ES2924400T3 - Mutantes por deleción de Brachyury, vectores que no son de levadura que codifican mutantes por deleción de Brachyury y su uso - Google Patents

Mutantes por deleción de Brachyury, vectores que no son de levadura que codifican mutantes por deleción de Brachyury y su uso Download PDF

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Abstract

La invención proporciona polipéptidos mutantes por deleción de Brachyury, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, vectores que no son de levadura que comprenden los ácidos nucleicos, células que no son de levadura y métodos de uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes por deleción de Brachyury, vectores que no son de levadura que codifican mutantes por deleción de Brachyury y su uso
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud de patente reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/200.438, presentada el 3 de agosto de 2015.
La presente invención se realizó con la financiación del gobierno con el número de proyecto Z01 BC010937 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
El gen Brachyury se clonó inicialmente a partir de mutantes de desarrollo de ratón caracterizados por una detención en la formación del mesodermo (Hermann et al., Nature 1990; 343:617-22) y se ha reconocido como un gen que es importante en el desarrollo del mesodermo durante la gastrulación. Brachyury es un miembro de una familia de factores de transcripción, denominados factores de transcripción T-box; estos factores se caracterizan por un dominio de unión al ADN conservado (Papaioannou et al., Bioessays 1998;20:9-19). Estos factores de transcripción desempeñan una función esencial en la formación y organización del mesodermo en vertebrados (véase, por ejemplo, Edwards et al., Genome Res 1996; 6:226-33). Además de la importante función de las proteínas T-box en el control de los procesos de desarrollo, varios miembros de esta familia están desregulados en el cáncer. Por ejemplo, se ha informado de que el gen Tbx2 humano está amplificado en líneas celulares de cáncer pancreático (Mahlamaki et al., Genes Chromosomes Cancer 2002; 35:353-8) y está sobreexpresado en tumores de mama con mutaciones en BRCA-1 y BRCA-2 (Sinclair et al., Cancer Res 2002; 62:3587-91). Además, se ha demostrado que la expresión de Tbx3 está aumentada en determinadas líneas celulares de cáncer de mama humano (Fan et al., Cancer Res 2004; 64:5132-9). La expresión de Brachyury también se ha documentado en líneas de teratocarcinoma humano: un subconjunto de tumores de células germinales, los teratocarcinomas son células de carcinoma embrionario con capacidad de diferenciación del mesodermo (Gokhale et al., Cell Growth Differ 2000; 11:157-62) y en cordomas (véase, por ejemplo, Vojovic et al., J Pathol 2006; 209:157-65). Brachyury también se sobreexpresa en una variedad de carcinomas humanos, incluyendo carcinoma de mama, pulmón, colon, próstata y hepatocelular, y en neoplasias malignas de origen de linfocitos B, tal como leucemia linfocítica crónica (LLC), linfomas de linfocitos B y mieloma múltiple, entre otros. El documento WO 2014/043535 A1 describe procedimientos y usos que se refieren a factores de transcripción implicados en la regulación de la transición epitelial a mesenquimatosa durante el desarrollo de vertebrados, tal como la proteína Brachyury, y composiciones que comprenden vectores poxvíricos que codifican dichos factores de transcripción, para el tratamiento del cáncer. El documento WO 2014/043518 A1 describe la proteína Brachyury, vectores que no son de levadura que no son poxvirus que codifican la proteína Brachyury y su uso.
Las intervenciones inmunoterápicas contra el cáncer dependen de la identificación de antígenos tumorales que pueden provocar una respuesta inmunitaria del huésped contra las células tumorales. Son buenas dianas las moléculas que se expresan selectivamente por células malignas y que también son esenciales para la transformación maligna y/o la progresión tumoral. Sigue existiendo una necesidad de reactivos que induzcan una respuesta inmunitaria eficaz contra el cáncer, incluyendo una respuesta de linfocitos T CD4 y CD8.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona polipéptidos mutantes por deleción de Brachyury y, en particular, la invención proporciona un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, vectores que no son de levadura que comprenden los ácidos nucleicos, células y composiciones de los mismos.
En particular, la invención proporciona una composición para su uso como medicamento, opcionalmente en la que el medicamento es para administración a un sujeto humano.
La invención proporciona un polipéptido, ácido nucleico, vector que no es de levadura, célula o composición, siendo la composición para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del polipéptido, ácido nucleico, vector que no es de levadura, célula o composición, tratando o previniendo la composición de este modo el cáncer en el sujeto.
La invención también proporciona un polipéptido para su uso en la inhibición del crecimiento de una célula cancerosa en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula dendrítica con el polipéptido para producir una célula presentadora de antígeno específica; y administrar la célula presentadora de antígeno específica al sujeto, induciendo de este modo una respuesta inmunitaria e inhibiendo el crecimiento de la célula cancerosa.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
Las figuras 1A y 1B son gráficos que representan un análisis de esplenocitos que expresan IFN-y e IL-2, respectivamente, después de la vacunación de ratones con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Tri-Ad5 y Ad5 [E1-, E2b-]-nulo. Se vacunaron ratones C57BL/6 (n = 5/grupo) tres veces a intervalos de 2 semanas con 1010 Pv (partículas víricas) de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury (barra blanca), Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (barra gris), Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 (barra negra) o Tri-Ad5 (mezcla 1:1:1 de 1010 PV cada uno de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [El-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1) (barra de entramado diagonal). Los controles recibieron 3*1010 PV de Adeno-nulo (barra con rayas horizontales). Se recogieron esplenocitos 14 días después de la vacunación final y se evaluaron las células secretoras de IFN-y (A) o las células secretoras de IL-2 (B) mediante ensayo ELISpOT. Para los controles positivos, los esplenocitos se expusieron a concanavalina A (Con A). Datos presentados como el número de células formadoras de manchas (CFM) por 106 esplenocitos. Las barras de error representan EEM. Las diferencias significativas (p < 0,05) entre columnas se presentan en valores de p, no significativas = ns.
Las figuras 2A-D son gráficos que representan un análisis de poblaciones celulares CD8+ y CD4+ y multifuncionales después de la vacunación con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Tri-Ad5 y Ad5 [E1-, E2b-]-nulo. Se vacunaron ratones C57BL/6 (n = 5/grupo) tres veces a intervalos de 2 semanas con 1010 PV (partículas víricas) de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury (barra blanca), Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (barra gris), Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 (barra negra) o Tri-Ad5 (mezcla 1:1:1 de 1010 PV (partículas víricas) cada uno de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1) (barra de entramado diagonal). Los controles recibieron 3*1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-nulo (barra con rayas horizontales). Se recogieron esplenocitos 14 días después de la vacunación final y se evaluaron mediante FACs para células CD8a+ (A) y CD4+ (B) que expresan IFN-y, o para células CD8a+ (C) y CD4+ (D) que secretan IFN-y y TNF-a. Para los controles positivos, los esplenocitos se expusieron a concanavalina A (Con A). Las barras de error representan EEM. Las diferencias significativas (p < 0,05) entre columnas se presentan en valores de p, no significativas = ns.
Las figuras 3A y 3B son gráficos que representan la actividad del anticuerpo contra CEA de sueros de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-CEA o Tri-Ad5. Los niveles de IgG contra CEA en ratones vacunados tres veces con 1010 PV (partículas víricas) de Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (barra gris), Tri-Ad5 (barra de entramado diagonal) o 3*1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-nulo (barra con rayas horizontales) se determinaron por ELISA (A). Se realizó citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células MC38-CEA2 (B). Las barras de error representan EEM. Las diferencias significativas (p < 0,05) entre columnas se presentan en valores de p, no significativas = ns.
La figura 4 es un gráfico que representa una comparación de inmunoterapia de tumores que expresan MUC1 usando Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 frente a Tri-Ad5. Se inocularon ratones C57BL/6 (n = 7/grupo) con 106 células MC-38-MUC1 por vía subcutánea en el flanco izquierdo. A los ratones se les administraron 1010 PV (partículas víricas) de Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o Tri-Ad5 (mezcla 1:1:1 de 1010 PV de cada uno de Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y Ad5 [e 1-, E2b-]-Brachyury, 3*1010 PV en total). Un grupo de control de ratones recibió 3*1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-nulo (sin transgén). Se vigiló el crecimiento tumoral y se calcularon los volúmenes. (*) indica los días en que los ratones tratados con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 tenían tumores significativamente más pequeños (p < 0,05) que los ratones de control y (A) indica los días en que los ratones tratados con Tri-Ad5 tenían tumores significativamente más pequeños (p < 0,05) que los ratones de control. No hubo una diferencia significativa (p > 0,1) entre los ratones tratados con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y Tri-Ad5 en ningún momento. Las barras de error representan el EEM.
Descripción detallada de la invención
Brachyury (también conocida como "proteína T") es una proteína que se transcribe en el mesodermo. La proteína Brachyury de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (véase también el n.° de acceso de GENBANK® NP_003172 y el n.° de acceso de GENBANK® NM_003181). La proteína Brachyury de longitud completa con un epítopo agonista tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
La invención proporciona un polipéptido de Brachyury modificado que comprende una modificación en la que la actividad de unión al ADN de la proteína Brachyury se ha reducido o suprimido por mutación (por ejemplo, por deleción, suficiente para reducir o suprimir la actividad de unión al ADN natural de la proteína Brachyury).
La invención proporciona un mutante por deleción de Brachyury, en el que la secuencia se ha modificado para delecionar un fragmento de 25 aminoácidos implicado en la unión al ADN (dominio de unión al ADN). El dominio de unión al ADN corresponde a los residuos 198-222 de SEQ ID NO: 1 y s Eq ID NO: 2.
El mutante por deleción de Brachyury es un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 3, en el que el residuo 228 puede ser Ser o Val. El polipéptido de SEQ ID NO: 3 es un ejemplo de un mutante por deleción de Brachyury, donde la secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína Brachyury humana de SEQ ID NO: 1 por la deleción de las posiciones 198-222 (es decir, las posiciones 198-222 de s Eq ID NO: 1 o 2 no están presentes en SEQ ID NO: 3). SEQ ID NO: 3 es un polipéptido que consiste en las posiciones 1-197 fusionadas directamente a las posiciones 223-435 de SEQ ID NO: 1 o 2. Este mutante por deleción de Brachyury tiene alterada la capacidad de unión al ADN en comparación con la proteína Brachyury de SEQ ID NO: 3.
En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido mutante por deleción de Brachyury comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica, al menos un 96 % idéntica, al menos un 97 % idéntica, al menos un 98 % idéntica, al menos un 99 %, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de la divulgación, el polipéptido mutante por deleción de Brachyury comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 sin la metionina N terminal, y/o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 con sustituciones en la posición 177 (Asp frente a Gly, respectivamente), posición 343 (Thr frente a Ser, respectivamente) y posición 384 (Asn frente a Asp, respectivamente).
El polipéptido de la invención se puede preparar mediante cualquier procedimiento, tal como sintetizando el polipéptido o expresando un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos apropiada en una célula y recolectando el polipéptido de la célula. También se puede usar una combinación de dichos procedimientos. Los procedimientos de síntesis de polipéptidos de novo y los procedimientos de producción recombinante de polipéptidos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Chan et al., Fmoc Solid Phase polypeptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Polypeptide and Protein Drug Analysis, Ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, Ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994).
El polipéptido puede estar en forma de una proteína de fusión (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende el polipéptido y uno o más agentes activos y/o marcas). El polipéptido también se puede unir a un vehículo. En general, un vehículo es una macromolécula inmunógena a la que se puede unir una molécula antigénica. Cuando se une a un vehículo, el polipéptido unido se vuelve más inmunógeno. Los vehículos se eligen para incrementar la inmunogenicidad de la molécula unida y/o para provocar concentraciones más altas de anticuerpos contra el vehículo, que son beneficiosas desde el punto de vista diagnóstico, analítico y/o terapéutico. La unión covalente de una molécula a un vehículo puede conferir inmunogenicidad potenciada y dependencia de linfocitos T (véase Pozsgay et al., PNAS 96:5194-97, 1999; Lee et al., J. Immunol. 116: 1711-18, 1976; Dintzis et al., PNAS 73:3671-75, 1976). Los vehículos útiles incluyen vehículos poliméricos, que pueden ser materiales naturales (por ejemplo, polisacáridos, polipéptidos o proteínas de bacterias o virus), semisintéticos o sintéticos que contienen uno o más grupos funcionales a los que se puede fijar un resto reactante. Los productos bacterianos y las proteínas víricas (tal como el antígeno de superficie y el antígeno central de la hepatitis B) también se pueden usar como vehículos, así como las proteínas de organismos superiores tal como la hemocianina de lapa californiana, hemocianina de cangrejo herradura, edestina, seroalbúminas de mamífero e inmunoglobulinas de mamífero. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, una proteína de envoltura pequeña de hepatitis B, HBsAg. Esta proteína tiene la capacidad de autoensamblarse en agregados y puede formar partículas similivíricas. La preparación de HBsAg está bien documentada, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente europea n.° EP-A-0226 846, la publicación de solicitud de patente europea n.° EP-A-0299 108 y la publicación PCT n.° WO 01/117554, y la secuencia de aminoácidos divulgada, por ejemplo, en Tiollais et al., Nature, 317:489, 1985, y la publicación de patente europea n.° EP-A-0278940y la publicación PCT n.° WO 91/14703.
La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido o la proteína de fusión. El ácido nucleico puede comprender ADN, ADNc y/o ARN, puede ser de mono- o bicatenario y puede ser natural, sintético y/o recombinante. Además, el ácido nucleico puede comprender análogos o derivados nucleotídicos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato y similares). Se producen mutaciones sinónimas en la secuencia codificante por la degeneración (es decir, la redundancia) del código genético, con lo que más de un codón puede codificar el mismo residuo aminoacídico. Por tanto, por ejemplo, la leucina puede estar codificada por CTT, CTC, CTA, CTG, TTA o TTG; la serina puede estar codificada por TCT, TCC, t Ca , TCG, AGT o AGC; la asparagina puede estar codificada por AAT o AAC; el ácido aspártico puede estar codificado por GAT o GAC; la cisteína puede estar codificada por TGT o TGC; la alanina puede estar codificada por GCT, GCC, GCA o GCG; la glutamina puede estar codificada por CAA o CAG; la tirosina puede estar codificada por TAT o TAC; y la isoleucina puede estar codificada por a Tt , ATC o ATA. Pueden encontrarse tablas que muestran el código genético estándar en diversas fuentes (por ejemplo, L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3.a edición, W.H. 5 Freeman and Co., NY).
El ácido nucleico puede codificar el polipéptido solo o como parte de una proteína de fusión. El ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede proporcionar como parte de una construcción que comprende el ácido nucleico y los elementos que posibilitan la administración del ácido nucleico a una célula y/o la expresión del ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido se puede unir de forma funcional a las secuencias de control de la expresión. Una secuencia de control de la expresión unida de forma funcional a una secuencia codificante se liga de manera que la expresión de la secuencia codificante se consiga en condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores apropiados, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG) delante de un gen que codifica una proteína, señal de empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada de ARNm y codones de terminación. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano de SV40, un promotor de VSR, un promotor tardío principal de adenovirus, un promotor temprano inmediato I de CMV humano, un promotor de poxvirus, un promotor 30K, un promotor 13, un promotor sE/L, un promotor 7.5K, un promotor 40K y un promotor C1. Se describen vacunas de a Dn T en la patente de EE. UU. n.° 5.589.466; la patente de EE. UU. n.° 5.973.972. Además de los protocolos de administración descritos en esas solicitudes, se describen procedimientos alternativos de administración de ADN en las patentes de EE. UU. n.° 4.945.050 y 5.036.006.
Un ácido nucleico que codifica el polipéptido o proteína de fusión se puede clonar o amplificar mediante procedimientos in vitro, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia automantenida (3SR) y el sistema de amplificación de replicasa Qp (QB). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica el polipéptido se puede aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa del ADNc usando cebadores basados en la secuencia de ADN de la molécula. Una amplia variedad de metodologías de clonación y amplificación in vitro son bien conocidos por expertos en la técnica. Se describen procedimientos de PCR, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.683.195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Los polinucleótidos también se pueden aislar cribando colecciones genómicas o de ADNc con sondas seleccionadas de las secuencias del polinucleótido deseado en condiciones de hibridación rigurosas.
La invención proporciona además un vector que no es de levadura que comprende el ácido nucleico. Ejemplos de vectores adecuados incluyen plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN), vectores bacterianos y vectores víricos, tales como poxvirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, poliovirus, alfavirus, baculorvirus y virus Sindbis. Cuando el vector es un plásmido (por ejemplo, plásmido de ADN), el plásmido puede formar complejos con quitosano.
Vectores bacterianos: El vector puede ser un vector bacteriano, tal como un vector de Listeria o Salmonella. Listeria es un bacilo grampositivo. El género Listeria contiene actualmente siete especies: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. murrayi, L. seeligeriy L. welshimeri. L. monocytogenes es una bacteria intracelular que se ha usado como vector para administrar genes in vitro.
Salmonella es un género de enterobacterias predominantemente móviles, gramnegativas, no formadoras de esporas, con forma de bastón, con diámetros de alrededor de 0,7 a 1,5 |jm, longitudes de 2 a 5 |jm y flagelos que se extienden en todas las direcciones (es decir, perítricos). Son quimioorganótrofos, que obtienen su energía de reacciones de oxidación y reducción usando fuentes orgánicas, y son anaerobios facultativos. Salmonella se puede usar como vector de administración de proteínas terapéuticas, mediante la inclusión de plásmidos, tales como los que tienen genes tetA truncados, en la célula huésped. S. typhimirium atenuada se puede transformar con plásmidos de ADN, tales como, pero sin limitarse a, pIRES (Invitrogen) y se puede usar como vehículo para la administración de polipéptidos y proteínas.
Poxvirus: El vector puede ser un poxvirus seleccionado del grupo que consiste en orthopoxvirus, avipoxvirus, viruela aviar, viruela del mapache, viruela del conejo, capripoxvirus (por ejemplo, viruela caprina y viruela ovina), leporipoxvirus y suipoxvirus (por ejemplo, viruela porcina). Ejemplos de avipoxvirus incluyen viruela aviar, viruela de las palomas y viruela del canario, tal como ALVAC. Ejemplos de orthopoxvirus incluyen virus variolovacunal, virus Ankara variolovacunal modificado (MVA), Wyeth, Ny VAC, TROYv Ac , Dry-Vax, POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) y derivados de los mismos. Por ejemplo, derivados de la cepa Wyeth incluyen, pero no se limitan a, derivados que carecen de un gen K1L funcional.
Vectores poxvíricos ejemplares para la expresión como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.165.460. El genoma del virus variolovacuna es conocido en la técnica. Está compuesto por una región HIND F13L, una región TK y una región HA. El virus variolovacuna recombinante se ha usado para incorporar un gen exógeno para la expresión del producto génico exógeno (véase, por ejemplo, Perkus et al. Science 229:981-984, 1985; Kaufman et al. Int. J. Cancer 48:900-907, 1991; Moss Science 252:1662, 1991). Baxby y Paoletti (Vaccine 10:8-9, 1992) divulgan la construcción y el uso como vector del poxvirus no replicante, incluyendo el virus de la viruela del canario, el virus de la viruela aviar y otras especies aviares. Sutter y Moss (Proc. Nat'l. Acad. Sci U.S.A.
89:10847-10851, 1992) y Sutter et al. (Virology 1994) divulgan la construcción y uso como vector del virus Ankara recombinante no replicante (MVA, Ankara variolovacunal modificado) en la construcción y uso de un vector.
Plásmidos: Los plásmidos se han diseñado con varios objetivos en mente, tales como conseguir un alto número de copias regulado y evitar posibles causas de inestabilidad de los plásmidos en bacterias, y proporcionar un medio para la selección de plásmidos que sean compatibles con el uso terapéutico humano. Se ha prestado especial atención a los requisitos dobles de los plásmidos de genoterapia. En primer lugar, son adecuados para el mantenimiento y la fermentación en E. coli, de modo que se puedan producir y purificar grandes cantidades de ADN. En segundo lugar, son seguros y adecuados para su uso en pacientes humanos y animales. El primer requisito exige plásmidos con un alto número de copias que se puedan seleccionar y mantenerse estables con relativa facilidad durante la fermentación bacteriana. El segundo requisito exige atención sobre elementos tales como marcadores de selección y otras secuencias codificantes. En algunos modos de realización, los plásmidos que codifican el polipéptido están compuestos por: (1) un origen de replicación de alto número de copias, (2) un marcador de selección, tal como, pero sin limitarse a, el gen neo para la selección en antibióticos con kanamicina, (3) secuencias de terminación de la transcripción y (4) un sitio de clonación múltiple para la incorporación de diversos casetes de ácido nucleico; y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifique el polipéptido.
Hay numerosos vectores plasmídicos que son conocidos en la técnica para inducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido. Estos incluyen, pero no se limitan a, los vectores divulgados en la patente de EE. UU. n.° 6.103.470; la patente de EE. UU. n.° 7.598.364; la patente de EE. UU. n.° 7.989.425; y la patente de EE. UU. n.° 6.416.998.
Vectores adenovíricos: Se pueden producir vectores adenovíricos (Ad) que codifican una proteína Brachyury o un polipéptido de Brachyury y son de utilidad en los procedimientos divulgados en el presente documento. Estos vectores son de utilidad en los procedimientos divulgados en el presente documento, incluyendo formas con capacidad de replicación, carentes de replicación, inactivas de los mismos y vectores de virus adenoasociados (AAV). Sin limitarse a teoría alguna, se sabe que los vectores adenovíricos presentan una expresión fuerte in vitro, una concentración excelente y la capacidad de transducir células en división y que no se dividen in vivo (Hitt et al., Adv in Virus Res 55:479-505, 2000). Cuando se usan in vivo, estos vectores dan lugar a una expresión génica fuerte, pero transitoria, debido a las respuestas inmunitarias provocadas en la cadena principal del vector.
Los vectores adenovíricos a menudo se construyen mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica una proteína Brachyury en lugar o en medio de secuencias víricas esenciales, tales como las encontradas en la región E1 del adenovirus (Berkner, BioTechniques, 6:616-629, 1988; Graham et al., Methods in Molecular Biology, 7:109-128, Ed: Murcy, The Human Press Inc., 1991). La inactivación de genes víricos esenciales mediante, por ejemplo, deleción o inserción, inhabilita la capacidad de replicación del adenovirus. Para propagar dichos vectores en cultivo celular, los genes delecionados se deben proporcionar en trans (por ejemplo, las proteínas E1A y E1B en el caso de un vector con E1 delecionada). Estos adenovirus con replicación defectuosa se producen en células de empaquetamiento diseñadas para complementar el virus sin capacidad de replicación mediante la expresión del subconjunto de elementos genéticos eliminados de su genoma vírico. Los posibles sitios para la inserción de un ácido nucleico de interés, tal como un ácido nucleico que codifica una proteína Brachyury, en vectores adenovíricos recombinantes incluyen, sin limitación, la región E1, E2, E3 y E4. En algunos modos de realización, se produce un vector adenovírico recombinante a partir de un adenovirus humano que tiene la región E1 delecionada y remplazada con un ácido nucleico que codifica una proteína Brachyury o un polipéptido de Brachyury. El vector vírico resultante, con uno o más de sus genes esenciales inactivados, tiene replicación defectuosa (Statford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy, 1:241-256, 1990).
Los vectores adenovíricos recombinantes pueden incluir: (1) un sitio de empaquetamiento que posibilita que el vector se incorpore en viriones Ad de replicación defectuosa; y (2) el ácido nucleico que codifica el polipéptido. Otros elementos de utilidad para la incorporación en viriones infecciosos incluyen las iTr 5' y 3' de Ad; los genes E2 y E3 se pueden incluir en el vector. En algunos modos de realización, un ácido nucleico que codifica el polipéptido se inserta en el adenovirus en la región E1A, E1B o E3 delecionada del genoma vírico. En algunos modos de realización, los vectores adenovíricos no expresan uno o más productos génicos adenovíricos naturales, tales como E1a, E1b, E2, E3, E4. En algunos ejemplos no limitantes, los viriones se usan típicamente junto con líneas celulares de empaquetamiento que complementan las funciones de las regiones génicas E1, E2A, E4 y, opcionalmente, E3 (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.872.005, 5.994.106, 6.133.028 y 6.127.175). En un modo de realización, se puede usar la plataforma de administración de genes del vector de adenovirus de serotipo 5 (Ad5) (Ad5 [E1-, E2b-]) descrita en los ejemplos en que regiones de los genes 1 temprano (E1), 2 temprano (E2b) y 3 temprano (E3) se han delecionado. Los vectores adenovíricos se pueden purificar y formular usando técnicas conocidas en la técnica.
En algunos modos de realización, las líneas celulares de empaquetamiento tales como la línea celular de riñón embrionario humano 293 ("HEK-293" o "293") (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977) o la línea celular de retinoblastos embrionarios humanos ("HER-911" o "911") (Fallaux et al., Hum. Gene Ther., 7:215-222, 1996), proporciona en trans la región faltante, tal como la región E1, de modo que el vector adenovírico con deleción o modificado se puede replicar en dichas células. Vectores adenovíricos adecuados se divulgan, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20080193484. Los viriones adenovíricos de replicación defectuosa que encapsulan los vectores adenovíricos recombinantes se pueden preparar mediante técnicas estándar conocidas en la técnica usando células de empaquetamiento y tecnología de empaquetamiento. Se pueden encontrar ejemplos de estos procedimientos, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.872.005.
Vectores adenoasociados (AAV): Los vectores AAV recombinantes se caracterizan por que pueden dirigir la expresión y la producción de los productos transgénicos seleccionados en células diana. Por tanto, los vectores recombinantes comprenden al menos todas las secuencias de AAV esenciales para la encapsidación y las estructuras físicas para la infección de células diana.
Los viriones AAV recombinantes (rAAV) se pueden construir de modo que incluyan, como componentes unidos de forma funcional en la dirección de la transcripción, secuencias de control que incluyen secuencias de inicio y terminación de la transcripción, y el ácido nucleico que codifica el polipéptido. Estos componentes están unidos en el extremo 5' y 3' por secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV funcionales. Por "secuencias de ITR de AAV funcionales"' se entiende que las secuencias ITR funcionan según lo previsto para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión AAV. Por tanto, las ITR de AAV para su uso en los vectores no necesitan tener una secuencia de nucleótidos natural, y se pueden alterar mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos, o las ITR de AAV se pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, siempre que sean funcionales. Un vector AAV es un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, etc. En algunos modos de realización, los vectores AAV tienen los genes REP y CAP naturales delecionados en su totalidad o en parte, pero retienen las secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Todos estos vectores se pueden usar, sin limitación, para la expresión de una proteína Brachyury.
Alfavirus: Se proporcionan alfavirus que codifican el polipéptido y son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento. Los alfavirus son un conjunto de virus transmitidos por artrópodos serológicamente relacionados de la familia Togavirus. Se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos dentro del género alfavirus utilizando el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI). En resumen, la prueba de HI segrega los 26 alfavirus en tres complejos principales: el complejo de encefalitis venezolana (VE), el complejo de bosque Semliki (SF) y el complejo de encefalitis occidental (WE). Además, cuatro virus adicionales, encefalitis oriental (EE), bosque Barmah, Middelburg y Ndumu, reciben una clasificación individual basada en el ensayo serológico de HI. Ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (American Type Culture Collection (ATCC) VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), virus de la encefalomielitis equina oriental (At CC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus del río Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69), virus de la encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, At CC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) e Y-62-33 (ATCC VR-375), véase la patente de EE. UU. n.° 5.843.723.
En algunos modos de realización, un vector alfavírico es un virus Sinbis. En algunos modos de realización, se utilizan construcciones de vectores alfavíricos recombinantes que incluyen una secuencia 5' que puede iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de alfavirus, una región de unión vírica que se ha inactivado de modo que la transcripción vírica del fragmento subgenómico se evite, una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa alfavírica y una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Las construcciones de vectores alfavíricos que tienen regiones de unión vírica inactivadas no transcriben el fragmento subgenómico, lo que las hace adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones.
En algunos modos de realización, se proporcionan construcciones de alfavirus tales como el virus Sinbis, que contienen un promotor 5' que puede iniciar la síntesis de ARN vírico in vitro a partir de ADNc. Los promotores 5' incluyen promotores tanto eucarióticos como procarióticos, tales como, por ejemplo, el promotor de la pgalactosidasa, el promotor de trpE, el promotor de lacZ, el promotor de T7, el promotor de T3, el promotor de SP6, el promotor de SV40, el promotor de CMV y la LTR de VLM-Mo. Ejemplos representativos de dichas secuencias incluyen los nucleótidos 1-60 y, en menor medida, los nucleótidos 150-210, del virus Sindbis natural, los nucleótidos 10-75 para el ARNt de asparagina (Schlesinger et al., patente de EE. UU. n.° 5.091.309), y secuencias 5' de otros Togavirus que inician la transcripción.
Los vectores alfavíricos pueden contener secuencias que codifican proteínas no estructurales (NSP) de alfavirus. Como ejemplo, para el virus Sindbis hay cuatro proteínas no estructurales, NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4, que codifican proteínas que posibilitan que el virus se autorreplique. Las proteínas no estructurales 1 a 3 (NSP1-NSP3) están codificadas por los nucleótidos 60 a 5750 del virus Sindbis natural. Estas proteínas se producen como una poliproteína y luego se escinden en las proteínas no estructurales NSP1, NSP2 y NSP3. NSP4. Las construcciones de vector alfavírico también pueden incluir una región de unión vírica que se ha inactivado, de modo que la transcripción vírica del fragmento subgenómico se evita. En resumen, la región de unión vírica del alfavirus normalmente controla el inicio de la transcripción del ARNm subgenómico. En el caso del virus Sindbis, la región de unión vírica normal típicamente comienza aproximadamente en el número de nucleótido 7579 y continúa hasta al menos el número de nucleótido 7612 (y posiblemente más allá), véase la patente de EE. UU. 5.843.723 para la secuencia completa.
Varios miembros del género alfavirus se pueden usar como vectores de expresión de "'replicón". Los vectores de replicón se pueden utilizar en cualquiera de varios formatos, incluyendo construcciones de vector de ADN, vectores de replicón de ARN y partículas de replicón recombinantes (véase a continuación). Estos incluyen, por ejemplo, SIN (Xiong et al., Science 243:1188-1191, 1989; Dubensky et al., J. Virol. 70:508-519, 1996; Hariharan et al., J.
Virol. 72:950-958, 1998; Polo et al., PNAS 96:4598-4603, 1999), virus del bosque Semliki (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361,1991; Berglund et al., Nat. Biotech. 16:562-565, 1998), Ve E (Pushko et al. Virology 239:389-401, 1997) y quimeras de múltiples alfavirus (patente de EE. UU. n.° 6.376.236; publicación PCT n.° WO2002099035; Perri et al., J. Virol. 77:10394-10403, 2003).
También se divulgan construcciones de vectores alfavíricos en las patentes de EE. UU. n.° 5.789.245; patente de EE. UU. n.° 5.843.723; patente de EE. UU. n.° 5.814.482 y patente de EE. UU. n.° 6.015.694; publicación PCT n.° WO 00/61772; y publicación PCT n.° WO 02/99035. En general, estos vectores incluyen una secuencia 5' que inicia la transcripción del ARN alfavírico, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales alfavíricas, un promotor de la región de unión subgenómica vírica que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga adyacente, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa y un tramo de poliadenilato.
Se puede usar un alfavirus como replicón (una partícula alfavírica recombinante) que es una partícula similiví rica que contiene un vector alfavírico autorreplicante o ácido nucleico "replicón". La propia partícula de replicón en general se considera incapaz o "defectuosa" para la replicación, es decir, no se producirán partículas de replicón descendientes cuando una célula huésped se infecte con una partícula de replicón, porque se delecionan los genes que codifican una o más proteínas estructurales necesarias para el empaquetamiento.
Aunque los vectores alfavíricos se pueden usar directamente para la administración in vivo como ARN, o se pueden administrar como un ADNc basado en plásmido (por ejemplo, sistema de inicio de vectores estratificados eucarióticos), a menudo, para vacunas in vivo y aplicaciones terapéuticas, el vector de replicón de ARN alfavírico o el ARN de replicón en primer lugar se empaqueta en una partícula similivírica, que comprende proteínas estructurales alfavíricas (por ejemplo, proteína de la cápside y glucoproteínas de la envoltura). Se divulgan alfavirus y replicones de utilidad, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.° 20110002958. Debido a su configuración, los replicones de vector no expresan estas proteínas estructurales alfavíricas necesarias para el empaquetamiento en partículas de replicón alfavíricas recombinantes. Por tanto, para generar partículas de replicón, las proteínas estructurales se deben proporcionar en trans.
El empaquetamiento se puede conseguir mediante una variedad de procedimientos, que incluyen estrategias transitorias tales como cotransfección de replicón transcrito in vitro y uno o más ARN auxiliares defectuosos (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361, 1991; Bredenbeek et al., I Virol. 67:6439-6446, 1993; Frolov et al., J. Virol. 71:2819-2829, 1997; Pushko et al., Virology 239:389-401, 1997; patente de EE. UU. n.° 5.789.245 y patente de EE. UU. n.° 5.842.723) o replicón basado en ADN plasmídico y construcciones auxiliares defectuosas (Dubensky et al., J. Virol. 70:508-519, 1996), así como la introducción de replicones alfavíricos en líneas celulares de empaquetamiento estables (PCL) (Polo et al., PNAS 96:4598-4603, 1999; patente de EE. UU. n.° 5.789.245; patente de EE. UU. n.° 5.842.723; patente de EE. UU. n.° 6.015.694).
Las metodologías de empaquetamiento en trans permiten la modificación de uno o más genes de proteínas estructurales (por ejemplo, para incorporar secuencias de variantes de alfavirus tales como los mutantes atenuados, véase la patente de EE. UU. n.° 5.789.245; la patente de EE. UU. n.° 5.842.723; la patente de EE. UU. n.° 6.015.694), seguido de la posterior incorporación de la proteína estructural modificada en las partículas de replicón finales. Además, dicho empaquetamiento permite la modificación global de partículas de replicón alfavíricas mediante el empaquetamiento de una construcción de vector o replicón de ARN derivado de un primer alfavirus usando proteínas estructurales derivadas de un segundo alfavirus diferente al de la construcción de vector.
Virus del sarampión: Se proporcionan virus del sarampión que codifican el polipéptido y son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento. Se divulgan las secuencias de ácido nucleico de los virus del sarampión en la publicación PCT n.° WO 98/13501, que proporciona la secuencia de una copia de ADN del ARN con sentido mensajero de hebra positiva (antigenómica) de diversas cepas vacunales del sarampión naturales, incluyendo la cepa natural Edmonston, la cepa Moraten y la cepa Schwarz. La publicación PCT n.° WO 97/06270 divulga la producción de vectores del sarampión recombinantes.
También se puede usar una cepa atenuada del virus del sarampión para administrar el polipéptido. La forma atenuada Moraten del virus se ha usado en todo el mundo como vacuna y tiene un excelente historial de seguridad (Hilleman, et al., J. Am. Med. Assoc. 206: 587-590, 1968). En consecuencia, en un modo de realización, se usa la cepa Moraten. La vacuna Moraten está disponible comercialmente en MERCK® y se proporciona liofilizada en un vial que, cuando se reconstituye a 0,5 ml, comprende 103 ufp/ml.
En otro modo de realización, se usa la cepa vacunal Edmonston-B del virus del sarampión (MV-Edm) (Enders y Peebles, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286, 1954). MV-Edm crece eficazmente en células tumorales, pero su crecimiento está muy restringido en cultivos primarios de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica humanos, fibroblastos dérmicos normales y células de músculo liso vascular. Una forma de la cepa Edmonston atenuada de Enders está disponible comercialmente de Merck (ATTENUVAX®). También se pueden utilizar otras cepas atenuadas del virus del sarampión, tales como las cepas Leningrad-16 y Moscow-5 (Sinitsyna, et al., Res.
Virol. 141(5): 517-31, 1990), la cepa Schwarz (Fourrier, et al., Pediatrie 24(1): 97-8, 1969), cepa 9301B (Takeda, et al. J. VIROL. 72/11:8690-8696), la cepa AIK-C (Takehara, et al., Virus Res 26 (2): 167-75, 1992), y las descritas en Schneider-Shaulies, et al., PNAS 92(2): 3943-7, 1995).
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos del virus del sarampión recombinante comprende un replicón que tiene un número total de nucleótidos que es un múltiplo de seis. La "regla de los seis" se expresa en el hecho de que el número total de nucleótidos presentes en el ADNc recombinante asciende finalmente a un número total de nucleótidos que es múltiplo de seis, una regla que permite una replicación eficaz del ARN genómico del virus del sarampión.
En modos de realización adicionales, se clona ADN heterólogo, tal como un ácido nucleico que codifica la proteína Brachyury, en el virus del sarampión dentro de una unidad de transcripción adicional (ATU) insertada en el ADNc correspondiente al ARN antigenómico del virus del sarampión. La ubicación de la ATU puede variar a lo largo del ADNc: sin embargo, está ubicada en un sitio tal que se beneficiará del gradiente de expresión del virus del sarampión. Por lo tanto, la ATU se puede propagar a lo largo del ADNc. En un modo de realización, la ATU se inserta en la parte N terminal de la secuencia y especialmente dentro de la región en dirección 5' del gen L del virus del sarampión y en dirección 5' del gen M del virus. En otros modos de realización, la ATU se inserta en dirección 5' del gen N del virus, véase la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 2011/0129493. Cistrones particulares en el genoma del virus del sarampión pueden ser dianas para modificar genes cuya expresión está asociada con la atenuación (Schneider-Shaulies et al. PNAS 92(2): 3943-7, 1995; Takeda, et al. J. Virol. 72/11: 8690-8696, 1998). Por tanto, en un modo de realización, se genera una cepa de virus del sarampión recombinante que codifica el polipéptido en cualquiera de una proteína H, una proteína V, una proteína C y combinaciones de las mismas.
Los vectores de virus del sarampión recombinantes incluyen el plásmido pTM-MVSchw que contiene el ADNc resultante de la retrotranscripción del ARN antigenómico del virus del sarampión y una secuencia de control de la expresión adaptada que incluye un promotor y un terminador para la polimerasa t 7. También se divulgan vectores, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 2006/0013826. Estos vectores son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento.
Se pueden producir cepas atenuadas adicionales del virus del sarampión que expresan el polipéptido. Las cepas atenuadas de virus se obtienen mediante pases en serie del virus en cultivo celular (por ejemplo, en células no humanas), hasta que se identifica un virus que es inmunógeno, pero no patógeno. Mientras que el virus natural provocará una infección mortal en los titíes, las cepas vacunales no. Las personas que reciben una vacuna de virus del sarampión atenuado no muestran los síntomas clásicos del sarampión. La atenuación se asocia con una replicación vírica disminuida (medida in vivo por la incapacidad de provocar sarampión en monos), viremia disminuida y fracaso en inducir efectos citopatológicos en los tejidos (por ejemplo, fusión de célula-célula, células multinucleadas). Véase la patente de EE. UU. n.° 7.393.527.
En un modo de realización, se produce una dosis eficaz de un virus del sarampión atenuado que codifica el polipéptido infectando una célula primaria o una línea celular continua con un inóculo inicial de una reserva que comprende una cepa Moraten atenuada del virus del sarampión (o un inóculo de una reserva MMR) o la cepa MV-Edm o cualquiera de las otras cepas descritas anteriormente y expandiendo el virus después del pase en serie. Las células o líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, células de riñón o testículo de mono o líneas celulares de mono (por ejemplo, Vero, KB, CV-1, BSC-1 y similares). La replicación vírica en las células se observa como una fusión de célula-célula y formación de sincitios.
El virus del sarampión atenuado se expande hasta obtener la concentración de dosis deseada en medios de cultivo celular estándar. En un modo de realización, la concentración de dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 103 a 1012 ufp. En otro modo de realización de la invención, la concentración es de aproximadamente 105 a 108 ufp. La concentración vírica se puede ensayar inoculando de células (por ejemplo, células Vero) en placas de cultivo (por ejemplo, tales como placas de 35 mm). Después de 2-3 horas de adsorción vírica, se retira el inóculo y se cubren las células con una mezcla de medio de cultivo celular y agarosa o metilcelulosa (por ejemplo, 2 ml de DMEM que contiene un 5 % de FCS y un 1 % de agarosa SeaPlaque). Después de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 días, los cultivos se fijan con 1 ml de ácido trifluoroacético al 10 % durante aproximadamente 1 hora, luego se reticulan con UV durante 30 minutos. Después de retirar la cubierta de agarosa, las monocapas celulares se tiñen con violeta de genciana y las placas se cuentan para determinar la concentración vírica. El virus se recoge de los sincitios celulares raspando las células de las placas, sometiéndolas a congelación/descongelación (por ejemplo, aproximadamente dos rondas) y centrifugación. Los sobrenadantes aclarados representan virus "purificados en placa".
Las reservas víricas se producen mediante la infección de monocapas celulares (por ejemplo, adsorción durante aproximadamente 1,5 horas a 37 °C), seguido del raspado de las células infectadas en un medio adecuado (por ejemplo, Opti-MEM, Gibco-BRL) y lisis por congelación/descongelación (por ejemplo, 2 rondas). Las reservas víricas se dividen en alícuotas, se congelan y se almacenan a 70 °C-80 °C y se pueden almacenar a concentraciones mayores que la dosis terapéuticamente eficaz. En un modo de realización, la reserva vírica se almacena en una solución estabilizadora. Las soluciones estabilizadoras son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.985.244 y la patente de EE. UU. n.° 4.500.512.
Poliovirus: Se proporcionan poliovirus que codifican el polipéptido y son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento. Se ha clonado y secuenciado todo el genoma del poliovirus y se han identificado las proteínas víricas. También está disponible un ADNc poliovírico infeccioso que ha permitido una mayor manipulación genética del virus (Racaniello V R et al., Science 214(4542) 916-919, 1981). La molécula de ARN genómico natural tiene una longitud de 7433 nucleótidos, está poliadenilada en el extremo 3' y tiene una pequeña proteína vírica unida covalentemente (VPg) en el extremo 5' (Kitamura N et al., Nature 291:547-553; 1981; Racaniello V R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4887-4891, 1981). La expresión del genoma poliovírico se produce mediante traducción de una sola proteína (poliproteína) que posteriormente se procesa por proteasas codificadas por el virus (2A y 3C) para dar las proteínas estructurales maduras (cápside) y no estructurales (Kitamura N et al., Nature 291:547-553, 1981; Koch F et al., The Molecular Biology of Poliovirus, Springer-Verlag, Viena, 1985). La replicación del poliovirus está catalizada por la ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el virus, que copia el ARN genómico para dar una molécula de ARN complementaria, que a continuación sirve como molde para la producción de ARN adicional (Koch F et al., supra; Kuhn R J et al., en D J Rowlands et al. (ed.) Molecular Biology of Positive Strand RNA viruses, Academic Press Ltd., Londres, 1987). La traducción y procesamiento proteolítico de la poliproteína poliovírica se describen en Nicklin M J H et al., Bio/Technology 4:33-42, 1986.
El genoma de ARN vírico codifica las proteínas necesarias requeridas para la generación del nuevo ARN de la descendencia, así como para la encapsidación de los nuevos genomas de ARN. In vitro, el poliovirus es lítico, lo que da como resultado la destrucción completa de las células permisivas. Como el ciclo de replicación vírico no incluye ningún intermedio de ADN, no hay posibilidad de integración del ADN vírico en el ADN cromosómico del huésped.
Los primeros estudios identificaron tres tipos de poliovirus basados en la reactividad a los anticuerpos (Koch F et al., supra, 1985). Estos tres tipos serológicos, denominados tipo I, tipo II y tipo III, se han distinguido además por tener numerosas diferencias nucleotídicas tanto en las regiones no codificantes como en las regiones codificantes de proteínas. Las tres cepas son adecuadas para su uso en la administración de proteínas heterólogas. Además, también hay disponibles versiones atenuadas de las tres cepas de poliovirus.
Los replicones pueden comprender ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Los replicones son polinucleótidos basados en poliovirus que carecen de un ácido nucleico poliovírico natural necesario para la encapsidación del virus. En consecuencia, no se pueden producir replicones recién encapsidados después de la entrada inicial en la célula en ausencia del ácido nucleico faltante. Los replicones pueden carecer de este ácido nucleico como resultado de cualquier modificación del ácido nucleico poliovírico natural incluyendo, pero sin limitarse a, deleciones, inserciones y sustituciones, incluyendo una inserción de un ácido nucleico que codifica el polipéptido. En algunos modos de realización, los replicones poliovíricos carecen de un ácido nucleico poliovírico natural que codifica al menos una parte de una proteína que se requiere para la encapsidación. Las proteínas necesarias para la encapsidación del replicón incluyen proteínas que forman parte de la estructura de la cápside. Ejemplos de dichas proteínas son las codificadas por los genes v P1, VP2, VP3 y VP4 de la región precursora de la cápside P1 del poliovirus, la proteína Vpg y aquellas proteínas que son necesarias para el procesamiento apropiado de las proteínas estructurales de la estructura de la cápside, tales como la proteasas responsables de escindir la poliproteína vírica. Por tanto, en algunos modos de realización, el vector poliovírico carece de secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de VP1, VP2, VP3 y VP4, genes de la región precursora de la cápside P1 del poliovirus, la proteína Vpg y codifica una proteína Brachyury o un polipéptido de Brachyury.
Los replicones típicamente se introducen en una célula en forma de ARN. Los replicones encapsidados pueden entrar en las células mediante interacción de las proteínas de la cápside con el receptor del poliovirus. Los replicones tienen total capacidad de replicación (amplificación) del ARN tras la introducción en las células y la traducción, en el marco de lectura correcto, de la poliproteína única a través de la que se produce la expresión del genoma completo del replicón. La traducción de secuencias de replicón puede ser transitoria, que dura habitualmente solo aproximadamente 24-48 horas. Se pueden acumular altos niveles de proteínas codificadas por el replicón durante el período de traducción. Los replicones encapsidados pueden entrar en las células mediante interacción de las proteínas de la cápside con la proteína hPVR.
En algunos modos de realización, los replicones comprenden ARN, incluyendo secuencias que codifican la proteína Brachyury, y se encapsidan. En algunos ejemplos, los replicones tienen una deleción del gen de la cápside (PI) y derivan del genoma de ARN del poliovirus de tipo 1, tipo 2, tipo 3 o combinaciones de los mismos. Además, un ácido nucleico que codifica una proteína Brachyury o un polipéptido de Brachyury se puede sustituir en el lugar de parte o la totalidad del gen de la cápside (P1) de modo que la parte del gen de la cápside (P1) que queda, si la hay, es insuficiente para sustentar la encapsidación in vivo. En general, la expresión "replicones P1" se refiere a replicones en los que todo el ácido nucleico que codifica la proteína precursora de la cápside P1 se ha delecionado o alterado de modo que las proteínas normalmente codificadas por este ácido nucleico no se expresan o se expresan de forma no funcional. Las proteínas normalmente codificadas por la región precursora de la cápside P1 del genoma poliovírico incluyen las proteínas codificadas por los genes VP1, VP2, VP3 y VP4. Los replicones P1, por lo tanto, carecen de los genes VP1, VP2, VP3 y VP4 o comprenden formas inexpresables o no funcionales de los genes VP1, VP2, VP3 y VP4. Los replicones P1 pueden incluir un ácido nucleico que codifica una proteína Brachyury o un polipéptido de Brachyury sustituido en el lugar de los genes VP1, VP2, VP3 y VP4.
En algunos modos de realización, se pueden producir replicones encapsidados introduciendo tanto un replicón como un vector de expresión complementario que proporciona el ácido nucleico faltante necesario para la encapsidación en trans a una célula huésped. Un "vector de encapsidación de replicón" se refiere a un vector no basado en poliovirus que comprende un ácido nucleico requerido para la encapsidación del replicón y proporciona el ácido nucleico requerido (o proteína codificada) en trans. Los vectores de encapsidación del replicón se pueden introducir en una célula huésped antes, simultáneamente o después de la introducción de replicón. Se divulgan procedimientos adecuados para la encapsidación en la patente de EE. UU. n.° 6.680.169. Se han descrito procedimientos que se pueden usar para preparar replicones encapsidados en Porter DC et al., J. Virol. 67:3712-3719, 1993; Porter DC et al., 1995, J. Virol. 69:1548-1555, 1995; publicación PCT n.° WO 96/25173; patente de EE. UU. n.° 5.614.413, patente de EE. UU. n.° 5.817.512; patente de EE. UU. n.° 6.063.384; y patente de EE. UU. n.° 6.680.169.
Los replicones no encapsidados se pueden administrar directamente a las células diana, por ejemplo, mediante inyección directa en, por ejemplo, células musculares (véase, por ejemplo, Acsadi G et al., Nature 352(6338): 815­ 818, 1991; Wolff J A et al., Science 247:1465-1468, 1990) o mediante electroporación, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas o captación de ácido nucleico mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu G et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988, Wilson J M et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; y patente de EE. UU. n.° 5.166.320), u otros procedimientos de administración de ácidos nucleicos desnudos a las células diana.
Vectores retrovíricos: Se proporcionan vectores retrovíricos, incluyendo vectores lentivíricos que codifican el polipéptido y son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento. Los vectores retrovíricos se han sometido a prueba y se ha descubierto que son vehículos de administración adecuados para la introducción estable de una variedad de genes de interés en el ADN genómico de una amplia gama de células diana. Sin limitarse a teoría alguna, la capacidad de los vectores retrovíricos de administrar transgenes de una sola copia sin reordenar a las células hace que los vectores retrovíricos sean muy adecuados para transferir genes a las células. Además, los retrovirus entran en las células huésped mediante la unión de glucoproteínas de la envoltura retrovírica a receptores de superficie celular específicos en las células huésped. En consecuencia, también se pueden usar vectores retrovíricos seudotipados en los que la proteína de la envoltura natural codificada se remplaza por una proteína de la envoltura heteróloga que tiene una especificidad celular diferente a la de la proteína de la envoltura natural (por ejemplo, se une a un receptor de superficie celular diferente en comparación con la proteína de la envoltura natural).
En general, los retrovirus contienen tres dominios codificantes principales, gag, pol, env, que codifican proteínas del virión esenciales. Los vectores retrovíricos son de utilidad cuando gag, pol y/o env están ausentes o no son funcionales. Se divulgan vectores retrovíricos, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 20060286634.
Por tanto, se proporcionan vectores retrovíricos que incluyen, por ejemplo, vectores de transferencia retrovíricos que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido y vectores de empaquetamiento retrovíricos que comprenden uno o más elementos de empaquetamiento. En algunos modos de realización, se proporcionan vectores retrovíricos seudotipados que codifican una proteína de envoltura heteróloga o funcionalmente modificada para producir retrovirus seudotipados.
Hay muchos retrovirus y ejemplos incluyen: virus de la leucemia murina (VLM), lentivirus tal como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), virus del tumor mamario del ratón (VTMR), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus del sarcoma de Fujinami (VSFu), virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-Mo), virus del osteosarcoma murino FBR (VSM FBR), virus del sarcoma murino de Moloney (VSM-Mo), virus de la leucemia murina de Abelson (VLM-A), virus de la mielocitomatosis aviar-29 (MC29) y el virus de la eritroblastosis aviar (VEA). Otros retrovirus adecuados para uso incluyen, pero no se limitan a, virus de la leucosis aviar, virus de leucemia bovina, virus inductor de focos en células de visón. La secuencia central de los vectores retrovíricos se puede derivar de una amplia variedad de retrovirus, incluyendo, por ejemplo, retrovirus de tipo B, C y D, así como spumavirus y lentivirus (véase RNA Tumor Viruses, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Un ejemplo de un retrovirus adecuado para su uso en las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento incluye, pero no se limita a, lentivirus.
Un lentivirus es un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), por ejemplo, de tipo 1 o 2 (es decir, VIH-1 o VIH-2). Otros vectores lentivíricos incluyen el virus Visna/maedi de las ovejas, el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el lentivirus bovino, el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), un virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y un virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC).
Los lentivirus comparten varias proteínas estructurales del virión, incluyendo las glucoproteínas de la envoltura SU (gp120) y TM (gp41), que están codificadas por el gen env; CA (p24), MA (p117) y NC (p7-11), que están codificadas por el gen gag; y RT, PR e IN codificadas por el gen pol. El VIH-1 y el VIH-2 contienen proteínas accesorias y otras implicadas en la regulación de la síntesis y el procesamiento del ARN vírico y otras funciones de replicación. Las proteínas accesorias, codificadas por los genes vif, vpr, vpu/vpx y nef, se pueden omitir (o inactivar) del sistema recombinante. Además, tat y rev se pueden omitir o desactivar, por ejemplo, mediante mutación o deleción.
Sin limitarse a teoría alguna, el uso de técnicas de transferencia génica basadas en lentivirus en general se basa en la producción in vitro de partículas lentivíricas recombinantes que portan un genoma vírico altamente delecionado en el que se acomoda un gen de interés, tal como un ácido nucleico que codifica el polipéptido. En particular, los lentivirus recombinantes se recuperan a través de la coexpresión en trans en una línea celular permisiva de (1) las construcciones de empaquetamiento, es decir, un vector que expresa los precursores de Gag-Pol junto con Rev (expresados de forma alternativa en trans); (2) un vector que expresa un receptor de la envoltura, en general de naturaleza heteróloga; y (3) el vector de transferencia, que consiste en el ADNc vírico privado de todos los marcos abiertos de lectura, pero manteniendo las secuencias necesarias para la replicación, encapsidación y expresión, en el que se insertan las secuencias a expresar. En un modo de realización, se usa el vector lentivírico Lentigen descrito en Lu, X. et al. Journal of gene medicine 6:963-973, 2004 para expresar el polipéptido. También se divulgan vectores lentivíricos adecuados, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 20100062524.
Los sistemas de empaquetamiento retrovíricos para generar células productoras y líneas de células productoras que producen retrovirus, y los procedimientos de preparación de dichos sistemas de empaquetamiento son conocidos en la técnica. En general, los sistemas de empaquetamiento retrovíricos incluyen al menos dos vectores de empaquetamiento: un primer vector de empaquetamiento que incluye una primera secuencia de nucleótidos que comprende los genes gag, pol o gag y pol; y un segundo vector de empaquetamiento que incluye una segunda secuencia de nucleótidos que comprende un gen de la envoltura heterólogo o funcionalmente modificado. En algunos modos de realización, los elementos retrovíricos derivan de un lentivirus, tal como VIH. Estos vectores pueden carecer de un gen tat funcional y/o genes accesorios funcionales (vif, vpr, vpu, vpx, nef). En otros modos de realización, el sistema comprende además un tercer vector de empaquetamiento que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un gen rev. El sistema de empaquetamiento se puede proporcionar en forma de una célula de empaquetamiento que contiene la primera, la segunda y, opcionalmente, la tercera secuencia de nucleótidos.
Los sistemas de empaquetamiento de vectores lentivíricos de primera generación proporcionan construcciones de empaquetamiento separadas para gag/pol y env, y típicamente emplean una proteína de la envoltura heteróloga o funcionalmente modificada por razones de seguridad. En los sistemas de vectores lentivíricos de segunda generación, los genes accesorios, vif, vpr, vpu y nef, se delecionan o inactivan. Los sistemas de vectores lentivíricos de tercera generación son aquellos de los que el gen tat se ha delecionado o inactivado de otro modo (por ejemplo, mediante mutación). La compensación para la regulación de la transcripción proporcionada normalmente por tat se puede proporcionar mediante el uso de un promotor constitutivo fuerte, tal como el potenciador/promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (HCMV-IE). Se pueden seleccionar otros promotores/potenciadores basados en la fuerza de la actividad promotora constitutiva, la especificidad por el tejido diana (por ejemplo, promotor específico del hígado) u otros factores relacionados con el control deseado sobre la expresión, como se entiende en la técnica. Por ejemplo, en algunos modos de realización, se puede usar un promotor inducible tal como tet para conseguir una expresión controlada. El gen que codifica rev se puede proporcionar en una construcción de expresión separada, de modo que un sistema de vector lentivírico típico de tercera generación implicará cuatro plásmidos: uno para cada uno de gagpol, rev, envoltura y el vector de transferencia. Independientemente de la generación del sistema de empaquetamiento empleado, gag y pol se pueden proporcionar en una sola construcción o en construcciones separadas.
Típicamente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento y se introducen en la célula mediante transfección, transducción o infección. Los procedimientos para la transfección, transducción o infección son bien conocidos por los expertos en la técnica. Un vector retrovírico de la presente invención se puede introducir en una línea celular de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula o una línea celular productora. Los vectores de empaquetamiento se pueden introducir en células o líneas celulares humanas mediante procedimientos estándar que incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. En algunos modos de realización, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador de selección dominante, tal como neo, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de clones. Un gen marcador de selección puede unirse físicamente a los genes que codifican el vector de empaquetamiento.
Son conocidas líneas celulares estables, en las que las funciones de empaquetamiento están configuradas para expresarse por una célula de empaquetamiento adecuada. Por ejemplo, véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.686.279; y Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11400-11406, 1996, que describen células de empaquetamiento. Zufferey et al., Nature Biotechnology 15:871-875, 1997 divulgan un plásmido de empaquetamiento lentivírico en el que se delecionan las secuencias 3' de pol, incluyendo el gen de la envoltura del VIH-1. La construcción contiene secuencias de tat y rev y la LTR 3' se remplaza con secuencias de poliA. Las secuencias de LTR 5' y psi se remplazan por otro promotor, tal como uno que sea inducible. Por ejemplo, se puede usar un promotor de CMV.
Los vectores de empaquetamiento pueden incluir cambios adicionales en las funciones de empaquetamiento para potenciar la expresión de la proteína lentivírica y potenciar la seguridad. Por ejemplo, se pueden eliminar todas las secuencias de VIH en dirección 5' de gag. Además, se pueden eliminar las secuencias en dirección 3' de la envoltura. Además, se pueden tomar medidas para modificar el vector para potenciar el empalme y la traducción del ARN.
Se puede usar un vector de autoinactivación (SIN), que mejora la bioseguridad del vector mediante la deleción de la repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, como se describe, por ejemplo, por Zufferey et al., J. Virology 72(12):9873-9880, 1998. También se pueden usar vectores inducibles, tal como a través de una LTR inducible por tet.
Cuando el vector que no es de levadura es para la administración a un huésped (por ejemplo, un ser humano), el vector que no es de levadura (por ejemplo, poxvirus) tiene preferentemente una eficacia de replicación baja en una célula diana (por ejemplo, no más de aproximadamente 1 descendiente por célula o, más preferentemente, no se produce más de 0,1 descendiente por célula). La eficacia de replicación se puede determinar fácilmente de forma empírica determinando la concentración del virus después de la infección de la célula diana.
Además del ácido nucleico que codifica el polipéptido, el vector que no es de levadura también puede comprender uno o más polinucleótidos/genes que codifican una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), citocinas u otras moléculas que pueden potenciar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, antígenos asociados a tumor adicionales, tal como el antígeno prostático específico (PSA), el antígeno carcinoembrionario (CEA) o versiones modificadas de los mismos, tales como CEA-6D, y mucina (MUC) y versiones modificadas de los mismos). El ácido nucleico que codifica el polipéptido, así como cualquier otro u otros genes exógenos, preferentemente se insertan en un sitio o región (región de inserción) en el vector (por ejemplo, poxvirus) que no afecta la viabilidad del virus recombinante resultante. Dichas regiones se pueden identificar fácilmente sometiendo a prueba segmentos de ADN vírico en busca de regiones que permitan la formación recombinante sin afectar de forma importante a la viabilidad del virus recombinante.
El gen de la timidina cinasa (TK) es una región de inserción que se puede usar fácilmente y está presente en muchos virus. En particular, el gen TK se ha encontrado en todos los genomas poxvíricos examinados. Se describen sitios de inserción adecuados adicionales en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2005/048957. Por ejemplo, en la viruela aviar, las regiones de inserción incluyen, pero no se limitan a, el fragmento BamHI J, el fragmento EcoRI-HindIII, el fragmento BamHI, el fragmento EcoRV-HindIII, los sitios de inserción de secuencia única larga (LUS) (por ejemplo, FPV006/FPV007 y FPV254/FPV255), el sitio de inserción FP14 (FPV060/FPV061) y el sitio de inserción 43K (FPV107/FPV108). En el virus variolovacunal, los sitios de inserción incluyen, pero no se limitan a, 44/45, 49/50 y 124/125.
Cuando el vector que no es de levadura es un virus de la viruela aviar recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido y/u otro u otros genes exógenos (por ejemplo, que codifican una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras), el ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede insertar en una región (por ejemplo, la región FP14), y el o los genes exógenos se pueden insertar en otra región (por ejemplo, la región BamHI J).
El vector que no es de levadura puede incluir promotores y elementos reguladores adecuados, tal como un elemento regulador de la transcripción o un potenciador. Cuando el vector es un vector poxvírico, se pueden usar promotores poxvíricos, incluyendo, pero sin limitarse a, el promotor 7.5K variolovacunal, el promotor 30K variolovacunal, el promotor 40K variolovacunal, el promotor 13 variolovacunal, el promotor temprano/tardío sintético (sE/L), el promotor 7.5, el promotor HH, el promotor 11K y el promotor Pi. Aunque los promotores típicamente serán promotores constitutivos, también se pueden usar promotores inducibles en los vectores según la invención. Dichos sistemas inducibles permiten la regulación de la expresión génica.
También se proporciona en el presente documento una célula que no es de levadura que comprende el polipéptido, el ácido nucleico que codifica el polipéptido o un vector que no es de levadura. Células adecuadas incluyen células procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, células de mamífero, hongos que no son levaduras y bacterias (tales como E. coli, Salmonella (por ejemplo, S. typhimurium) o Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes). La célula que no es de levadura puede estar in vitro, ya que es útil para la investigación o para la producción del polipéptido, o la célula que no es de levadura puede estar in vivo. La célula que no es de levadura puede ser una célula presentadora de antígeno estimulada brevemente con polipéptido. Las células presentadoras de antígeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células dendríticas, linfocitos B, monocitos, macrófagos y similares.
En un modo de realización, la célula que no es de levadura es una célula dendrítica. Se pueden aislar células dendríticas de diferentes etapas de maduración basadas en los marcadores de expresión de superficie celular. Por ejemplo, las células dendríticas maduras tienen menos capacidad de capturar nuevas proteínas para su presentación, pero son mucho mejores en estimular el crecimiento y la diferenciación de los linfocitos T en reposo. Por tanto, las células dendríticas maduras pueden ser importantes. Las células dendríticas maduras se pueden identificar por su cambio de morfología y por la presencia de diversos marcadores. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores de superficie celular tales como B7.2, CD40, CD11 y MHC de clase II. De forma alternativa, la maduración se puede identificar observando o midiendo la producción de citocinas proinflamatorias.
Las células dendríticas se pueden recolectar y analizar usando técnicas y dispositivos típicos de citofluorografía y clasificación de células, tal como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos específicos para antígenos de superficie celular de diferentes etapas de maduración de células dendríticas están disponibles comercialmente.
Las técnicas para la propagación de células de mamífero en cultivo son bien conocidas (véase, Jakoby y Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volumen 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, NY). Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero normalmente usadas son células VERO y HeLa, células CHO y líneas celulares WI38, BHK y COS, aunque se pueden usar líneas celulares, tales como células diseñadas para proporcionar patrones de glucosilación deseables de mayor expresión u otros rasgos característicos.
La transformación de una célula huésped con ADN recombinante se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales, que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando el huésped es procariótico, tal como, pero sin limitarse a, E. coli, se pueden preparar células competentes que pueden captar el ADN a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y posteriormente se pueden tratar mediante el procedimiento de CaCh usando procedimientos bien conocidos en la técnica. De forma alternativa, se puede usar MgCl2 o RbCl. La transformación también se puede realizar después de formar un protoplasto de la célula huésped que no es de levadura, si se desea, o mediante electroporación.
Cuando la célula es un eucariota, se pueden usar procedimientos de transfección de ADN tales como coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas o infección con vectores víricos. Las células eucarióticas también se pueden cotransformar con secuencias polinucleotídicas que codifican el polipéptido y una segunda molécula de a Dn exógeno que codifica un fenotipo de selección, tal como el gen de la timidina cinasa del herpes simple. Los procedimientos para usar vectores víricos para transformar células eucarióticas que no son de levadura son conocidos (véase, por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).
El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula que no es de levadura se puede aislar. El término "aislado", como se usa en el presente documento, abarca compuestos o composiciones que se han extraído de un entorno biológico (por ejemplo, una célula, tejido, medio de cultivo, líquido corporal, etc.) o que han incrementado su pureza en cualquier grado (por ejemplo, aislados de un medio de síntesis). Los compuestos y composiciones aislados, por tanto, pueden ser sintéticos o producidos de forma natural.
El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula que no es de levadura se puede formular como una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula que no es de levadura y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de la invención se puede usar en los procedimientos descritos en el presente documento solos o como parte de una formulación farmacéutica.
La composición (por ejemplo, composición farmacéutica) puede comprender más de un polipéptido, ácido nucleico, vector que no es de levadura o célula que no es de levadura o composición de la invención. De forma alternativa, o además, la composición puede comprender uno o más agentes o fármacos farmacéuticamente activos distintos. Ejemplos de dichos agentes o fármacos farmacéuticamente activos distintos que pueden ser adecuados para su uso en la composición farmacéutica incluyen agentes antineoplásicos (por ejemplo, fármacos quimioterápicos), antibióticos, fármacos antivíricos, fármacos antifúngicos, ciclofosfamida y combinaciones de los mismos. Agentes antineoplásicos adecuados incluyen, sin limitación, agentes alquilantes, mostazas nitrogenadas, antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, venenos para el huso, inhibidores de la topoisomerasa, agentes inductores de la apoptosis, inhibidores de la angiogénesis, podofilotoxinas, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, interferón, asparginasa, tamoxifeno, leuprolida, flutamida, megestrol, mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, irinotecán, taxol, geldanamicina (por ejemplo, 17-AAG) y diversos polipéptidos y anticuerpos antineoplásicos conocidos en la técnica.
El vehículo puede ser cualquiera de los usados convencionalmente y está limitado solo por consideraciones fisicoquímicas, tal como la solubilidad y la falta de reactividad con el o los compuestos activos y por la vía de administración. Los vehículos farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Es preferente que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte para el o los agentes activos y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del vehículo estará determinada en parte por el polipéptido, ácido nucleico, vector que no es de levadura, célula que no es de levadura o composición de los mismos particular de la invención y otros agentes activos o fármacos usados, así como por el procedimiento particular usado para administrar el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos.
La composición adicionalmente o de forma alternativa puede comprender una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras. Se puede usar cualquier molécula inmunoestimuladora/reguladora adecuada, tal como interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, interferón (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, anti-CTLA-4 y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la composición comprende una combinación de B7.1, ICAM-1 y LFA-3 (también denominada TRICOM). La una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras se pueden administrar en forma de vector (por ejemplo, un vector vírico recombinante, tal como un vector poxvírico) que comprende un ácido nucleico que codifica una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras. Por ejemplo, la una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras (por ejemplo, IL-12) se pueden administrar en forma de un plásmido de ADN con o sin quitosano. De forma alternativa, la una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras se pueden administrar como una proteína (por ejemplo, proteína recombinante), tal como una proteína (por ejemplo, IL-12 recombinante) mezclada con quitosano.
La proteína Brachyury se expresa en numerosos cánceres humanos, tal como cáncer de intestino delgado, estómago, vejiga, útero, ovario, testículos, pulmón, colon, próstata, bronquios, leucemia linfocítica crónica (LLC), otras neoplasias malignas basadas en linfocitos B y cáncer de mama, tal como carcinomas ductales infiltrantes de mama. La administración del polipéptido se puede usar para tratar o prevenir estos cánceres. En ejemplos específicos no limitantes, el cáncer de mama es un cáncer de mama negativo para el receptor de estrógenos y negativo para el receptor de progesterona. En ejemplos no limitantes adicionales, el cáncer es cualquier cáncer que sea resistente a la radiación y/o resistente a la quimioterapia. El cáncer puede expresar Brachyury o tener el potencial de expresar Brachyury.
La administración del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula que no es de levadura se puede usar para inducir linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ específicos de Brachyury. Por tanto, se divulgan procedimientos para inducir linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ específicos de Brachyury, que incluyen el uso del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula que no es de levadura (por ejemplo, célula dendrítica) para inducir la producción de linfocitos T CD4+ específicos de Brachyury.
La divulgación también proporciona procedimientos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, tal como, pero sin limitarse a, cáncer de intestino delgado, estómago, riñón, vejiga, útero, ovario, testículos, pulmón, colon, próstata, bronquios, leucemia linfocítica crónica (LLC), otras neoplasias malignas basadas en linfocitos B o cáncer de mama, tal como un carcinoma ductal infiltrante o cánceres de mama negativos para el receptor de estrógenos y negativos para el receptor de progesterona. Cualquiera de estos cánceres puede ser resistente a la quimioterapia y/o a la radiación. El cáncer puede expresar Brachyury o tener el potencial de expresar Brachyury. En ejemplos no limitantes específicos, el cáncer es neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, poliposis adenomatosa familiar o atipia de mama. También se divulgan procedimientos para prevenir estos cánceres.
Estos procedimientos incluyen la inducción de linfocitos T CD4+ específicos de Brachyury. Los procedimientos también pueden incluir la inducción de linfocitos T CD8+ específicos de Brachyury. El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura y la célula que no es de levadura se pueden administrar al sujeto solos o junto con un segundo agente, tal como radioterapia y/o quimioterapia.
En modos de realización adicionales de la divulgación, se proporcionan procedimientos para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa en un sujeto. Estos procedimientos incluyen poner en contacto una célula dendrítica con el polipéptido o una célula huésped que expresa el polipéptido, preparando de este modo una célula presentadora de antígeno específica. Estos procedimientos también incluyen la administración de la célula presentadora de antígeno al sujeto, induciendo de este modo una respuesta inmunitaria e inhibiendo el crecimiento de la célula cancerosa.
Los procedimientos de la divulgación pueden incluir la selección de un sujeto que necesite tratamiento, tal como un sujeto con un cáncer que exprese Brachyury o un cáncer con el potencial de expresar Brachyury. En varios ejemplos, los procedimientos incluyen seleccionar un sujeto con cáncer de intestino delgado, estómago, riñón, vejiga, útero, ovario, testículos, pulmón, colon, próstata, tumor de origen de linfocitos B (tal como leucemia linfocítica crónica (LLC), un linfoma de linfocitos B, linfoma de Burkitt o un linfoma de Hodgkin) o cáncer de mama en el que el cáncer expresa Brachyury o tiene el potencial de expresar Brachyury. En algunos ejemplos no limitantes, el cáncer es resistente a la radiación y/o resistente a la quimioterapia. En ejemplos no limitantes adicionales, el sujeto tiene cáncer de mama, tal como un carcinoma ductal, por ejemplo, un carcinoma ductal infiltrante o un cáncer de mama negativo para el receptor de estrógenos y negativo para el receptor de progesterona. En otros ejemplos, el sujeto tiene neoplasia intraepitelial prostética de alto grado, poliposis adenomatosa familiar o atipia de mama.
En aplicaciones ejemplares de la divulgación, las composiciones se administran a un sujeto en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria contra las células que expresan Brachyury, tal como una respuesta de linfocitos T CD4+. También se puede inducir una respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Brachyury usando los procedimientos divulgados en el presente documento. La administración induce una respuesta inmunitaria suficiente para ralentizar la proliferación de células que expresan Brachyury, o para inhibir su crecimiento, o para reducir un signo o síntoma del cáncer, o para prevenir un cáncer. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud del paciente y la robustez del sistema inmunitario del paciente. En un ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición es aquella que proporciona alivio subjetivo de uno o más síntomas o una mejora objetivamente identificable según lo observado por el médico u otro observador cualificado.
La composición se puede administrar por cualquier medio conocido por un experto en la técnica. Por tanto, la composición se puede administrar de forma local o sistémica, tal como por inyección intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa, pero se contempla incluso la administración oral, nasal, transdérmica o anal. En un modo de realización de la divulgación, la administración es por inyección subcutánea o intramuscular.
El polipéptido se puede proporcionar como un implante, una inyección oleosa, en un liposoma o como un sistema de partículas. El sistema de partículas puede ser una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanocápsula o una partícula similar. Se ha demostrado que un vehículo de partículas basado en un polímero sintético actúa como adyuvante para potenciar la respuesta inmunitaria, además de proporcionar una liberación controlada. También se pueden usar adyuvantes en combinación con la proteína, incluyendo, por ejemplo, quitosano, sales de aluminio, un oligodesoxinucleótido inmunoestimulador, liposomas y/o una o más citocinas. El polipéptido se puede administrar en un liposoma.
En un ejemplo no limitante específico de la divulgación, el polipéptido se administra de manera que dirija la respuesta inmunitaria a una respuesta celular (es decir, una respuesta CD4+ y/o una respuesta CD8+ específica de Brachyury), en lugar de una respuesta humoral (anticuerpos). El polipéptido puede inducir tanto una respuesta de linfocitos T CD4+ específica de Brachyury como una respuesta de linfocitos T CD8+ específica de Brachyury. Los procedimientos para medir una respuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+ son conocidos en la técnica e incluyen ensayos biológicos, ensayos ELISPOT y clasificación de células activadas por fluorescencia. Un ensayo ejemplar para medir linfocitos T c D4+ específicos de Brachyury se divulga en los ejemplos a continuación.
En un ejemplo no limitante específico, una composición farmacéutica para administración intravenosa incluiría de aproximadamente de 0,1 |jg a 10 mg del polipéptido por paciente al día. Se pueden usar dosificaciones de 0,1 a aproximadamente 100 mg por paciente al día, en particular si el agente se administra en un sitio apartado y no en el sistema circulatorio o linfático, tal como en una cavidad corporal o en la luz de un órgano. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1995.
Opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras, tales como IL-2, IL-6, IL-12, LFA (por ejemplo, LFA-1, LFA-2 y/o LFA-3), CD72, RANTES, G-CSF, GM-CSF, TNF-a, IFN-y, ICAM-1, B7-1, B7-2, otras moléculas relacionadas con B7, OX-40L y/o 41 BBL, o combinaciones de estas moléculas, se pueden usar como adyuvantes biológicos (véase, por ejemplo, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2): 122-38; Lotze et al., 2000, Cancer J Sci. Am. 6 (Supl. 1):S61-6; Cao et al., 1998, Stem Cells 16 (Supl. 1):251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Estas moléculas se pueden administrar de forma sistémica (o de forma local) al huésped. En varios ejemplos, se administran IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-y, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, OX-40l , 41 BBL y/o ICAM-1. Se puede administrar IL-15 o un complejo de IL-15/receptor de IL-15.
Son conocidos varios medios para inducir respuestas celulares, tanto in vitro como in vivo. Los lípidos se han identificado como agentes que pueden ayudar a sensibilizar los linfocitos T in vivo contra diversos antígenos. Por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.662.907, los residuos de ácido palmítico se pueden unir a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo de lisina y a continuación se pueden conectar (por ejemplo, mediante uno o más residuos conectores, tales como glicina, glicina-glicina, serina, serina-serina o similares) a un polipéptido o proteína inmunógena. A continuación, el polipéptido lipidado se puede inyectar directamente en forma micelar, se puede incorporar en un liposoma o se puede emulsionar en un adyuvante. Como otro ejemplo, las lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina, se pueden usar para sensibilizar los linfocitos T específicos de tumor cuando se unen covalentemente a un polipéptido o proteína apropiada (véase, Deres et al., Nature 342:561, 1989). Además, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también se puede sensibilizar con la misma molécula conjugada con una proteína que muestra un epítopo apropiado, se pueden combinar dos composiciones para provocar respuestas tanto humorales como mediadas por células cuando se considere deseable.
En un modo de realización de la invención, el polipéptido se mezcla con un adyuvante que contiene dos o más de un detergente estabilizante, un agente formador de micelas y un aceite. Los detergentes estabilizantes, los agentes formadores de micelas y los aceites adecuados se detallan en la patente de EE. UU. n.° 5.585.103; la patente de EE. UU. n.° 5.709.860; la patente de EE. UU. n.° 5.270.202; y la patente de EE. UU. n.° 5.695.770. Un detergente estabilizante es cualquier detergente que permita que los componentes de la emulsión permanezcan como una emulsión estable. Dichos detergentes incluyen polisorbato, 80 (TWEEN) (mono-9-octadecenoato de sorbitánpoli(oxi-1,2-etanodiilo); fabricado por ICI Americas, Wilmington, DE), TWEEN 40™, TWEEN 20™, TWEEN 60™, Zwittergent™ 3-12, TEEPOL HB7™ y SPAN 85™. Estos detergentes habitualmente se proporcionan en una cantidad de aproximadamente un 0,05 a un 0,5 %, tal como a aproximadamente un 0,2 %. Un agente formador de micelas es un agente que puede estabilizar la emulsión formada con los otros componentes de modo que se forme una estructura de tipo micelar. Dichos agentes en general provocan algo de irritación en el sitio de la inyección para reclutar macrófagos para potenciar la respuesta celular. Ejemplos de dichos agentes incluyen tensioactivos poliméricos descritos por las publicaciones de BASF Wyandotte, por ejemplo, Schmolka, J. Am. Oil. Chem. Soc.
54:110, 1977, y Hunter et al., J. Immunol 129:1244, 1981, PLURONIC™ L62LF, L101 y L64, PEG1000, y TETRONIC™ 1501, 150R1, 701, 901, 1301 y 130R1. Las estructuras químicas de dichos agentes son bien conocidas en la técnica. En un modo de realización, el agente se elige para que tenga un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) entre 0 y 2, como se define por Hunter y Bennett, J. Immun. 133:3167, 1984. El agente se puede proporcionar en una cantidad eficaz, por ejemplo, entre un 0,5 y un 10 %, o en una cantidad entre un 1,25 y un 5 %.
El aceite incluido en la composición se elige para que promueva la retención del antígeno en la emulsión de aceite en agua, tal como para proporcionar un vehículo para el antígeno deseado, y preferentemente tiene una temperatura de fusión de menos de 65 °C, de modo que se forma emulsión a temperatura ambiente (de aproximadamente 20 °C a 25 °C), o una vez que la temperatura de la emulsión baja hasta temperatura ambiente. Ejemplos de dichos aceites incluyen escualeno, escualano, EICOSANE™, tetratetracontano, glicerol y aceite de cacahuete u otros aceites vegetales. En un ejemplo no limitante específico, el aceite se proporciona en una cantidad entre un 1 y un 10 %, o entre un 2,5 y un 5 %. El aceite debe ser tanto biodegradable como biocompatible para que el organismo pueda descomponer el aceite con el tiempo, y para que no sean evidentes efectos adversos, tales como granulomas, tras el uso del aceite.
En un modo de realización, el adyuvante es una mezcla de detergentes estabilizantes, agente formador de micelas y aceite disponible con el nombre PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).
El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se puede administrar al huésped mediante cualquier procedimiento. Por ejemplo, el polipéptido o ácido nucleico que codifica el polipéptido (por ejemplo, como un vector que no es de levadura) se puede introducir en una célula (por ejemplo, en un huésped) mediante cualquiera de diversas técnicas, tal como poniendo en contacto la célula con el polipéptido, el ácido nucleico o una composición que comprende el ácido nucleico como parte de una construcción, como se describe en el presente documento, que posibilita la administración y expresión del ácido nucleico. Los protocolos específicos para introducir y expresar ácidos nucleicos en células son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), supra; y Ausubel et al., supra).
Son conocidos en la técnica procedimientos adecuados de administración de polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores que no son de levadura, células que no son de levadura y composiciones a huéspedes (sujetos). El huésped (sujeto) puede ser cualquier huésped adecuado, tal como un mamífero (por ejemplo, un roedor, tal como un ratón, rata, hámster o conejillo de indias, conejo, gato, perro, cerdo, cabra, vaca, caballo, primate o ser humano).
Por ejemplo, el polipéptido, el ácido nucleico o el vector que no es de levadura (por ejemplo, el poxvirus recombinante) se puede administrar a un huésped mediante exposición de las células tumorales al polipéptido, el ácido nucleico o el vector que no es de levadura ex vivo o mediante inyección del vector de polipéptido, el ácido nucleico o el vector que no es de levadura en el huésped. El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura (por ejemplo, el poxvirus recombinante) o la combinación de vectores que no son de levadura, las células que no son de levadura y las composiciones se pueden administrar directamente (por ejemplo, administrar de forma local) mediante inyección directa en la lesión cancerosa o tumor o mediante aplicación tópica (por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable).
El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se puede administrar solo o en combinación con adyuvantes, incorporado en liposomas (como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 5.643.599, 5.464.630, 5.059.421 y 4.885.172), con citocinas, con modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferón, interleucina-2 (IL-2) y factores estimulantes de colonias (CSF, GM-CSF y G-CSF), u otros reactivos en la técnica que son conocidos por potenciar la respuesta inmunitaria.
Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen alumbre, sales de aluminio, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, sílice de aluminio, fosfato de calcio, adyuvante incompleto de Freund, QS21, MLP-A y RIBI DETOX™.
Un adyuvante en particular preferente para su uso en la invención es la citocina GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un adyuvante de vacuna eficaz porque potencia el procesamiento y la presentación de antígenos por parte de células dendríticas. Los estudios experimentales y clínicos sugieren que GM-CSF recombinante puede reforzar la inmunidad del huésped dirigida a una variedad de inmunógenos.
GM-CSF se puede administrar usando un vector vírico (por ejemplo, un vector poxvírico) o como una proteína aislada en una formulación farmacéutica. GM-CSF se puede administrar al huésped antes, durante o después de la administración inicial del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula o la composición de los mismos para potenciar la respuesta inmunitaria específica de antígeno en el huésped. Por ejemplo, la proteína GM-CSF recombinante se puede administrar al huésped cada día de vacunación con el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula o la composición de los mismos y durante cada uno de los siguientes 3 días (es decir, un total de 4 días). Se puede usar cualquier dosis adecuada de GM-CSF. Por ejemplo, se pueden administrar 50-500 |jg (por ejemplo, 100 |jg, 200 |jg, 300 |jg, 400 |jg e intervalos de los mismos) de GM-CSF recombinante al día. El GM-CSF se puede administrar mediante cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, por vía subcutánea) y, preferentemente, se administra en o cerca del sitio de vacunación de un huésped con el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula o la composición de los mismos.
En un modo de realización, el polipéptido según la invención se puede conjugar con péptidos auxiliares o con moléculas transportadoras grandes para potenciar la inmunogenicidad del polipéptido. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, péptido de la gripe, toxoide tetánico, epítopo CD4 de toxoide tetánico, exotoxina A de Pseudomonas, poli-L-lisina, una cola lipídica, secuencia señal del retículo endoplásmico (RE) y similares.
El polipéptido según la invención también se puede conjugar con una molécula de inmunoglobulina usando procedimientos aceptados en la técnica. La molécula de inmunoglobulina puede ser específica para un receptor de superficie presente en células tumorales, pero ausente o en cantidades muy bajas en células normales. La inmunoglobulina también puede ser específica para un tejido específico (por ejemplo, tejido de mama, ovario, colon o próstata). Dicho conjugado de polipéptido-inmunoglobulina permite dirigir el péptido a un tejido y/o célula específica.
Cualquier dosis adecuada del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o la célula o la composición de los mismos se puede administrar a un huésped. La dosis apropiada variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general, los antecedentes médicos previos, la progresión de la enfermedad y la carga tumoral del huésped, y la puede determinar un médico. Por ejemplo, el péptido se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 10 mg (por ejemplo, 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg e intervalos de los mismos) por vacunación del huésped (por ejemplo, mamífero, tal como un ser humano), y preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg por vacunación. Se pueden proporcionar varias dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) (por ejemplo, durante un periodo de semanas o meses). En un modo de realización de la divulgación, se proporciona una dosis cada mes durante 3 meses.
Cuando el vector que no es de levadura es un vector vírico, una dosis adecuada puede incluir de aproximadamente 1*105 a aproximadamente 1*1012 (por ejemplo, 1*106, 1x107, 1*108, 1*109, 1*1010, 1X1011 e intervalos de los mismos) unidades formadoras de placa (ufp), aunque se puede administrar una dosis menor o mayor a un huésped. Por ejemplo, se pueden administrar aproximadamente 2 * 108 ufp (por ejemplo, en un volumen de aproximadamente 0,5 ml).
Las células según la invención (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos) se pueden administrar a un huésped en una dosis entre aproximadamente 1*105 y 2X1011 (por ejemplo, 1*106, 1*107, 1*108, 1*109, 1 *1010 e intervalos de los mismos) células por infusión. Las células se pueden administrar, por ejemplo, en una a tres (por ejemplo, dos) infusiones. Además de la administración de las células, al huésped se le puede administrar un modificador de la respuesta biológica, tal como interleucina 2 (IL-2). Cuando las células a administrar son linfocitos T citotóxicos, la administración de los linfocitos T citotóxicos puede ir seguida de la administración del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura o una composición de los mismos para sensibilizar los linfocitos T citotóxicos para expandir más el número de linfocitos T in vivo.
Cuando las células a administrar son células dendríticas, la cantidad de células dendríticas administradas al sujeto variará dependiendo del estado del sujeto y se debe determinar mediante la consideración de todos los factores apropiados por parte del facultativo. Preferentemente, se utilizan de aproximadamente 1*106 a aproximadamente 1*1012 (por ejemplo, aproximadamente 1*107, aproximadamente 1*108, aproximadamente 1*109, aproximadamente 1*1010 o aproximadamente 1X1011 incluyendo intervalos de cualquiera de los números de células descritos en el presente documento) células dendríticas para seres humanos adultos. Estas cantidades variarán dependiendo de la edad, el peso, la estatura, el estado, el sexo del sujeto, el tipo de tumor a tratar, la vía de administración, si el tratamiento es regional o sistémico, y otros factores. Los expertos en la técnica deben ser capaces de obtener fácilmente las dosificaciones y las pautas de administración apropiadas para adecuarse a las circunstancias y necesidades específicas del sujeto.
La divulgación incluye un protocolo de sensibilización y refuerzo. En particular, el protocolo incluye una "sensibilización" inicial con una composición que comprende uno o más vectores que no son de levadura recombinantes que codifican el polipéptido según la invención y, opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos, seguida de uno o preferentemente múltiples "refuerzos" con una composición que contiene el polipéptido según la invención o uno o más vectores que no son de levadura que codifican el polipéptido según la invención y, opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos.
La primovacunación inicial puede comprender uno o más vectores que no son de levadura. En un modo de realización de la divulgación, se usa un único vector que no es de levadura (por ejemplo, vector poxvírico) para la administración del polipéptido según la invención y, opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos. En otro modo de realización de la divulgación, dos o más vectores que no son de levadura (por ejemplo, vectores poxvíricos) comprenden la primovacunación, que se administran simultáneamente en una sola inyección.
Las vacunaciones de refuerzo también pueden comprender uno o más vectores que no son de levadura (por ejemplo, vectores poxvíricos). En un modo de realización de la divulgación, se usa un único vector que no es de levadura para la administración del polipéptido según la invención y, opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos de la vacunación de refuerzo. En otro modo de realización de la divulgación, dos o más vectores que no son de levadura comprenden la vacunación de refuerzo, que se administran simultáneamente en una sola inyección.
Se pueden usar diferentes vectores que no son de levadura (por ejemplo, vectores poxvíricos) para proporcionar un protocolo heterólogo de sensibilización/refuerzo usando vectores que portan diferentes conjuntos de moléculas terapéuticas para inoculaciones en diferentes intervalos de tiempo. Por ejemplo, en una combinación heteróloga de sensibilización/refuerzo de la divulgación, se usa una primera composición de vector orthopoxvírico para la sensibilización, y se usa una segunda composición de vector avipoxvírico para el refuerzo.
La pauta de administración de los vectores que no son de levadura (por ejemplo, vectores poxvíricos) típicamente implica la administración repetida del vector de refuerzo. El vector de refuerzo se puede administrar 1-3 veces (por ejemplo, 1, 2 o 3 veces) en cualquier periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, cada 2-4 semanas) durante cualquier periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, 6-12 semanas para un total de al menos 5-15 vacunaciones de refuerzo). Por ejemplo, la primovacunación puede comprender un vector variolovacunal recombinante o MVA seguido de múltiples vacunaciones de refuerzo con un vector avipoxvírico. En un modo de realización particular de la divulgación, el huésped recibe una vacunación con el vector de sensibilización, seguida cada 2 semanas después de esto con el vector de refuerzo para 6 refuerzos, seguido cada 4 semanas después de esto con el vector de refuerzo, y continuando con el vector de refuerzo durante un periodo de tiempo dependiente de la progresión de la enfermedad.
La divulgación proporciona además un kit que tiene al menos un primer vector que no es de levadura recombinante (por ejemplo, vector poxvírico) que ha incorporado en su genoma o parte del mismo un ácido nucleico que codifica el polipéptido según la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El primer vector que no es de levadura recombinante (por ejemplo, vectores poxvíricos) también puede comprender uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos. Además del primer vector que no es de levadura recombinante, el kit puede tener un segundo vector que no es de levadura recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican la una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El kit proporciona además recipientes, agujas de inyección e instrucciones de uso del kit. En otro modo de realización, el kit proporciona además un adyuvante como GM-CSF y/o instrucciones de uso de un adyuvante disponible comercialmente con los componentes del kit.
El polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se puede administrar a un huésped por diversas vías incluyendo, pero sin limitarse a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa e intratumoral. Cuando se administran múltiples administraciones, las administraciones pueden ser en uno o más sitios en un huésped.
La administración del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos puede ser "profiláctica" o "terapéutica". Cuando se proporciona profilácticamente, el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se proporciona antes de la formación del tumor para permitir que el sistema inmunitario del huésped luche contra un tumor que el huésped es susceptible de desarrollar. Por ejemplo, los huéspedes con susceptibilidad hereditaria al cáncer son un grupo preferente de pacientes tratados con dicha inmunización profiláctica. La administración profiláctica del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos previene, mejora o retarda el cáncer. Cuando se proporciona terapéuticamente, el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se proporciona en el momento de o después del diagnóstico del cáncer.
Cuando al huésped ya se le ha diagnosticado cáncer o cáncer metastásico, el polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos se puede administrar junto con otros tratamientos terapéuticos tales como quimioterapia o radiación.
En un modo de realización preferente de la divulgación, la administración del polipéptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de los mismos a un huésped da como resultado una célula huésped que expresa el polipéptido según la invención y, opcionalmente, una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos que se administraron conjuntamente. El polipéptido según la invención se puede expresar en la superficie celular de la célula huésped infectada. La una o más moléculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antígenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA, MUC), versiones modificadas de los mismos y epítopos inmunógenos de los mismos se pueden expresar en la superficie celular o se pueden secretar activamente por la célula huésped. La expresión tanto del epítopo como de la molécula inmunoestimuladora/reguladora proporciona el péptido restringido por MHC necesario a los linfocitos T específicos y la señal apropiada a los linfocitos T para ayudar en el reconocimiento del antígeno y en la proliferación o expansión clonal de los linfocitos T específicos del antígeno. El resultado global es una regulación por incremento del sistema inmunitario. Preferentemente, la regulación por incremento de la respuesta inmunitaria es un incremento de los linfocitos T auxiliares específicos del antígeno y/o linfocitos citotóxicos, que pueden destruir o inhibir el crecimiento de una célula cancerosa (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer tiroideo, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de próstata).
Hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica para los procedimientos divulgados. Las siguientes formulaciones para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal son ejemplares y no son de ninguna manera limitantes. Un experto en la técnica apreciará que estas vías de administración del péptido, el ácido nucleico, el vector que no es de levadura, la célula que no es de levadura o la composición de la invención son conocidas y, aunque se pueda usar más de una vía para administrar un compuesto determinado, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.
Las formulaciones inyectables se encuentran entre esas formulaciones que son preferentes de acuerdo con la presente invención. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4.a ed., páginas 622-630 (1986)).
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El péptido, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición de los mismos se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, tal como un líquido o mezcla de líquidos estéril, incluyendo agua, solución salina, soluciones de dextrosa y glúcidos relacionadas acuosas, un alcohol, tal como etanol, isopropanol o alcohol hexadecílico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, cetales de glicerol, tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, tales como poli(etilenglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un éster o glicérido de ácido graso, o un glicérido de ácido graso acetilado con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.
Aceites que se pueden usar en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales y sintéticos. Ejemplos específicos de aceites incluyen de cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y minerales. Ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. Ejemplos de ésteres de ácido graso adecuados son oleato de etilo y miristato de isopropilo.
Jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos y sulfosuccinatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-b-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina y (e) mezclas de los mismos.
Se pueden usar conservantes y tampones. Para minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones variará típicamente de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % en peso. Tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilensorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol.
Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes monodosis o multidosis sellados, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en estado secado por congelación (liofilizado), que requiere solo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no se deberían interpretar como limitantes de ningún modo de su alcance.
Ejemplo 1
Este ejemplo proporciona materiales y procedimientos para los experimentos descritos en el ejemplo 2.
Construcción vírica
Se construyeron Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA y Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y se produjeron como se describe previamente en Gabitzsch et al., (Cancer Immunol Immunother. 2010; 59:1131-1135) y Amalfitano et al. (J Virol. 1998; 72:926-933). En resumen, los transgenes se subclonaron en la región E1 del vector Ad5 [E1-, E2b-] usando una estrategia basada en recombinación homóloga. El virus carente de replicación se propagó en la línea celular de empaquetamiento E.C7, se purificó con CsCh y se valoró como se describe previamente en Amalfitano et al., supra. La concentración vírica infecciosa se determinó como unidades formadoras de placas (UFP) en una monocapa de células E.C7. La concentración de PV se determinó mediante alteración con dodecilsulfato de sodio (SDS) y espectrofotometría a 260 nm y 280 nm (ViraQuest, North Liberty, IA). El transgén CEA también contiene un c Ea modificado que contiene el epítopo CAP1-6D altamente inmunógeno (véase Salazar et al., Int J Cancer. 2000; 85:829-838; y Zaremba et al., Cancer Res. 1997; 57:4570-4577).
La secuencia que codifica la proteína Brachyury humana (NM_003181.3) se modificó introduciendo el epítopo HLA-A2 potenciador de linfocitos T (WLLPGTSTV) (véase Tucker et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:1307-1317) y por eliminación de un fragmento de 25 aminoácidos implicado en la unión al ADN. La construcción resultante se subclonó posteriormente en el vector Ad5 para generar la construcción Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury.
La molécula MUC1 consiste en dos regiones: el extremo N (MUC1-N), que es el dominio extracelular grande de MUC1, y el extremo C (MUC1-C), que tiene tres regiones: un dominio extracelular pequeño, un solo dominio transmembranario y una cola citoplásmica (véase Lan et al., J Biol Chem. 1990; 265:15294-15299). La cola citoplásmica contiene sitios para la interacción con proteínas de señalización y se ha demostrado que actúa como oncogén y un impulsor de la motilidad, la invasividad y la metástasis del cáncer (véase Wei et al., Cancer Res.
2007; 67:1853-1858; y Li et al., J Biol Chem. 2001, 276:35239-35242).
Para la construcción de Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, el transgén MUC1 completo, incluyendo ocho epítopos agonistas descritos previamente (véase Tsang et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:2139-2149; y Jochems et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:161-174), se subclonó en el vector Ad5. Los epítopos agonistas incluidos en el vector Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 se unen a HLA-A2 (epítopo P93L en el extremo N, VIA y V2A en la región VNTR y CIA, C2A y C3A en el extremo C), HLA-A3 (epítopo c 5a ) y HLA-A24 (epítopo C6A en el extremo C). La vacuna Tri-Ad5 se produjo combinando 1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA y Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 en una proporción de 1:1:1 (3*1010 PV en total).
Generación de DC humanas a partir de PBMC
Se generaron células dendríticas (DC) a partir de leucocitos monomorfonucleares en sangre periférica (PBMC) de un paciente con cáncer de próstata (HLA-A2+ y -A24+) inscrito en un ensayo clínico que empleaba una vacuna PSA-TRICOM en combinación con ipilimumab (véase Madan et al., Lancet Oncol. 2012; 13:501-508), usando el procedimiento descrito previamente (véase Cereda et al., Vaccine. 2011; 29: 4992-4999). Usando PBMC de este paciente después de la vacunación, se pudieron establecer líneas de linfocitos T individuales específicas para CEA, MUC1 y Brachyury. Un Comité de Revisión Institucional del Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) aprobó los procedimientos y se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. En resumen, los PBMC se aislaron usando un gradiente de medio de separación de linfocitos (ICN Biochemicals, Aurora, VA), se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA) (2*107 células) y se permitió que se adhirieran en una placa de 6 pocillos durante 2 horas. Las células adherentes se cultivaron durante 5 días en medio AIM-V que contenía 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante (rh) y 20 ng/ml de rhIL-4. El medio de cultivo se repuso cada 3 días.
Infección de DC humanas con vectores adenovíricos
Se infectaron células dendríticas (2*105) en 1 ml de medio AIM-V con vectores adenovíricos (Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury y Ad5 [E1-, E2b-]-nulo a la multiplicidad de infección indicada (MOI de 10.000 o 20.000) durante 1 hora en placas de 6 pocillos. A continuación, se añadió medio AIM-V (4 ml) a cada pocillo y se incubó durante 2 días adicionales. Para analizar la eficacia de expresión del transgén, las CD se recogieron y analizaron usando citometría de flujo e inmunoelectrotransferencia. Para el análisis fenotípico, las CD se tiñeron para determinar la expresión de CD80, CD83, CD86, CEA y HLA-DR usando anti-CD80 conjugado con BV421, anti-CD83 conjugado con PerCP Cy5.5, anti-HLA DR conjugado con APC-Cy7, anti-CD86 conjugado con PE y anti-CEA conjugado con FITC. Los anticuerpos para citometría de flujo se adquirieron de BD Bioscience (San José, CA).
Generación de líneas de linfocitos T usando DC infectadas con adenovirus
Una modificación del procedimiento descrito por Tsang et al. (J Natl Cancer Inst. 1995; 87:982-990) se usó para generar linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de CEA, MUC1 y Brachyury. Se infectaron células dendríticas (1-2*105/pocillo en 1 ml de AIM-V) con 20.000 MOI de Tri-Ad5, como se describe anteriormente. Las DC infectadas se usaron como APC para la estimulación de células no adherentes autólogas en una proporción de efector-APC de 10:1. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2.
A continuación, los cultivos se complementaron con rhIL-2 durante 7 días; el medio que contenía IL-2 se repuso cada 3 días. La estimulación durante 10 días constituyó un ciclo de estimulación in vitro (IVS). Se usaron DC autólogas infectadas con vector como APC para tres IVS. Se usaron linfocitos B autólogos estimulados brevemente con péptido para reestimular los CTL específicos de antígeno después de tres IVS. Las líneas de linfocitos T se mantuvieron en medio que contenía IL-7 e IL-15 (10 ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ).
Ensayo citotóxico
Una modificación del protocolo descrito por Tsang et al. (Cancer Res. 2001; 61:7568-7576) se usó para el análisis de CTL. En resumen, las células diana se marcaron con 50 |j C¡ de óxido de 111In (GE Health Care, Viena, VA) a 37 °C durante 20 min y se usaron a 3000 células/pocillo en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron linfocitos T en diferentes proporciones y se incubaron a 37 °C durante 16 horas. Los sobrenadantes se recogieron para el recuento gamma. Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado y se calcularon las DE. La liberación espontánea se determinó incubando las células diana con medio solo y la lisis completa se determinó incubando con Triton X-100 al 0,25 %. La lisis específica se calculó con el uso de la siguiente fórmula: Lisis (%) = [liberación observada (CPM) - liberación espontánea (CPM)] / [liberación completa (CPM) - liberación espontánea (CPM)] x 100.
Cultivo de células tumorales
Se obtuvieron líneas celulares de carcinoma de colon humano SW620 (HLA-A2+, HLA-A24+, Brachyury+, MUC1+, CEA+) y carcinoma pancreático ASPC-1 (HLA-A1+, HLA-A26+, MUC1+) de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Los cultivos celulares estaban libres de micoplasma y se mantuvieron en medio completo (RPMI-1640 complementado con FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina, 100 jg/m l de estreptomicina y L-glutamina 2 mM) (Mediatech, Herndon, VA).
Detección de citoquinas
Se evaluó la secreción de IFN-y en los sobrenadantes de linfocitos T estimulados durante 24 horas con DC infectadas con vectores adenovíricos o DC estimuladas brevemente con péptido en medio sin IL-2 usando un kit de ELISA (Invitrogen, Frederick, MD). Las líneas de linfocitos T específicos de antígeno usadas en este análisis se han presentado previamente: (a) un CTL específico de HLA-A2 CEA (Palena et al., Cytokine. 2003; 24: 128-142), (b) un CTL específico de HLA-A2 MUC1 (Tsang et al., Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149), (c) un CTL específico de HLA-A24 Mu C1 (Jochems et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174) y (d) un CTL específico de HLA-A2 Brachyury (Tucker et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317).
Péptidos
En este estudio se usaron los siguientes péptidos de unión a HLA-A2 y HLA-A24: (a) el péptido CAP1-6D agonista de CEA de unión a HLA-A2 (YLSGADLNL) (Zaremba et al., Cancer Res. 1997; 57:4570-4577), (b) el péptido P93L agonista de HLA-A2 MUC1 (ALWGQDVTSV) (Tsang et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:2139-2149), (c) el péptido C6A agonista de MUC1 que se une a HLA-A24 (KYHPMSEYAL) (Jochems et al., Cancer Immunol Immunother.
2014; 63:161-174) y (d) el péptido agonista de Brachyury de unión a HLA-A2 (WLLPGTSTV) (Tucker et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:1307-1317). Todos los péptidos tenían una pureza mayor de un 96 % y se fabricados por American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA).
Ratones
Se alojaron ratones C57BL/6 hembra sin patógenos específicos (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 8-10 semanas de edad en instalaciones para animales en el Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas (IDRI) (Seattle, WA, EE. UU.). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Vacunación y preparación de esplenocitos
A ratones C57BL/6 hembra (n = 5) se les inyectó s.c. 1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury o Ad5 [E1-, E2b-]-CEA o Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o una combinación de 1010 PV de los tres virus en una proporción de 1:1:1 (Tri-Ad5). A los ratones de control se les inyectó 3*1010 PV de Adeno-nulo (sin inserto de transgén). Las dosis se administraron en 25 |jl de tampón de inyección (HEPES 20 mM con sacarosa al 3 %) y los ratones se vacunaron tres veces a intervalos de 14 días. Catorce días después de la inyección final, se recogieron los bazos y los sueros. Los sueros se congelaron a -20 °C. Las suspensiones de esplenocitos se generaron triturando suavemente los bazos a través de un filtro celular de nailon de 70 jM (BD Falcon, San José, CA). Los glóbulos rojos se eliminaron mediante la adición de tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y los esplenocitos se lavaron dos veces y se resuspendieron en R10 (RPMI 1640 complementado con L-glutamina (2 mM), HEPES (20 mM) (Corning, Corning, NY), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 jg/m l (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT) y suero bovino fetal al 10 % (Hyclone). Se analizó la producción de citocinas en los esplenocitos mediante ELISPOT y citometría de flujo.
Ensayo ELISPOT
Los linfocitos T secretores de IFN-y o IL-2 específicos de Brachyury, CEA y MUC1 se determinaron mediante ensayo ELISPOT a partir de esplenocitos de ratón recién aislados, como se describe anteriormente. El ensayo ELISPOT se realizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Affymetrix Bioscience, San Diego, CA). En resumen, se estimularon 2*105 esplenocitos con 0,2 jg/pocillo de péptidos de 15 monómeros superpuestos en una única combinación derivada de Brachyury o CEA (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) o MUC1. Las células se estimularon con concanavalina A (Con A) a una concentración de 0,0625 jg/por pocillo como control positivo y combinaciones de péptidos completos de 15 monómeros superpuestos derivadas de VIS-Nef y VIS-Vif (Programa de Investigación del SIDA y Reactivos de Referencia, Division de SIDA, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de la Salud (NIH)) como controles de péptidos irrelevantes. El número de CFM se determinó usando un lector de placas Immunospot ELISpot (Cellular Technology, Shaker Heights, OH) y los resultados se presentaron como el número de CFM por 106 esplenocitos.
Estimulación de citocinas intracelulares
Los esplenocitos se prepararon como se indica anteriormente. Los ensayos de estimulación se realizaron usando 1*106 esplenocitos vivos por pocillo en placas con fondo en U de 96 pocillos. Las combinaciones de péptidos superpuestos que abarcan las secuencias codificantes completas de Brachyury, CEA y MUC1 se sintetizaron como oligómeros de 15 monómeros con superposiciones de 11 aminoácidos (j Pt GmbH) y las combinaciones de péptidos liofilizadas se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Combinaciones de péptidos construidos de manera similar correspondientes a VIS-Vif y VIS-Nef sirvieron como controles inespecíficos. Los esplenocitos en medio R10 (RPMI 1640, suero bovino fetal al 10 % y antibióticos) se estimularon mediante la adición de combinaciones de péptidos a 2 jg/ml/péptido durante 6 h a 37 °C y un 5 % de CO2, con inhibidor del transporte de proteínas (GolgiStop, BD) añadido 2 h en la incubación. A continuación, los esplenocitos estimulados se tiñeron con respecto a marcadores de superficie de linfocitos CD8a y CD4, se fijaron, se permeabilizaron y a continuación se tiñeron para determinar la acumulación intracelular de iFN-y y TNFa. Los anticuerpos contra CD8a de ratón (clon 53-6.7), CD4 (clon RM4-5), IFN-y (clon XMG1.2) y TNFa (clon MP6-XT22) se adquirieron de BD y la tinción se realizó en presencia de anti-CD16/CD32 (clon 2.4G2). La citometría de flujo se realizó usando un citómetro de flujo Accuri C6 (BD) y se analizó en el programa informático BD Accuri C6.
ELISA para detectar anticuerpos contra CEA
Se recubrieron placas ELISA (Maxisorp; Nunc, Rochester, NY) con 100 ng de CEA humano (Sigma-Aldrich) en tampón de carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 al 1 % (PBS-T) y a continuación se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % durante 60 min a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, se añadieron sueros diluidos 1/50 en PBS-T a los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de ratón (Ig) G (específico de la cadena y) marcado con peroxidasa (Sigma-Aldrich) a una dilución de 1:5000 a los pocillos después de los lavados y las placas se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces y se añadió solución de sustrato de 1,2-fenilendiamina (Thermo-Fisher, Scientific, Waltham, MA) a cada pocillo. La reacción se detuvo añadiendo ácido fosfórico al 10 %. La absorbancia se midió a 492 nm en un lector de ELISA SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los equivalentes en nanogramos de IgG unida a CEA por pocillo se obtuvieron por referencia a una curva estándar generada usando IgG de ratón purificada y desarrollada al mismo tiempo que el ELISA de CEA (Sigma-Aldrich) como se describe previamente (véase Gabitzsch et al., Vaccine.
2011; 29: 8101-8107). Los resultados se analizaron y cuantificaron usando el programa informático SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices).
Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Las células tumorales MC38-CEA2 se cultivaron durante la noche a una densidad de 2*104 células por pocillo en microplacas de histocultivo de 96 pocillos. Se añadieron sueros de ratón combinados inactivados por calor a una dilución de 1:50 y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se añadió suero de conejo a una dilución de 1:50 como fuente de complemento y las células se incubaron durante 2,5 horas más a 37 °C. Los sobrenadantes de cultivo celular se ensayaron usando el ensayo de citotoxicidad no radiactivo Promega Cytotox 96 (Promega, Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El porcentaje de lisis de células MC38-CEA2 se calculó mediante la fórmula % de lisis = (experimental - espontánea diana)/(máxima diana - espontánea diana) x 100 %.
Inmunoterapia tumoral
Para los estudios de tratamiento de tumores in vivo, se implantaron 106 células MC38-MUC1 s.c. en el flanco izquierdo de ratones C57BL/6 hembra de 8 a 10 semanas de edad. Los ratones se trataron tres veces con un intervalo de 7 días con 1010 PV de Adeno-MUC1 o Tri-Ad5. A los ratones de control se les inyectó 3x1010 PV de Adeno-nulo. El crecimiento del tumor se evaluó midiendo dos dimensiones opuestas (a, b) y el volumen se calculó como se describe previamente (véase Tomayko et al., Cancer Chemother Pharmacol. 1989; 24:148-154) de acuerdo con la fórmula V = (axb)2/2 donde la dimensión más corta era "a". Los estudios de tumores se terminaron cuando los tumores alcanzaron 1500 m3 o se ulceraron gravemente.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la generación y caracterización de vectores que comprenden el polipéptido mutante por deleción de Brachyury.
Se generó Ad5 recombinante [E1-, E2b-]-CEA y se caracterizó como se describe previamente (véase Gabitzsch et al., Cancer Immunol Immunother. 2010; 59:1131-1135). Se generaron Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury recombinantes como se describe en el ejemplo 1. El análisis de inmunoelectrotransferencia usando un anticuerpo monoclonal específico anti-Brachyury (MAb 54-1) reveló la expresión de Brachyury cuando células dendríticas (DC) humanas se infectaron con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury. Se usó un vector Ad5[E1-, E2b-] desprovisto de cualquier transgén (Ad5 [E1-, E2b-]-nulo) como control negativo y se usaron células de carcinoma de colon humano SW620 que expresan Brachyury de forma endógena como control positivo.
Se usó un MAb específico anti-MUC1 para detectar la expresión de MUC1 en DC humanas infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1. Se usaron células SW620, que también expresan MUC1 de forma endógena, como control positivo. La diferencia en los pesos moleculares observados en las DC humanas frente a las células de carcinoma humano SW620 muy probablemente se deba a la glucosilación diferencial de la proteína MUC1.
Parecería que MUC1-C se expresa en las DC humanas predominantemente como la forma de 17 o 15 kDa aglucosilada y no como la especie glucosilada 25-20. Las DC humanas infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y Ad5 [E1-, E2b-]-nulo se analizaron en busca de evidencias de maduración de DC frente a DC humanas no infectadas. No hubo diferencias entre los vectores Ad5[E1-, E2b-]-nulo y Ad5 [E1-, E2b-] recombinante que expresan los TAA en cuanto a que cada uno de ellos regulaba por incremento ligeramente la expresión de CD80 y CD83 en la superficie y regulaba por incremento fuertemente la expresión en la superficie de HLA-DR. Por tanto, es evidente que cualquier cambio en la maduración de DC se debe al vector Ad5 solo y no a la inserción del transgén TAA.
La generación de linfocitos T CD8+ humanos específicos de Brachyury, CEA y MUC1 empleando el péptido correspondiente para cada TAA se presentó previamente (véase Palena et al., Clin Cancer Res. 2007; 13:2471 -2478; Tsang et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:2139-2149; Jochems et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:161-174; Tucker et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:1307-1317; Salazar et al., Int J Cancer. 2000, 85:829-838; y Zaremba et al., Cancer Res. 1997, 57:4570-4577).
Como se muestra en la tabla 1, Ad5 [E1-, E2b-]-nulo no activó ninguno de los linfocitos T para producir IFN-y. Las DC infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury activaron los linfocitos T específicos de Brachyury y no los linfocitos T específicos de CEA (como control negativo). Esto demuestra que las DC infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury podían procesar Brachyury de una manera que genera complejos de Brachyury-MHC de clase I con capacidad de activación específica de linfocitos T.
Tabla 1A. La infección de células dendríticas humanas con vectores adenovíricos recombinantes que codifican CEA, MUC1 o Brachyury puede activar líneas de linfocitos T específicos de antígeno
Células dendríticas (DC) Líneas de linfocitos T específicos de antígeno infectadas con CEA MUC1 (HLA- MUC1 (HLA- Brachyury
A2) A24)
Ad5 [E1, E2b]-nulo < 15,6 < 15,6 < 15,6 < 15,6
Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury < 15,6 - - 351,9
Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 < 15,6 335,2 806,4
-- Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 350,0 < 15,6 < 15,6
-- DC no infectadas < 15,6 < 15,6 < 15,6
< 15,6
Solo linfocitos T < 15,6 < 15,6 < 15,6 < 15,6
Se infectaron DC humanas (cultivo de 6 días en IL-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) 2*104 células/pocillo en 0,5 ml de AIM-V) con los vectores adenovíricos indicados a una multiplicidad de infección (MOI) de 20.000. Después de 48 horas, las DC se lavaron y se usaron para la estimulación de linfocitos T humanos específicos de antígeno. Los resultados se expresan en pg/ml de IFN-y por 1*105 linfocitos T/ml. Los números en negrita indican una potenciación significativa de la secreción de IFN-y en comparación con los pocillos correspondientes con DC no infectadas. [-- indica que no se realizó el ensayo.]
Tabla 1B. La infección de células dendríticas humanas con vectores Tri-Ad5 que codifican transgenes puede activar líneas de linfocitos T específicos de antígeno para producir IFN-y____________________________
Células dendríticas (DC) Líneas de linfocitos T específicos de antígeno infectadas con CEA (HLA- MUC1 (HLA- MUC1 (HLA- Brachyury (HLA-A2) A2) A24) A2)
Tri-Ad5 480 236 763 496
Ad5 [E1, E2b]-nulo < 15,6 < 15,6 < 15,6 < 15,6
DC no infectadas < 15,6 < 15,6 < 15,6 < 15,6
Solo linfocitos T < 15,6 < 15,6 < 15,6 < 15,6
Se infectaron DC humanas (cultivo de 6 días en IL-4 y GM-CSF) de un donante HLA-A2 y -A24 con el vector Tri-Ad5 a 2*104/pocillo (placa de 24 pocillos) en 0,5 ml de AIM-V. Se usaron vectores Tri-Ad5 a 20.000 MOI durante 1 hora y a continuación se añadieron 1,5 ml de AIM-V a cada pocillo. Las DC infectadas se incubaron durante 48 horas y a continuación se lavaron y se usaron para la estimulación de linfocitos T humanos específicos de antígeno. Los resultados se expresan en pg de IFN-y por 1x105 linfocitos T/ml. Los números en negrita indican una potenciación significativa de la secreción de IFN-y en comparación con los pocillos correspondientes con DC no infectadas.
De forma similar, las DC infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-CEA activaron específicamente las linfocitos T específicas de CEA, pero no las líneas de linfocitos T específicos de MUC1. Las líneas de linfocitos T específicos tanto de HLA-A2 de clase I como de -A24 MUC1 se han generado previamente (véase Jochems et al., Cancer Immunol Immunother. 2014; 63:161-174) y las DC infectadas con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 pudieron activar estados dos líneas de linfocitos T, pero no la línea de linfocitos T específicos de CEA (tabla 1A). Las DC humanas se infectaron de forma similar con el vector Tri-Ad5. Como se observa en la tabla 1B, los linfocitos T específicos de CEA, MUC1 y Brachyury se activaron cada una para inducir niveles similares de IFN-y como se observa con el uso de los vectores Ad-5 individuales.
A continuación se llevaron a cabo estudios para determinar si la infección simultánea de DC humanas con la mezcla de CEA/MUC1/Brachyury de Tri-Ad5 podía generar líneas de linfocitos T específicos de los tres TAA. Como se observa en la tabla 2, cuando los linfocitos T se activaban mediante incubación con linfocitos B autólogos estimulados brevemente con el péptido correspondiente, y no con un péptido de control, se observó activación de linfocitos T específicos.
Tabla 2. La infección de células dendríticas humanas con Tri-Ad5 puede generar linfocitos T específicos de antígeno para Brachyury, MUC1 y CEA y puede producir IFN-y cuando se estimula con linfocitos B autólogos estimulados brevemente con los péptidos correspondientes
Líseas de lisfocitos T específicos Péptidos (10 pg/ml)
de antigene CEA MUC1 (HLA- MUC1 (HLA- Brachyury
A2) A24)
T-Brachyury < 15,6 - - 243
T-MUC1 (A2) < 15,6 < 15,6 - -
T-MUC1 (A24) < 15,6 - 206 -
T-CEA 211 < 15,6 - -
Se infectaron células dendríticas (DC) humanas de un paciente con cáncer de próstata (cultivo de 6 días en IL-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) 2*104 células/pocillo en 0,5 ml de AIM-V) con Tri-Ad5 a 20.000 MOI. Después de 48 horas, las DC infectadas se lavaron y se usaron para generar linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos usando leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) autólogos como efectores.
Después de 3 ciclos de estimulaciones in vitro, se usaron linfocitos B autólogos estimulados brevemente con péptidos como células presentadoras de antígeno. Los resultados se expresan en pg/ml de IFN-y. [-- indica que no se realizó el ensayo.]
Por ejemplo, la línea de linfocitos T específicos de Brachyury, generada infectando DC humanas con Tri-Ad5, se estimuló para producir IFN-y cuando se incubó con DC autólogas estimuladas brevemente con péptido de Brachyury, pero no se activó con las mismas DC autólogas estimuladas brevemente con un péptido de CEA. Se observaron resultados similares con líneas de linfocitos T contra CEA y MUC1 generadas con DC infectadas con Tri-Ad5. Estos resultados indican la ausencia de la denominada "competencia antigénica" en el uso in vitro de Tri-Ad5.
A continuación se investigó si los linfocitos T humanos específicos de Brachyury, MUC1 y CEA generados usando DC infectadas con Tri-Ad5 podían lisar las células de carcinoma humano que expresan de forma endógena estos TAA. Las células de carcinoma de colon humano SW620 expresan los tres TAA y poseen los alelos HLA-A2 y -A24 de clase I. Se usaron células de carcinoma pancreático humano ASPC-1 como control negativo ya que expresan los tres TAA, pero en el contexto de moléculas HLA-A1 y -A26. Los resultados (tabla 3) demostraron que las DC humanas infectadas con Tri-Ad5 pueden generar linfocitos T que pueden lisar, de manera restringida por MHC, células tumorales humanas que expresan de forma endógena Brachyury, CEA y MUC1.
Tabla 3. La infección de DC humanas con Tri-Ad5 puede generar CTL específicos de Brachyury, MUC1 y CEA que lisan eficazmente las células tumorales que expresan los tres antígenos
l_inea s d e 1 m foatosT SW620 Brachyury+MUC1+CEA+ ASPC-1 Brachyury+MUC1+CEA+ especific°s de (HLA-A2+/A24+) (HLA-A2+/A26+)
antigene '
T-Brachyury 64,4 (3,6) 8,3 (2,7)
T-MUC1 (P93L) 28,5 (1,3) 2,0(1,6)
T-MUC1 (C6A) 49,3 (3,3) 5,0 (1,8)
T-CEA 42,2 (3,7) 4,3 (1,9)
Se infectaron células dendríticas (DC) humanas con Tri-Ad5 a 20.000 MOI. Las DC infectadas se usaron para generar linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos usando leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) autólogos. Se usaron DC autólogas como células presentadoras de antígeno para tres estimulaciones in vitro (IVS). Se usaron linfocitos B autólogos estimulados brevemente con péptido para reestimular los CTL específicos de antígeno para dos IVS adicionales. La proporción de efector a diana usada fue de 30:1; los CTL se usaron en IVS 5. Los resultados se expresan en % de lisis específica (DE).
A continuación, se realizaron estudios para determinar si Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 y Ad5 [E1-, E2b-]-CEA podían generar respuestas de linfocitos T específicos de TAA in vivo, y si la mezcla de Tri-Ad5 podía generar respuestas comparables. A ratones C57BL/6 (n = 5 por grupo) se les inyectó por vía subcutánea (s.c.) tres veces a intervalos de 2 semanas 1010 partículas víricas (Pv ) de Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]MUC1, Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury o Tri-Ad5 (mezcla 1:1:1 de 1010 PV cada uno). Un grupo adicional de ratones (n = 5) recibió 3*1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-nulo (un control de vector vacío).
Dos semanas después de la vacunación final, los esplenocitos de los ratones vacunados se estimularon con las combinaciones de péptidos de Brachyury, CEA o MUC1 correspondientes y se analizaron en relación a células secretoras de IFN-y e IL-2 mediante el ensayo de inmunotransferencia enzimática (ELISPOT). Los ratones vacunados con construcciones singulares o con Tri-Ad5 respondieron a los péptidos de Brachyury, CEA y MUC1, respectivamente, con incrementos significativos en las células formadoras de manchas (CFM) de IFN-y e IL-2 en comparación con los ratones de control (figuras 1A y B). No hubo diferencia significativa en el número promedio de CFM de IFN-y en ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury o Ad5 [E1-, E2b-]-CEA individualmente en comparación con la vacuna Tri-Ad5. Hubo disminución significativa en las CFM de IFN-y en ratones tratados con la vacuna Tri-Ad5 en comparación con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 sola, aunque la respuesta inmunitaria específica de MUC1 inducida por Tri-Ad5 permaneció significativamente elevada para ratones control (p < 0,0001) (figura 2A). Las respuestas de IL-2 fueron similares en ratones tratados con Tri-Ad5 frente a construcciones de vacuna individuales; además, hubo un incremento significativo (p = 0,004) en las CFM de IL-2 específicas de CEA cuando los ratones se vacunaron con la vacuna Tri-Ad5 frente a la vacuna Ad5 [E1-, E2b-]-CEA sola (figura 3B). Los esplenocitos de ratones vacunados con vector vacío no respondieron a las combinaciones de péptidos de Brachyury, CEA o MUC1. Además, no hubo reactividad para controlar las combinaciones de péptidos (virus de la inmunodeficiencia simia (VIS)-Nef y VIS-Vif) en los esplenocitos de ninguno de los grupos vacunados.
Tomados conjuntamente, estos datos indican que combinar Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA y Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 en una mezcla de vacuna Tri-Ad5 tiene la efecto de generar células productoras de IFN-y e IL-2 específicas de antígeno similar al conseguido cuando se usa cada vacuna sola.
La acumulación intracelular de IFN-y y TNF-a en poblaciones de linfocitos CD8+ y CD4+ también se evaluó por citometría de flujo usando esplenocitos de ratones vacunados con los vectores adenovíricos y estimulados con combinaciones superpuestas de los respectivos péptidos sintéticos (figura 2). No se observaron diferencias significativas entre la producción de IFN-y observada con linfocitos esplénicos CD8+ aislados de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury en comparación con los aislados de ratones vacunados con Tri-Ad5 (figura 2A). Se observaron reducciones significativas entre la acumulación de IFN-y específica de CEA y específica de MUC1 en esplenocitos CD8+ aislados de ratones vacunados con Tri-Ad5 en comparación con ratones vacunados con una construcción individual, aunque el número relativo de CFM se mantuvo significativamente elevado sobre los controles (p < 0,0001) (figura 2A). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la acumulación de IFN-y entre los esplenocitos CD4+ aislados de ratones vacunados con cada construcción individual o ratones vacunados con Tri-Ad5 (figura 2B).
Los esplenocitos estimulados con péptidos también se evaluaron por citometría de flujo para determinar la acumulación intracelular tanto de IFN-y como de TNF-a. Se detectaron esplenocitos CD8+ y CD4+ multifuncionales específicos de antígeno en ratones vacunados con cada vector de un solo antígeno, así como con T ri-Ad5. Cuando se comparan directamente las frecuencias de esplenocitos CD8+ y CD4+ de doble función aislados de ratones vacunados con un solo vector frente a las de un ratón vacunado con Tri-Ad5, se observaron muy pocas diferencias (figura 2C y D). No se detectaron diferencias significativas entre los esplenocitos CD8+ de doble función aislados de ratones vacunados con Ad5 [E1-,E2b-]-Brachyury o Ad5 [E1-, E2b-]-CEA contra al antígeno respectivo en comparación con los aislados de ratones vacunados con T ri-Ad5 (figura 2C). Se observó una reducción significativa en los esplenocitos CD8+ de doble función de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 en comparación con Tri-Ad5 (p = 0,04); esta frecuencia reducida, sin embargo, fue significativamente elevada en comparación con los controles (p < 0,001). No se encontraron diferencias significativas en las frecuencias de esplenocitos CD4+ multifuncionales aislados de ratones vacunados con cada construcción individual o Tri-Ad5 (figura 2C).
Para evaluar si las respuestas humorales se indujeron por las vacunas Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury o Tri-Ad5, se emplearon ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) cuantitativos específicos de antígeno. Se detectaron respuestas de anticuerpos significativas y comparables contra CEA en sueros de ratones vacunados con Ad5 [E1-,E2b-]-CEA o Tri-Ad5 (figura 3A). No se detectaron anticuerpos contra CEA en ratones vacunados con el vector de control (figura 3A), o ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury o Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1. No se detectaron anticuerpos específicos de antígeno para Brachyury o MUC1 en sueros de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-Brachyury, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o Tri-Ad5, respectivamente.
Para determinar la propensión de los anticuerpos contra CEA en los sueros de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-CEA o Tri-Ad5 para lisar células tumorales que expresan CEA, se utilizó un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Se incubaron sueros inactivados por calor de ratones vacunados con células tumorales MC38-CEA2 (células de carcinoma de colon CEA murino transfectadas con CEA humano), seguido de sueros de conejo como fuente de complemento. La lisis se determinó por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células MC38-CEA2. Hubo lisis significativa de células MC38-CEA2 en sueros de ratones vacunados con Tri-Ad5 o Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, y este efecto fue similar entre los dos grupos (figura 3B).
A continuación se llevaron a cabo estudios para determinar si la pauta de vacunas Tri-Ad5 era tan eficaz como el uso de una sola construcción de adenovirus recombinante para provocar un efecto antitumoral. A ratones C57BL/6 (n = 7/grupo) se les implantó s.c. 1*106 células MC38 que expresaban MUC1 (MC38-MUC1) en el flanco izquierdo. Los ratones se vacunaron semanalmente con inyecciones s.c. en el flanco opuesto usando 1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o Tri-Ad5, respectivamente. Un grupo de control de ratones recibió 3*1010 PV de Ad5 [E1-, E2b-]-nulo (sin transgén). Los ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o Tri-Ad5 tenían tumores significativamente más pequeños que los ratones de control en los días 25 (p < 0,01) y 29 (p < 0,05) (figura 4). No hubo diferencia significativa (p > 0,1) en el efecto antitumoral para los grupos de ratones vacunados con Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 o Tri-Ad5 en todos los puntos temporales.
El uso de las expresiones "un/o" y "una" y "el/la" y "al menos uno" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar de modo que cubra tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de la expresión "al menos uno" seguida de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, "al menos uno de A y B") se debe interpretar como un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique de otro modo en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. La expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos indefinidos (es decir, que significan "incluyendo, pero sin limitarse a") a menos que se indique de otro modo. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento pretende servir simplemente como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que esté dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se hubiera enumerado individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del vocabulario ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se indique de otro modo. Ningún vocabulario en la memoria descriptiva se debe interpretar de forma que indique que algún elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
2. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.
3. Un vector que no es de levadura que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.
4. El vector de la reivindicación 3, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, poxvirus, retrovirus, adenovirus, herpesvirus, poliovirus, alfavirus, baculorvirus, virus Sindbis o un vector bacteriano.
5. El vector de la reivindicación 4, en el que el vector es un vector bacteriano, y el vector bacteriano es un vector de Listeria o Salmonella; o
en el que el vector es un poxvirus, y el poxvirus se selecciona del grupo que consiste en orthopoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus y suipoxvirus, o del grupo que consiste en virus variolovacunal, de la viruela aviar y de la viruela del canario.
6. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende además un ácido nucleico que codifica una molécula inmunoestimuladora/reguladora.
7. El vector de la reivindicación 6, en el que la molécula inmunoestimuladora/reguladora se selecciona del grupo que consiste en interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, interferón (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-4OL, 41 BBL, anti-CTLA-4 y combinaciones de los mismos, y/o en el que el vector comprende además un ácido nucleico que codifica uno o más antígenos asociados a tumor.
8. Una célula que no es de levadura que comprende (i) el polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2 o (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7.
9. La célula de la reivindicación 8, en la que la célula es una célula presentadora de antígeno o célula tumoral.
10. Una composición que comprende:
(a) (i) el polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 o (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9, y
(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. La composición de la reivindicación 10, en la que la composición comprende además una molécula inmunoestimuladora/reguladora.
12. La composición de la reivindicación 11, en la que la molécula inmunoestimuladora/reguladora se selecciona del grupo que consiste en interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, interferón (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, anti-CTLA-4 y combinaciones de los mismos, o en la que la molécula inmunoestimuladora/reguladora se selecciona del grupo que consiste en (i) un plásmido que codifica IL-12 en complejo con quitosano y (ii) IL-12 recombinante mezclada con quitosano.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende además un fármaco quimioterápico, un fármaco antibiótico, un fármaco antivírico, un fármaco antifúngico, ciclofosfamida o una combinación de los mismos.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, que comprende además uno o más adyuvantes, opcionalmente en la que el uno o más adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en alumbre, sales de aluminio, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, sílice de aluminio, fosfato de calcio, adyuvante incompleto de Freund, QS21, MPL-A, RIBI DETOX™ y combinaciones de los mismos.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, que comprende además factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) y/o que comprende además liposomas.
16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para su uso como medicamento, opcionalmente en la que el medicamento es para administración a un sujeto humano.
17. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (Ni) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i), (ii), (iii), (iv) o (v), tratando o previniendo de este modo el cáncer en el sujeto.
18. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de la reivindicación 17, en el que el sujeto es un ser humano.
19. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en el que el sujeto tiene cáncer.
20. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de la reivindicación 19, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de testículos, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de linfocitos B, linfoma de Burkitt o linfoma de Hodgkin.
21. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, que comprende administrar al sujeto un liposoma que comprende el polipéptido y/o que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un adyuvante.
22. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de la reivindicación 21, en el que el adyuvante es quitosano.
23. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-22, que comprende además administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo agente, en el que el segundo agente es un agente quimioterápico, radiación, un agentes micromolecular dirigido, hormonoterapias o inhibidores de puntos de control.
24. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15 para el uso de la reivindicación 23, en el que los inhibidores de puntos de control se seleccionan del grupo que consiste en anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 y combinaciones de los mismos.
25. (i) El polipéptido de la reivindicación 1, (ii) el ácido nucleico de la reivindicación 2, (iii) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, (iv) la célula de la reivindicación 8 o 9 o (v) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-16 para el uso de la reivindicación 23 o 24, en el que el segundo agente es un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epitelial, un inhibidor del factor de crecimiento transformante (TGF)-p o un inhibidor de la tirosina cinasa.
26. El polipéptido de la reivindicación 1 para su uso en la inhibición del crecimiento de una célula cancerosa en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula dendrítica con el polipéptido para producir una célula presentadora de antígeno específica; y administrar la célula presentadora de antígeno específica al sujeto, induciendo de este modo una respuesta inmunitaria e inhibiendo el crecimiento de la célula cancerosa.
27. El polipéptido de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 25, en el que el sujeto es humano.
28. El polipéptido de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 26 o 27, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de testículos, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de linfocitos B, linfoma de Burkitt o linfoma de Hodgkin.
29. El polipéptido de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 28, en el que el sujeto tiene neoplasia intraepitelial prostética de alto grado, poliposis adenomatosa familiar o atipia de mama.
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