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例1
本実施例は、実施例2において記載される実験のための材料及び方法を提供する。
ウイルス構築
Gabitzschら (Cancer Immunol Immunother. 2010; 59: 1131-1135)及びAmalfitanoら (J Virol. 1998; 72: 926-933)に以前に記載されたように、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA及びAd5 [E1-, E2b-]-MUC1を構築及び産生した。簡易には、相同組換えベースのアプローチを用いて、Ad5 [E1-, E2b-]ベクターのE1領域に、導入遺伝子をサブクローニングした。Amalfitanoら（上記）に以前に記載されたように複製欠損ウイルスをE.C7パッケージング細胞株内で増殖させ、CsCl2精製し、タイターを測定した。ウイルス感染タイターは、E.C7単層細胞におけるプラーク形成ユニット(PFU)として決定した。VP濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）による破壊、並びに260nm及び280nmでの分光測光法によって決定した (ViraQuest, North Liberty, IA)。CEA導入遺伝子はまた、高度免疫原性エピトープCAP1-6Dを含有する改変CEAを含有する (Salazarら、Int J Cancer. 2000; 85: 829-838；及びZarembaら、Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577を参照)。
エンハンサーT細胞HLA-A2エピトープ (WLLPGTSTV)を導入することによって(Tuckerら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317を参照)、及びDNA結合に関与する25アミノ酸断片を除去することによって、ヒトBrachyuryタンパク質 (NM_003181.3)をコードする配列を改変した。結果として得られたコンストラクトを、続けてAd5 [E1-、E2b - ]-Brachyuryコンストラクトを生成するようAd-5ベクターにサブクローニングした。
MUC1分子は2つの領域：MUC1の大きい細胞外ドメインであるN末端 (MUC1-N)及び3つの領域（小さい細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部）を有するC末端 (MUC1-C)からなる (Lanら、J Biol Chem. 1990; 265: 15294-15299を参照)。細胞質尾部は、シグナリングタンパク質との相互作用のための部位を含有し、がん遺伝子として、並びにがんの運動性、侵襲性及び転移の原動力として作用することが示されている (Weiら、Cancer Res. 2007; 67: 1853-1858；及びLiら、J Biol Chem. 2001; 276: 35239-35242を参照)。
Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1の構築のために、以前に記載された8つのアゴニストエピトープを含む、完全なMUC1導入遺伝子 (Tsangら、Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149；及びJochemsら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174を参照)を、Ad-5ベクターにサブクローニングした。Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1ベクターに含まれるアゴニストエピトープは、HLA-A2 (N末端におけるエピトープP93L、VNTR領域におけるV1A及びV2A、並びにC末端におけるC1A、C2A及びC3A)、HLA-A3 (エピトープC5A)、及びHLA-A24 (C末端におけるエピトープC6A)に結合する。Tri-Ad5ワクチンは、1010VPのAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA及びAd5 [E1-, E2b-]-MUC1を1:1:1の比で (合計3×1010VP)組合せることによって産生した。
PBMC由来ヒトDCの生成
イピリムマブと組合せたPSA-TRICOMワクチン (Madanら、Lancet Oncol. 2012; 13: 501-508を参照)を用いた臨床試験に登録された前立腺がん患者 (HLA-A2+及びHLA-A24+)の末梢血単核細胞 (PBMC)から、以前に記載された方法を用いて、樹状細胞 (DC)を生成した (Ceredaら、Vaccine. 2011; 29: 4992-4999を参照)。ワクチン接種後の本患者に由来するPBMCを用いて、CEA、MUC1及びBrachyuryに特異的である個々のT細胞株を樹立することができた。国立衛生研究所 (NIH)臨床センターの施設内治験審査委員会は手続きを承認し、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得た。簡易には、リンパ球分離培地の勾配 (ICN Biochemicals, Aurora, VA)を用いて、PBMCを単離し、AIM-V培地 (Invitrogen, Carlsbad, CA)に再懸濁し (2×107細胞)、2時間、6ウェルプレート中で接着させた。100ng/mlの組換えヒト(rh)GM-CSF及び20ng/mlのrhIL-4を含有するAIM-V培地中で、5日間、接着細胞を培養した。培養培地は、3日毎に補充した。
アデノウイルスベクターでのヒトDCの感染
1mlのAIM-V培地中の樹状細胞 (2×105)を、1時間、6ウェルプレート中において、示された感染多重度（10,000又は20,000 MOI）で、アデノウイルスベクター（Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury及びAd5 [E1-, E2b-]-null）に感染させた。次いで、AIM-V培地 (4ml)を各ウェルに添加し、追加で2日間インキュベートした。導入遺伝子発現の有効性を分析するために、DCを回収し、フローサイトメトリー及びウェスタンブロットを用いて分析した。表現型分析のために、BV421-複合体化抗CD80、PerCP Cy5.5-複合体化抗CD83、APC-Cy7-複合体化抗HLA-DR、PE-複合体化抗CD86及びFITC-複合体化抗CEAを用いて、CD80、CD83、CD86、CEA及びHLA-DRの発現に関して、DCを染色した。フローサイトメトリー用の抗体は、BD Bioscience (San Jose, CA)から購入した。
アデノウイルスで感染させたDCを用いたT細胞株の生成
Tsangら (J Natl Cancer Inst. 1995; 87: 982-990)によって記載された方法を改変して、CEA-、MUC1-及びBrachyury特異的な細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)を生成するために使用した。上記のように、樹状細胞 (1mlのAIM-V中、1～2×105／ウェル)を、20,000 MOIのTri-Ad5で感染させた。自己の非接着細胞を刺激するために、APCとして感染DCを、エフェクターとAPCの比を10:1で用いた。培養液は、5% CO2を含有する加湿雰囲気中で、37℃で3日間、インキュベートした。
次いで、培養液に、7日間、rhIL-2を補充した；IL-2を含有する培地を3日毎に補充した。10日間の刺激で、1回のin vitro刺激（IVS）サイクルを構成した。3回のIVSのために、ベクター感染させた自己のDCをAPCとして用いた。3回のIVS後に、ペプチドでパルスした自己のB細胞を、抗原特異的CTLを再刺激するために使用した。T細胞株は、IL-7及びIL-15を含有する培地中 (10 ng/ml；PeproTech, Rocky Hill, NJ)で維持した。
細胞傷害性アッセイ
Tsangら (Cancer Res. 2001; 61: 7568-7576)によって記載されたプロトコールを改変して、CTL分析のために用いた。簡易には、標的細胞を、37℃で20分間、50μCiの111In酸化物 (GE Health Care, Vienna, VA)で標識し、96ウェルの丸底培養プレート中で、3,000細胞／ウェルで用いた。T細胞を様々な比で添加し、37℃で16時間インキュベートした。ガンマ計数のために、上清を回収した。決定は三連で行い、SDを計算した。自然放出は、標的細胞を培地のみとインキュベートすることによって決定し、完全溶解は、0.25％Triton X-100でインキュベートすることによって決定した。特異的な溶解は、以下の式：溶解 (%)＝[観察された放出 (CPM)－自然放出(CPM)]／[完全な放出 (CPM)－自然放出(CPM)]×100、を用いて計算した。
腫瘍細胞培養
ヒト結腸がんSW620 (HLA-A2+、HLA-A24+、Brachyury+、MUC1+、CEA+)及び膵臓がんASPC-1 (HLA-A1+、HLA-A26+、MUC1+)細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション (Manassas, VA)から得た。細胞培養物は、マイコプラズマフリーで、完全培地(10% FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び2 mM L-グルタミンを補充したRPMI-1640) (Mediatech, Herndon, VA)中で維持した。
サイトカインの検出
IL-2フリーの培地中で、アデノウイルスベクターで感染させたDC又はペプチドでパルスしたDCで、24時間刺激したT細胞の上清について、ELISAキット (Invitrogen, Frederick, MD)を用いてIFN-γの分泌を評価した。本分析において用いた抗原特異的T細胞株は、以前に報告されている：(a)HLA-A2 CEA特異的CTL (Palenaら、Cytokine. 2003; 24: 128-142)、(b)HLA-A2 MUC1特異的CTL (Tsangら、Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149)、(c)HLA-A24 MUC1特異的CTL (Jochemsら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174)、及び(d)HLA-A2 Brachyury特異的CTL (Tuckerら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317)。
ペプチド
本研究においては、以下のHLA-A2及びHLA-A24結合ペプチドを用いた：(a)HLA-A2結合CEAアゴニストペプチドCAP1-6D (YLSGADLNL) (Zarembaら、Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577)、(b)HLA-A2 MUC1アゴニストペプチドP93L (ALWGQDVTSV) (Tsangら、Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149)、(c)HLA-A24結合MUC1アゴニストペプチドC6A (KYHPMSEYAL) (Jochemsら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174)、及び(d) HLA-A2結合Brachyuryアゴニストペプチド (WLLPGTSTV) (Tuckerら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317)。全てのペプチドは96%より高い純度であり、American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA)によって製造された。
マウス
特異的病原体フリーの、8～10週齢のメスC57BL/6マウス (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を、感染症研究所（IDRI）(Seattle, WA, USA)の動物施設に収容した。全ての手順は、所内動物実験委員会 (IACUC)が承認したプロトコールに従って行われた。
ワクチン接種及び脾細胞の調製
メスC57BL/6マウス (n=5)の皮下に、1010VPのAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury又はAd5 [E1-, E2b-]-CEA又はAd5 [E1-, E2b-]-MUC1又は1:1:1の比での1010VPの全3ウイルスの組合せ (Tri-Ad5)を注射した。対照マウスには、3×1010VPのAdeno-null (導入遺伝子の挿入なし)を注射した。用量は、25μlの注射バッファー (3%スクロースを含む20mM HEPES)中で投与され、マウスは14日の間隔で、3回ワクチン接種された。最後の注射後14日で、脾臓及び血清を回収した。血清は－20℃で冷凍した。70μMのナイロン細胞ストレーナー (BD Falcon, San Jose, CA)に通して脾臓を穏やかに粉砕することによって、脾細胞懸濁液を生成した。赤血球は、赤血球溶解緩衝液 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加することによって除去し、R10（L-グルタミン (2mM)、HEPES (20mM) (Corning, Corning, NY)、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT)及び10%ウシ胎仔血清 (Hyclone)を補充したRPMI 1640）中で、脾細胞を2回洗浄し、再懸濁した。脾細胞は、ELISPOT及びフローサイトメトリーによって、サイトカインの産生について分析した。
ELISPOTアッセイ
上記のように、新鮮な単離されたマウス脾細胞に由来する、Brachyury-、CEA-及びMUC1特異的な、IFN-γ又はIL-2を分泌するT細胞を、ELISPOTアッセイによって決定した。ELISPOTアッセイは、製造者の仕様書に従って実施した (Affymetrix Bioscience, San Diego, CA)。簡易には、Brachyury又はCEA (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)又はMUC1に由来する単一のプール中で、0.2μg／ウェルの重複する15merのペプチドで、2×105の脾細胞を刺激した。細胞は、陽性対照として0.0625μg／ウェルの濃度でコンカナバリンＡ (Con A)で刺激し、SIV-Nef及びSIV-Vif（エイズ研究及び基準試薬プログラム（AIDS Research and Reference Reagent Program）、エイズ部門、国立アレルギー・感染症研究所 (NIAID)、国立衛生研究所 (NIH)）に由来する重複する15merの完全なペプチドプールが、無関係なペプチド対照として使用された。Immunospot ELISpotプレートリーダー (Cellular Technology, Shaker Heights, OH)を用いてSFC数を決定し、結果を106脾細胞当たりのSFC数として報告した。
細胞内サイトカイン刺激
上記で示したように、脾細胞を調製した。96ウェルU底プレート中で、1ウェル当たり106の生きた脾細胞を用いて、刺激アッセイを行った。Brachyury、CEA及びMUC1の全コード配列にまたがる重複するペプチドのプールを、11アミノ酸の重複がある15merとして合成し (JPT GmbH)、凍結乾燥されたペプチドのプールをジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解した。同様に構築された、SIV-Vif及びSIV-Nefに対応するペプチドプールは、オフターゲットの対照として役割を果たした。R10培地 (RPMI 1640、10%ウシ胎仔血清及び抗生物質)中の脾細胞は、37℃で6時間、5% CO2で、1ペプチド当たり2μg/mLで、ペプチドプールを添加することによって刺激し、インキュベーションにタンパク質輸送阻害剤 (GolgiStop, BD)を2時間加えた。次いで、刺激された脾細胞を、リンパ球表面マーカーCD8α及びCD4について染色し、固定し、浸透化し（permeabilized）、次いでIFN-γ及びTNFαの細胞内蓄積について染色した。マウス CD8α (クローン53-6.7)、CD4 (クローンRM4-5)、IFN-γ (クローンXMG1.2)及びTNFα (クローンMP6-XT22)に対する抗体を、BDから購入し、染色を抗CD16/CD32 (クローン2.4G2)の存在下で行った。フローサイトメトリーは、Accuri C6 Flow Cytometer (BD)を用いて行い、BD Accuri C6ソフトウェアで分析した。
CEAに対する抗体を検出するためのELISA
ELISAプレート (Maxisorp; Nunc, Rochester, NY)を、0.05M炭酸塩-重炭酸塩緩衝液（pH9.6）中の100ngのヒトCEA (Sigma-Aldrich)でコートし、室温で一晩インキュベートした。プレートは、1% Tween-20 (PBS-T)を含有するリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、次いで、1% BSAを含有するPBSで、室温で60分間ブロッキングした。追加で3回洗浄した後、PBS-T中で1/50希釈した血清をウェルに添加し、該プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン(Ig)G(γ鎖特異的) (Sigma-Aldrich)抗体（1:5000希釈）をウェルに添加し、プレートを1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、1,2-フェニレン・ジアミン基質溶液 (Thermo-Fisher, Scientific, Waltham, MA)を各ウェルに添加した。10%リン酸を添加することによって、反応を停止した。SpectraMax 190 ELISAリーダー (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で、492nmにおける吸光度を測定した。精製したマウスIgGを用いて生成した標準曲線を参照することによって、1ウェル当たり、CEAに結合したIgGのナノグラム当量が得られ、以前に記載されたように、CEA ELISA (Sigma-Aldrich)と同時に作成された (Gabitzschら、Vaccine. 2011; 29: 8101-8107を参照)。結果は、SoftMax Pro 6.3ソフトウェア (Molecular Devices)を用いて、分析し、定量した。
補体依存性細胞毒性アッセイ (CDC)
96ウェル組織培養マイクロプレート中において、1ウェル当たり2×104細胞の濃度で、MC38-CEA2腫瘍細胞を、オーバーナイトで培養した。プールし、熱で不活性化したマウス血清を1:50希釈して添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、補体のソースとして、ウサギ血清を1:50希釈して添加し、細胞を37℃で2.5時間追加でインキュベートした。Promega Cytotox 96 non-radioactive細胞毒性アッセイ (Promega, Madison, WI)を用いて、製造業者の指示に従って、細胞培養上清をアッセイした。MC38-CEA2細胞の％溶解を、式：%溶解＝(実験－標的自然)／(標的最大－標的自然)×100％、によって計算した。
腫瘍免疫治療
in vivoでの腫瘍治療研究のために、メスC57BL/6マウス（8～10週齢）の左脇の皮下に、106 MC38-MUC1細胞を移植した。マウスは、7日間隔で3回、1010 VPのAdeno-MUC1又はTri-Ad5で治療した。対照マウスには、3×1010 VPのAdeno-nullを注射した。腫瘍増殖は、2つの対向する寸法 (a、b)を測定することによって評価し、以前に記載されたように (Tomaykoら、Cancer Chemother Pharmacol. 1989; 24: 148-154を参照)、式：V=(a×b)2／2（ここで短い方の寸法を「a」とした）に従って、体積を計算した。腫瘍が1500m3に達するか、又は重度に潰瘍化した場合、腫瘍研究を終結した。
実施例2
本実施例は、Brachyury欠失変異体ポリペプチドを含むベクターの生成及び特徴付けについて記載する。
以前に記載されたように、組換えAd5 [E1-, E2b-]-CEAを生成し、特徴付けを行った (Gabitzschら、Cancer Immunol Immunother. 2010; 59: 1131-1135を参照)。実施例1に記載されたように、組換えAd5 [E1-, E2b-]-MUC1及びAd5 [E1-, E2b-]-Brachyuryを生成した。ヒト樹状細胞 (DC)をAd5 [E1-, E2b-]-Brachyuryで感染させた場合に、抗Brachyury特異的モノクローナル抗体 (MAb 54-1)を用いたウェスタンブロット分析によって、Brachyury発現を明らかにした。何ら導入遺伝子を持たないAd5 [E1-, E2b-]ベクター(Ad5 [E1-, E2b-]-null)を陰性対照として用い、内在的にBrachyuryを発現するヒト結腸がん細胞SW620を陽性対照として用いた。
Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1で感染させたヒトDCにおける、MUC1の発現を検出するために、抗MUC1特異的Mabを用いた。MUC1も内在的に発現するSW620細胞を、陽性対照として用いた。ヒトDCとヒトがん細胞SW620との比較において見られた、分子量における相違は、MUC1タンパク質の異なるグリコシル化に起因する可能性が最も高い。
MUC1-Cは、主に非グリコシル化17又は15kDa形態としてヒトDCにおいて発現されていて、25～20グリコシル化分子種としては発現しないようである。DC成熟の証拠を求めて、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1及びAd5 [E1-, E2b-]-nullで感染させたヒトDCを、感染していないヒトDCと比較して分析した。Ad5 [E1-, E2b-]-null及びTAAを発現する組換えAd5 [E1-, E2b-]ベクター間では、それぞれわずかに上方制御された表面CD80及びCD83を発現し、HLA-DR表面発現を強く上方制御するという点で差異はなかった。それゆえ、DC成熟におけるあらゆる変化はAd-5ベクター単独によるものであり、TAA導入遺伝子の挿入によるものでは全くないことは明らかである。
各TAAについて対応するペプチドを用いた、Brachyury-、CEA-、及びMUC1特異的ヒトCD8+T細胞の生成が、以前に報告された (Palenaら、Clin Cancer Res. 2007; 13: 2471-2478；Tsangら、Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149；Jochemsら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174；Tuckerら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317；Salazarら、Int J Cancer. 2000; 85: 829-838；及びZarembaら、Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577を参照)。
表1に示されるように、Ad5 [E1-, E2b-]-nullは、IFN-γを産生するよう、T細胞のいずれも活性化しなかった。Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyuryで感染させたDCは、Brachyury特異的T細胞を活性化し、CEA特異的T細胞 (陰性対照として)を活性化しなかった。このことは、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyuryで感染させたDCは、特異的にT細胞を活性化できるBrachyury-MHCクラスI複合体を生成する様式で、Brachyuryをプロセッシングできたことを実証する。
Figure 0007048482000001
ヒトDC (IL-4及び顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)中で、6日培養、0.5 mlのAIM-V中、2×104 細胞/ウェル)を、表示したアデノウイルスベクターで、20,000感染多重度 (MOI)で感染させた。48時間後、DCを洗浄し、ヒト抗原特異的T細胞の刺激のために使用した。結果は、1×105 T細胞/ml当たりのIFN-γ（pg/ml）で表される。太字の数字は、感染していないDCを含む対応するウェルと比べての、IFN-γ分泌の有意な促進を示す。[--はアッセイが行われなかったことを示す。]
Figure 0007048482000002
HLA-A2及びHLA-A24ドナーに由来するヒトDC (IL-4及びGM-CSF中で、6日培養)を、0.5 mlのAIM-V中で、2×104/ウェル (24ウェルプレート)でTri-Ad-5ベクターに感染させた。TriAd-5ベクターを20,000 MOIで、1時間用い、次いで、1.5 mlのAIM-Vを各ウェルに添加した。感染させたDCを48時間インキュベートし、次いで、洗浄し、ヒト抗原特異的T細胞の刺激のために用いた。結果は、1×105 T細胞/ml当たりのIFN-γ（pg）で表される。太字の数字は、感染していないDCを含む対応するウェルと比べての、IFN-γ分泌の有意な促進を示す。
同様に、Ad5 [E1-, E2b-]-CEAで感染させたDCは特異的に、CEA特異的T細胞を活性化したが、MUC1特異的T細胞株を活性化しなかった。クラスＩHLA-A2及びHLA-A24の両方のMUC1特異的T細胞株が、以前に生成されており (Jochemsら、Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174を参照)、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1で感染させたDCは、これらのT細胞株の両方を活性化することができたが、CEA特異的T細胞を活性化することはできなかった (表1A)。同様に、ヒトDCをTriAd-5ベクターで感染させた。表1Bで見られるように、CEA、MUC1及びBrachyuryに特異的であるT細胞は、各々活性化され、個々のAd-5ベクターの使用で見られるのと同様のレベルのIFN-γを誘導した。
次いで、CEA/MUC1/Brachyury混合のTri-Ad5でのヒトDCの同時感染が、3つのTAA全てに特異的なT細胞株を生成することができるかどうかを決定するために、研究が行われた。表2に示されるように、T細胞が、対照ペプチドでなく、対応するペプチドでパルスされた自己のB細胞とのインキュベーションによって活性化されたとき、特異的T細胞の活性化を観察した。
Figure 0007048482000003
前立腺がん患者に由来するヒト樹状細胞 (DC) (IL-4及び顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)中で、6日培養、0.5 mlのAIM-V中、2×104 細胞/ウェル)をTri-Ad5で、20,000 MOIで感染させた。48時間後、感染させたDCを洗浄し、エフェクターとしての自己の末梢血単核細胞 (PBMC)を用いて、特異的な細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)を生成するために使用した。3サイクルのin vitroでの刺激に続いて、ペプチドでパルスした自己のB細胞を抗原提示細胞として用いた。結果は、IFN-γ（pg/ml）で表される。[--はアッセイが行われなかったことを示す。]
例えば、ヒトDCをTri-Ad5で感染させることによって生成した、Brachyury特異的T細胞株は、Brachyuryペプチドでパルスされた自己DCと共にインキュベートされた時、IFN-γを産生するよう刺激されたが、CEAペプチドでパルスされた同じ自己DCによっては活性化されなかった。Tri-Ad5で感染させたDCを用いて生成されたCEA及びMUC1 T細胞株で、類似する結果が見られた。これらの結果は、in vitroでのTri-Ad5の使用における、いわゆる「抗原競合」の欠如を示す。
Tri-Ad5で感染させたDCを用いて生成された、Brachyury-、MUC1-及びCEA特異的ヒトT細胞は、内在的にこれらのTAAを発現するヒトがん細胞を溶解できるかどうかが、次いで調べられた。ヒト結腸がん細胞SW620は、3つのTAA全てを発現し、HLA-A2及びHLA-A24クラスI対立遺伝子を有する。ヒト膵臓がん細胞ASPC-1は、3つのTAAを発現するが、HLA-A1及びHLA-A26分子の関係で発現するので、それを陰性対照として用いた。結果（表3）は、Tri-Ad5で感染させたヒトDCがMHC拘束性の様式で、内在的にBrachyury、CEA及びMUC1を発現するヒト腫瘍細を溶解することができるT細胞を生成し得ることを実証した。
Figure 0007048482000004
ヒト樹状細胞 (DC)をTri-Ad5で、20,000 MOIで感染させた。感染させたDCは、自己の末梢血モノクローナル細胞 (PBMC)を用いて、特異的な細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)を生成するために用いた。自己のDCを抗原提示細胞として、3回のin vitroでの刺激 (IVS)のために用いた。ペプチドパルスでパルスされた自己のB細胞を、2回の追加的なIVSのために、抗原特異的CTLを再刺激するために使用した。用いたエフェクターと標的の比は30:1であった；CTLをIVS 5で用いた。結果は%特異的溶解 (SD)で表される。
Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1及びAd5 [E1-, E2b-]-CEAが、各々in vivoで、TAA特異的なT細胞応答を生成することができるかどうか、及びTri-Ad5混合物が同等の応答を生成することができるかどうか、を決定するための研究が次に行われた。C57Bl/6マウス (1群当たり、n=5)は、2週間の間隔で、3回、皮下に（s.c.）1010 ウイルス粒子 (VP)のAd5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury又はTri-Ad5 (各1010 VPの1:1:1混合物)を注射された。追加群 (n=5)のマウスは、3×1010 VPのAd5 [E1-, E2b-]-null (空ベクター、対照)が接種された。
最後のワクチン接種後2週間で、ワクチン接種したマウスに由来する脾細胞を、対応するBrachyury、CEA又はMUC1ペプチドプールで刺激し、酵素結合免疫スポット (ELISPOT)アッセイによって、IFN-γ及びIL-2分泌細胞について分析した。1つだけのコンストラクト又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスは、それぞれBrachyury、CEA及びMUC1ペプチドに応答し、対照マウスと比べて、IFN-γ及びIL-2スポット形成細胞 (SFC)の有意な増加を伴った (図1A及びB)。Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury又はAd5 [E1-, E2b-]-CEAで個々にワクチン接種したマウスにおいては、Tri-Ad5ワクチンを接種したマウスと比べて、IFN-γ SFCの平均数において、有意差がなかった。Tri-Ad5ワクチンで処置したマウスは、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1のみで処置したマウスと比べて、IFN-γ SFCにおいて有意に減少したが、Tri-Ad5で誘導されたMUC1特異的な免疫応答は、対照マウスよりも有意に上昇したままであった (p<0.0001) (図2A)。IL-2の応答は、Tri-Ad5と単一ワクチンコンストラクトで処置したマウスとの比較においては、類似していた；更に、Tri-Ad5ワクチンや（versus）Ad5 [E1-, E2b-]-CEAワクチンのみで、マウスをワクチン接種した時、CEA特異的IL-2 SFCにおいて有意な上昇があった (p=0.004) (図3B)。空ベクターでワクチン接種したマウスに由来する脾細胞は、Brachyury、CEA又はMUC1ペプチドプールに対して応答しなかった。加えて、ワクチン接種したいずれの群に由来する脾細胞においても、対照ペプチドプール（サル免疫不全ウイルス(SIV)-Nef及びSIV-Vif)）に対して反応がなかった。
まとめると、これらのデータは、Tri-Ad5ワクチン混合物において、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA及びAd5 [E1-, E2b-]-MUC1を組合せることは、各ワクチンのみを用いるときに得られた、抗原特異的なIFN-γ及びIL-2産生細胞を生成する効果と類似する効果を有していることを示す。
CD8+及びCD4+リンパ球集団におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内蓄積はまた、アデノウイルスベクターでワクチン接種したマウスに由来し、それぞれの合成ペプチドの重複するプールで刺激された脾細胞を用いたフローサイトメトリーによって評価された (図2)。Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyuryでワクチン接種したマウスから単離されたCD8+脾臓リンパ球で観察されたIFN-γ産生は、Tri-Ad5でワクチン接種したマウスから単離されたものと比べて、有意差が観察されなかった (図2A)。単一コンストラクトワクチンを接種したマウスでみられたものと比べて、Tri-Ad5でワクチン接種したマウスから単離されたCD8+脾細胞におけるCEA特異的及びMUC1特異的なIFN-γの蓄積では有意な減少が観察されたが、相対的なSFC数は、対照よりも有意に上昇したままであった (p<0.0001) (図2A)。しかしながら、各単一コンストラクトでワクチン接種したマウス又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスから単離されたCD4+脾細胞間では、IFN-γの蓄積において有意差が見られなかった (図2B)。
ペプチドで刺激された脾細胞はまた、IFN-γ及びTNF-αの両方の細胞内蓄積についてフローサイトメトリーによって評価された。各単一抗原ベクター及びTri-Ad5でワクチン接種したマウスにおいては、抗原特異的な多機能CD8+及びCD4+脾細胞が検出された。単一ベクターでワクチン接種したマウスから単離された二重機能CD8+及びCD4+脾細胞とTri-Ad5でワクチン接種したマウスからのものの頻度を直接的に比較したときは、非常に少ない差異が観察された (図2C及びD)。それぞれの抗原に対するAd5 [E1-,E2b-]-Brachyury又はAd5 [E1-, E2b-]-CEAでワクチン接種したマウスから単離された二重機能CD8+脾細胞と、Tri-Ad5でワクチン接種したマウスから単離されたものとの間を比較して、有意差は検出されなかった (図 2C)。Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1でワクチン接種したマウスに由来する二重機能CD8+脾細胞は、Tri-Ad5でワクチン接種したものに比べて有意な減少(p=0.04)が観察された；しかしながら、この減少頻度は、対照のものと比べて有意に上昇していた (p<0.001)。各単一コンストラクト又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスから単離された多機能CD4+脾細胞の頻度においては、有意差がみられなかった (図 2C)。
Ad5 [E1-, E2b-]-CEA、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1、Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury又はTri-Ad5ワクチンによって液性応答が誘導されるかどうかを評価するために、抗原特異的な定量的酵素結合免疫測定法 (ELISA)が利用された。Ad5 [E1-,E2b-]-CEA又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスに由来する血清においては、CEAに対する、著しい、相当な抗体応答が検出された(図3A)。対照ベクターでワクチン接種したマウス (図3A)、又はAd5 [E1-, E2b-]-Brachyury又はAd5 [E1-, E2b-]-MUC1でワクチン接種したマウスにおいて、CEAに対する抗体は検出されなかった。Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury、Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1又はTri-Ad5で、それぞれワクチン接種したマウスの血清においては、Brachyury又はMUC1に対する抗原特異的抗体は検出されなかった。
Ad5 [E1-, E2b-]-CEA又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスの血清におけるCEA抗体の、CEAを発現する腫瘍細胞を溶解するための傾向を決定するために、補体依存性細胞傷害 (CDC)アッセイが利用された。ワクチン接種したマウスに由来する血清を熱で不活性化させて、MC38-CEA2腫瘍細胞 (ヒトCEAでトランスフェクトしたマウスCEA結腸がん細胞)と共にインキュベートし、続けて補体のソースとしてのウサギ血清とインキュベートした。MC38-CEA2細胞に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)の放出によって、溶解を決定した。Tri-Ad5又はAd5 [E1-, E2b-]-CEAでワクチン接種したマウスに由来する血清において、MC38-CEA2細胞の有意な溶解がみられ、この効果は2群間で類似していた (図3B)。
次いで、抗腫瘍効果を引き起こすことにおいて、Tri-Ad5ワクチン療法が、単一の組換えアデノウイルスコンストラクトの使用と同じ位効果的であるかどうかを決定するための研究が行われた。C57BL/6マウス (n=7／群)は、左脇の皮下に、MUC1を発現する1×106 MC38細胞 (MC38-MUC1)を移植された。マウスは、それぞれ1010 VPのAd5 [E1-, E2b-]-MUC1又はTri-Ad5を用いて、反対側の脇の皮下に注射することで毎週ワクチン接種された。マウスの対照群は、3×1010 VPのAd5 [E1-, E2b-]-null (導入遺伝子なし)の接種を受けた。Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスは、25日 (p<0.01)及び29日 (p < 0.05)において、対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有していた (図4)。Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1又はTri-Ad5でワクチン接種したマウスの群については、全ての時点において抗腫瘍効果において有意差がなかった (p>0.1)。
本明細書において引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に、具体的に、参照によって取り込まれることが示されているのと同程度に、かつ全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照することによって本明細書に取り込まれる。
本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも1つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。1以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「A及びBの少なくとも1つ」）は、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、列記された項目（A又はB）から選択された１つの項目、又は列記された項目（A及びB）の2以上の任意の組合せを意味するものとして解釈されるべきである。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（すなわち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
本発明を実施するための発明者が知るベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予測し、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。

Claims (33)

  1. 配列番号３のアミノ酸配列であって、残基229がValであるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  3. 請求項２に記載の核酸を含む非酵母ベクター。
  4. 前記ベクターが、プラスミド、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、シンドビスウイルス又は細菌のベクターからなる群から選択される、請求項３に記載のベクター。
  5. 前記細菌のベクターが、リステリア又はサルモネラベクターである、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記ベクターが、オルトポックス、アビポックス、カプリポックス及びスイポックスウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスである、請求項４に記載のベクター。
  7. 前記ポックスウイルスが、ワクシニア、鶏痘及びカナリアポックスウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載のベクター。
  8. インターロイキン (IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、
    抗CTLA-4、又はそれらの組合せをコードする核酸を更に含む、請求項３～６のいずれか１項に記載のベクター。
  9. １以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸を更に含む、請求項３～８のいずれか１項に記載のベクター。
  10. (i)請求項１に記載のポリペプチド、(ii)請求項２に記載の核酸、又は(iii)請求項３～
    ９のいずれか１項に記載のベクターを含む、非酵母細胞。
  11. 前記細胞が抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項１０に記載の細胞。
  12. (a) (i)請求項１に記載のポリペプチド、(ii)請求項２に記載の核酸、(iii)請求項３～９のいずれか１項に記載のベクター、又は(iv)請求項１０又は１１に記載の細胞、及び
    (b) 医薬的に許容される担体
    を含む組成物。
  13. (i)インターロイキン (IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、インターフェロン (IFN)-γ、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、抗CTLA-4若しくはそれらの組合せ、
    (ii) キトサンと複合体化した、IL-12をコードするプラスミド、又は
    (iii)キトサンと混合された組換えIL-12
    を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロホスファミド又はそれらの組合せを更に含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
  15. １以上のアジュバントを更に含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. １以上のアジュバントが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、QS21、MPL-A、RIBI DETOXTM及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１
    ５に記載の組成物。
  17. 顆粒球単球コロニー刺激因子 (GM-CSF)を更に含む、請求項１２～１６のいずれか１項
    に記載の組成物。
  18. リポソームを更に含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 免疫応答を誘導するための請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組成物であって、前記免疫応答がBrachyury特異的CD4+Ｔ細胞応答を含む、組成物。
  20. 前記免疫応答がBrachyury特異的CD8+Ｔ細胞応答を更に含む、請求項１９に記載の組成
    物。
  21. 対象におけるがんを治療又は予防するための請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記対象がヒトである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記対象ががんを有する、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記がんが、乳がん、小腸がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、慢性リンパ性白血病 (CLL)、B細胞リンパ腫
    、バーキットリンパ腫又はホジキン・リンパ腫である、請求項２３に記載の組成物。
  25. 有効量のアジュバントを更に含む、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記アジュバントがキトサンである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 治療有効量の第二の剤と共に対象に投与される請求項１９～２５のいずれか１項に記載の組成物であって、前記第二の剤が、化学療法剤、放射線、小分子標的治療薬、ホルモン療法又はチェックポイント阻害剤である、組成物。
  28. 前記チェックポイント阻害剤が、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4及びそれらの組合せから
    なる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記第二の剤が、上皮増殖因子受容体阻害剤、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β阻害剤又はチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  30. 対象におけるがん細胞の増殖を阻害するための請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、樹状細胞と接触して特異的抗原提示細胞を産生し；及び前記特異的抗原提示細胞が対象に投与され、それにより免疫応答が誘導され、がん細胞の増殖が阻害される、ポリペプチド。
  31. 前記対象がヒトである、請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. 前記がんが、乳がん、小腸がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、慢性リンパ性白血病 (CLL)、B細胞リンパ腫
    、バーキットリンパ腫又はホジキン・リンパ腫である、請求項３０又は３１に記載のポリペプチド。
  33. 前記対象が、高悪性度の前立腺上皮内新生物、家族性腺腫様ポリープ症又は乳房の異型を有する、請求項３２に記載のポリペプチド。
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